CN101233240A - 与质量分析结合的甲基化特异性扩增产物的碱基特异性切割 - Google Patents

Abstract

本发明提供了方法、组合物和试剂盒，该方法、组合物和试剂盒用于鉴定靶核酸分子的甲基化状态、靶核酸分子中核苷酸基因座的甲基化状态，或者用于鉴定靶核酸分子中一个或多个甲基化或未甲基化核苷酸的基因座。甲基化状态通过以下方式进行：用可修饰靶核酸分子中一个或多个核苷酸作为靶核酸分子甲基化状态的函数的试剂处理甲基化的靶核酸分子，甲基化特异性扩增靶核酸分子、断裂扩增产物并且检测一个或多个片段，从而鉴定靶核酸分子的甲基化状态、靶核酸分子中核苷酸基因座的甲基化状态、或者靶核酸分子中一个或多个甲基化或未甲基化的核苷酸的基因座。

Description

与质量分析结合的甲基化特异性扩增产物的碱基特异性切割

相关申请

本申请要求于2004年3月26日提交的60/556,632号美国临时专利申请的优先权，标题为“BASE SPECIFIC CLEAVAGE OFMETHYLATION-SPECIFIC AMPLIFICATION PRODUCTS INCOMBINATION WITH MASS ANALYSIS”，给予Mathias Ehrich和Dirk van den Boom，其全部内容结合于此供参考。本申请的主题涉及美国申请系列第10/272,665号(给予Andreas Braun，ChristianJurinke和Dirk van den Boom，于2002年10月15日提交，标题为：“METHODS FOR GENERATING DATABASES AND DATABASESFOR IDENTIFYING POLYMORPHIC GENETIC MARKERS”；涉及美国临时申请系列第10/723,365号(代理人案卷号(attorney docketnumber)2073)(给予Dirk van den Boom和Sebastian

，于2003年11月27日提交，标题为“FRAGMENTATION-BASEDMETHODS AND SYSTEMS FOR SEQUENCE VARIATIONDETECTION AND DISCOVERY”)的主题；以及涉及美国临时系列第60/466,006号(代理人案卷号P2070)(给予Sebastian

andDirk van den Boom，标题为“FRAGEMNTATION-BASEDMETHODS AND SYSTEMS FOR DENO VOSEQUENCING”，于2003年4月25日提交)。这些非临时和临时申请以及其优先权和母案申请中各自的主题和内容全部结合于此供参考。

技术领域

本发明提供了用于评估核酸甲基化状态的方法和产品。

背景技术

遗传信息不仅存储于四个核苷酸碱的序列构型中，还存储于选定碱基的共价修饰中(参见例如Robertson et al.Nature Rev.Genet.1：11-19(2000))。这些共价修饰的其中之一是胞嘧啶核苷酸的甲基化，尤其是“CpG”二核苷酸中鸟嘌呤核苷酸邻近的胞嘧啶。CpG二核苷酸内将甲基共价加成给胞嘧啶的反应由来自DNA甲基转移酶(DNMT)家族的蛋白催化(Amir et al.Nature Genet.23：185-88(1999)；Okano et al.Cell 99：247-57(1999))。在人类基因组中，CpG二核苷酸通常描述不足，并且多数CpG二核苷酸存在于称为CpG岛的独特区域。这些CpG岛中的大部分可以在基因启动子区发现。在启动子相关的CpG岛中胞嘧啶转化成5’-甲基胞嘧啶已表明与染色质结构的变化有关，而且经常引起相关基因的转录性剪切。由DNA甲基化引起的转录性剪切与哺乳动物发育、遗传印记和X染色体的失活以及寄生DNA和多种癌症类型的抑制相关(参见例如Li et al.Cell 69：915-26(1992)；Okano et al.Cell 99：247-57(1999))。检测到DNA甲基化状态的变化可以作为瘤形成事件早期检测中的标记物(Costello et al.Nature Genet.24：132-38(2000))。

例证DNA甲基化在临床环境中实际应用的研究比较缺乏，这一点至少部分是由于DNA甲基化研究面临的技术局限性。已经有几个DNA甲基化分析技术被人们采用，但每个方法均有其局限性。一些方法易于得到假阳性结果，因此限制了每次分析时将甲基化评估精确到单一的胞嘧啶位点。其他方法则需要大量的高质量基因组DNA、消耗劳力且易于得到假阳性结果。

由于DNA甲基化具有诊断以及其他用途，因此需要可靠且成本有效的高通量DNA甲基化分析工具和方法，以评估可能的甲基化位点、联系甲基化位点与疾病、并且用来开发预后性甲基化标记物。因此在本文所述的目的中，提供甲基化核苷酸鉴定方法及用于该方法的产品是本文的一个目的。

发明内容

概述

本发明提供了鉴定靶核酸分子甲基化状态的方法、组合物以及试剂盒。所述方法可以包括用修饰作为靶核酸分子甲基化状态的函数的靶核酸分子的核苷酸的试剂处理靶核酸分子；扩增处理过的靶核酸分子；断裂扩增的靶核酸分子；检测一个或多个扩增的靶核酸分子片段，以及根据所述片段例如其大小和(或)其数量来鉴定靶核酸分子或核酸分子中核苷酸基因座的甲基化状态，或者鉴定核酸分子或其中的核苷酸基因座为甲基化或未甲基化。

断裂可通过在诸如碱基特异性切割条件下处理扩增产物而完成。这些片段的检测可以通过诸如像MALDI-TOF质谱分析法测定或检测一个或多个扩增的靶核酸分子片段而实现。检测还可以通过诸如比较所述一个或多个靶核酸分子片段的测定质量与一个或多个参考核酸像未处理核酸分子片段的测定质量而实现。在一个示例性的方法中，所述试剂修饰未甲基化核苷酸，并且随后修饰特异性扩增所得到的修饰靶核酸。

本发明还提供了鉴定核酸中一个或多个甲基化或未甲基化核苷酸的方法、组合物以及试剂盒，方法为：用修饰作为选定核苷酸甲基化状态的函数的选定的核苷酸生成不同核苷酸的试剂处理靶核酸分子；用引物接触处理过的靶核酸分子，而该引物含有一个或多个与选定核苷酸互补的核苷酸，或者含有一个或多个与不同核苷酸互补的核苷酸；在核酸合成条件下处理接触过的靶核酸分子，据此核苷酸在杂交到靶核酸分子的引物上合成；在碱基特异性切割条件下处理合成的产物；以及检测切割处理的产物，其中根据切割产物的数量或者一个或多个切割产物与一个或多个参照物之间的比较，确定含有一个或多个甲基化或未甲基化核苷酸的靶核酸分子。

同样地，本发明提供了鉴定核酸中一个或多个甲基化或未甲基化核苷酸的方法、组合物以及试剂盒，方法为：用可修饰作为选定核苷酸甲基化状态的函数的选定的核苷酸生成不同核苷酸的试剂，处理靶核酸分子；扩增处理过的核酸分子，以形成扩增产物；用引物接触处理过的靶核酸分子，所述引物含有与选定核苷酸互补的核苷酸相互补的一个或多个核苷酸，或者含有与不同核苷酸互补的核苷酸相互补的一个或多个核苷酸；在核酸合成条件下处理接触过的靶核酸分子，据此核苷酸在杂交到靶核酸分子的引物上合成；在碱基特异性切割条件下处理合成的产物；以及检测切割处理的产物，其中根据切割产物的数量或者一个或多个切割产物与一个或多个参照物之间的比较，确定含有一个或多个甲基化或未甲基化核苷酸的靶核酸分子。

例如，本发明提供的方法、组合物以及试剂盒包括鉴定核酸中一个或多个甲基化或未甲基化核苷酸的方法、组合物以及试剂盒，方法为：用试剂处理靶核酸分子，试剂选自修饰未甲基化的选定核苷酸生成不同核苷酸的试剂以及修饰甲基化的选定核苷酸生成不同核苷酸的试剂；特异性扩增处理过的靶核酸分子，方法选自：(i)用引物接触处理过的靶核酸分子，而该引物与含有一个或多个选定核苷酸或者一个或多个不同核苷酸的靶核酸区特异性杂交，并且在核酸合成条件下处理接触过的靶核酸分子；以及(ii)扩增处理过的核酸分子，以形成扩增产物，用引物接触扩增产物，而该引物与含有一个或多个选定核苷酸或者一个或多个不同核苷酸的靶核酸区特异性杂交；在核酸合成条件下处理接触过的靶核酸分子；用碱基特异性切割条件处理扩增产物；以及检测切割处理的产物，其中含有一个或多个甲基化或未甲基化核苷酸的靶核酸分子由下列观察结果表示，选自于：存在两个或多个切割产物、仅存在一个单个切割产物、存在比参考核酸分子数量多一个或多个的切割产物、存在比参考核酸分子数量少一个或多个的切割产物、存在与参考核酸分子数量相同的切割产物、与参考核酸分子质量相比一个或多个切割产物质量的变化以及一个或多个切割产物与参考核酸分子质量相同。

本发明还提供了用于鉴定甲基化核苷酸分子的方法、组合物以及试剂盒的实例，方法为：处理靶核酸分子，以确定未甲基化的胞嘧啶核苷酸；用包含一个和多个鸟嘌呤核苷酸特异性的扩增处理过的靶核酸分子；碱基特异性的切割扩增产物；以及检测切割产物，其中存在两个和多个片段表示靶核酸分子包含一个和多个甲基化的胞嘧啶。其他实例包括包括鉴定非甲基化核酸分子的方法，方法为：用修饰未甲基化的胞嘧啶的试剂处理靶核酸分子以产生尿嘧啶；用包含一个或多个腺嘌呤核苷酸的引物特异性的扩增处理过的靶核酸分子；以及检测切割产物，其中存在两个或多个片段表示包含一个或多个未甲基化的胞嘧啶的靶核酸分子。

本文所提供的其他示例性的方法、组合物和试剂盒包括用于鉴定核酸中甲基化的核苷酸的核苷酸基因座的方法、组合物和试剂盒，方法为：用修饰未甲基化的胞嘧啶的试剂处理靶核酸分子以产生尿嘧啶；用包含一个或多个腺嘌呤核苷酸的引物特异性的扩增处理过的靶核酸分子；以及检测切割产物的质量，其中与参考质量相比，一个或多个切断产物的质量变化表示靶内的核苷酸基因座被甲基化。类似的示例性方法包括用于鉴定靶核酸内未甲基化核苷酸的核苷酸基因座的方法，方法为：用修饰未甲基化的胞嘧啶的试剂处理靶核酸分子以产生尿嘧啶；用包含一个或多个腺嘌呤核苷酸的引物特异性的扩增处理过的靶核酸分子；碱基特异性的切割扩增产物；以及检测切割产物的质量，其中与参考质量相比，一个或多个切断产物的质量变化表示靶内的核苷酸基因座被甲基化。

本发明还提供了用于鉴定甲基化核酸中甲基化状态的核苷酸基因座的方法、组合物以及试剂盒，方法为：处理靶核酸分子，以确定未甲基化的胞嘧啶核苷酸；特异性扩增处理过的靶核酸分子，采用的引物与靶核酸分子的第一预定区特异性杂交，其中预定区含有一个或多个胞嘧啶核苷酸。碱基特异性的切割扩增产物；以及检测切割产物的质量，其中：相对于参考质量，一个或多个切割产物的质量变化表示靶核酸中第二个区域内的核苷酸基因座是甲基化的，其中第一个区域和第二个区域互相不交迭。

本发明提供的方法、组合物以及试剂盒可以与多个其它流程中任何一个联合实施或应用，这些流程包括但不限于：根据靶核酸分子的甲基化状态修饰靶核酸分子的流程、任何用于扩增靶核酸分子的流程、任何用于断裂靶核酸分子的流程、任何用于检测靶核酸分子片段的流程。

例如，本发明提供了用于鉴定核酸中甲基化核苷酸的核苷酸基因座的方法、组合物以及试剂盒，方法为：用可将未甲基化的胞嘧啶修饰生成尿嘧啶的试剂处理靶核酸分子；用含有一个或多个鸟嘌呤核苷酸的引物特异性扩增处理过的靶核酸分子；碱基特异性的切割扩增产物；用相同的切割试剂(s)切割或模拟切割参考核酸；检测切割产物的质量；确定靶核酸分子片段和参考片段之间质量信号的差异；以及从质量信号的差异确定一组数量减少的序列变异候选物，从而确定与参考核酸相比靶核酸中的序列变异，其中核苷酸基因座的甲基化通过序列变异的核苷酸基因座表示。本发明提供的方法、组合物以及试剂盒另一个实例是用于鉴定核酸中甲基化核苷酸的核苷酸基因座的方法、组合物以及试剂盒，方法为：用可将未甲基化的胞嘧啶修饰生成尿嘧啶的试剂处理靶核酸分子；扩增处理过的靶核酸分子以形成第一扩增产物；用含有一个或多个胞嘧啶的核苷酸的引物特异性扩增第一扩增产物，以形成第二扩增产物；碱基特异性的切割所述第二扩增产物；用相同的切割试剂(s)切割或模拟切割参考核酸；检测切割产物的质量；确定靶核酸分子片段和参考片段之间质量信号的差异；以及从质量信号的差异确定一组数量减少的序列变异候选物，从而确定与参考核酸相比靶核酸中的序列变异，其中所述核苷酸基因座的甲基化通过序列变异的核苷酸基因座表示。

本发明还提供了在两个或多个核酸中用于鉴定一个或多个甲基化或未甲基化核苷酸的方法、组合物以及试剂盒，方法为：用可修饰作为选定核苷酸的甲基化状态的函数的选定的核苷酸生成不同核苷酸的试剂而处理两个或多个不同的靶核酸分子；用引物接触所述处理过的靶核酸分子，所述引物含有一个或多个与选定核苷酸互补的核苷酸，或者含有一个或多个与不同核苷酸互补的核苷酸；在核酸合成条件下处理所述接触过的靶核酸分子，据此，核苷酸在与靶核酸分子杂交的引物上合成；在碱基特异性切割条件下处理所述合成产物；以及检测所述切割处理的产物，其中含有一个或多个甲基化或未甲基化的选定核苷酸的靶核酸分子根据一个或多个切割产物与一个或多个参照物之间的比较来确定。

本发明还提供了用于鉴定核酸中一个或多个甲基化或未甲基化核苷酸的方法、组合物以及试剂盒，方法为：用可修饰作为选定核苷酸甲基化状态的函数的选定的核苷酸生成不同核苷酸的试剂处理靶核酸分子；用引物接触所述处理过的靶核酸分子，所述引物含有一个或多个与选定核苷酸互补的核苷酸或含有一个或多个与不同核苷酸互补的核苷酸；在核酸合成条件下处理接触过的靶核酸分子，据此，核苷酸在与靶核酸分子杂交的引物上合成；在断裂条件下处理合成的产物；以及通过质谱分析法检测所述断裂处理的产物，其中含有一个或多个甲基化或未甲基化的选定核苷酸的靶核酸分子，根据断裂产物的数量或根据一个或多个断裂产物与一个或多个参照物之间的比较来确定。类似的，提供了用于鉴定核酸中一个或多个甲基化或未甲基化核苷酸的方法，方法为：用可修饰作为选定核苷酸甲基化状态的函数的选定的核苷酸生成不同核苷酸的试剂，处理靶核酸分子；用封闭性寡核苷酸接触所述处理过的靶核酸分子，所述封闭性寡核苷酸含有一个或多个与选定核苷酸互补的核苷酸，或者含有一个或多个与不同核苷酸互补的核苷酸；在核酸合成条件下处理所述接触过的靶核酸分子，其中，当封闭性寡核苷酸与靶核酸分子杂交时，核苷酸合成被抑制；在碱基特异性切割条件下处理所述合成产物；以及检测切割处理的产物，其中含有一个或多个甲基化或未甲基化的选定核苷酸的靶核酸分子根据切割产物的数量或者根据一个或多个切割产物与一个或多个参照物之间的比较来确定。

本发明还提供了用于鉴定核酸中一个或多个甲基化或未甲基化核苷酸的方法、组合物或试剂盒，方法为：用可修饰作为选定核苷酸的甲基化状态的函数的选定核苷酸生成不同核苷酸的试剂，处理靶核酸分子；用切割试剂接触所述靶核酸分子，所述切割试剂在含有一个或多个甲基化的选定核苷酸或者一个或多个未甲基化的选定核苷酸的位点选择性切割靶核酸，或者切割试剂在含有一个或多个选定核苷酸或者一个或多个不同核苷酸的位点选择性切割处理过的靶核酸；在核酸合成条件下处理接触过的靶核酸分子，其中未被切割的靶核酸分子被扩增；在碱基特异性切割条件下处理述扩增产物；以及检测切割处理的产物，其中含有一个或多个甲基化或未甲基化的选定核苷酸的靶核酸分子根据切割产物的数量或者根据一个或多个切割产物与一个或多个参照物之间的比较来确定。

本发明还提供了用于鉴定核酸中一个或多个甲基化或未甲基化核苷酸的方法、组合物或试剂盒，方法为：用引物接触靶核酸分子并在核酸合成条件下处理接触过的靶核酸分子，其中与靶核酸分子互补的链被合成；用甲基转移酶试剂接触所述靶核酸合成的产物双链，据此靶核酸CpG序列中的甲基化也存在于合成产物的互补CpG序列中；重复引物和甲基转移酶试剂接触步骤，以形成第二合成产物，其具有与靶核酸分子中相同的核苷酸序列以及CpG核苷酸的甲基化状态；用可修饰作为选定核苷酸的甲基化状态的函数的选定核苷酸生成不同核苷酸的试剂处理合成产物；在碱基特异性切割条件下处理试剂处理过的产物；以及检测切割处理的产物，其中含有一个或多个甲基化或未甲基化的选定核苷酸的靶核酸分子根据切割产物的数量或者根据一个或多个切割产物与一个或多个参照物之间的比较来确定。

本发明还提供了用于鉴定核酸中一个或多个甲基化或未甲基化核苷酸的方法、组合物或试剂盒，其中扩增产物通过碱基特异性切割条件被切割，而碱基特异性条件选自由化学条件、物理条件、酶碱基特异性切割条件以及其组合所组成的组。例如，扩增产物可以用RNase、DNase、碱性化合物、甲酸哌啶、哌啶、硫酸二甲酯、肼、氯化钠以及其组合进行切割。

本发明还提供了用于鉴定核酸中一个或多个甲基化或未甲基化核苷酸的方法、组合物或试剂盒，其中扩增步骤包括转录。在这些方法中，整合入转录本的三磷酸核苷可以包括三个rNTP和一个dNTP。例如，一个dNTP选自dCTP、dTTP、dATP以及dGTP。在另一个实施中，一个dNTP选自dCTP和dTTP，并且转录本可以用RNaseA进行切割。

本发明还提供了用于鉴定核酸中一个或多个甲基化或未甲基化核苷酸的方法、组合物或试剂盒，其中一个或多个样品测定的质量强度与一个或多个参考质量强度进行比较。同样地，本发明还提供了用于鉴定核酸中一个或多个甲基化或未甲基化核苷酸的方法，其中收集两个或多个核酸样品，并且一个或多个样品测定的质量强度与一个或多个参考质量强度进行比较。在这些方法中，将不完全转化的靶核酸分子与甲基化的靶核酸分子区分开。

本发明提供的方法、组合物和试剂盒可以用于各种不同的应用，包括确证甲基化或未甲基化靶核酸分子的特异性扩增、确定疾病诊断、可能的疾病结果或疾病治疗方案以及鉴定甲基化相关的等位基因。

本发明的方法、组合物和试剂盒可以用于区分假阳性甲基化特异性扩增和真阳性甲基化特异性扩增，通过例如：用可修饰未甲基化的选定核苷酸生成不同核苷酸的试剂处理靶核酸分子；用甲基化状态特异性引物接触处理过的靶核酸分子，所述甲基化状态特异性引物与含有一个或多个选定核苷酸的第一个靶核酸区互补；在核酸合成条件下处理接触过的靶核酸分子；在碱基特异性切割条件下处理合成产物；以及检测切割产物的质量，其中与参考质量相比，一个或多个切割产物质量的变化表示靶核酸第二区域中的核苷酸基因座是甲基化的，其中所述第二区域与第一区域相互不交迭，据此，在第二区域内存在一个或多个甲基化基因座确证真阳性甲基化特异性扩增。

本发明的方法、组合物和试剂盒可以用于鉴定甲基化，从而鉴定与疾病、疾病结果或者治疗方案结果相关的甲基化模式，通过例如：根据本发明提供的任何方法，鉴定来自于一个或多个样品的一个或多个核酸分子的甲基化或未甲基化核苷酸，所述样品从一个或多个已知疾病、疾病结果或者治疗方案的受试者收集；根据本发明提供的任何方法，鉴定来自于一个或多个样品的一个或多个核酸分子的甲基化或未甲基化核苷酸，所述样品从一个或多个正常受试者收集；鉴定在步骤(a)的一个或多个核酸分子与步骤(b)的一个或多个核酸分子之间差异的甲基化或未甲基化核苷酸；据此，根据差异的甲基化或未甲基化核苷酸鉴定与疾病、疾病结果或治疗方案结果相关的甲基化。

在另一个实施中，本发明提供的方法、组合物和试剂盒可以用于诊断疾病、决定治疗方案、或确定受试者疾病结果，通过例如：鉴定来自于一个或多个样品(从一个受试者收集)的一个或多个核酸分子中的一个或多个甲基化或未甲基化核苷酸；与同已知疾病、疾病结果或者治疗方案结果相关的一个或多个参考核酸分子用于比较一个或多个核酸分子中的甲基化或未甲基化核苷酸；据此，与参考核酸分子相同的甲基化或未甲基化核苷酸可以鉴定受试者的疾病、疾病结果或者治疗方案结果。本发明提供的方法、组合物和试剂盒也可以用于决定治疗方案或确定受试者疾病结果的方法，通过例如：鉴定来自于一个或多个样品的一个或多个核酸分子的甲基化或未甲基化核苷酸，所述样品从一个受试者收集；与同已知疾病、疾病结果或者治疗方案结果相关的一个或多个参考核酸分子用于比较所述一个或多个核酸分子中的甲基化或未甲基化核苷酸；据此，不同于参考核酸分子的甲基化或未甲基化核苷酸可以鉴定受试者的疾病、疾病结果或者治疗方案结果。

本发明提供的方法、组合物和试剂盒可以用于确定与等位基因相关的一个或多个核苷酸基因座上的甲基化状态，通过例如：收集含有已知等位基因的核酸分子；鉴定含有已知等位基因的核酸分子中的一个或多个甲基化或未甲基化核苷酸基因点；鉴定不含有等位基因的核酸分子中的相应核苷酸基因点的甲基化状态；以及比较含等位基因的核酸分子中核苷酸基因点的甲基化状态与缺乏等位基因的核酸分子中核苷酸基因座的甲基化状态，据此，一个或多个基因点甲基化状态频率的差异可鉴定与等位基因相关的不同基因点。类似的，本发明提供的方法、组合物和试剂盒可以用于确定与一个或多个核酸基因座的甲基化状态相关的等位基因，通过形成含有一个或多个已知甲基化或未甲基化核苷酸基因座的核酸分子的第一集合，基因座根据本文提供的方法加以鉴定；鉴定集合的核酸样品中存在的一个或多个等位基因的频率；鉴定核酸分子的第二集合中存在的一个或多个等位基因的等位基因频率，核酸分子的第二集合相对于第一集合的核酸分子，含有甲基化状态不同的核苷酸基因座；以及比较核酸分子第一集合中的等位基因频率与核酸分子第二集合中的等位基因频率，据此，根据等位基因频率的差异可鉴定与等位基因相关的一个或多个基因座。

本发明提供的方法、组合物以及试剂盒也可用于检测一个或多个等位基因可能的同一性，通过例如鉴定核酸分子中一个或多个甲基化或未甲基化核苷酸的核酸分子；以及确定一个或多个等位基因与一个或多个甲基化或未甲基化核苷酸一起存在的频率，其中可以确定等位基因可能的同一性。

本发明还提供用于鉴定靶核酸分子甲基化状态的组合物和试剂盒。试剂盒可以包括试剂，其可作为靶核酸分子甲基化状态的函数而修饰靶核酸分子的一个或多个核苷酸；一个或多个甲基化特异性引物能特异性杂交到处理过的靶核酸分子上；以及一个或多个化合物能断裂扩增的靶核酸分子。一个或多个能断裂扩增的靶核酸产物可以包括RNase、DNase、碱性化合物、甲酸哌啶、哌啶、硫酸二甲酯、肼、氯化钠及其组合，例如本发明提供的试剂盒可以包括一种或多种RNase。

详细描述

A.定义

B.用于确定靶核酸分子甲基化的方法

1.样品

a.来源

b.制备

2.靶核酸分子

a.核酸的类型

b.靶核酸分子的结构或生物学作用

c.靶核酸分子的大小和组成

C.甲基状态特异性序列修饰

1.用于序列修饰的试剂

2.含有重亚硫酸盐胞嘧啶的修饰

3.所得的核酸分子

D.扩增处理过的靶核酸分子

1.甲基化特异性引物

a.甲基特异性引物的设计

b.引物组成

c.引物结合区

d.含有C或G核苷酸的引物

2.核酸合成方法

a.预扩增

b.互补链的合成

c.将首次扩增步骤与后面的步骤分开

d.反应参数

e.修饰的三磷酸核苷

f.处理过的靶核酸分子的两条链

g.扩增后步骤

h.扩增产物的多个等份

i.多重扩增

3.核苷酸合成阻滞剂

a.核苷酸合成阻滞剂的组成和性质

b.核苷酸合成阻滞剂的应用

c.多个核苷酸合成阻滞剂的应用

4.断裂与核苷酸合成联合应用

5.转录

6.扩增靶核酸分子，同时保持甲基化序列

E.核酸分子的断裂

1.核酸分子的酶断裂

a.碱基特异性断裂

b.核酸分子的内切核酸酶断裂

c.核酸酶断裂

d.核酸酶断裂

2.核酸分子的物理性断裂

3.核酸分子的化学性断裂

4.断裂方法的组合

a.碱基特异性断裂

i.无片段

ii.存在片段

iii.与参照物的比较

b.多个碱基特异性切断反应

c.序列信息和甲基化状态的鉴定

F.靶核酸分子片段的检测

1.质谱分析

a.质谱分析样品

i.测定的核酸分子的特征

ii.调节

iii.多重和质量修饰

2.其他质量测定方法

3.确定质量峰值特征

4.基于杂交的检测方法

G.片段测定分析

1.甲基化状态鉴定

a.无需参照物的鉴定方法

b.使用参照物的鉴定方法

i.核酸分子序列已知

ii.核酸分子序列未知

c.质量峰值特征的应用

2.来自片段测定分析的可用信息

a.小量甲基化或未甲基化核酸的检测

b.区分甲基化状态与不完全转化

c.确定两个或多个基因座的甲基化状态

d.特异性扩增的确证

i.与错配杂交区分

ii.与不完全转化区分

3.两条靶核酸分子链的分析

4.切割模式的信息

H.应用

1.甲基化的发现

a.疾病相关的发现

b.多重分析

c.靶核酸分子片段作为标记物

2.甲基化分析

a.疾病相关分析

b.生物体鉴定

c.病原体鉴定和分型

d.单模标本

e.确定甲基化频率

f.鉴定等位基因

3.组成和试剂盒

A.定义

除非另有指明，本文所用的所有技术和科学术语具有相同的含义，并且为本发明所属领域的技术人员所理解。本文的全部披露过程提到的所有专利、专利申请、公开的申请和出版物、GENEBANK序列、网站以及其他公开材料，除非另有指明，其全部内容结合于此供参考。假如本文中术语存在多个定义，本部分所用的定义优先。无论参考文献连接URL或者其他这种标识符或地址，应该理解，这种标识符会有变化而且因特网上的特定信息也会转换，但同等信息是已知的并且可以很容易获取，例如通过搜索因特网和/或恰当的数据库。此外，参考文献证明了这种信息的可用性和公共传播性。

如本文所使用的“靶核酸分子”是利用本文披露的方法进行研究的核酸分子。靶核酸分子包括基因组DNA片段、线粒体DNA或RNA片段以及RNA片段，例如可以研究靶核酸分子中一个或多个甲基化核苷酸的存在或缺乏。在甲基化鉴定方法的上下文中，例如鉴定靶核酸分子的甲基化状态或核苷酸基因座的甲基化状态，靶核酸分子也可以指靶核酸分子的扩增产物，包括处理过的靶核酸分子的扩增产物，其中这种扩增产物的核苷酸序列反映靶核酸分子的甲基化状态。期望的目的从上下文将会变得清晰或者将特别指出。

如本文所使用的靶核酸分子的“甲基化状态”指靶核酸分子中一个或多个甲基化核苷酸碱基的存在或缺乏。例如含有甲基化胞嘧啶的靶核酸分子认为是甲基化的(即：靶核酸分子的甲基化状态是甲基化的)。不含有任何甲基化核苷酸的靶核酸分子被认为是未甲基化的。类似的，靶核酸分子中核苷酸基因座的甲基化状态指在靶核酸分子中特定基因座上甲基化核苷酸的存在或缺乏。例如当存在于靶核酸分子中第七位核苷酸的核苷酸是5-甲基胞嘧啶时，则靶核酸分子中第七位核苷酸上的胞嘧啶的甲基化状态是甲基化的。类似的，当存在于靶核酸分子中的第七位核苷酸的核苷酸是胞嘧啶(并且不是5-甲基胞嘧啶)时，则靶核酸分子中得第七位核苷酸上的胞嘧啶甲基化装提是未甲基化的。

如本文所使用的“甲基化状态频率”指相对于分子或基因座为未甲基化的情形的数量，分子或基因座为甲基化的情形的数量。甲基化状态频率可用来描述一群个体或来自单一个体的样品。例如，具有50％甲基化状态频率的核苷酸基因座是50％情形为甲基化而50％情形为未甲基化。这种频率可以用来，例如，描述一群个体中核苷酸基因座或核酸区域甲基化的程度。因此，当在第一人群或核酸分子集合中的甲基化不同于在第二人群或核酸分子集合中的甲基化时，则第一人群或集合的甲基化状态的频率将不同于所述第二人群或集合的甲基化装提频率。这种频率也可以用来，例如，描述在单一个体中核苷酸基因座或核酸区域甲基化的程度。例如这种频率可以用来描述来自组织样品的一群细胞在核苷酸基因座或核酸区域的甲基化或未甲基化程度。

如本文所使用的“甲基化核苷酸”或“甲基化核苷酸碱基”指的是核苷酸碱基上存在的甲基部分，其中甲基部分通常在识别的核苷酸碱基上不存在。例如，胞嘧啶的嘧啶环上不含有甲基，但5-甲基胞嘧啶的嘧啶环上含有甲基部分。因此，胞嘧啶不是甲基化核苷酸而5-甲基胞嘧啶是甲基化核苷酸。在另一个实施例中，胸腺嘧啶在其嘧啶环的第5位含有甲基部分；然而，为了本发明的目的，由于胸腺嘧啶通常是DNA核苷酸碱基，所以当胸腺嘧啶存在于DNA中时，不认为其是甲基化核苷酸。用于DNA典型的核苷碱基是胸腺嘧啶、腺嘌呤、胞嘧啶和鸟嘌呤。用于RNA典型的核苷碱基是尿嘧啶、腺嘌呤、胞嘧啶和鸟嘌呤。

如本文所使用的“甲基化核酸分子”指的是含有一个或多个非特有甲基化的甲基化核苷酸的核酸分子。

如本文所使用的“核苷酸基因座”指的是核酸分子中的核苷酸的位置。甲基化核苷酸的核苷酸基因座指的是核酸分子中甲基化核苷酸的位置。

如本文所使用的“CpG岛”指的是相对于全基因组DNA，含有的CpG二核苷酸数量增多的基因组DNA的G:C富集区。CpG岛长度至少为200bp，其中所述区域的G:C含量为至少50％，并且观察到的CpG频率与预期频率比为0.6；典型的CpG岛长度至少为500bp，其中所述区域的G:C含量为至少55％，并且观察到的CpG频率与预期频率比为0.65。观察到的CpG频率/预期频率的比值可以根据Gardiner-Garden et al.J.Mol.Biol.196：261-281(1987)中提供的方法进行计算。例如，观察到的CpG频率/预期频率的比值可以根据下面的公式来计算：

R＝(AxB)/(CxD)

其中，R是CpG频率/预期频率的比值，A是分析序列中CpG二核苷酸的数量，B是分析序列的核苷酸总数，C是分析序列中C核苷酸的总数，以及D是分析序列中G核苷酸的总数。

如本文所使用的，修饰作为靶核酸分子甲基化状态的函数的靶核酸分子的核苷酸的试剂或者甲基化特异性试剂，指的是可以改变靶核酸分子的核苷酸序列的化合物或混合物或其他试剂，使得其能反映靶核酸分子的甲基化状态。用这种试剂处理靶核酸分子的方法可以包括用试剂接触靶核酸分子，如果需要可以联合加成步骤，以便实现核苷酸序列的预期改变。靶核酸分子的核苷酸序列的这种变化可以得到一种靶核酸分子，其中每个甲基化核苷酸均被修饰成不同核苷酸。靶核酸核苷酸序列的这种变化可以得到一种靶核酸分子，其中每个未甲基化核苷酸均被修饰成不同核苷酸。靶核酸核苷酸序列的这种变化可以得到一种靶核酸分子，其中每个未甲基化的选定核苷酸(例如每个未甲基化的胞嘧啶)均被修饰成不同核苷酸。改变靶核酸核苷酸序列的这种试剂的使用，可以得到一种靶核酸分子，其中每个甲基化核苷酸的选定核苷酸(例如每个甲基化的胞嘧啶)均被修饰成不同核苷酸。

如本文所使用的，利用能修饰选定核苷酸的试剂指的是能修饰核酸分子中的4个典型存在的核苷酸其中之一(DNA为C、G、T、A；RNA为C、G、U、A)的试剂，以便该试剂修饰一个核苷酸而不修饰其他三个核苷酸。在一个示例性的具体实施方式中，这种试剂修饰未甲基化的选定核苷酸以生成不同核苷酸。在另一个示例性的具体实施方式中，这种试剂可使未甲基化的胞嘧啶核苷酸脱去氨基。示例性的试剂是重亚硫酸盐。

如本文所使用的“选定的核苷酸”指的是核酸分子中通常存在4个核苷酸其中之一(DNA为C、G、T、A；RNA为C、G、U、A)，并且可以包括核苷酸典型存在的甲基化衍生物(例如，当C是选定核苷酸时，甲基化和未甲基化C均包含在选定核苷酸的含义内)，然而甲基化的选定核苷酸特指典型存在甲基化的核苷酸，以及未甲基化的选定核苷酸特指典型存在未甲基化的核苷酸。

如本文所使用的“不同核苷酸”指的是化学上不同于选定核苷酸的核苷酸，典型的，使得不同核苷酸具有的Watson-Crick碱基配对性质不同于选定核苷酸，由此，与选定核苷酸互补的典型存在的核苷酸不同于与不同核苷酸互补的典型核苷酸。例如，当C是选定核苷酸时，U或T可以为不同核苷酸，其通过C对G的互补性以及U或T对A的互补性来例证。

如本文所使用的，与选定核苷酸互补的核苷酸或者与不同核苷酸互补的核苷酸指的是一种可在高严谨性条件下与选定核苷酸或不同核苷酸形成碱基配对，亲和力高于互补性核苷酸与4个典型核苷酸中的三个的碱基配对的核苷酸。互补性的一个实例是DNA(例如：A-T和C-G)和RNA(例如：A-U和C-G)中的Watson-Crick碱基配对。因此，例如在高严谨性条件下，G与C碱基配对的亲和力高于G与G、A或T碱基配对，且因此当C为选定核苷酸时，G是与选定核苷酸互补的核苷酸。具有类似碱基配对性质的非天然或不典型核苷酸也包括在内，例如与C互补的非天然或不典型核苷酸是与G类似的非天然或不典型核苷酸，因为其与C碱基配对的亲和力高于其与G、A或T碱基配对。

如本文所使用的，决定错配百分比的杂交严谨性如下：

1)高严谨性：0.1xSSPE，0.1％SDS，65℃

2)中严谨性：0.2xSSPE，0.1％SDS，50℃

3)低严谨性：1.0xSSPE，0.1％SDS，50℃

本领域的技术人员通晓适合稳定杂交物的洗涤步骤，并且也通晓SSPE的成分(参见，例如Sambrook，E.F.Fritsch，T.Maniatis，in：Molecular Cloning，ALaboratorv Manual，Cold Spring Harbor Laboratory Press(1989)，vol.3，p.B.13，，也可以参见多个描述常用实验室溶液的目录)。SSPE是pH值为7.4磷酸盐缓冲的0.18M NaCl。另外，本领域的技术人员认识到杂交物的稳定性由T_m决定，T_m是钠离子浓度和温度的函数(T_m＝81.5℃-16.6(log₁₀[Na⁺])+0.41(％G+C)-600/1))，所以，洗涤条件中对杂交物稳定性关键的参数只有SSPE(或SSC)中的钠离子浓度和温度。特异性杂交通常发生在高严谨性条件下。

如本文所使用的，与选定核苷酸的互补物相互补的核苷酸或者与不同核苷酸的互补物相互补的核苷酸指的是在高严谨性条件下与选定核苷酸互补的核苷酸或与不同核苷酸互补的核苷酸形成碱基配对的核苷酸，其亲和力高于互补核苷酸与4个典型核苷酸中其余3个的碱基配对。例如，当C为选定核苷酸时，G可以是选定核苷酸的互补物，以及C或C的类似核苷酸可以是与选定核苷酸的互补物相互补的核苷酸。在另一个实例中，U可以是不同核苷酸，A可以是不同核苷酸的互补物，以及T可以是与不同核苷酸的互补物相互补的核苷酸。

如本文所使用的，含有预先确定区域的靶核酸分子或者含有预先确定区域的经处理的靶核酸分子及其变异体，指用试剂处理过的靶核酸分子的特定区域，所述试剂作为靶核酸分子甲基化状态的函数而修饰靶核酸分子的一个或多个核苷酸，其中所得的区域的核苷酸序列是已知的或预期的核苷酸序列。例如，与靶核酸分子中预先确定区域杂交的引物可以是其核苷酸序列与已知核苷酸序列的靶核酸分子区域互补的引物。当引物与经试剂处理的靶核酸分子互补时，杂交是特异性的。如在这种引物的上下文中所使用的“预先确定”可以指在靶核酸的至少一部分中已知的核苷酸序列。预先确定还指当用甲基化特异性试剂处理引起核苷酸序列改变时，经处理的靶核酸的至少一部分预期的核苷酸序列，且这种区域的核苷酸序列改变可以推算，从而可设计与核苷酸序列改变的区域互补的引物。

如本文中所使用的“处理”指使被分析物(通常为核酸分子)暴露于某些条件的工艺，在所述条件下，分析物可以发生物理性或化学性修饰或者其他化学反应(包括酶反应)。例如，用可修饰靶核酸的试剂，作为靶核酸甲基化状态的函数处理靶核酸，可以包括将诸如重亚硫酸盐的试剂加入到含有靶核酸分子的溶液中，其中存在于靶核酸分子中的任何未甲基化的选定核苷酸，例如任何未甲基化的C核苷酸，可被化学性修饰例如脱氨；然而，如果靶核酸分子不含有未甲基化的选定核苷酸例如不含有未甲基化的C核苷酸，那么用这种试剂处理的靶核酸分子根本不可以被化学性修饰。在另一个实例中，在断裂或切割条件下处理靶核酸分子，可以包括在选定的靶核酸分子例如含有可以发生切割G核苷酸的靶核酸分子中，加入诸如RNaseT1的切割试剂。然而，切割不一定发生，例如当靶核酸分子不含有G核苷酸时，通过RNaseT1的切割可能不会发生。在另一个实施中，在核酸合成条件下处理靶核酸分子可包括加入DNA或RNA聚合酶和NTPs，以便如果例如引物被杂交到靶核酸分子上，则核酸合成可以发生；然而，如果例如引物未被杂交到靶核酸分子上，核酸合成则不是必要的。

如本文所使用的，混合样品或者其他含被分析物的组合物“处理前”样品指的是首先将样品混合成单一混合物，并且随后实施一种或多种处理步骤例如核酸合成或断裂或重亚硫酸盐处理。相反，当两个或多个样品或组合物“单独处理”时，在一个或多个处理步骤后，再将样品或组合物互相加入。

如本文所使用的“等份”是少于总量的一部分样品或其他含被分析物的组合物。多个等份的大小或数量不必彼此相等。

如本文所使用的处理过的靶核酸分子“形成于”或“源自”未处理的靶核酸分子指处理过的靶核酸分子具有与未处理的靶核酸分子的核苷酸序列相关的核苷酸序列，其反映未处理过的靶核酸分子的甲基化状态。

如本文所使用的“甲基转移酶试剂”指的是将甲基部分转移或者催化转移到诸如核苷酸或核酸分子的化合物上的试剂。典型的，甲基转移酶试剂可以碱基特异性的转移甲基部分。示例性的甲基转移酶试剂是本领域中已知的DNA甲基转移酶试剂。

如本文所使用的习语“杂交”或其语法变异形式指在低、中或高严谨性条件下或在核酸合成条件下第一核酸分子结合到第二核酸分子上。杂交可以包括一些情形，其中第一核酸分子结合到第二核酸分子上，在那里第一和第二核酸分子互补。

如本文所使用的“特异性杂交”指在核酸合成条件下，和与不含有互补序列的核酸分子杂交相比，探针或引物优先杂交到含有与探针或引物互补序列的核酸分子上。例如，特异性杂交包括探针杂交到与和探针互补的靶序列上。

如本文所使用的，在引物杂交的上下文中，核苷酸合成条件指引物退火到待扩增的核酸分子上的条件。示例性的核苷酸合成条件是10mM TrisHCl pH＝8.3、1.5mM MgCl₂、50mM NaCl，62℃。其他示例性的核苷酸合成条件是16.6mM硫酸铵、67mM Tris pH＝8.8、6.7mM MgCl₂、10mM 2-巯基乙醇，60℃。本领域的技术人员通晓影响杂交的参数，例如温度、探针或引物长度和组成、缓冲液组成和pH、以及盐浓度，可以很容易调整这些参数以实现核酸与靶序列的特异性杂交。

如本文所使用的互补性碱基配对指Watson-Crick碱基配对(例如：DNA中的G-C和A-T，和RNA中的G-C和A-U)，或者当使用非天然或不典型核苷酸时其等同物。两条互补的核酸链含有互补的碱基配对。在一些具体实施方式中，探针可含有通用或半通用碱基或者其他组分，其可以通过碱基配对或其他方式与一个或多个核苷酸碱基相互作用；在这种情况下，尽管含有一些非典型的G-C或A-T的碱基配对，探针仍然可以是互补的。当探针或引物与靶核酸分子杂交时，如果出现错配例如G-T、G-A、C-T或C-A，则探针不是互补性的。

如本文所使用的，“基本上”互补的指引物是充分互补的，以与含有需要的序列的靶核酸分子在核酸合成条件下杂交。引物应该具有充分的互补性，以与需要的靶核酸分子杂交，并使靶核酸分子扩增。例如，在本文披露的方法中所用的引物可与需要的待扩增靶核酸分子100％互补。在另一个实例中，只要引物可用来扩增至少一个待扩增的靶核酸分子，则引物可以有1、2、3或更多个错配。例如，靶核酸分子可在引物杂交区含有3个胞嘧啶核苷酸；当3个C核苷酸中仅有一个被甲基化时，用重亚硫酸盐处理可以将2个未甲基化C核苷酸转化为U核苷酸，而与含有3个C核苷酸的靶核酸分子100％互补的引物仍然可以杂交到仅含有一个C核苷酸的靶核酸分子上，从而仅含有一个C核苷酸的靶核酸分子仍然可以被扩增。

如本文所使用的“核酸”指的是多聚核苷酸例如脱氧核糖核酸(DNA)以及核糖核酸(RNA)。术语还包括作为等同物的从核苷酸类似物制得的RNA或DNA的衍生物、变异体和类似物以及单链(正义或反义)和双链多聚核苷酸，包括PNA(肽核酸)。脱氧核糖核苷酸包括脱氧腺苷、脱氧胞苷、脱氧鸟苷以及脱氧胸苷。对于RNA，尿核苷的碱基部分是尿嘧啶。

如本文所使用的“检测”核酸分子或其片段指的是确定存在核酸分子，典型的当核酸分子或其片段已经从样品或混合物的其他组分中完全或部分分离时，并且还可以包括确定核酸分子或其片段的荷质比、质量、数量、吸光度、荧光或其他性质。

如本文所使用的“质谱分析法”包括任何本领域的技术人员已知的合适的质谱分析形式。这些形式包括但不限于基质辅助激光解吸电离飞行时间质谱(MALDI-TOF)、电喷雾(ES)、IR-MALDI(参见，例如99/57318号国际PCT公开申请和美国专利5,118,937)、离子回旋共振质谱仪(ICR)、傅立叶变换及其组合。MALDI，特别是UV和IR，属于本领域中的已知形式。

如本文所使用的习语“质谱分析”指原子、分子或分子片段荷质比的确定。

如本文所使用的质谱指利用质谱分析生物多聚体或其片段，得到的数据以图解或数字编码或其他方式演示出来。

如本文所使用的，与光谱或光谱分析的相关的图案指信号、峰值或其数字图表的特征性分布及数量。

如本文所使用的，在质谱及其分析的上下文中的信号、峰值或者测定指的是输出数据，其可以反映原子、分子或分子片段的荷质比，并且还可以反映存在的原子、分子或其片段的数量。荷质比可以用来确定原子、分子或分子片段的质量，并且数量可用于定量或半定量方法。例如，在一些具体实施方式中，信号峰值或测定可以反映具有特定荷质比的分子的数量或相对数量。信号或峰值包括输出数据的视觉、图表和数字表示。

如本文所使用的强度，当涉及测定的质量时，指的是与其他样品或混合物组分相比，存在于样品或混合物中的被分析物的相对量的反映。例如，第一质谱峰值或信号的强度可以相对于质谱的第二峰值而报道，或者相对于所有峰值强度之和而报道。本领域的技术人员可以认识用来报道峰值相对强度的多种方式。强度可以表示为峰高、半峰高时的峰宽、峰下面积、信噪比或者其他本领域中已知的表示法。

如本文所使用的“比较测定的质量或质量峰值“指的是相对于一个或多个样品或参考质量峰值分析一个或多个测定的样品质量峰值。例如，测定的样品质量峰值可以通过与推算出的质量峰值模式进行比较，并且可确定测定的质量峰值与推算出的质量峰值之间的任何交迭，以鉴定样品质量或分子。参考质量峰值是参考原子、分子或分子片段质量的图解。

如本文所使用的参考质量是测定的样品质量可与之比较的质量。样品质量与参考质量之间的比较可以鉴定样品质量与参考质量相同还是不同。这种参考质量可以推算得出，可以存在于数据库中，或可以通过实验确定。推算出的参考质量可以基于核酸的预测质量。例如，推算出的参考质量可以基于已知或预测序列或者已知或预测甲基化状态的靶核酸分子的预测断裂模式。实验来源的参考质量可以源自任何核酸样品的测定质量。例如，实验来源的质量可以是在用甲基化特异性的试剂处理的靶核酸分子、扩增处理后的靶核酸分子以及碱基特异性切割扩增产物后的质量。参考质量的数据库可以包括一个或多个参考质量，其中参考质量可以推算出或实验确定；数据库可以包含相应于推算出或实验确定的靶核酸分子的断裂模式的参考质量；数据库可以包含相应于推算出或实验确定的两个或多个靶核酸分子的断裂模式的参考质量。

如本文所使用的“参考核酸分子“指已知为甲基化或未甲基化的核酸分子，或者核酸分子的一个或多个核苷酸基因座的甲基化状态已知的核酸分子。参考核酸分子可以用来推算或者实验推导参考质量。用来推算参考质量的参考核酸分子通常是序列已知且含有已知甲基化核苷酸基因座的核酸。用来实验推导参考质量的参考核酸分子可以含有但不必须含有已知序列或已知甲基化核苷酸基因座；即使当参考核酸不含有已知序列时，诸如本文所披露的方法或者本领域已知的其他方式可以用来鉴定参考核酸分子为甲基化的。

如本文所使用的，在一个或多个样品质量(或一个或多个样品质量峰值特征)和一个或多个参考质量(或一个或多个参考质量峰值特征)以及其语法变体之间的“相关”指在一个或多个样品质量(或一个或多个样品质量峰值特征)和一个或多个参考质量(或一个或多个参考质量峰值特征)之间的比较，其中质量相似性的提高表示样品靶核酸分子的质量性质，例如样品靶核酸分子的甲基化与参考核酸的质量性质例如甲基化相同的可能性提高。这种相关可以用来鉴定靶核酸分子，例如鉴定其为甲基化的、鉴定靶核酸分子中甲基化核苷酸的数量、鉴定一个或多个核苷酸基因座的甲基化状态、或者鉴定一个或多个核苷酸基因座是甲基化的。

如本文所使用的靶核酸分子与参考物之间的相关性，包括靶核酸分子中的核苷酸基因座和参考物中核苷酸基因座之间的相关性，其指靶核酸分子或参考物的核苷酸基因座与的相似性或同一性，以便预期靶核酸分子和参考物含有甲基化状态相同的至少一个未确定基因座。例如，当靶核酸分子少于所有核苷酸基因座的甲基化状态已经鉴定时，并且当在参考核酸和靶核酸之间存在相关性时，则可以预期靶核酸分子的一个或多个未鉴定基因座具有与参考物中相应的核苷酸基因座相同的甲基化状态。在另一个实例中，当在参考核酸与靶核酸之间存在相关性时，位于引物杂交区的靶核酸分子的一个或多个基因座可以预期具有与参考物中相应的核苷酸基因座的相同的甲基化状态。缺乏这种相关性可以指相关性不足以用来提供靶核酸分子中未确定甲基化状态的期望值，或者可以指反相关，其中靶核酸分子中的甲基化状态预期与参考物中的甲基化状态相反(即：未甲基化或甲基化)。

如本文所使用的“分析”指确定单个寡核苷酸或寡核苷酸混合物的具体性质。这些性质包括但不限于寡核苷酸或寡核苷酸混合物的核苷酸组成以及完整序列、寡核苷酸中存在的一个或多个甲基化核苷酸、寡核苷酸的质量和长度以及存在样品分子内的分子或序列。

如本文所使用的“多重”、“多重反应”或其语法变异体指在单一反应中或在单一质谱分析或其他质量测定(例如单一质谱)中，同时评估或分析一个以上的分子，例如生物分子(如寡核苷酸分子)。

如本文所使用的“收集”指从两个或多个来源混合样品。这种收集可以是，例如混合来自相同生物体的细胞的核酸样品、混合来自同一物种不同生物体的核酸样品或者混合来自不同物种的核酸样品。

如本文所使用的“核酸合成”指化学或生物化学反应，其中在一个核苷酸和另一个核苷酸或寡核苷酸之间形成磷酸二酯键。核酸合成可以包括酶反应例如DNA复制反应如PCR或转录或者化学反应例如固相合成。核酸合成条件指含核酸分子溶液的条件，其中可能形成核苷酸磷酸二酯键。例如，靶核酸分子可以与引物接触，并且可以在核酸合成反应下处理，其可以包括例如PCR或转录条件，以及当引物杂交到靶核酸分子上时，核苷酸可以在引物上合成，即：核苷酸可以通过磷酸二酯键连接到引物3′末端而实现酶促加成；然而，当引物不杂交到靶核酸分子上，可能没有核苷酸在引物上合成。

如本文所使用的“扩增”指增加生物聚合物尤其是核酸的量。扩增包括形成附加的生物聚合物的一个或多个步骤，例如，1个或多个PCR循环。根据选择的5’和3’引物，扩增还可以用来限制并确定进行分析的核酸的区域。可以通过本领域的技术人员已知的任何途径进行扩增，包括使用聚合酶链反应(PCR)、转录以及其他这种方法。例如当要确定甲基化核苷酸的频率时，例如PCR的扩增可以定量实施。

如本文所使用的“特异性扩增”指根据生物聚合物的一种或多种性质来增加具体生物聚合物的量。例如，根据核酸的核苷酸序列或者根据核酸一部分的核苷酸序列，核酸可以特异性扩增。根据核酸序列的一部分的核酸特异性扩增的实例是利用诸如PCR的核酸扩增，其中利用一个或两个引物特异性杂交到核酸的一个或两个区域。典型的，特异性扩增包括靶核酸分子的核酸合成，其中引物完全互补的与靶核酸分子中的核酸序列杂交。在特异性扩增反应中，一些引物可以非计划的杂交到核苷酸序列上，所述引物与该序列部分错配，导致非计划或假阳性扩增产物。本文提供的方法可以用来区分真正特异性扩增产物和假阳性产物。

如本文所使用的“引物”是多聚核苷酸例如含有3’羟基的DNA或RNA。引物可以用作例如在3’羟基上形成磷酸酯键或磷酸二酯键的前体，通过如核苷酸合成反应诸如转录或DNA复制。引物可杂交到模板核酸上，于是酶可以催化一个或多个核苷酸加成到引物3’末端。

如本文所使用的“甲基化特异性引物”或“甲基化状态特异性引物”指根据靶核酸分子的甲基化状态，可与靶核酸分子或经甲基化特异性试剂处理的靶核酸分子特异性杂交的引物。例如，靶核酸分子可以用作为靶核酸分子甲基化状态的函数的甲基化特异性试剂处理，导致靶核酸分子核苷酸序列的改变；并且甲基化状态特异性引物可以特异性杂交到处理过的甲基化靶核酸分子上，而不与处理过的未甲基化靶核酸分子杂交，或不与处理过的、差异的甲基化靶核酸分子杂交。在另一个实例中，靶核酸分子可以用甲基化特异性试剂作为靶核酸分子甲基化状态的函数处理，引起所述靶核酸分子核苷酸序列的改变；并且甲基化状态特异性引物可以特异性杂交到处理过的未甲基化靶核酸分子上，而不与处理过的甲基化靶核酸分子杂交，或不与处理过的、差异的未甲基化靶核酸分子杂交。在其他实例中，甲基化特异性引物不但始终仅与完全互补序列杂交，而且非计划的结合到至少部分与甲基化状态特异性引物错配的核苷酸序列上。尽管这种低效错配杂交可以引起未甲基化特异性扩增，本文提供的方法可以用来区分来自于完全互补杂交的扩增产物和来自错配杂交的扩增产物。杂交到靶核酸分子上的甲基化特异性引物然后可作为用于随后核苷酸合成反应例如PCR的引物。

如本文所使用的“扩增阻滞剂”或“核苷酸合成阻滞剂”指化合物特别是寡核苷酸，能结合核酸分子上的核苷酸序列并降低或抑制酶催化核苷酸合成的能力，例如DNA或RNA聚合酶。在一个实例中，扩增阻滞剂结合到核苷酸序列上，同时酶丧失催化核苷酸合成的能力。在另一个实例中，扩增阻滞剂可以与引物竞争，结合到核酸分子上核苷酸合成起始的核苷酸序列上。典型的，扩增阻滞剂是寡核苷酸，其中这种封闭性寡核苷酸不含有3’羟基，因此在核酸合成期间，附加的核苷酸不能加入到扩增阻滞剂上。

如本文所使用的“抑制核苷酸合成”指的是降低合成的核酸分子的量，而该核酸分子由来自于样品或混合物中的全部或选定亚群的核酸分子而生成。核苷酸合成可以通过例如降低引物与核苷酸序列杂交的能力或者通过物理性阻断核酸聚合酶的持续途径而被抑制。典型的，对于不含有所需要的序列的核酸分子，例如尽管与甲基化特异性引物部分错配但可能以其他方式扩增的某些核酸分子，其核酸合成被抑制。

如本文所使用的，核酸分子的检测区指的是待分析核苷酸序列的核酸分子区域。核酸分子的引物检测区指的是核酸分子的某些区域，其核苷酸序列待分析以确定引物是否杂交到核酸分子的该区域。例如，在核酸合成条件下，当引物检测区与引物互补时，甲基化特异性引物可以在引物检测区特异性杂交到靶核酸分子上。类似的，靶核酸分子的非引物检测区是核酸分子中甲基化特异性引物不与其特异性杂交的区域。典型的，靶核酸分子的非引物检测区是不与引物检测区互相交迭的核苷酸区域，例如，位于两个引物杂交位点之间的区域，包括位于靶核酸分子的两个引物检测区之间的核苷酸区域。靶核酸分子的未甲基化特异性引物检测区通常是不与甲基化特异性引物检测区相互交迭的核苷酸区域，尽管当引物不是甲基化特异性引物时，其可以与引物杂交区交迭。

如本文所使用的，预先确定区指含有确定核苷酸序列的核酸分子的区域。例如，可以生成具有已知的具体核苷酸序列的引物。与这种引物完全互补性杂交的靶核酸分子区域可以根据引物已知的特定核苷酸序列来确定。因此，预先确定区可以是与这样的引物完全互补性杂交的核酸分子的区域。

如本文所使用的，第一区域与第二区域不相互交迭指的是不包含任何相同核苷酸基因座的核酸分子的一部分。例如，不与引物杂交区交迭的第一区域是不含有任何与引物杂交的核苷酸基因座的第一区域。

如本文所使用的，扩增产物是利用靶核酸分子作为模板的核苷酸合成反应的任何产物。因此，与处理过的靶核酸分子互补并在第一扩增步骤中形成的单链核酸分子是扩增产物。另外，随后核苷酸合成反应的产物为扩增产物，其含有与处理过的靶核酸分子或其互补物相同序列，。扩增产物可以是单链核酸分子或双链核酸分子。

如本文所使用的“断裂”或“切割”指核酸分子例如靶核酸分子或其扩增产物断裂成两个或多个较小核酸分子的步骤或条件。这种断裂或切割可以是序列特异性、碱基特异性或者非特异性，且可以通过各种方法、试剂或条件包括例如化学断裂、酶促断裂、物理断裂来完成。

如本文所使用的，断裂条件指化学、酶促或物理条件，在所述条件下，可以但不是必需实现核酸分子的断裂或切割。切割条件或切割反应条件可以包括一个或多个用于实施实际或模拟切割反应的切割试剂；并且反应的其他参数包括但不限于时间、温度、pH值、或者缓冲液或粒子的选择。例如，断裂条件可以指含有序列特异性内切核酸酶的缓冲液，其中含有可识别序列的核酸分子被切割，而不含有识别序列的核酸分子则不被切割。

如本文所使用的，切割试剂是任何可以引起核酸分子切割的试剂，包括，例如核酸酶和可切割核酸分子的化学试剂如强碱。

如本文所使用的，“片段”、“切割产物”、“被切割的产物”或其语法变异体，指的是来自于靶核酸分子或其扩增产物的断裂或切割的核酸分子产物。尽管这种片段或被切割的产物可以指所有来自切割反应的核酸分子，典型的这种片段或被切割的产物仅指来自于靶核酸分子的片段或切断或其扩增产物中含有靶核酸分子相应核苷酸序列的一部分的核酸分子产物。例如，在本发明方法的范围内，扩增产物的化合物和混合物可以比靶核酸分子序列的被扩增核苷酸区域多含有一个或多个核苷酸(例如：除了含有与靶核酸分子互补的核苷酸之外，引物可以含有“额外的”核苷酸例如转录起始序列，得到的扩增产物含有“额外的”核苷酸或者与靶核酸分子的被扩增核苷酸区域不相对应的核苷酸)。在这种实例中，对应于非源自靶核酸分子的核苷酸的片段或被切割的产物，典型的将不能提供有个靶核酸分子中甲基化的任何信息。因此，本领域的技术人员应该理解，在本文提供的方法中，用来提供甲基化信息的被扩增产物的片段是含有一个或多个起源靶核酸分子的核苷酸的片段，而非含有仅起源于不同于靶核酸分子中的序列的核苷酸的片段。因此，本领域的技术人员将理解，起源于本文中提供的方法、化合物和混合物的片段包括来源于被扩增核酸分子的一部分的片段，其至少部分含有来自于靶核酸分子或基本的或代表性的靶核酸分子的核苷酸序列信息。

如本文所使用的，碱基特异性切割指的是在具体碱基位点上(例如：RNA中A、C、U或G或DNA中A、C、T或G)的核酸选择性切割或者具体碱基类型(例如：嘌呤或嘧啶)的选择性切割。例如，C特异性切割指核酸中每个C核苷酸位置的核酸的切割。

如本文所使用的，在核酸切割的上下文中，习语“非特异性切割”指的是在任意位置靶核酸分子的切割，从而可以随机产生大小和核苷酸序列不同的多种被切割产物。如本文所使用的，在任意位置的切割，不要求绝对的算术随机化，而是仅替代在切割中缺乏基于序列的优先性。例如，通过发光或剪切方式的切割可以在几乎任何位置切割DNA；然而，这种方法可以导致在某些位置的切割频率稍高于其他位置。然而，对于本发明的目的，在仅有轻微序列优先性的几乎所有位置的切割仍然是随机的。利用本文描述的方法非特异性切割可以导致相互交迭的核苷酸片段的产生。

如本文所使用的术语“完全切割”或“全部切割”指的是在一个切割反应中，通过具体切割试剂识别的所有切割位点均被切割完全。

如本文所使用的术语“部分切割”、“部分断裂”或“不完全切割”或其语法变异体，指的是在一个反应中，用于具体切割试剂的相关切割位点仅有一部分真正被切割试剂切割。部分切割可以指具体基因座全部切割，但在相同靶核酸分子的一个或多个其它基因座未达到完全切割；或者部分切割可以指在一个或多个基因座上的部分而不是全部靶核酸分子的切割。切割试剂可以是但不限于，酶、化学切割试剂或者机械或物理力量。如在本文阐明的，用于实现部分切割的示例性方法是产生生物分子，并且在其产生期间包括可切割或不可切割的核苷酸或氨基酸，从而即使当切割反应进行完全时，具体切割位点含有非可切割的核苷酸或氨基酸。这使得所得的靶生物分子部分的被切割。例如，如果未切割的靶生物分子含有4个可能的切割位点，那么由部分切割所得的产物混合物可以含有靶生物分子片段的任何组合：在第一、第二、第三、第四个切割位点的单一切割；2个切割位点的任何一个或多个组合上的双重切割；或3个切割位点的任何一个或多个组合的三重切割；

如本文所使用的，未切割的切割位点指用于切割试剂的已知识别位点，但在反应条件下未被切割试剂切割的切割位点，所述条件例如时间、温度或者在切割识别位点上修饰碱基以避免被试剂切割。

如本文所使用的，互补性切割反应指的是利用不同切割试剂或通过改变所述同一切割试剂的切割特异性在同一个靶或参考核酸或蛋白上实施或模拟的切割反应，从而即可产生相同靶或参考核酸或蛋白的交替的切割模式。

如本文所使用的习语“相互交迭的片段”指的是具有一个或多个来自天然靶核酸分子的共有核苷酸基因座的片段。

如本文所使用的习语“大小的统计学范围”指的是利用本领域中已知的或本文披露的切割方法用于产生的多数片段的尺寸范围，以便某些片段可能显著小于或大于具体尺寸范围内的大多数其他片段。这种片段尺寸的统计学范围的实例是泊松分布。例如，12～30个碱基的统计学尺寸范围还可以包括一些小至1个核苷酸或大至300个或更多个核苷酸的寡核苷酸，但是这些具体尺寸在统计上出现相对罕见。在一些具体实施方式中，不存在片段统计学范围的限制。在其他具体实施方式中，片段的统计学范围可以指定一个范围，使得10％的片段在指定的尺寸范围内、其中20％的片段在指定的尺寸范围内、30％的片段在指定的尺寸范围内、40％的片段在指定的尺寸范围内、50％的片段在指定的尺寸范围内、60％的片段在指定的尺寸范围内、70％的片段在指定的尺寸范围内、80％的片段在指定的尺寸范围内、90％的片段在指定的尺寸范围内、95％的片段在指定的尺寸范围内。

如本文所使用的基质或支持粒子指的是以分散粒子形式存在的支持物质。粒子具有任何形状和尺寸，但典型的具有的尺寸至少为100mm或更小、50mm或更小、10mm或更小、1mm或更小、100μm或更小、50μm或更小、10μm或更小、5μm或更小、1μm或更小、0.5μm或更小，并且且典型的体积为100mm³或更小、50mm³或更小、10mm³或更小、1mm³或更小、100μm³或更小以及立方毫米的等级；典型的粒子的直径为大于约1.5微米并且小于约15微米，例如约4～6微米。这种微粒统称为“珠子(beads)”。

如本文所使用的“底物”指的是不溶性支持物，可以提供一个表面，在表面上面或其上方可以进行反应，和/或可以在可鉴定基因座上保持反应产物。支持物可以从几乎任何不溶性或固态物质制作，例如硅胶、玻璃(如可控孔径玻璃(CPG))、尼龙、王水树脂、Merrifield树脂、葡聚糖凝胶、琼脂糖、纤维素、金属表面(例如：钢、金、银、铝、硅和铜)、塑性材料(例如：聚乙烯、聚丙二醇、聚酰胺、聚酯、聚偏氟乙烯(PVDF))。示例性的底物包括但不限于平面支持物例如玻璃纤维过滤器、玻璃表面、金属表面(钢、金、银、铝、铜和硅)以及塑性材料。固态支持物可以是任何适于爬在cartridge base上的形状，包括但不限于：板、膜、晶圆片、带有凹陷的晶圆片、多孔三维底物以及为本领域技术人员已知的其他几何形状和构型。示例性的支持物是设计用来在分散的基因座上接收或连接样品的平面支持物，例如带有疏水区环绕的亲水区的平面支持物，用于接收、容纳或结合样品。

如本文所使用的“非特异性RNase”指的是无需考虑切割位点上存在的核苷酸序列而切割RNA分子的酶。示例性的非特异性RNase是RNaseI。

如本文所使用的“非特异性DNase”指的是无需考虑切割位点上存在的核苷酸序列而切割DNA分子的酶，示例性的非特异性DNase是DNaseI。

如本文所使用的术语“单碱基切割酶”指的是可以识别并切割具体碱基(例如：DNA的A、C、T或G；RNA的A、C、U或G)或者具体类型的碱基(例如嘌呤或嘧啶)的限制性酶。

如本文所使用的术语“1-1/4-切割酶”指的是可以识别并切割核酸中2碱基链的限制性酶，其中一个碱基位置的身份(identity)固定而另一个碱基位置的身份是四个典型出现碱基中任何三个。

如本文所使用的术语“1-1/2-切割酶”指的是可以识别并切割核酸中2碱基链的限制性酶，其中一个碱基位置的身份固定而另一个碱基位置的身份是四个典型碱基中任何两个。

如本文所使用的术语“双碱基切割酶”或“2切割酶”指的是可以识别并切割长度为2碱基的具体核酸位点。

如本文所使用的术语“一组质量信号”或“质量峰值模式”指的是适合核酸分子中两个或多个核酸片段的每一个的两个或多个质量测定值。“质量模式”指的是对应于核酸分子的两个或多个核酸片段的两个或多个质量。

如本文所使用的评分或分数指的是推算具体甲基化核苷酸或序列候选物真正存在于靶核酸分子或蛋白序列中的概率。分数的值用来确定对应于实际靶序列的甲基化核苷酸或序列候选物。通常，在一组靶序列样品中，最高分数代表在靶分子中最可能的甲基化核苷酸或序列，但是可以使用其他筛选原则，例如当存在单个靶序列时，检测阳性分数。

如本文所使用的，模拟指的是根据核酸中甲基化核苷酸的核苷酸序列和定位以及核酸中用于特定的特异性切割试剂的预测切割位点的推算。断裂模式可以模拟为数字表格(例如，对应于参考生物分子片段质量的质量列表)、质谱、凝胶上的条带模式、或任何测定质量分布的技术的图解。在大多数情况下，模拟可以通过推算机程序进行。

如本文所使用的，模拟切割指的是一个虚拟过程，其中靶分子或参考分子实际上被切割。

如本文所使用的，虚拟指的是利用计算机进行的研究和实验。虚拟方法包括但不限于分子模型研究、生物分子对接实验、以及分子结构和/或过程的实际演示例如分子的相互作用。

如本文所使用的受试者包括但不限于动物、植物、细菌、病毒、寄生虫以及任何其他具有核酸的生物体或实体。哺乳动物属于受试者，包括灵长类比如人类。

如本文所使用的，疾病治疗方案指的是处理疾病采取的步骤，包括例如行为矫正、手术或药物。治疗包括改善或消除疾病症状或疾病的方案。

如本文所使用的，当涉及核酸分子或样品来源时例如个体或一组个体，正常值指的是不按照任何具体标准筛选的核酸分子或样品来源，并且典型的指核酸分子的一般核苷酸序列或者样品来源(例如一个或多个健康受试者或一个或多个未诊断疾病的受试者)的健康状况。例如，具体核苷酸基因座的正常甲基化状态可以是核苷酸基因座的野生型甲基化状态。在另一个实例中，一组正常受试者可以是一组不具有具体表现型(例如疾病)的受试者。

如本文所使用的，表现型指的是包括任何可区分的生物体特征的一组参数。表现型可以为体部特征，并且在受试者是动物的情况下，表现型可以为心理特征例如情绪特征。

如本文所使用的，与疾病、疾病结果或治疗方案结果相关的甲基化或甲基化状态指的是相对于正常受试者的核酸区域或核苷酸基因座的甲基化状态，在已知疾病、疾病结果或治疗方案结果的受试者的核酸区域或核苷酸基因座的甲基化状态存在更频繁或缺失更频繁。

如本文所使用的，等位基因指的是发生于基因基因座上的两个或多个核苷酸变异中的任何一个的特定变异。例如，等位基因可以为一个或多个核苷酸的缺失、SNP或者多个核苷酸的突变、多个微卫星中大量重复中的任何一个或者杂合性缺失。已知的等位基因是已经按照本领域技术人员所应用的方法进行表征的等位基因。

如本文所使用的，等位基因缺乏的核酸分子或基因座是不含有具体等位基因(例如：具体数量的微卫星重复)的核酸分子或基因座，但是在该基因座可以含有任何其他等位基因变异。

如本文所使用的，等位基因频率是人群中含有具体等位基因的基因座的分数或百分比，其中人群可以为任何组别包括例如正常或共用相似表现型的多个个体。

如本文所使用的，与等位基因相关的甲基化状态是一种甲基化状态，其中在同一个核酸分子中观察到甲基化的存在或缺失和等位基因的存在比不相关甲基化状态/等位基因配对时其他预期状态要更加频繁。

如本文所使用的，与疾病、疾病结果或治疗方案结果相关的甲基化状态是一种甲基化状态，其中在同一个体中核酸分子中观察到甲基化的存在或缺失和疾病、疾病结果或治疗方案结果比在一群较大个体(例如，所有个体的人群)中存在的其他方式要更加频繁。

如本文所使用的，“分配”指的是确定核酸片段的位置表示具体分子量以及具体末端核苷酸。

如本文所使用的，“一个”指的是一个或多个。

如本文所使用的，“多个”指的是两个或多个核苷酸，其中每个均具有不同序列或甲基化状态。这种差异可能是由于多聚核苷酸中天然存在的变异例如多聚核苷酸中的差异甲基化，或者可能由于引入不同多聚核苷酸的特定修饰，例如用甲基化特异性试剂处理后形成的特定核苷酸差异整合入每个多聚核苷酸中。

如本文所使用的，“模糊分配”指的是对应于靶核酸分子中的特定序列变异或甲基化状态的峰值或信号的独特分配，以及如果分子数量被复合，特定序列变异或甲基化状态代表的峰值可以独特地分配给每个分子。

如本文所使用的，数据处理程序指的是一个过程，可以在软件中具体实施，并确定所获得数据(即，分析的最终结果)的生物学显著性。例如，数据处理程序可以根据收集的数据确定基因型。在本文的系统和方法中，数据处理程序还可以控制仪器和/或基于结果确定的数据收集程序。数据处理程序和数据收集程序可以合并，并通过仪器提供反馈以处理获得数据，从而提供基于分析的判断方法。

如本文所使用的，多个基因或多个靶核酸分子包括至少2、5、10、25、50、100、250、500、1000、2,500、5,000、10,000、100,000、1,000,000个或更多个基因或靶核酸分子。多个基因或靶核酸分子可以包括一个生物体或甚至多个生物体的完整或部分基因组。选择生物体类型就确定了基因或靶核酸分子所选自的基因组。用于选择基因或靶核酸分子的示例性生物体包括动物如哺乳动物，后者包括人类和啮齿类如小鼠、昆虫、酵母、细菌、寄生虫和植物。

如本文所使用的“样品”指的是含有待检测物质的混合物。样品包括“生物样品”，其指获自有生命的来源的任何物质，例如，动物诸如人类或其他哺乳动物、植物、细菌、真菌、原生生物或病毒或者处理过的形式例如被扩增或被提取的物质。生物样品可以为任何形式，包括固态物质例如组织、细胞、细胞团、细胞提取物或活检，或者生物流体例如尿液、血液、组织间液、腹膜液、血浆、淋巴液、腹水、汗液、唾液、滤泡液、乳汁、非乳汁乳腺分泌物、血清、脑脊液、粪便、精液、肺部痰液、羊膜液、感染或炎症区的渗出物、含有颊细胞的漱口液、滑膜液或者由受试者产生的任何其他液态样品。另外，样品可以为组织或器官的固态样品，例如采集的组织包括骨髓、上皮、胃、前列腺、肾、膀胱、乳腺、结肠、肺、胰腺、子宫内膜、神经元、肌肉以及其他组织。样品可以包括器官以及病理样品例如福尔马林固定石蜡包埋的样品。如需要，固态物质可以与液体混合或纯化或扩增或以其他方式处理。采用本文描述的方法进行分析的样品可以在一个或多个纯化步骤中处理，以提高样品中所需细胞或核酸的纯度，样品也可以无需任何提高所需细胞或核酸纯度的纯化步骤，而采用本文中描述的方法进行分析。尤其是，本文的样品包括用于质谱分析的基质混合物以及生物聚合物例如核酸。

如本文所用的，衍生于另一个样品的样品指的是已经被加工过的样品，例如核酸分子的纯化或提取和/或扩增。

如本文所用的混合物指的是任何混合物，其可以为溶液、悬浮液、流体、粉末、糊剂、水相、非水相或其组合。

如本文所用的组合物指的是两个成分之间或多个成分之间的任何联合。

如本文所用的术语“假阳性”指的是高于背景噪声的结果，但并非由于预期事件或序列或甲基化状态而产生。例如，当出现错配杂交时、或通过除了核酸的特异性切割过程而形成的片段时或当甲基化特异性试剂的处理不完全(即，并非所有可以被试剂转化的核苷酸实际上均被转化了)时，可以出现假阳性。

如本文所用的术语“真阳性”指的是高于背景噪声的结果，并且由预期的事件或序列或甲基化状态产生。例如，当发生完全互补杂交时，或当通过核酸的特异性切断而形成断裂时，或当甲基化特异性试剂的处理不完全(即，所有可以被试剂转化的核苷酸实际上均被转化了)时，可以出现假阳性。

如本文所用的术语“假阴性”指的是在实际测定中缺失、但另外被预期的真实信号。例如，当实际质谱中不存在但在相应的模拟质谱中经推算出现质量信号时，可以出现假阴性。

如本文所用的“不完全转化”及其语法变异体指的是作为核酸分子甲基化状态的函数而修饰核酸分子序列的步骤，其中实际被修饰的核苷酸少于全部核苷酸。在处理步骤之后，本文提供的质量测定方法可以用来区分来自于不完全转化的片段以及来自于实际的甲基化核苷酸的片段。

如本文所用的，流体指的是任何可以流动的混合物。因此，包含混合物的流体可以包括半固态、糊剂、溶液、水相混合物、凝胶、洗液、膏剂以及其他这种混合物。

如本文所用的，细胞提取物指的是由裂解或破裂细胞制造的制品或成分。

如本文所用的，试剂盒是一个组合物，其中包装有各种组分，可能带有使用说明书以及与组合物一起使用的试剂和/或设备。

如本文所用的，系统指的是具有用于控制和指导方法的软件和/或任何其他的元件的元件组合。

如本文所用的，软件指的是计算机可读的程序指令，当由计算机执行时，可以实施计算机操作。典型的，软件在程序产品上提供，其含有的程序指令记录在计算机可读的媒介上，例如但不限于磁性媒介包括软盘、硬盘和磁带；以及光媒介包括CD-ROM盘、DVD盘、磁光盘以及其他这种记录程序指令的媒介。

如本文所用的“阵列”指的是成分例如核酸的集合。典型的，阵列包含两种或多种成分。可寻址的阵列是一种阵列成分可鉴别的阵列，典型的通过固相支持物上的位置。因此，通常阵列的成分将固定于固相表面上分散的可鉴别基因座。阵列包括单一固相表面上的成分的组合，例如芯片上的核苷酸集合。

B.用于确定靶核酸分子甲基化的方法

本文提供的是用于确定靶核酸分子甲基化状态的方法。甲基化的核酸分子例如DNA包括甲基化的核苷酸。甲基化的核苷酸有多种作用。例如在基因表达中发挥作用，而且与包括癌症在内的疾病相关。本文提供的方法可以用来确定核酸分子是否是甲基化的(即，含有甲基化的核苷酸)。本文提供的方法可以用来确定核酸分子中甲基化或未甲基化核苷酸的基因座。本文提供的方法可以用来确定核酸分子中的核苷酸基因座是否是甲基化的。本文还提供了另外的方法以及用于实施所述方法的组合物、试剂盒及系统。

在一种方法中，核酸分子的甲基化状态可以通过用修饰靶核酸分子核苷酸序列的试剂作为靶核酸分子甲基化状态的函数处理靶核酸分子、使用一个或多个引物扩增处理过的靶核酸分子、切割扩增产物、以及检测一个或多个被切割的产物来鉴定。在一个具体实施方式中，扩增方法包括甲基化特异性扩增例如甲基化特异性PCR。在另一个具体实施方式中，检测被切割产物的步骤是通过测定靶核酸分子片段的质量而实施的，例如通过质谱。在又一个具体实施方式中，一个或多个被切割产物的质量与参考核酸分子的一个或多个质量进行比较。

在另一个方法中，核酸分子中甲基化或未甲基化核苷酸的基因座可以通过用修饰靶核酸分子核苷酸序列的试剂作为靶核酸分子甲基化状态的函数处理靶核酸分子、使用一个或多个引物扩增处理过的靶核酸分子、切割扩增产物、以及检测一个或多个被切割的产物来鉴定。在一个具体实施方式中，扩增方法包括甲基化特异性扩增例如甲基化特异性PCR。在另一个具体实施方式中，检测被切割产物的步骤是通过测定靶核酸分子片段的质量而实施的，例如通过质谱。在又一个具体实施方式中，一个或多个被切割产物的质量与参考核酸分子的一个或多个质量进行比较。

在另一个方法中，核酸分子中核苷酸基因座的甲基化状态可以通过用修饰靶核酸分子核苷酸序列的试剂作为靶核酸分子甲基化状态的函数处理靶核酸分子、使用一个或多个引物扩增处理过的靶核酸分子、切割扩增产物、以及检测一个或多个被切割的产物来确定。在一个具体实施方式中，扩增方法包括甲基化特异性扩增例如甲基化特异性PCR。在另一个具体实施方式中，检测被切割产物的步骤是通过测定靶核酸分子片段的质量而实施的，例如通过质谱。在又一个具体实施方式中，一个或多个被切割产物的质量与参考核酸分子的一个或多个质量进行比较。

鉴定甲基化或未甲基化核酸分子或核酸分子中甲基化或未甲基化核苷酸基因座的方法可以用于各种应用例如本文将进一步阐述的甲基化发现、疾病诊断、决定治疗模式以及生物体鉴定。

与疾病相关的甲基化核苷酸是甲基化胞嘧啶，例如5-甲基胞嘧啶。在某些情况下，存在甲基化胞嘧啶与疾病相关。在其他情况下，缺乏甲基化胞嘧啶或者存在未甲基化胞嘧啶与疾病相关。本文中提供的所述方法可以用来确定核酸分子是否含有甲基化或未甲基化胞嘧啶。本文中提供的方法也可以用来确定核酸分子甲基化或未甲基化胞嘧啶的基因座。本文中提供的方法还可以用来确定核酸分子中具体核苷酸基因座上的胞嘧啶是否是甲基化的。

1.样品

本文中描述的所述方法可以应用于多种来源的任何样品，用于多种目的中的任何一种。典型的，本文使用的方法可以用来确定受试者相关的信息或者确定核酸甲基化与疾病之间的联系。本文所描述的方法中使用的样品将根据应用的方法的目的而选择。例如，当将生物体的表现型与甲基化核酸分子或核苷酸基因座进行联系时，样品可以含有来自多种不同生物体的核酸。在另一个实施例中，样品可以含有一个个体的核酸，其中分析样品以确定疾病状态或个体的疾病趋势。本领域的技术人员可以利用本文描述的方法确定所需待分析样品。

a.来源

样品可以来自任何受试者，包括动物、植物、细菌、病毒、寄生虫、鸟类、爬行动物、两栖动物、真菌、鱼类以及其他植物和动物。哺乳动物包括在受试者中，典型的是人类。

来自于受试者的样品可以是任何形式，包括固态材料例如组织、细胞、细胞团、细胞提取物或活检，或者生物生物体液例如尿液、血液、组织间液、腹膜液、血浆、淋巴液、腹水、汗液、唾液、滤泡液、乳汁、非乳汁乳腺分泌物、血清、脑脊液、粪便、精液、肺部痰液、羊膜液、感染或炎症区的渗出物、含有颊细胞的漱口液、滑膜液或者由受试者产生的任何其他液态样品。另外，样品可以是收集的组织，包括骨髓、上皮、胃、前列腺、肾、膀胱、乳腺、结肠、肺、胰腺、子宫内膜、神经元以及肌肉。样品可以包括组织、器官以及病理样品诸如福尔马林固定石蜡包埋的样品。

b.制备

本领域的技术人员将认识到，某些样品可以直接用于本文所提供的方法中。例如，无需任何提高所需细胞或核酸分子纯度的纯化或处理步骤，样品即可利用本文描述的方法进行分析。

如需要，样品可以利用已知的技术进行制备，如Maniatis，et al.(Molecular Cloning：A Laboratory Manual，Cold Spring Harbor，N.Y.pp.280-281(1982))所描述的技术。例如，利用本文所描述的方法分析的样品可以在一个或多个纯化步骤中进行处理，以提高样品中所需要的细胞或核酸的纯度。如需要，固态物质可以与流体混合。

用于分离来自体内几乎任何生物体或组织或器官的样品以及来自培养细胞的样品中核酸的方法是众所周知的。例如，样品可以加以处理以均化器官、组织或细胞样品，并且细胞可以利用已知的溶解缓冲液、超声波降解法、电穿孔以及其方法和组合进行溶解。如需要本领域的技术人员将理解到，可以进行进一步的纯化。另外，样品制备可以包括多种试剂，其可以包括在随后步骤中。这些试剂包括例如盐类、缓冲液、中性蛋白(如白蛋白)、去垢剂以及这种可以用来促进优化杂交或酶促反应和/或降低非特异性或本底相互作用的试剂。另外，以其他方式提高分析效率的试剂，例如蛋白酶抑制剂、核酸酶抑制剂以及抗微生物制剂，可以根据样品制备方法以及靶核酸分子的纯度而采用。

2.靶核酸分子

本文提供的方法用来确定甲基化状态，包括靶核酸分子是含有甲基化还是含有未甲基化核苷酸、靶核酸分子中的核苷酸基因座是否是甲基化的以及靶核酸中甲基化或未甲基化核苷酸的核苷酸基因座。因此，在本文提供的方法中使用的靶核酸分子包括任何核酸分子。可以实施本文提供的一种或多种方法，以提供靶核酸分子中有关甲基化核苷酸的信息。

a.核酸类型

本文提供的方法允许采用纯化或非纯化形式的任何含核酸的样品或标本。因此，过程可以采用如DNA或RNA包括信使RNA，其中DNA或RNA可以是单链或双链。另外，可以分析各含有一条链的DNA-RNA杂交体。还可以采用核酸混合物，例如含有核苷酸类似物的核酸以及核糖核苷酸和脱氧核糖核苷酸的混合物。待分析的特异性核酸分子序列，即，靶核酸分子可以是较大分子的一部分或者初始作为分散的分子而存在，以便特异性靶核酸分子组成样品的全部核酸成分。待分析靶核酸分子初始不必以纯化的形式存在，它可以是复杂混合物的较小部分，例如可以包含在生物体全DNA中。将要确定其甲基化状态的靶核酸分子可以是独立的分子或者核酸分子混合物的一部分。待分析的靶核酸分子可以仅代表核酸分子复合物的一个较小部分。另外，靶核酸分子可以组成样品中多聚核苷酸的一部分或几乎全部。

b.靶核酸分子的结构或生物学作用

待分析的靶核酸分子可以包括基因组DNA或其一部分的一个或多个蛋白编码区。靶核酸分子可以含有一个或多个基因启动子区、一个或多个CpG岛、与染色质结构相关的一个或多个序列、或者细胞核酸的其他区域。靶核酸分子可以是甲基化或未甲基化的，可在单一核苷酸如胞嘧啶、或者小的核苷酸群如胞嘧啶富集序列、或者一个或多个CpG岛。

c.靶核酸分子的大小和组成

在本文方法中使用的靶核酸分子的长度可以根据靶核酸分子的序列、用于甲基化鉴定的具体方法以及所需要的具体甲基化状态的鉴定而变化，但典型的，其长度将限制于一个长度，本文披露的断裂以及检测方法可以用来鉴定靶核酸分子的一个或多个核苷酸基因座的甲基化状态。例如，靶核酸分子的长度可以限制在其中靶核酸分子的至少约1％、至少约3％、至少约5％、至少约10％、至少约20％、至少约30％、至少约40％、至少约50％、至少约60％、至少约70％、至少约80％、至少约85％、至少约90％、至少约95％、至少约98％、至少约99％或其全部的甲基化状态，其可以利用本文披露的断裂和检测方法进行测定。

在一个具体实施方式中，靶核酸分子的长度为其中两个或多个核苷酸基因座的甲基化状态可以进行鉴定，例如靶核酸分子的长度可以限制为这样的长度，其中正被分析的核苷酸基因座的至少约1％、至少约3％、至少约5％、至少约10％、至少约20％、至少约30％、至少约40％、至少约50％、至少约60％、至少约70％、至少约80％、至少约85％、至少约90％、至少约95％、至少约98％、至少约99％或其全部的甲基化状态均可以利用本文披露的断裂以及检测方法进行鉴定。例如，靶核酸分子的长度可以为至少约20、25、30、35、40、50、60、70、80、90、100、120、140、160、180、200、225、250、275、300、350、400、450、500、550、600、700、800、900、1000、1200、1400、1600、1800、2000、2500或3000个碱基。典型的，靶核酸分子的长度将不长于约10,000、5000、4000、3000、2500、2000、1500、1000、900、800、700、600、500、450、400、350、280、260、240、220、200、190、180、170、160、150、140、130、120、110或100个碱基。

利用本文披露的方法分析的靶核酸分子可以包括一个或多个甲基化的核苷酸，但不是必需含有任何甲基化的核苷酸。本文披露的方法可以用来鉴定靶核酸分子是否含有甲基化或未甲基化的核苷酸、并且还可以用来鉴定靶核酸分子中甲基化或未甲基化核苷酸的核苷酸基因座。

靶核酸分子或者靶核酸分子中核苷酸基因座的甲基化状态可以利用本文中提供的方法进行鉴定。甲基化的核苷酸可以成簇存在，从而一个核酸区域包含多个甲基化的核苷酸。另外，甲基化的核苷酸可以以单一、非成簇的基因座存在。靶核酸分子可以包括甲基化核苷酸簇可能存在的核酸区域的全部或一部分。靶核酸分子还可以包括其中仅一个核苷酸基因座能被甲基化的核酸区域。

基因组DNA中已经鉴定为甲基化的核苷酸是胞嘧啶。甲基化的胞嘧啶可以存在于基因组DNA多个区域中任何一个。本文提供的方法可以用来确定多个基因组DNA区域的任何一个中胞嘧啶的甲基化状态。例如，甲基胞嘧啶通常存在于命名为胞嘧啶-鸟嘌呤二核苷酸中。在一个具体实施方式中，对靶核酸分子中一个或多个CpG二核苷酸内的胞嘧啶核苷酸的甲基化状态进行鉴定，这种二核苷酸在基因组中某些区域被富集，其中这些富集区命名为CpG岛。CpG岛可以在某些基因的启动子区附近发现，包括用于肿瘤抑制基因、癌基因、发育调节基因以及管家基因的启动子区。因此，本文披露的方法可以用来鉴定靶核酸分子中CpG二核苷酸内的胞嘧啶核苷酸的甲基化状态，其中CpG核苷酸被定位于基因启动子区，例如肿瘤抑制基因、癌基因、发育调节基因以及管家基因的启动子区。本文披露的方法还可以用来鉴定靶核酸分子中CpG岛内的一个或多个胞嘧啶的甲基化状态

本文提供的方法可以用来鉴定多个核苷酸基因座的甲基化状态。因此，较大的靶核酸的一个或多个甚至全部核苷酸基因座的甲基化状态可以利用本文提供的方法进行鉴定。例如，整个CpG岛的多个核苷酸基因座甚至全部核苷酸基因座的甲基化状态可以利用本文提供的方法进行鉴定。

C.甲基化状态特异性序列修饰

核酸分子可以含有带有修饰的核苷酸，例如甲基化而不改变核酸分子的核苷酸序列。扩增含有这样修饰的核苷酸的核酸分子可以得到与非修饰的核苷酸互补的扩增产物，使得扩增产物不包含有关核苷酸修饰的信息。例如，含有甲基化胞嘧啶的核酸分子的扩增产物将导致扩增产物在甲基化胞嘧啶的位置上含有未修饰的鸟嘌呤(对互补链而言)或者未修饰的胞嘧啶。可以根据一个或多个核苷酸中修饰的存在或缺乏而修饰靶核酸分子的核苷酸序列的试剂是已知的，其中修饰本身不改变核苷酸序列。例如，重亚硫酸盐可以用于将未甲基化胞嘧啶转化为尿嘧啶的过程中，因此使得可以根据核酸分子中修饰的存在或缺乏而修饰靶核酸分子的核苷酸序列。

在实施本文所披露的方法中，用修饰靶核酸分子作为靶核酸分子甲基化状态的函数的试剂处理靶核酸分子。处理过的靶核酸分子序列可以具有反映未处理靶核酸分子的甲基化状态的所得序列。在一个具体实施方式中，试剂可以用来修饰未甲基化的选定的核苷酸以生成不同核苷酸。例如，试剂可以用来修饰未甲基化的胞嘧啶以生成尿嘧啶。在某些具体实施方式中，在一个反应容器(例如反应管)中，用一种或多种修饰试剂接触核苷酸，其中在反应容器中完成一个或多个扩增、切割和/或检测步骤。在这些具体实施方式中，修饰或未修饰核酸可以用一个反应容器进行检测。在某些具体实施方式中，核酸样品分到两个或多个反应容器中，其中反应容器中的一个用修饰试剂进行接触，而反应容器中的另一个不用修饰试剂进行接触。

1.用于序列修饰的试剂

用于修饰核酸分子的核苷酸序列的各种试剂在本领域是已知的，而且可以与本文提供的方法联合使用。试剂和条件例如已知的诱变剂或致突变制剂可以选自多种化合物或其他程序(procudure)。诱变性化学试剂包括甲磺酸甲酯(methylmethane sulfonate)、甲磺酸乙酯(ethylmethane sulfonate)、硫酸二乙酯、亚硝基胍(N-甲基-N’-硝基-N-亚硝基胍)、亚硝酸、二(2-氯乙基)硫醚、二(2-氯乙基)甲胺、2-氨基嘌呤、t-溴尿嘧啶、羟胺、亚硫酸氢钠、肼、甲酸以及亚硝酸钠。可以改变核酸分子的核苷酸序列的酶也可以用于本文提供的方法包括例如5-甲基胞嘧啶DNA糖苷酶。另外，某些条件例如高温、紫外照射、X辐射可以诱发核酸分子序列的变化。

用于确定核酸分子或核苷酸基因座甲基化状态的方法包括用可修饰靶核酸分子核苷酸序列的试剂，作为靶核酸分子甲基化状态的函数接触含有靶核酸分子的样品。例如，可以用修饰甲基化碱基如甲基化胞嘧啶的试剂接触靶核酸分子，从而可以在甲基化碱基例如甲基化胞嘧啶的位置上修饰靶核酸分子的核苷酸序列。可以采用修饰碱基的任何试剂。修饰甲基化碱基的示例性的试剂是5-甲基胞嘧啶DNA糖苷酶。还可以利用加热将甲基化胞嘧啶修饰成胸腺嘧啶。

在另一个实施例中，靶核酸分子可以用修饰未甲基化碱基而不是甲基化碱基的试剂进行接触，例如未甲基化胞嘧啶而不是甲基化胞嘧啶，于是靶核酸分子的核苷酸序列在未甲基化碱基的位置而不是甲基化碱基的位置被修饰，例如在未甲基化胞嘧啶的位置而不是甲基化胞嘧啶的位置。修饰未甲基化碱基而不是甲基化碱基的示例性试剂是重亚硫酸钠，其可以修饰未甲基化胞嘧啶而不是甲基化胞嘧啶。

用于修饰靶核酸分子在某种意义上反映靶核酸分子的甲基化模式的方法在本领域中是已知的，如在美国专利5,786,146号以及美国专利公开20030180779号和20030082600号中所例证的。

2.用重亚硫酸盐修饰胞嘧啶

在一个具体实施方式中，试剂可以用来将未甲基化胞嘧啶修饰成尿嘧啶。用于将未甲基化胞嘧啶修饰成尿嘧啶的示例性试剂是重亚硫酸钠。重亚硫酸钠(NaHSO₃)与胞嘧啶的5，6-双键反应，以形成易于脱氨的磺化胞嘧啶反应的中间产物，以生成磺化尿嘧啶。磺化尿嘧啶的磺化基团在碱性条件下可以去除，导致尿嘧啶的形成。尿嘧啶是作为胸腺嘧啶被DNA聚合酶例如Taq聚合酶识别，因此，用诸如PCR的方法扩增靶核酸分子时，得到的被扩增的靶核酸分子在起始模板靶核酸分子中未甲基化胞嘧啶存在的位置上含有胸腺嘧啶，而互补链在与起始靶核酸分子中未甲基化胞嘧啶存在的位置相互补的位置上含有胞嘧啶。另外，诸如PCR的扩增方法可以产生含有胞嘧啶的被扩增的靶核酸分子，其中起始靶核酸分子含有5-甲基胞嘧啶，而互补链在与起始靶核酸分子中甲基化胞嘧啶存在的位置相互补的位置上含有鸟嘌呤。因此，在诸如PCR的扩增方法中，扩增产物中的胞嘧啶可以标记5-甲基胞嘧啶的位置，而扩增产物中的胸腺嘧啶可以标记未甲基化胞嘧啶的位置。类似的，在与被处理的靶核酸分子互补的扩增产物链中，鸟嘌呤可以标记5-甲基胞嘧啶的位置而腺嘌呤可以标记未甲基化胞嘧啶的位置。

用重亚硫酸盐处理靶DNA的示例性方法可以包括：用还可以含有尿素和对苯二酚的重亚硫酸盐溶液的接触变性的DNA，以及孵育混合物20个循环，每个循环为95℃、30秒以及55℃、15min。另一个可替换的方法中，重亚硫酸盐处理可以在琼脂糖中实施，并且沉淀步骤可以用透析步骤取代(6,214,556号美国专利以及Olek et al.Nucl.Acids Res.24：5064-66(1996))。重亚硫酸盐处理靶核酸分子的变异在本领域是已知的，如在美国专利5,786,146和6,214,556号、美国专利公开20030082600号、Tost et al.Nucl.Acids.Res.31：e50(2003)、Olek et al.Nucl.Acids Res.24：5064-66(1996)以及Grunau et al.Nucl.Acids Res.29：e65(2001)中所例证的。

3.所得的核酸分子

在本文提供的方法中，与处理前靶核酸分子的核苷酸序列相比，经甲基化特异性试剂处理的靶核酸分子可以具有不同的核苷酸序列。因为甲基化特异性试剂作为靶核酸分子的甲基化状态的函数而修饰靶核酸分子的核苷酸序列，处理过的核酸分子将含有与未处理的靶核酸分子相关的核苷酸序列，其能反映未处理的靶核酸分子的甲基化状态。

D.扩增处理过的靶核酸分子

本文提供的方法还可以包括利用一个或多个引物扩增处理过的靶核酸分子的步骤。在一个具体实施方式中，至少一个引物是甲基化特异性引物。在另一个具体实施方式中，引物含有与利用甲基化特异性试剂处理的核苷酸互补的一个或多个核苷酸。例如，重亚硫酸盐是胞嘧啶特异性的；当使用重亚硫酸盐时，在鉴定甲基化核苷酸的方法中使用的引物可以含有一个或多个鸟嘌呤核苷酸。扩增方法可以用来选择性扩增与引物互补的靶核酸分子，而不扩增核酸样品中的一个或多个其它核酸分子。

1.甲基化特异性引物

甲基化特异性引物，本文中还可称为甲基化状态特异性引物，设计用来根据未处理的靶核酸分子中的一个或多个核苷酸的甲基化状态区分处理过的靶核酸分子的核苷酸序列。例如，甲基化特异性引物可以被设计为与来自含有甲基化核苷酸的靶核酸分子的经试剂处理的靶核酸分子的核苷酸序列杂交，优于与来自含有未甲基化核苷酸的靶核酸分子的经试剂处理的靶核酸分子的核苷酸序列杂交。在另一个实施例中，甲基化特异性引物可以被设计为与来自含有未甲基化核苷酸的靶核酸分子的经试剂处理的靶核酸分子的核苷酸序列杂交，优于与来自含有甲基化核苷酸的靶核酸分子的经试剂处理的靶核酸分子的核苷酸序列杂交。

在核苷酸合成反应可以发生的条件下，用于扩增样品中处理过的靶核酸分子的引物可以与处理过的靶核酸分子杂交。典型的，可以实施两个或多个核苷酸合成反应循环以生成足够量的用于后续步骤包括断裂和检测的靶核酸分子。在利用甲基化特异性引物选择性扩增靶核酸分子的方法中，在扩增方法中使用的至少一种引物将是甲基化特异性的。在一些具体实施方式中，在扩增方法中使用的两种引物将均是甲基化特异性的。

在一个具体实施方式中，由甲基化的未处理靶核酸分子形成的经处理靶核酸分子的扩增优于由未甲基化的未处理靶核酸分子形成的经处理靶核酸分子。例如，甲基化特异性引物可以特异性杂交到由甲基化靶核酸分子形成的经处理的靶核酸分子上，而甲基化特异性引物并不选择性杂交到由未甲基化靶核酸分子形成的经处理的靶核酸分子上。在另一个具体实施方式中，由未甲基化未处理的靶核酸分子形成的经处理靶核酸分子的扩增优先于由甲基化未处理的靶核酸形成的经处理靶核酸分子。例如，甲基化特异性引物可以特异性杂交到由未甲基化靶核酸分子形成的经处理靶核酸分子上，而甲基化特异性引物并不选择性杂交到由甲基化靶核酸分子形成的经处理靶核酸分子上。

在另一个具体实施方式中，形成自在一个或多个选定的核苷酸基因座上含有甲基化核苷酸的未处理靶核酸分子的经处理靶核酸分子的扩增优于形成自在一个或多个选定的核苷酸基因座上含有未甲基化核苷酸的未处理靶核酸分子的经处理靶核酸分子。例如，甲基化特异性引物可以特异性杂交到形成自在一个或多个选定的核苷酸基因座上含有甲基化核苷酸的靶核酸分子的经处理靶核酸分子上，而甲基化特异性引物并不选择性杂交到形成自在一个或多个选定的靶核苷酸基因座上不含有甲基化核苷酸的经处理靶核酸分子上。在另一个具体实施方式中，形成自在一个或多个选定的核苷酸基因座上含有未甲基化核苷酸的未处理靶核酸分子的经处理靶核酸分子的扩增优于形成自在一个或多个选定的核苷酸基因座上含有甲基化核苷酸的未处理靶核酸分子的经处理靶核酸分子。例如，甲基化特异性引物可以特异性杂交到形成自在一个或多个选定的核苷酸基因座上含有未甲基化核苷酸的经靶核酸分子的经处理靶核酸分子上，而甲基化特异性引物并不选择性杂交到形成自在一个或多个选定的靶核苷酸基因座上不含有未甲基化核苷酸的靶核酸分子的经处理靶核酸分子上。

a.甲基化特异性引物的设计

设计甲基化特异性引物以用来根据未处理的靶核酸分子中的一个或多个核苷酸的甲基化状态区分处理过的靶核酸分子的核苷酸序列。例如，甲基化特异性引物可以设计为与来自未甲基化核苷酸的处理过的靶核酸分子进行选择性杂交。甲基化特异性引物也可以设计为与来自甲基化靶核酸分子的处理过的靶核酸分子进行选择性杂交。甲基化特异性引物还可以设计为结合到处理过的靶核酸分子的预先确定的核苷酸序列上，其中预先确定的核苷酸序列可以源自甲基化或未甲基化的靶核酸分子。

甲基化特异性引物的设计将受到期望选择性扩增的靶核酸分子的核苷酸甲基化状态的影响(例如，选择扩增含有甲基化核苷酸基因座的靶核酸分子，而不扩增含有未甲基化核苷酸基因座的靶核酸分子)，还受到作为靶核酸分子甲基化状态的函数修饰靶核酸分子的核苷酸序列的试剂的影响(例如重亚硫酸盐，其可以用来将未甲基化胞嘧啶转化为尿嘧啶)。例如，设计用来扩增经重亚硫酸盐处理的含有甲基化胞嘧啶的靶核酸分子的引物通常含有一个或多个鸟嘌呤核苷酸。甲基化特异性引物的设计还受到对靶核酸分子上引物杂交区的核苷酸序列的任何了解的影响。例如，当已知靶核酸分子的全部核苷酸序列时，引物杂交位点可以通过设计含有与预定义位点互补的核苷酸序列的引物而选择。

在一个实施例中，甲基化特异性引物设计用来选择性结合靶核酸分子，其预定义位点未被甲基化状态特异性试剂修饰，有利于具有被甲基化状态特异性试剂修饰的预定义位点的靶核酸分子。在另一个实施例中，一个或多个甲基化特异性引物可以选择性结合靶核酸分子，其未被甲基化状态特异性试剂修饰的预定位点，优于具有被甲基化状态特异性试剂修饰的预定义位点的靶核酸分子。

b.引物组成

本文披露的方法中使用的引物具有足够的长度以及适当的序列，以允许利用靶核酸分子模板进行特异性引物延伸。典型的，引物被设计为与待扩增的靶核酸分子的每一条链互补。引物可以为寡脱氧核糖核苷酸、寡核糖核苷酸、或既含有脱氧核糖核苷酸又含有核糖核苷酸的寡核苷酸；在某些具体实施方式中，引物可以含有一个或多个核苷酸类似物。引物的长度可以根据多个因素中的任何一个而变化，所述因素包括温度、缓冲液、所需要的选择性以及核苷酸组成。引物可以含有至少约5、8、10、15、20、25、30、40、50、60、70或80个核苷酸，并且典型的含有不多于约120、110、100、90、70、60、50、40、30、20或10个核苷酸。

在一个具体实施方式中，在核酸合成方法中使用的引物还可以包含不与靶核酸分子杂交的成分(moiety)。这种成分可以包括多种化合物或混合物中的任何一个，而且可以发挥多种功能中的任何一个。例如，这种成分可以是不与靶核酸分子杂交的另外的核苷酸例如转录起始序列。成分还可以是利于引物或引物所整合入的核酸的鉴定或分离的成分。这种成份可以是，例如可结合成分例如生物素、多组氨酸、磁性珠子或其他用于特异性结合的混合物或化合物。这种成份还可以是荧光化合物、含有放射性核素的化合物、胶体金属、量子点或其他用于检测的混合物或化合物。

本文使用的寡核苷酸引物可以利用任何合适的方法制备，例如传统的磷酸二酯和磷酸三酯法或者其自动化的具体实施方式。在一个这样的自动化具体实施方式中，二乙基亚磷酰胺用作起始物质，并且可以如通过Beaucage，et al.Tetrahedron Letters 22：1859-1862(1981)所描述的进行合成。在固态支持物上用于合成寡核苷酸的方法在本领域中是已知，如美国专利4,458,066号中所例证的。

c.引物结合区

按照所披露的扩增和核酸合成法而使用的引物可以特异性杂交到靶核酸分子上。典型的，甲基特异性引物可以特异性杂交到具有预定义或预先确定序列的靶核酸分子上。靶核酸分子上甲基化特异性引物特异性杂交的部分可以命名为引物检测区(query region)。

在本文提供的方法中，靶核酸分子的核苷酸序列可以作为靶核酸分子的甲基化状态的函数而被修饰。因此，相应于未处理靶核酸分子区域的甲基化状态，经甲基化特异性试剂处理的靶核酸分子的引物检测区可以是其核苷酸序列反映未处理靶核酸分子中该区域甲基化状态的引物检测区。例如，在第4位核苷酸含有甲基胞嘧啶而第7位核苷酸含有未甲基化胞嘧啶的未处理靶核酸分子的区域可以用重亚硫酸盐处理，可以将第7位核苷酸的胞嘧啶转化为尿嘧啶而不改变第4位核苷酸的甲基胞嘧啶，因此，相应于在第4位核苷酸含有甲基胞嘧啶而第7位核苷酸含有未甲基化胞嘧啶的未处理靶核酸分子的区域的处理过的靶核酸分子的引物检测区以及与这个引物检测区互补的引物，将在与第4位核苷酸互补的基因座上含有腺嘌呤而与第7位核苷酸互补的基因座上含有鸟嘌呤。

在本文披露的甲基化特异性扩增方法的一个具体实施方式中，当引物检测区含有与甲基化特异性引物互补的序列时，甲基化特异性引物可以特异性杂交到靶核酸分子的引物检测区上。另外，与此具体实施方式相一致，当引物检测区不含有与甲基化特异性引物互补的序列时，甲基化特异性引物则不可以特异性杂交到靶核酸分子的引物检测区上。例如，含有一个或多个甲基化基因座的靶核酸分子可以用重亚硫酸盐处理，且处理过的靶核酸分子的引物检测区可以含有一个或多个胞嘧啶核苷酸；甲基化特异性引物可以设计为与处理过的靶核酸分子的引物检测区中存在的一个或多个胞嘧啶核苷酸特异性杂交，而引物因此可以与处理过的甲基化靶核酸分子的引物检测区特异性杂交。类似的，在另一个实施例中，含有一个或多个未甲基化基因座的靶核酸分子可以用重亚硫酸盐处理，且处理过的靶核酸分子的引物检测区可以不含有胞嘧啶核苷酸；甲基化特异性引物可以设计为与处理过的靶核酸分子的引物检测区中存在的一个或多个胞嘧啶核苷酸特异性杂交，而引物因此可以不与处理过的未甲基化靶核酸分子特异性杂交。

在另一个实施例中，含有一个或多个未甲基化基因座的靶核酸分子可以用重亚硫酸盐处理，且处理过的靶核酸分子的引物检测区可以包含一个或多个尿嘧啶核苷酸；甲基化特异性引物可以设计为与处理过的靶核酸分子的引物检测区中存在的一个或多个尿嘧啶核苷酸特异性杂交，而引物因此可以与处理过的未甲基化靶核酸分子的引物检测区特异性杂交。类似的，在另一个实施例中，含有一个或多个甲基化基因座的靶核酸分子可以用重亚硫酸盐处理，且处理过的靶核酸分子的引物检测区可以不含有尿嘧啶核苷酸；甲基化特异性引物可以设计为与处理过的靶核酸分子的引物检测区中存在的一个或多个尿嘧啶核苷酸特异性杂交，而引物因此可以不与处理过的甲基化靶核酸分子特异性杂交。本文提供的方法可以用来确定靶核酸分子的非引物检测区的甲基化状态。本文提供的方法也可以用来确定靶核酸分子的非引物检测区中一个或多个核苷酸基因座的甲基化状态。本文提供的方法可以用来确定靶核酸分子中非引物检测区中甲基化或未甲基化核苷酸的基因座。在一个实施例中，靶核酸分子的非引物检测区可以含有一个或多个胞嘧啶核苷酸；鉴定处理过的靶核酸分子的非引物检测区含有一个或多个胞嘧啶核苷酸可以用来鉴定靶核酸分子的非引物检测区含有一个或多个甲基化核苷酸。在另一个实施例中，处理过的靶核酸分子的非引物检测区中一个或多个核苷酸基因座可以鉴定为含有胞嘧啶核苷酸；在这种鉴定中，靶核酸分子的非引物检测区中的一个或多个核苷酸基因座可以鉴定为甲基化。本文提供的方法还可以用来确定甲基化胞嘧啶核苷酸的基因座。

在另一个实施例中，靶核酸分子的非引物检测区可以含有一个或多个尿嘧啶核苷酸；鉴定处理过的靶核酸分子的非引物检测区含有一个或多个尿嘧啶核苷酸可以用来鉴定靶核酸分子的非引物检测区含有一个或多个未甲基化核苷酸。在另一个实施例中，处理过的靶核酸分子的非引物检测区中一个或多个核苷酸基因座可以鉴定为含有尿嘧啶核苷酸；在这种鉴定中，处理过的靶核酸分子的非引物检测区中的一个或多个核苷酸基因座可以鉴定为未甲基化。本文提供的方法还可以用来确定未甲基化胞嘧啶核苷酸的基因座。

因此，本文提供的方法可以用来鉴定靶核酸分子非引物检测区的甲基化状态，可以用来鉴定靶核酸分子非引物检测区中一个或多个核苷酸基因座的甲基化状态，以及还可以用来确定甲基化或未甲基化核苷酸的基因座。

在一个具体实施方式中，靶核酸分子的引物检测区可以含有一个或多个胞嘧啶核苷酸。典型的，当甲基化靶核酸分子用甲基化特异性试剂例如重亚硫酸盐进行处理时，未甲基化胞嘧啶核苷酸可以被转化为尿嘧啶，而甲基化胞嘧啶核苷酸则不然。因此，用重亚硫酸盐处理的甲基化靶核酸分子可以含有一个或多个胞嘧啶核苷酸，其中胞嘧啶核苷酸与未处理的靶核酸分子中的甲基化胞嘧啶核苷酸相对应。在一个具体实施方式中，一个或多个胞嘧啶核苷酸定位于靶核酸分子的引物检测区5’末端附近。例如，引物检测区的5’一半可以含有一个或多个胞嘧啶核苷酸，其中5’一半指的是包括引物检测区5’末端和引物检测区的中点并介于二者之间的核苷酸。在另一个具体实施方式中，靶核酸分子的引物检测区在其5’末端含有胞嘧啶核苷酸。

类似的，与处理过的靶核酸分子互补的扩增产物的引物检测区可以含有一个或多个鸟嘌呤核苷酸。在一个具体实施方式中，一个或多个鸟嘌呤核苷酸定位于互补性扩增产物的引物检测区5’末端附近。例如，引物检测区的5’一半可以含有一个或多个鸟嘌呤核苷酸，其中5’一半指的是包括引物检测区5’末端和引物检测区的中点并介于二者之间的核苷酸。在另一个具体实施方式中，互补性扩增产物的引物检测区在其5’末端含有鸟嘌呤核苷酸。

在另一个具体实施方式中，靶核酸分子的引物检测区可以含有一个或多个尿嘧啶核苷酸。经重亚硫酸盐处理的含有一个或多个未甲基化胞嘧啶的靶核酸分子可以含有一个或多个尿嘧啶核苷酸，其中至少某些尿嘧啶核苷酸可以对应于未处理靶核酸分子中的未甲基化胞嘧啶核苷酸。在一个具体实施方式中，一个或多个尿嘧啶核苷酸定位于靶核酸分子的引物检测区5’末端附近。例如，引物检测区的5’一半可以含有一个或多个尿嘧啶核苷酸。在另一个具体实施方式中，靶核酸分子的引物检测区在其5’末端含有尿嘧啶核苷酸。

类似的，与处理过的靶核酸分子互补的扩增产物的引物检测区中可以含有一个或多个腺嘌呤核苷酸。在一个具体实施方式中，一个或多个腺嘌呤核苷酸定位于互补性扩增产物的引物检测区5’末端附近。例如，引物检测区的5’一半可以含有一个或多个腺嘌呤核苷酸。在另一个具体实施方式中，互补性扩增产物的引物检测区在其5’末端含有腺嘌呤核苷酸。

靶核酸分子包含与甲基化特异性引物特异性杂交的一个或多个引物检测区，还可以包含一个或多个非引物检测区。非引物检测区是不能发挥甲基化特异性扩增作用的靶核酸分子的一部分。例如，非引物检测区可以是不能与甲基化特异性引物特异性杂交靶核酸分子的区域。靶核酸分子的非引物检测区可以包含位于两个引物检测区之间，但引物检测区不包括在内的靶核酸分子的一部分；例如，非引物检测区还可以位于引物杂交区之间，但该引物杂交区不包括在内，以及还可以位于甲基化特异性引物杂交区之间，并且不甲基化特异性引物杂交区。本文还有一些预期的方法，其中第一引物是甲基化特异性引物，而第二引物则不是(即：第二引物不与处理过的靶核酸分子选择性杂交，作为未处理靶核酸分子甲基化状态的函数)。在这些方法中，未甲基化特异性引物检测区包括位于引物杂交区之间的区域，还包括第二(未甲基化特异性)引物杂交的区域。

d.含有C或G核苷酸的引物

根据引物的预期用途，甲基化特异性引物可以包含核苷酸的任何组合。如本领域的技术人员将理解，引物可以包含多个区域，其包括一个或多个不与靶核酸分子杂交的区域(例如，转录起始序列)。因此，除非另有指明，论及有关引物的核苷酸组成指的是与靶核酸分子杂交的区域的核苷酸组成，而不指不与核酸分子杂交的引物区域的核苷酸组成。在一个实施例中，甲基化特异性引物可以含有一个或多个鸟嘌呤核苷酸(即：靶核酸分子结合区含有一个或多个鸟嘌呤核苷酸)。甲基化特异性引物可以含有一个或多个胞嘧啶核苷酸(即：靶核酸分子结合区含有一个或多个胞嘧啶核苷酸)。处理过的靶核酸分子或其具有相同核苷酸序列的扩增产物，可以含有一个或多个胞嘧啶核苷酸。与这种处理过的靶核酸分子或其扩增产物互补的甲基化特异性引物可以含有一个或多个鸟嘌呤核苷酸。与处理过的靶核酸分子互补的扩增产物可以含有一个或多个鸟嘌呤核苷酸。与这种扩增产物互补的甲基化特异性引物可以含有一个或多个胞嘧啶核苷酸。

在另一个实施例中，甲基化特异性引物可以含有一个或多个胸腺嘧啶或尿嘧啶核苷酸(即：靶核酸分子结合区含有一个或多个胸腺嘧啶或尿嘧啶核苷酸)。甲基化特异性引物可以含有一个或多个腺嘌呤核苷酸(即：靶核酸分子结合区含有一个或多个腺嘌呤核苷酸)。处理过的靶核酸分子或其具有相同核苷酸序列的扩增产物，可以含有一个或多个胸腺嘧啶或尿嘧啶核苷酸。与这种处理过的靶核酸分子或其扩增产物互补的甲基化特异性引物可以含有一个或多个腺嘌呤核苷酸。与处理过的靶核酸分子互补的扩增产物可以含有一个或多个腺嘌呤核苷酸。与这种扩增产物互补的甲基化特异性引物可以含有一个或多个胸腺嘧啶或尿嘧啶核苷酸。

在一个具体实施方式中，其中重亚硫酸盐用作处理靶核酸分子的试剂，该靶核酸分子可以含有很少的甲基化胞嘧啶，由于一条链的引物中大多数缺乏C，而互补链的引物中大多数缺乏G，因而甲基化特异性引物的序列中含有相对较少的C或G，由于未甲基化C被修饰成U(尿嘧啶)，在扩增产物中作为T(胸腺嘧啶)扩增，因此被扩增的互补链将在对应于扩增C的每个位点上用A取代G。

在其他具体实施方式中，靶核酸分子可以包含多个未甲基化的胞嘧啶。在这些具体实施方式中，甲基化特异性引物的序列中可以包含相当少、相当多、或任何相对之间的数量的C或G。

在一个具体实施方式中，引物可以设计为减少来自非特异性杂交的扩增可能性。一个或多个鸟嘌呤核苷酸可以定位于引物3’末端附近。例如，引物3’一半可以含有一个或多个鸟嘌呤核苷酸，其中3’一半指的是包括引物3’末端和引物中点并介于二者之间的核苷酸。靶核酸分子或其扩增产物可以含有这种引物与其特异性杂交的一个或多个胞嘧啶核苷酸。在某些条件下，引物可以非特异性杂交到不含有一个或多个胞嘧啶核苷酸的核酸分子上。然而，3’一半含有一个或多个鸟嘌呤核苷酸的引物将在其3’一半具有一个或多个错配的碱基对。由于引物延伸发生在3’末端，因此相对于在5’末端同等程度的错配，在3’末端或其附近(即，在3’一半之上)的错配碱基对可以降低引物延伸的可能性。因此，使用在引物3’一半内含有一个或多个鸟嘌呤核苷酸的引物将增加特异性杂交的引物而非错配的引物延伸的可能性。在另一个具体实施方式中，当与处理过的靶核酸分子互补的扩增产物被杂交到引物上时，一个或多个胞嘧啶核苷酸可以位于引物3’末端附近。例如，引物的3’一半可以含有一个或多个胞嘧啶核苷酸。

在另一个具体实施方式中，当甲基化特异性引物用来选择性扩增未甲基化靶核酸时，一个或多个腺嘌呤核苷酸可以位于引物3’末端附近。例如，引物的3’一半可以含有一个或多个腺嘌呤核苷酸。类似的，当与处理过的靶核酸互补的扩增产物被杂交到引物时，一个或多个胸腺嘧啶或尿嘧啶核苷酸可以位于引物3’末端附近。例如，引物的3’一半可以含有一个或多个胸腺嘧啶或尿嘧啶核苷酸。

在另一个具体实施方式中，甲基化特异性引物的3’核苷酸可以特异性区分在一个基因座上为甲基化的处理过的靶核酸分子以及在该基因座上为未甲基化的处理过的靶核酸分子，通过在引物3’末端选择性杂交来自甲基化核苷酸的核苷酸。例如，甲基化特异性引物在其3’末端可以含有鸟嘌呤(G)，而且一旦与靶核酸分子杂交，在与引物3’G核苷酸基因座相应的位置上存在C核苷酸，引起靶核酸分子的扩增，然而在与引物3’G核苷酸基因座相应的位置上存在U或T核苷酸，则不能导致靶核酸分子的扩增。在另一个实施例中，甲基化特异性引物在其3’端可以含有C，而且一旦与靶核酸分子杂交，在与引物3’C核苷酸基因座相应的位置上存在G核苷酸，可以引起靶核酸分子的扩增，然而在与引物3’G核苷酸基因座相应的位置上存在A核苷酸则不能导致靶核酸分子的扩增。

在另一个具体实施方式中，在引物3’末端，引物可以用来与来自未甲基化核苷酸的核苷酸选择性杂交。例如，甲基化特异性引物在其3’末端可以含有腺嘌呤(A)，而且一旦与靶核酸分子杂交，在与引物3’G核苷酸基因座相应的位置存在T或U核苷酸可以引起靶核酸分子的扩增，然而在与引物3’G核苷酸基因座相应的位置存在C核苷酸则不能导致靶核酸分子的扩增。在另一个实施例中，甲基化特异性引物在其3’末端可以含有T或U，而且一旦与靶核酸分子杂交，在与引物3’C核苷酸基因座相应的位置存在A核苷酸可以引起靶核酸分子的扩增，然而在与引物3’G核苷酸基因座相应的位置存在G核苷酸则不能导致靶核酸分子的扩增。

2.核酸合成方法

本文描述的或本领域已知的甲基化特异性引物，可以用于根据靶核酸分子的甲基化状态特异性扩增靶核酸分子的方法中，因此，用来选择性增加样品中靶核酸分子的量。甲基化状态特异性引物的扩增产物可以按照本文提供的断裂及片段检测方法分析其进一步的甲基化信息。利用一个或多个甲基化特异性引物，甲基化状态特异性扩增方法包括一个或多个核酸合成步骤。在一个具体实施方式中，利用一个甲基化特异性引物和一个不根据靶核酸分子甲基化状态而特异性结合的引物，可以实施甲基化特异性扩增。在另一个具体实施方式中，利用两个甲基化特异性引物实施甲基化特异性扩增。在另一个具体实施方式中，可以在进行甲基化特异性扩增之前实施预扩增步骤。

根据本文所披露的方法，靶核酸序列可以用作一步或多步核酸合成的模板。核酸合成步骤可以包括引物延伸、DNA复制、聚合酶链式反应(PCR)、逆转录、逆转录聚合酶链式反应(RT-PCR)、滚环扩增、全基因组扩增、链置换扩增(SDA)以及基于转录的反应。

a.预扩增

在一个具体实施方式中，在利用甲基化特异性引物进行核酸合成步骤之前，可以实施一个扩增步骤，该步骤可以扩增一个或多个核酸分子而不区分甲基化和未甲基化核酸分子或基因座。例如，当样品中的核酸量很低时可以实施这种扩增步骤；通过不区分样品中甲基化靶核酸分子和未甲基化靶核酸分子或其他核酸的预扩增步骤，可以改善甲基化靶核酸分子的检测。典型的，在用试剂处理核酸样品之后，可以实施这种扩增步骤，而试剂可以作为核酸分子的甲基化状态的函数而修饰核酸分子的核苷酸序列。尽管这种方法不根据甲基化状态区分，然而，在这种预扩增步骤中使用的引物可以用来增加样品中待分析的特定靶核酸区域核酸分子相对于核酸总量的量。例如，引物可以设计为与靶核酸分子的预先确定区杂交，以便增加样品中靶核酸分子的相对量，而不根据靶核酸分子的甲基化状态扩增靶核酸分子。本领域的技术人员可以根据多个已知因素确定在这种预扩增步骤中使用的引物，并且包括预扩增步骤的预期选择性以及任何已知的核苷酸序列信息。

b.互补链的合成

在利用双链核酸分子的核酸合成方法中，在任何核酸合成步骤之前首先分离链。在链分离之后，一个或多个引物可以杂交到一个或多个处理过的待扩增的单链核酸分子上，并实施核苷酸合成以向每条引物添加核苷酸，以形成与靶核酸分子的链互补的链。在一个具体实施方式中，可以进行核酸合成以选择性扩增处理过的核酸分子两条链中的一条。在另一个具体实施方式中，合成与处理过的双链靶核酸分子的每条链互补的链的步骤可以在两条或多条引物存在时实施，以便至少一条引物可以杂交到每一条链，从而引导加合性核苷酸合成。

在利用单链核酸分子进行核酸合成的方法中，引物可以杂交到待扩增的单链核酸分子上，并可以实施核苷酸合成以向引物上添加核苷酸，以形成与单链核酸分子互补的链。在一个具体实施方式中，合成与单链核酸分子互补的链的步骤在存在两条或多条引物时实施，以便一条引物可以杂交到靶核酸分子链的核苷酸序列上，并且一条引物可以杂交到合成的互补链上并引导加成性核苷酸合成。例如，在合成互补链后，可以立即进行核酸分子的PCR扩增而无需进一步处理样品。

c.将首次扩增步骤与后期步骤分离

在另一个具体实施方式中，合成与单链核酸分子互补的链的步骤可以单独实施，通过加成性核苷酸合成反应。例如，可以合成互补链以形成双链核酸分子，而在扩增双链核酸分子之前，样品可以经历一个或多个中间步骤。中间步骤可以包括多个处理核酸样品的方法中任何一个，包括增加核酸分子的纯度、去除多余引物、改变反应条件(例如缓冲液条件、样品中存在的酶或反应物)以及其他参数。在一个实施例中，样品可以经历核酸分子的一个或多个纯化步骤。例如，用来生成与核酸分子互补的链的引物在其5’末端可以含有一个基团(moiety)，该基团允许鉴定或分离引物或将引物引入核酸内。这种基团可以为，例如，可结合成分(moiety)例如生物素、多组氨酸、磁性珠子或其他合适的底物，由此用可结合成分的结合性配偶体接触样品可以得到引物已引入的核酸分子内的选择性结合。这种选择性结合可以用来从样品杂质中分离核酸分子，从而增加核酸分子的纯度。在实施一个或多个中间步骤例如增强纯度的步骤之后，核酸分子可以根据本文提供的方法以及本领域已知的方法进行扩增。

在这种具体实施方式的一个变通例中，在合成互补链之后，一个或多个第二甲基化特异性引物可以杂交到在前述步骤中合成的互补链上，并进行核酸合成。例如，当第一甲基化特异性引物特异性杂交到靶核酸分子上时，而靶核酸分子在第一甲基化特异性引物不与其杂交的区域含有不同核苷酸序列，可以适使用这种具体实施方式。通过利用不同的第二甲基化特异性引物，可以分离含有不同核苷酸序列的靶核酸分子。例如，根据核酸分子中第二位置上的序列，可以利用可结合基团与第二引物的粘附而分离核酸分子。在另一个变通例中，第一扩增步骤的产物可以分成两份或更多份，并且可以将不同的第二引物加入到每一份中，其中第二引物的部分或全部可以是甲基化特异性引物。利用两个或多个为甲基化特异性引物的第二引物的具体实施方式，可以用来在多个不同的第二引物检测区上甲基化特异性扩增靶核酸。

d.反应参数

在形成与单链靶核酸分子互补的链后，可以实施随后的靶核酸分子扩增步骤，其中互补链被分离，引物被杂交到链上，并且引物添加到核苷酸上以形成新的互补链。链分离可以作为独立的步骤实现，或者与引物延伸产物的合成同时进行。这种链分离可以利用多种合适的变性条件完成，包括物理、化学或酶促途径，所述“变性”包括所有这种途径。分离核酸链的一种物理方法涉及加热靶核酸分子直到其变性。典型的热变性可以涉及温度在约80℃～105℃的范围内，时间在约1～10的范围内。链分离还可以通过化学途径实现，包括高盐条件或者强碱条件。链分离还可以通过来自已知为解旋酶的一类酶的酶诱导，或被RecA酶诱导，其中RecA酶具有解旋酶活性，已知在存在riboATP时可使DNA变性。适合于通过解旋酶的核酸链分离的反应条件通过Kuhn Hoffmann-Berling，CSH-Quantitative Biology，43：63(1978)描述，应用RecA的技术在Ann.Rev.Genetics 16：405-437(1982)进行综述。

在每种扩增步骤后，扩增产物将是双链，其中一条链与另一条链互补。互补的链可以分离，而且两条分离的链均可以用作合成加成性核酸链的模板。这种合成可以在允许引物杂交到模板的条件下进行。通常合成在缓冲的水相溶液中进行，典型的在pH值约为7～9例如pH值约为8。典型的，可以将过量摩尔数的两种寡核苷酸引物加入到含有分离的模板链的缓冲液中。在某些具体实施方式中，靶核酸的量是未知的(例如，当本文披露的方法用于诊断性应用时)，因此不能肯定地确定引物的量相对于互补链的量。

在一个示例性的方法中，三磷酸脱氧核糖核苷酸dATP、dCTP、dGTP和dTTP可以独立或与引物一起加入到合成混合物中，并且所得的溶液可以加热到约90℃～100℃，持续约1～10min，典型的为1～4min。在这种加热阶段后，溶液可以冷却到约室温。冷却的混合物可以加入用于实现引物延伸反应的适当的酶(本文称为“用于聚合作用的酶”)，并且反应可以在本领域已知的条件下进行。这种合成(或扩增)反应可以在室温直到一个高于该温度则聚合作用不能发生的温度下进行。例如，如果酶是热稳定的，则用于聚合作用的酶还可以在高于室温的温度下使用。在一个具体实施方式中，扩增方法是利用如在本文描述的以及本领域技术人员通常使用的PCR。可替换的扩增方法已经被描述且可以应用。用于此目的多种合适的酶在本领域中是已知的，包括例如E.coli DNA聚合酶I、E.coli DNA聚合酶I的Klenow片段、T4 DNA聚合酶以及其他可用的DNA聚合酶、聚合酶突变蛋白质、逆转录酶、以及其他酶包括热稳定酶(即，在温度升高时可以进行引物延伸的酶，典型的，升高的温度可以引起待扩增的核酸变性)。

e.修饰的三磷酸核苷

在一个具体实施方式中，根据本文披露的方法或本领域已知的方法进行的核酸合成反应可以利用一种或多种三磷酸核苷。修饰可以例如赋予或者改变通过各自切割方法的靶核酸分子的切割特异性，或者可以改变被切割的靶核酸分子的检测。例如，三磷酸核苷中的一个或多个可以被类似物取代，该类似物在核苷酸之间生成选择性的非水解键。例如，核苷可以被α-硫代-酶作用物取代，核苷间的磷硫酰键随后可以通过利用试剂诸如卤代烷(例如，碘乙酰胺、碘乙醇)或2，3-环氧-1-丙醇的烷化而修饰。其他可以为选择性非水解性的示例性核苷包括2’氟代核苷、2’脱氧核苷以及2’氨基核苷。

其它示例性修饰的三磷酸核苷包括质量修饰的三磷酸核苷，可以使用例如质量修饰的三磷酸脱氧核苷、质量修饰的三磷酸二脱氧核苷以及质量修饰的三磷酸核糖核苷。质量修饰的三磷酸核苷可以在碱基、糖和/或磷酸基团(moiety)上进行修饰，并且通过酶促步骤、化学性或二者的组合而引入。在一个方面，修饰可以包括除了羟基以外的2’取代基。在另一个方面，核苷酸之间的键可以被修饰，例如，磷硫酰键或进一步与烷化剂反应的磷硫酰键。在又一个方面，修饰的三磷酸核苷可以用甲基进行修饰，例如5-甲基胞嘧啶或5-甲基尿苷。

在另一个具体实施方式中，靶核酸分子利用天然存在但不是靶核酸分子正常前体的三磷酸核苷进行扩增。例如，正常不存在于DNA中的三磷酸尿苷，可以通过在存在正常DNA前体核苷酸(例如dCTP、dATP和dGTP)及dUTP时扩增DNA，而将其引入到扩增的DNA分子中。这种将尿苷引入到DNA可以促进DNA的碱基特异性切割。例如，当扩增的含有尿苷的DNA是用尿嘧啶-DNA转葡糖基酶(UDG)处理时，尿嘧啶残基被切割。随后化学性处理来自UDG反应的产物，引起磷酸骨架的切割并产生碱基特异性切割产物。

f.处理过的靶核酸分子的两条链

在一个具体实施方式中，用可修饰靶核酸分子作为靶核酸分子甲基化状态的函数的试剂处理后，处理过的双链靶核酸分子的两条链将不能保持完全互补。例如，当双链靶核酸分子用重亚硫酸盐处理时，靶核酸分子两条链上的未甲基化C核苷酸可以被转化为U核苷酸。两条链的互补性G核苷酸未被修饰。因此，每个基于甲基化的靶核酸分子序列修饰可以在靶核酸分子互补链之间引起错配。

基于甲基化的序列修饰处理后，处理靶核酸分子的方法例如扩增和断裂，可以仅利用处理过的核酸分子的一条链或者利用处理过的核酸分子的两条链而进行。例如，用于扩增步骤的引物可以仅与处理过的核酸分子的一条链互补，或者可以与处理过的核酸分子的两条链互补。因此，可以实施扩增步骤以生成至少两种不同的扩增的双链产物，其中处理过的靶核酸分子的两条链被扩增成独立的双链产物。

可替换的，可以进行扩增，以便处理过的靶核酸分子的两条链中仅一条链被扩增。例如，当利用至少一种对两条链中的一条具有选择性的引物进行扩增时，与引物杂交的链可以被选择性扩增。例如，由于在试剂处理后两条链不再是完全互补物，甲基化特异性引物可以设计为与第一处理过的链的核苷酸序列特异性杂交，而不与第二处理过的链的互补物对应的核苷酸序列特异性杂交。因此，至少一种引物将选择性杂交到来源于两条处理过的靶核酸分子链的唯一其中一条的核苷酸序列上。类似的，第二引物也可以设计为与两条处理过的靶核酸分子链中的仅一条选择性杂交。可替换的，第二引物另一条链可以设计为与两条链之一均可杂交，但是，当与第一链选择性引物联合应用时，将仍引起两条处理过的靶核酸分子链中仅一条的选择性扩增。

g.扩增后步骤

在一步或多步扩增后，在加成性扩增步骤之前或切割步骤之前，扩增产物可以经历一个或多个处理步骤。例如，在加成性扩增之前或切割之前，扩增产物可以经历一个或多个纯化步骤。扩增的产物也可以经历一个或多个修饰扩增产物的步骤。

用于纯化核酸分子的方法在本领域中是已知的，包括沉淀、透析或其他溶剂交换、凝胶电泳、杂质的酶促降解(例如蛋白酶处理或RNase处理DNA靶核酸分子样品)、液相层析包括离子交换层析和亲和层析以及其他特异性结合靶核酸分子以将其与杂质分离的方法(例如，杂交、生物素结合)。纯化步骤还可以包括分离扩增产物的互补链。本领域的技术人员将认识到，根据用于随后扩增、修饰或切割步骤所需要的纯度水平和/或样品组成来选择使用哪种纯化步骤。

修饰被扩增的产物的步骤可以包括任何改变产物组成的方法。这些步骤可以包括分离双链产物的两条链、将核酸杂交到产物的单链上、从扩增产物的5’或3’末端添加或去除基团(例如荧光染料、生物素、信号序列以及其他本文披露的或在本领域中已知的成分)、修饰核苷酸碱基、修饰磷酸二酯键或者修饰糖基。

h.扩增产物的多个等份

用于确定靶核酸中甲基化的方法可以包括一些方法，其中单一样品在一个或多个步骤中加以处理，然后单一样品可以分成两份或多份用于随后步骤中的平行处理。平行处理样品等份可以提供有关靶核酸分子中甲基化的互补性信息。例如，单一样品可以在用接触样品的步骤中用试剂进行处理，而该试剂根据靶核酸分子的甲基化状态修饰靶核酸分子的序列；然后单一样品可以被扩增；并且在断裂之前，将单一样品分成两分或多份，使得每一不同的等份可以在不同的断裂条件下处理。来自每一等份的不同断裂模式可以提供与其他等份的质谱提供信息的补充信息。因此，通过将单一样品分成两份或多份，可以获得关于靶核酸分子中甲基化的补充信息。

扩增后，扩增产物可以分成两份或多份。例如，在扩增后但在切割扩增产物之前，可以将扩增产物分成两份或多份；在扩增后可以将扩增产物分成两份或多份，并且经历进一步的步骤例如一个或多个扩增产物纯化步骤或扩增产物修饰步骤。。

当在切割前将扩增产物分成两份或多份时，对所述两份或多份中的每一份可以应用不同的切割方法。例如，第一靶核酸分子等份可以用RNaseA特异性断裂，同时第二靶核酸分子等份可以用RNaseT1特异性断裂。在另一个实施例中，扩增的靶核酸分子可以分成4份，并且每份可以用不同的碱基特异性试剂处理以生成4组不同的碱基特异性切割的靶核酸分子片段。分成两份或多份可以实现对同一个扩增产物实施不同的切割反应。对同一个扩增产物使用不同的切割反应在本文提供的切割方法中将进一步描述。

在另一个具体实施方式中，处理过的靶核酸分子或其扩增产物可以分成两份或多份，可以实施两个或多个不同的扩增步骤以从相同的处理过的核酸产生两种或多种不同的扩增产物。例如，可以对处理过的靶核酸的PCR产物实施两个或多个不同的转录步骤。两种不同转录步骤的实例是其中第一转录反应将rATP、rGTP、rCTP和dTTP引入到转录物，而第二转录反应则将rATP、rGTP、rTTP和dCTP引入到转录物，从而两个合成的转录物引入其中的脱氧核苷酸不同。

不同的扩增步骤可以包括在不同等份中使用不同的酶、在不同等份中使用不同的反应条件、在不同等份中使用不同的核苷或核苷类似物，而且可以设计为扩增处理过的靶核酸分子或扩增处理过的靶核酸分子的一条链的扩增产物的一条特异性链。例如，不同的扩增反应可以含有质量、化学组成典型事件(typical occurrence)(典型vs.非典型核苷)不同的核苷酸，如本文披露以及本领域中已知的。不同的扩增步骤可以用来在不同核苷酸基因座切割、具有不同的切割产物质量或者可以通过不同的方法检测的扩增产物。

典型的，两种或多种不同的扩增步骤将产生不同的扩增产物，典型的，不同的扩增产物将具有不同的断裂性质。不同的扩增产物一般将为至少一个原子不同的靶核酸分子。例如，第一扩增产物可以含有脱氧胞嘧啶核苷酸，而第二扩增产物可以含有核糖ribonucleic胞嘧啶核苷酸，其中两个扩增产物之间的区别是存在键合到核苷酸糖基2’碳的氧原子。典型的，具有不同断裂性质的扩增产物，即当在相同切割条件下处理时能够产生不同组切割产物的扩增产物。例如，含有一个或多个脱氧胞嘧啶核苷酸的转录物将具有与含有一个或多个脱氧胸腺嘧啶的转录物不同的RNAseA切割模式。

样品可以分成两份或多份，不同的份中特异性扩增靶核酸分子的不同链。例如，处理过的靶核酸分子可以含有非互补链，可以在不同的份中采用诸如甲基化状态特异性引物的不同引物扩增不同的链。在另一个具体实施方式中，根据每一份中所使用的引物，扩增靶核酸分子的互补链可以在不同份中分别扩增。例如，扩增的靶核酸分子样品可以分成两份或多份，其中正向链在第一组等份中转录，反向链在第二组等份中转录。如本领域技术人员将理解到，样品可以分为任何多个等份，其中可以实施本文描述的平行反应的任何组合。

i.多重扩增

扩增方法可以同时在两个或多个靶核酸分子上进行实施，例如可通过多重PCR方法。在这种具体实施方式中，引物可以作为一个或多个靶核酸分子的甲基化特异性引物。典型的，每个靶核酸分子可以用不同甲基化特异性引物杂交，以扩增多个不同的靶区域。多个靶核酸或其扩增子可以经受断裂条件包括例如碱基特异性切割。

多重扩增还可以在靶核酸分子上实施，检测从一个或多个断裂反应产生的片段。在一个检测片段的具体实施方式中，当待检测以及在甲基化鉴定中使用的质量(masses)相互不交迭时，可以实施多重扩增。当两个或多个靶核酸的质量mass断裂以及测定的质量masses为已知或可以推算时，则可以测定或推测得到质量masses的交迭。在该上下文中，交迭指的是足以分别决定两个或多个片段存在的两个或多个片段的质量或测定质量的差异。当质量mass片段相互不交迭时，可以实施多重扩增，而且在甲基化鉴定的方法中，所得到的质量mass可以与适当的靶核酸分子联系起来。例如，根据靶核酸分子核苷酸序列和引物设计的知识，可以推测来自两个或多个扩增产物的断裂模式，以生成不具有相同质量的片段；这些片段的质量测定可以在一个质谱测定中实施，并且根据推算的断裂模式，可以将得到的测定质量与适当的靶核酸联系起来。

当靶核酸分子的核苷酸序列已知时，可以设计引物和断裂方法以减少片段交迭，通过例如增加推测片段的核苷酸组成差异。减少交迭的引物和断裂方法将是靶核酸核苷酸序列的函数，且可以很容易被本领域技术人员确定。

在另一个多重扩增的具体实施方式中，某些片段mass可以交迭，但仍然可以利用非交迭峰实施甲基化鉴定方法。在这种具体实施方式中，断裂模式的一部分对于靶核酸分子可以是非交迭的，来自该非交迭部分的质量masses可以用于本文提供的甲基化鉴定方法中。本领域的技术人员可以确定非交迭片段质量masses是否适合于甲基化鉴定方法，通过确定质量移位、新片段质量或缺失片段的质量可否被检测以及可否与靶核酸分子的甲基化状态联系起来。

在其他具体实施方式中，两个或多个含有甲基化状态信息的靶核酸分子片段的质量可以相互交迭。在这些具体实施方式中，来自两个或多个靶核酸分子的片段仍然可以通过利用多种方法中的一种或多种而用于多重扩增方法。例如，交迭片段可以通过修饰靶核酸分子的一个或多个的片段质量而使其不再相互交迭。本文描述了用于核酸分子质量修饰的方法。例如，来自两个靶核酸分子的交迭片段质量的分离可以通过RNA整合，即将rCTP、rGTP、rUTP和rATP引入到第一转录物而将rCTP、rGTP、dTTP和rATP引入到另第二转录物。

在多重测定中使用的核酸分子可以来自多种来源中的任何一种。例如，多重核酸分子可以是来自相同个体的不同染色体或不同基因组区域的核酸分子、处理过的靶核酸分子的正向和反向链(其中，对靶核酸分子的处理已经使得两条链非互补)、核酸分子的正向和反向互补链、不同个体的不同基因组或染色体区域、或在本文描述的方法中可以分别测定的任何其他不同的序列。

在多重测定中使用的核酸分子还可以包括具有相同核苷酸序列的核酸分子。典型的，这种多重测定可以用来确定样品中存在的甲基化和未甲基化核苷酸或核苷酸基因座的相对量。例如，样品可以含有来自多个个体的相同基因组区域的核酸分子。这种多重测定可以用于确定一群个体中的甲基化频率。在另一个实施例中，多重可以包含来自单一个体的二倍体DNA的两个拷贝，其中二倍体DNA的两个拷贝的甲基化状态将被确定。

3.核苷酸合成阻滞剂

靶核酸分子的甲基化特异性扩增可以利用处理过的靶核酸分子的一个区域的特异引物而实施，该区域含有预期核苷酸序列，例如反映未处理的靶核酸分子中一个或多个甲基化或未甲基化核苷酸的核苷酸序列。另外，靶核酸分子的甲基化特异性扩增可以利用寡核苷酸实施，该寡核苷酸不作为引物而是用来抑制其杂交的靶核酸分子的扩增。这种寡核苷酸，本文命名为核苷酸合成阻滞剂或扩增阻滞剂，可以结合到含有非预期序列的靶核酸分子上，例如在未处理的靶核酸分子中仅反映未甲基化核苷酸或选定的甲基化核苷酸的核苷酸序列。例如，当用重亚硫酸盐处理靶核酸分子时，可以使用扩增阻滞剂与处理过的靶核酸区域杂交，其中一个或多个胞嘧啶核苷酸已经转化为尿嘧啶。在另一个具体实施方式中，当用重亚硫酸盐处理靶核酸分子时，可以使用扩增阻滞剂与处理过的含有一个或多个胞嘧啶核苷酸的靶核酸区域杂交。因此，本文提供的用于本文描述的核苷酸合成的方法还可以向其中添加一种或多种核苷酸合成阻滞剂。扩增阻滞剂的其他应用在本领域是已知的，例如美国专利20030082600号中所提供的。

a.核苷酸合成阻滞剂的组成和性质

核苷酸合成阻滞剂或扩增阻滞剂是杂交到不被扩增的样品中的一个或多个核酸的寡核苷酸。典型的，扩增阻滞剂不含有3’-羟基基团，以便在核苷酸合成反应期间其他的核苷酸不能加成到扩增阻滞剂上。在一个具体实施方式中，扩增阻滞剂结合到核酸的至少一个核苷酸基因座上，其中核苷酸基因座的甲基化状态待分析。例如，当样品用重亚硫酸盐处理时，扩增阻滞剂可以结合到核酸中的U(或T)核苷酸上，其中U/T核苷酸从C核苷酸到U核苷酸的基于重亚硫酸盐的转化结果而产生。在另一个实施例中，当样品用重亚硫酸盐处理时，扩增阻滞剂可以结合到核酸中的C核苷酸上，其中C核苷酸未因为重亚硫酸盐处理而转化为U(或T)核苷酸。

在用甲基化特异性试剂例如重亚硫酸盐处理之前，可以根据核酸是甲基化或未甲基化而加入扩增阻滞剂，其特异性结合到核酸区域上，包括靶核酸分子或扩增产物的区域。在扩增阻滞剂的一种应用中，当一种或多种扩增阻滞剂结合与其靶核酸分子不如结合背景DNA或不具有预期序列的核酸分子那么有效时，具有预期序列的处理过的靶核酸分子被扩增。即，扩增阻滞剂可以选择性阻滞背景DNA和不具有预期序列的核酸分子的扩增。例如，扩增阻滞剂可以结合到具有反映未甲基化核苷酸的核苷酸序列的核酸分子上(例如，当使用重亚硫酸盐时，结合含有U/T的序列，如果U/T产生于从未甲基化胞嘧啶向尿嘧啶的重亚硫酸盐转化)。在另一个实施例中，扩增阻滞剂可以结合到具有反映甲基化核苷酸的核苷酸序列的核酸分子上(例如，当使用重亚硫酸盐时，结合含有C的序列，其中C未被重亚硫酸盐转化为U)。

在使用扩增阻滞剂的上下文中，具有预期的序列的靶核酸分子或扩增产物指的是含有反映未处理的靶核酸分子中一个或多个甲基化或未甲基化核苷酸的核苷酸序列的核酸分子。本领域技术人员可以根据实验设计确定核苷酸序列的满意度。例如，当靶核酸分子中一个或多个未甲基化胞嘧啶基因座待确定时，预期的重亚硫酸盐处理的序列在一个或多个C核苷酸的位置含有一个或多个U/T核苷酸，且待扩增的预期的核酸分子含有这些U/T核苷酸。在另一个实施例中，当靶核酸中一个或多个甲基化胞嘧啶基因座待确定时，预期的重亚硫酸盐处理的序列含有的一个或多个C核苷酸未被重亚硫酸盐处理而转化，且待扩增的预期的核酸分子含有这些C核苷酸。典型的，相对于结合到含有预期序列的核酸分子上，扩增阻滞剂将更易于结合到具有非预期序列的核酸分子上。

扩增阻滞剂可以短至两个核苷酸，例如CG、TG或CA二核苷酸，或者扩增阻滞剂可以长于两个核苷酸。例如，扩增阻滞剂可以含有3、4、5、6、7、8、9、10个或更多个核苷酸，且可以结合到特异性序列上以抑制扩增阻滞剂杂交的序列的扩增。扩增阻滞剂的核苷酸组成可以根据待确定的甲基化状态以及用来处理靶核酸分子的甲基化特异性试剂而选择。例如，当使用重亚硫酸盐且甲基化胞嘧啶待确定时，设计用来直接结合到处理过的靶核酸分子上的扩增阻滞剂可以含有A、C和T/U核苷酸，但不含有G核苷酸。设计用来结合到与重亚硫酸盐处理的靶核酸分子互补的核酸上的扩增阻滞剂可以含有A、G和T/U核苷酸，但不含有C核苷酸。在另一个实施例中，当使用重亚硫酸盐且未甲基化胞嘧啶待确定时，设计用来直接结合到处理过的靶核酸分子上的扩增阻滞剂可以含有G、C和T/U核苷酸，但不含有A核苷酸。设计用来结合到与重亚硫酸盐处理的靶核酸分子互补的核酸上的扩增阻滞剂可以含有A、G和C核苷酸，但不含有T/U核苷酸。

在一个具体实施方式中，扩增阻滞剂可以设计为特异性结合到具有非预期序列的核酸分子上(即，在扩增阻滞剂杂交位点，重亚硫酸盐处理的靶核酸分子序列含有一个或多个尿嘧啶)，而结合到具有预期序列(即，重亚硫酸盐处理的具有胞嘧啶的靶核酸分子序列)的靶核酸分子上则特异性或亲和性低得多。在一个实施例中，扩增阻滞剂可以特异性杂交到仅含有A、T和G的靶核酸分子序列上，而不能特异性杂交到含有一个或多个C核苷酸的靶核酸分子序列上。这些扩增阻滞剂一般将不含有G核苷酸。类似的，当扩增阻滞剂结合到与处理过的靶核酸分子互补的序列上时，扩增阻滞剂可以特异性结合到仅含有A、T和C核苷酸的核苷酸序列上，而不能特异性杂交到含有一个或多个G核苷酸的靶核酸分子序列上。这些扩增阻滞剂一般将不含有C核苷酸。

某些示例性的扩增阻滞剂可以特异性杂交到核酸分子中含有TG或CA二核苷酸序列的区域。这种核酸分子含有的核苷酸序列反映重亚硫酸盐处理的未甲基化CpG二核苷酸序列或与其互补的序列。因此，扩增阻滞剂可以含有TG或CA二核苷酸序列。在一个具体实施方式中，扩增阻滞剂含有两个或多个TG或CA二核苷酸序列，其可以结合例如重亚硫酸盐处理的未甲基化CpG岛或与其互补的序列。

其它示例性的扩增阻滞剂可以特异性的杂交到核酸分子中含有GC或CG二核苷酸序列的区域。这种核酸分子含有的核苷酸序列反映重亚硫酸盐处理的未甲基化CpG二核苷酸序列或与其互补的序列。因此，扩增阻滞剂可以含有GC或CG二核苷酸序列。在一个具体实施方式中，扩增阻滞剂含有两个或多个GC或CG二核苷酸序列，其可以结合例如重亚硫酸盐处理的未甲基化CpG岛或与其互补的序列。

扩增阻滞剂可以具有这样的性质，即其不能被核苷酸合成反应中使用的酶延伸。这一点可以通过利用在3’位置具有其他功能的3’-脱氧寡核苷酸或寡核苷酸而实现，例如，3’-O-乙酰基寡核苷酸。另外，扩增阻滞剂一般不易于通过在扩增反应中使用的酶而水解。这一点可以通过利用不具有核酸酶活性的酶或利用修饰的非水解寡核苷酸而实现，其中非水解寡核苷酸可以具有例如5’末端的硫代硫酸桥赋予水解抗性。

b.核酸合成阻滞剂的应用

甲基化特异性扩增阻滞剂以及甲基化特异性引物或未甲基化特异性引物同时存在时，可以实施甲基化特异性扩增。因此，扩增阻滞剂的应用可以允许在甲基化特异性扩增反应中使用各种各样的引物。在一个具体实施方式中，扩增阻滞剂与甲基化特异性引物联合应用。在这种具体实施方式中，扩增阻滞剂可以抑制背景DNA以及具有非预期序列的核酸分子的扩增，而甲基化特异性引物可以优先扩增具有预期序列的核酸分子。在这种方法中，在靶核酸分子样品中可能存在非常高的相对量的背景DNA以及具有非预期序列的核酸分子，然而仅具有预期序列的核酸分子被扩增。

在一个具体实施方式中，扩增阻滞剂可以指向未甲基化核酸分子的引物检测区，其中所述引物检测区是甲基化核酸分子中甲基化特异性引物结合的位点。在这种具体实施方式中，甲基化特异性引物可以用于最初的核酸合成反应步骤中，并且随后可以加入扩增阻滞剂以抑制由于非目的性杂交导致的扩增(例如，防止扩增与甲基化特异性引物杂交但为错配的核酸)。利用甲基化特异性引物，起始的两个核酸合成反应步骤可以选择性生成与具有预期序列的处理过的单链靶核酸分子互补的核酸，并用来选择性复制处理过的单链靶核酸分子。某些扩增可以来自于在引物杂交区具有非预期序列的核酸分子的非目的性杂交(典型的，来自于一个或多个错配的碱基对的序列)，在几个扩增循环后，由于引物整合入扩增产物中，所以甲基化特异性引物不能防止选择这些序列。在起始的几个扩增步骤中，引物整合的扩增产物的量相对小于多个步骤之后的量。因此，通过在一个或两个核苷酸合成步骤后应用扩增阻滞剂，所述阻滞剂将杂交到具有非预期序列的核酸中非引物整合区，以抑制其扩增。因此，扩增阻滞剂可以用来降低甲基化特异性引物与具有非预期序列的核酸的非目的性杂交的量，从而减少来自非预期序列的扩增产物。

在另一个具体实施方式中，扩增阻滞剂可以对核酸或其他核酸分子的一个区域特异，该区域不同于甲基化特异性引物杂交的区域。在这种具体实施方式中，扩增阻滞剂可以用来抑制具有非预期序列的核酸在每一个扩增步骤期间的扩增。因此，在核酸合成的起始步骤中，甲基化特异性引物可以用来选择性扩增核酸，典型的具有预期序列的靶核酸分子，而扩增阻滞剂可以进一步用来在每一个扩增步骤选择性抑制具有非预期序列的核酸扩增。

在另一个具体实施方式中，当靶核酸分子含有两个用于甲基化特异性扩增的选择性的区域，并且待分析其甲基化状态的预期全长靶核酸分子大于含有两个用于甲基化特异性扩增的选择区并介于二者之间的核酸部分时，可以使用甲基化特异性引物与扩增阻滞剂的组合物。例如，相对于待分析的靶核酸分子的全长，当用于甲基化特异性扩增的两个区域接近于在一起时，可以采用这种组合。例如，待分析的靶核酸分子长度为200个核苷酸，但是可以含有两个由20个核苷酸分开的特定区域，其将用于靶核酸分子的选择性扩增。在这种情况下，选择性区域的其中之一可以由甲基化特异性引物处理/定向(targeted)，而另一个选择性区域择由扩增阻滞区处理/定向targeted。例如，一个引物可以是甲基化特异性引物、另一个引物可以是甲基化非特异性引物，且其他的甲基化特异性可以通过使用一种或多种扩增阻滞剂而赋予。

c.多个核酸合成阻滞剂的应用

在一个具体实施方式中，可以采用两个或多个扩增阻滞剂。典型的，采用不多于两条甲基化特异性引物来选择特定的靶核酸分子，与之对比的是，可以采用的扩增阻滞剂的数量不加以限定。例如，可以利用1、2、3、4、5、6、7、8、9、10或更多个扩增阻滞剂赋予甲基化特异性。每个扩增阻滞剂可以含有不同的核苷酸数量，而且使用多个扩增阻滞剂可以包括使用含有共用序列的扩增阻滞剂(例如，使用具有TTA序列的扩增阻滞剂三核苷酸或具有TTAA序列的扩增阻滞剂四核苷酸)。在一个实施例中，至少一个扩增阻滞剂结合到核酸序列上，以便抑制甲基化特异性引物与核酸的非目的性杂交。在另一个实施例中，至少一个扩增阻滞剂结合到除甲基化特异性引物可以非目的性杂交的序列以外的核酸序列上。在另一个实施例中，仅仅利用扩增阻滞剂赋予甲基化特异性(例如，利用甲基化特异性扩增阻滞剂以及甲基化非特异性引物进行甲基化特异性扩增)。在另一个实施例中，靶核酸分子的两个或多个区域可以用扩增阻滞剂处理。当在应用中使用的少于两个引物是甲基化特异性引物时，扩增可以利用一个或多个甲基化非特异性引物。当甲基化特异性仅通过使用一个或多个扩增阻滞剂来决定时，两个扩增引物均可以为甲基化非特异性引物。

在一个具体实施方式中，扩增阻滞剂不用于首次甲基化特异性核酸合成反应。例如，当用甲基化特异性引物接触处理过的单链靶核酸分子，且核酸合成将核苷酸添加到引物上以形成与处理过的靶核酸分子互补的链时，可以省略扩增阻滞剂。扩增阻滞剂在互补链合成之后的步骤中也可以省略。因此，在第一个、第二个或者第一个以及第二个核酸合成反应中，可以免用扩增阻滞剂。在无需扩增阻滞剂的核酸合成反应之后，在核酸扩增反应期间可以加入扩增阻滞剂。例如，甲基化特异性引物可以用于具有预期序列的靶核酸分子的初始甲基化特异性合成，然后在随后的扩增步骤期间，扩增阻滞剂可以用来防止除具有预期序列的靶核酸分子以外的核酸的扩增。

4.断裂与核苷酸合成的联合

选择性核苷酸合成还可以与断裂联合实施。通过多个核酸合成循环扩增的靶核酸将利用引物杂交到靶核酸分子的两个独立区域上。靶核酸分子在两个引物杂交位点之间内的中心区的断裂，将防止靶核酸分子的扩增。因此，即使在核酸合成中使用的引物不是选择性的引物时，核酸分子中心区的选择性断裂可以导致靶核酸分子的选择性扩增。

在一个实施例中，在用核酸合成条件处理之前，以及在用修饰所述靶核酸分子序列的试剂作为核酸甲基化状态的函数处理之前，可以用断裂条件处理样品。在这个实施例中，断裂条件可以对甲基化或未甲基化核苷酸具有选择性。例如，样品中可以加入甲基化敏感性内切核酸酶例如HPA II，该酶可以在未甲基化识别位点而不是甲基化识别位点切割，这就导致样品当识别位点为甲基化时含有完整的靶核酸分子，而识别位点为未甲基化时含有切割的靶核酸分子。样品然后可以通过核酸合成条件处理，采用的引物经设计使得仅未切割的靶核酸分子被扩增。作为切割的结果，扩增将对识别位点为甲基化的靶核酸分子具有选择性。

在另一个实施例中，在用核酸合成条件处理之前，但在用修饰靶核酸分子序列作为靶核酸甲基化状态的函数的试剂处理之后，可以用断裂条件处理样品。例如，样品中可以加入内切核酸酶，该酶在具体基因座包含C核苷酸的识别位点切割，但在具体基因座包含T或U核苷酸的识别位点则不切割。反之，样品可以样品中可以加入内切核酸酶，该酶在具体基因座包含T或U核苷酸的识别位点切割，但在具体基因座包含C核苷酸的识别位点则不切割。样品可以首先用修饰靶核酸分子序列作为靶核酸分子甲基化状态的函数的试剂进行处理，然后用这种内切核酸酶处理。所得的样品将含有在识别位点具有预期甲基化状态的完整靶核酸分子，并含有在识别位点具有非预期甲基化状态的切割的靶核酸分子。样品随后可以用利用设计的引物的核酸合成条件处理，以便仅为切割的靶核酸分子被扩增。作为切割的结果，扩增将对识别位点为甲基化的靶核酸分子具有选择性。

可以在这种方法中使用的断裂条件包括任何可以选择性切割甲基化核酸分子或未甲基化核酸分子的断裂条件，包括可以选择性切割甲基化核酸分子或未甲基化核酸分子的内切核酸酶。可以使用的另外的断裂条件包括任何可以通过序列特异性切割的断裂条件，例如，选择性切割在特定基因座含有C核苷酸的核苷酸序列的内切核酸酶，或者选择性切割在特定基因座含有U或T核苷酸的核苷酸序列的内切核酸酶。

与核酸合成联合使用的断裂还可以与其他甲基化特异性方法联合使用，包括那些本文提供的方法。例如，与核酸合成联用的断裂可以利用甲基化特异性引物实施，且与核酸合成联用的断裂可以利用扩增阻滞剂实施。如本领域技术人员将理解，本文提供的方法的任何组合均可以联用。

5.转录

转录方法利用模板DNA分子以形成RNA分子，其可以用来扩增靶核酸分子以及将靶核酸分子从DNA形式修饰成RNA形式。示例性的模板DNA包括扩增的产物靶核酸分子以及处理过的未扩增的靶核酸分子。

如本文所描述的，处理过的靶核酸分子经历一个或多个核酸合成反应。核酸合成反应可以用来扩增处理过的靶核酸分子和/或修饰核酸分子的形式。在一个具体实施方式中，处理过的靶核酸分子或PCR产物被转录。

模板DNA例如靶核酸分子或其扩增产物的转录，或其扩增的产物可以对模板DNA的一条链或两条链而实施。在一个具体实施方式中，待转录的核酸分子含有能实施转录的酶结合的基团(moiety)，这种基团可以为例如转录启动子序列。

转录反应可以利用本领域已知的多种方法中的任何一种并利用本领域已知的多种酶中的任何一种来实施。例如，具有整合dNTP和rNTP能力的突变体T7RNA聚合酶(T7R&DNA聚合酶；Epicentre，Madison，WI)可以用于转录反应中。转录反应可以在本领域已知的标准反应条件下进行，例如40mM Tris-Ac(pH＝7.5)、10mM NaCl、6mM MgCl₂、2mM亚精胺、10mM二硫苏糖醇、1mM每种rNTP、5mM dNTP(当使用时)、40nM DNA模板、以及5U/μL T7R&DNA聚合酶，在37℃孵育2小时。转录后，可以将虾碱性磷酸酶加入切割反应中以减少环磷酸副产品的量。T7R&DNA聚合酶的使用在本领域中是已知的，如美国专利5,849,546，6,107,037号以及Sousa et al.EMBO J.14：4609-4621(1995)，Padilla et al.Nucl.Acid Res.27：1561-1563(1999)，Huang et al.Biochemistry 36：8231-8242(1997)，and Stanssens et al.GenomeRes.14：126-133(2004)所例证的。

除了用四种常规的核糖核苷酸底物(rCTP、rATP、rGTP以及rUTP)进行转录外，还可以用核苷类似物取代一种或多种三磷酸核糖核苷而实施转录反应，例如那些本文提供的以及本领域已知的或者具有相应的三磷酸脱氧核糖核苷的核苷类似物(例如，用dCTP取代rCTP、或用dUTP或dTTP取代rUTP)。在一个具体实施方式中，一个或多个rNTP用核苷或核苷类似物取代，整合入转录的核酸后，在应用于转录的核酸的断裂条件下，核苷或核苷类似物不是可切割的。

在一个具体实施方式中，转录的实施在一个或多个核酸合成反应之后，包括一个或多个利用甲基化特异性引物的核酸合成反应。例如，扩增产物的转录可以在靶核酸分子扩增之后进行，包括靶核酸分子的甲基化特异性扩增。在另一个具体实施方式中，处理过的靶核酸分子无须经过任何前序核酸合成步骤而进行转录。转录可以在缺乏本文描述的扩增阻滞剂时进行，或者可以在存在扩增阻滞剂时进行。例如，扩增可以在存在一种或多种甲基化特异性扩增阻滞剂时进行。

6.扩增靶核酸分子同时保持甲基化序列

本文还提供了能保持任何甲基化残基甲基化的扩增甲基化靶核酸分子的方法。在这种实施例中，甲基化的靶核酸分子可以在核酸合成步骤中作为模板链，例如本文描述的或本领域已知的核酸合成方法。双链产物将含有一个甲基化链以及一个未甲基化链。然后，双链靶核酸分子的新合成的未甲基化链可以选择性甲基化。甲基化反应可以参照核酸模板链的甲基化状态，而在新合成链的特定胞嘧啶碱基上进行。例如，当模板链上的CpG二核苷酸为甲基化时，新合成链上可杂交到甲基化二核苷酸中鸟嘌呤的胞嘧啶，可以在5’位置被甲基化。在一个具体实施方式中，在合成链的甲基化传导(conductive to)条件下，可以通过双链核酸与甲基转移酶接触而实施这种方法。酶的甲基酶活性可以是合成的链内CpG二核苷酸可以被甲基化以反映模板链上相应CpG二核苷酸的甲基化，因此，保持模板链的基因组甲基化模式。

甲基化反应完成后，两条甲基化的链可以被分离，并且分离的链可以进行进一步的核酸合成反应步骤。核酸合成完成后，每个双链核酸将含有一条甲基化链和一条未甲基化链。未甲基化链然后可以进行本文描述的或者本领域已知的甲基化步骤。作为第二轮核酸合成和甲基化的结果，可以生成模板靶核酸链的复制物，能精确保持初始模板靶核酸链中CpG二核苷酸的甲基化状态。

可以用于甲基化步骤中的甲基化酶包括那些能根据模板链上相应的CpG二核苷酸内胞嘧啶的甲基化状态而在5’位置将胞嘧啶甲基化的酶。当模板链CpG内的胞嘧啶为甲基化时，与其杂交的合成链的相应CpG可以通过甲基酶的作用而在胞嘧啶核苷酸的5’位置被甲基化。如果模板链CpG内的胞嘧啶为未甲基化时，合成链上相应的CpG将保持未甲基化。反应可以利用适当的缓冲液和其他试剂以及所选酶的供应商所建议的反应条件而实施，这些条件可以包括甲基供体分子例如腺苷甲硫氨酸。在一个具体实施方式中，加成到合成链的甲基携带可检测标记物，包括质量标记物，可以根据本文描述的以及本领域已知的方法将其引入到合成的核酸链的胞嘧啶内。

酶可以来自多种来源中的任何一种，例如人类、小鼠、重组体、以及其他来源的酶。在一个具体实施方式中，甲基转移酶是DNA(胞嘧啶-5)甲基转移酶(DNMT1)。几种甲基转移酶是已知的，例如，能传播未甲基化链内半甲基化DNA的甲基化模式的甲基转移酶家族，例如重组的人类DNMT1(参见Pradhan，S.Bacolla，A.Wells，R.D.Roberts，R.J.“重组人类DNA(胞嘧啶-5)甲基转移酶I.表达、纯化以及重新甲基化和维持甲基化的比较”J.Biol.Chem.274：33002-33010和Bacolla，A.Pradhan，S.Roberts，R.J.Wells，R.D.“重组人类DNA(胞嘧啶-5)甲基转移酶.II.稳态动力学揭示甲基化DNA的变构激活”J.Biol.Chem.274：33011-33019)。在一个具体实施方式中，甲基化转移酶是维持甲基化转移酶。本文描述的扩增/甲基化方法以及用于实施这些方法的试剂在本领域中是已知的，如在US20030180779和WO02/101353公开的申请所例证的。

甲基化的扩增产物可以用于本文所披露的方法中。例如，可以用修饰甲基化扩增产物序列作为甲基化扩增产物的甲基化的函数的试剂处理甲基化的扩增产物。处理过的甲基化扩增产物随后可以进一步被扩增，接下来进一步扩增的产物可以断裂，并可以测量片段的质量。可替换的，处理过的甲基化扩增产物无需进一步扩增即可断裂，并可以测量片段的质量。

E.核酸分子的断裂

本文提供的方法还包括靶核酸分子或扩增产物的断裂和/或切割步骤。任何用于将核酸分子切割成合适大小分布的片段的方法可以用来生成核酸片段。核酸分子分断裂在本领域是已知的，并且可以通过多种方式完成。例如，由DNA、RNA、DNA和RNA类似物或其组合构成的核酸分子，可以物理的、化学的或酶促切割。在一个具体实施方式中，在一个或多个特异性酶切位点的酶促切割可以用来产生本文所利用的核酸分子片段。典型的，切割可以在扩增后实现，从而为一旦利用本文提供的方法产生了足够量的扩增产物，扩增产物即可以被切割成两个或多个片段。

在使用限制酶的具体实施方式中，根据所使用的限制酶的数量和类型以及所选择的具体反应条件，产生片段的平均长度可以被控制在一个具体范围内。在具体具体实施方式中，制备用于本发明的核酸分子片段大小可以在一组范围内，包括1～50个碱基、2～40个碱基、3～35个碱基、以及5～30个碱基。然而，其他计划用于本发明的大小范围包括在约50～150个碱基之间、在约25～75个碱基之间、以及在约12～30个碱基之间。在一个特定的具体实施方式中，使用了约3～35个碱基的片段。通常，片段大小范围将被选择，以使得片段的质量可以利用本文描述的以及本领域已知的质量测量方法来准确确定，另外，在某些具体实施方式中，选择大小范围，以促进MALDI-TOF MS的预期解吸效率。

1.核酸分子的酶促断裂

核酸分子片段可以由单链或多链核酸分子的酶促切割而产生。多链核酸分子包括含有多于一条链的核酸分子(包括例如双链和三链核酸分子)的核酸分子复合体。根据所使用的酶，核酸分子被非特异性切割或在特异性核苷酸序列切割。可以使用任何能够切割核酸分子的酶，包括但不限于，内切核酸酶、外切核酸酶、单链特异性核酸酶、双链特异性核酸酶、核酶、以及DNA酶。多个用于断裂核酸分子的酶在本领域是已知的并有市售，例如核酸酶BAL-31、绿豆核酸酶、外切核酸酶I、外切核酸酶III、外切核酸酶VIII、λ外切核酸酶、T7外切核酸酶、外切核酸酶T、RecJ、RNaseA、RNaseU2、RNaseT1、RNaseH、ShortCutRNaseIII、AccI、BasAI、BtgZI、MfeI、SacI、N.BbvCIA、N.BbvC IB、N.BstNBI、I-Ceu1、I-SceI、PI-PspI、PI-SceI、McrBC、以及其他已知酶(参见，例如New England Biolabs，Inc.Catalog；Sambrook，J.Russell，D.W.Molecular Cloning：A Laboratory Manual，3rd ed.Cold Spring Harbor Laboratory Press，Cold Spring Harbor，New York，2001)。酶还可以用来将大核酸分子降解为较小片段。

本文还预期的是两个或多个“双碱基切割酶”的使用或者优先切割内切核酸酶(例如RNase PHyM)的使用，通过使用非可切割核苷酸(同时增加平均片段大小)使其更特异。在另一个具体实施方式中，利用单碱基和/或双碱基切割酶可以进行切割。一旦产生片段，片段可选择性的进行凝胶电泳以分离具有具体尺寸范围的片段。

a.碱基特异性断裂

靶核酸分子可以利用在特定碱基(例如：对于DNA为A、C、T或G；对于RNA为A、C、U或G)或碱基类型(即：嘧啶或嘌呤)选择性切割的核酸酶进行断裂。在一个具体实施方式中，特异性切割3种RNA核苷酸(例如U、G和A)、2种RNA核苷酸(例如C和U)、或1种RNA核苷酸(例如A)的RNase可以用来碱基特异性的切割靶核酸分子的转录物。例如，RNaseT1在G核糖核苷酸上切割ssRNA(单链RNA)、RNaseU2在A核糖核苷酸上切割ssRNA、RNaseCL3在C核糖核苷酸上切割ssRNA、PHyM在U和A核糖核苷酸上切割ssRNA、以及RNaseA在嘧啶核糖核苷酸(C和U)上切割ssRNA。单特异性RNase例如RNaseT1(G特异性)和RNaseU2(A特异性)的使用在本领域是已知的(Donis-Keller et al.Nucleic Acids Res.4：2527-2537(1977)；Gupta and Randerath，Nucleic Acids Res.4：1957-1978(1977)；Kuchino andNishimura，Methods Enzymol.180：154-163(1989)；and Hahner et al.Nucl.Acids Res.25(10)：1957-1964(1997))。另一种酶，已经报道鸡肝核糖核酸酶(RNaseCL3)优先在胞嘧啶上切割，但据报道酶对这种碱基的倾向性受反应条件的影响(Boguski et al.J.Biol.Chem.255：2160-2163(1980))。报道还宣称了另一种核糖核酸酶的胞嘧啶特异性，即cusativin，分离自Cucumis sativusL的干种子(Rojo et al.Planta 194：328-338(1994))。可替换的，已经证明可利用RNase PHyM(A和U特异)(Donis-Keller，H.Nucleic Acids Res.8：3133-3142(1980))和RNaseA(C和U特异)(Simoncsits et al.Nature 269：833-836(1977)；Gupta and Randerath，Nucleic Acids Res.₄：1957-1978(1977))鉴定嘧啶残基。这种切割模式的实例在Stanssens et al.WO 00/66771中给出。

另外，碱基可以被定向(targeted)，例如可以通过将修饰的核苷酸整合入核酸内并切除核苷酸的碱基，随后在适当的条件下或用酶处理核酸，可以引起核酸在被切除碱基位点的断裂。例如，dUTP可以整合入DNA内，碱基特异性断裂可以通过利用UDG去除尿嘧啶碱基来完成、并且随后在已知的切割条件下切割DNA。在另一个实施例中，甲基胞嘧啶可以整合入DNA中，碱基特异性可以通过利用甲基胞嘧啶去糖基酶去除甲基胞嘧啶来完成、随后在已知条件下处理而导致DNA断裂。碱基特异性断裂可以用于部分切割反应(包括当靶核酸分子含有整合入其中的非可切割核苷酸时，进行彻底的部分切割反应)以及全切割反应。

利用RNase的碱基特异性切割反应条件在本领域是已知的，可以包含例如4mM Tris-Ac(pH 8.0)，4mM KAc，1mM spermidine，0.5mM dithiothreitol以及1.5mM的MgCl₂。

在一个具体实施方式中，扩增产物可以转录成单链RNA分子，然后利用内切核糖核酸酶碱基特异性切割。利用例如可将未甲基化胞嘧啶转化成尿嘧啶而不修饰甲基化胞嘧啶的重亚硫酸盐处理靶核酸分子，其可用来产生碱基特异性切割模式的差异，可以利用诸如质谱分析的质量分析方法进行分析，还可以用于鉴定甲基化位点。在一个具体实施方式中，靶核酸分子的转录可以产生RNA分子，所述RNA分子可以利用特异性RNA内切核酸酶进行切割。例如，RNA分子的碱基特异性切割可以利用两种不同的内切核糖核酸酶来实施，例如RNaseT1和RNaseA。RNaseT1特异性切割G核苷酸，而RNaseA特异性切割嘧啶核糖核苷酸(即，胞嘧啶和尿嘧啶碱残基)。在一个具体实施方式中，当可切割一个以上核苷酸的酶例如RNaseA用于切割时，在靶核酸分子或扩增产物的转录期间可以引入非可切割的核苷例如dNTP。例如，在扩增产物的转录期间，可以引入dCTP，并且得到的被转录的核酸可以通过在U核糖核苷酸上的RNaseA进行切割，但对在C脱氧核糖核苷酸上的RNaseA的切割有抗性。在另一个实施例中，在靶核酸分子的转录期间，可以引入dTTP，并且得到的被转录的核酸可以通过在C核糖核苷酸上的RNaseA进行切割，但对在T脱氧核糖核苷酸上的RNaseA的切割有抗性。通过选择性使用非可切割核苷例如dNTP以及通过利用RNase例如RNaseA和RNaseT1实施碱基特异性切割，可以在同一靶核酸序列的不同转录物上实施三种不同核苷酸碱基的特异性的碱基切割。例如，特定靶核酸分子的转录物可以利用RNaseT1进行G特异性切割；在转录反应中，转录物可以利用dTTP进行C特异性切割，随后用RNaseA消化；在转录反应中，转录物可以利用dTTP进行T特异性切割，随后用RNaseA消化。

在另一个具体实施方式中，利用dNTP、不同RNase以及靶核酸分子的两个取向，可以允许6种不同的切割图谱。例如，双链靶核酸分子可以产生两种不同的单链转录产物，其可以称为靶核酸分子正向链的转录产物和靶核酸分子反向链的转录产物。两种不同转录产物中的每一种可以进行三种独立的碱基特异性切割反应，例如本文所描述的G特异性切割、C特异性切割以及T特异性切割，以引起6种不同的碱基特异性切割。6个可能的切割图谱列于表1中。使用4种不同的碱基特异性切割反应可以产生靶核酸分子一条链中所有4种核苷酸碱基的信息。也就是说，考虑到正向链的切割可以通过切割反向链上的互补碱基而模拟，正向链4个核苷酸的碱基特异性切割可以通过参照反向链的切割而完成。例如，三个碱基特异性切割反应可以在靶核酸分子正向链的转录物上进行，以产生靶核酸分子正向链的G-、C-以及T-特异性切割；第四个碱基特异性切割反应可以是靶核酸分子反向链转录物的T-特异性切割，其结果将相当于靶核酸分子正向链转录物的A-特异性切割。本领域的技术人员将通晓，产生靶核酸分子一条链所有4个核苷酸碱基信息的碱基特异性切割可以利用可能的碱基特异性切割反应的多种不同组合完成，包括表1中提供的用于RNaseT1和RNaseA的切割反应和用于正向链或负向链的其他切割反应，和/或利用非水解性核苷酸，可用本领域已知的或者本文披露的其他碱基特异性RNase实施的切割反应。

表1

	正向引物	反向引物
			RNaseT1	G特异性切割	G特异性切割
RNaseA；dCTP	T特异性切割	T特异性切割
			RNaseA；dTTP	C特异性切割	C特异性切割

在一个实施例中，RNaseU2可以用来碱基特异性切割靶核酸分子转录物。RNaseU2可以在A核苷酸上碱基特异性切割RNA。因此，通过利用RNaseT1、U2和A以及通过利用适当的dNTP(与RNaseA联合使用)，通过碱基特异性切割靶核酸分子仅一条链的转录物，可以分析靶核酸分子的所有4种碱基位置。在某些具体实施方式中，当利用仅碱基特异性切割4种核糖核苷酸中一种的RNaseA实施碱基特异性切割时，非可切割的三磷酸核苷不是必需的。例如，RNaseT1、RNaseCL3、cusativin或者RNaseU2用于碱基特异性切割时，不需要在靶核酸分子转录物中存在非可切割的核苷酸。使用诸如RNaseT1和RNaseU2的RNase可以产生靶核酸分子中所有4种核苷酸碱基的信息。例如，可以合成靶核酸分子或扩增产物的正向链和反向链的转录物，且每个转录物均可以利用RNaseT1和RNaseU2进行碱基特异性切割。所得的4种切割反应的切割模式将产生靶核酸分子一条链中所有4种核苷酸碱基的信息。在这种具体实施方式中，可以进行两个转录反应：正向靶核酸分子的第一转录反应和反向靶核酸分子链的第二转录反应。

还计期望用于方法的是多种不同的碱基特异性切割方法。多种不同的碱基特异性切割方法在本领域是已知的和本文所描述的，包括酶促碱基特异性RNA切割、酶促碱基特异性DNA切割以及化学性碱基特异性DNA切割。例如，酶促碱基特异性切割如利用尿嘧啶-脱糖基酶(UDG)或甲基胞嘧啶脱糖基酶(MCDG)的切割在本领域是已知的和本文所描述的，并可以与本文描述的酶促RNase介导的碱基特异性切割反应联合实施。

b.核酸分子的内切核酸酶断裂

内切核酸酶是对断裂核酸分子非常有用的一类示例性酶。内切核酸酶切割核酸分子链内的键(bonds)。内切核酸酶可以对双链或单链核酸分子特异。切割可以在核酸分子内或在特异性序列上随机发生。随机切割双链核酸分子的内切核酸酶经常与核酸分子的骨架相互作用。核酸分子的特异性断裂可以在连续反应中或同时利用一种或多种酶而实现。均质或异质核酸分子可以被切割。

限制内切核酸酶是内切核酸酶的一个亚类，其能识别双链核酸分子内的特异序列，并且通常切割识别序列内或与其接近的两条链。一个在DNA分析中常用的酶是HaeIII，其在5’-GGCC-3’序列上切断DNA。其它示例性限制内切核酸酶包括AccI、AflIII、Alu IAlw44I，ApaI，AsnI，AvaI，AvaII，BamHI，BanII，BclI，BglI.BglII，BlnI，BsmI，BssHII，BstEII，CfoI，ClaI，DdeI，DpnI，DraI，EclXI，EcoRI，EcoRI，EcoRII，EcoRV，HaeII，HaeIII，HindII，HindIII，HpaI，HpaII，KpnI，KspI，MluI，MluNI，MspI，NciI，NcoI，NdeI，NdeII，NheI，NotI，NruI，NsiI，PstI，PvuI，PvuII，RsaI，SacI，SalI，Sau3AI，ScaI，ScrFI，，SfiI，SmaI，SpeI，SphI，SspI，StuI，StyI，SwaI，TaqI，XbaI，XhoI这些酶的切割位点在本领域是已知的。另外期望的是TypeII S限制内切核酸酶，从其识别位点的下游切割。

根据所使用的酶，在核酸分子中的切割可以得到一条链的突出末端、另一条链也称为“粘”末端。例如，BamHI产生黏附性5’突出末端，而KpnI产生黏附性3’突出末端。可替换的，切割可以得到不具有突出末端的“平”末端。例如，DraI切割产生平末端。限制性酶可以切割含有一个或多个甲基化核苷酸的序列而不切割未甲基化同等序列、可以特异性切割不含甲基化核苷酸的序列而不切割含有一个或多个甲基化核苷酸的同等序列、或者可以切割一个序列而不管序列中一个或多个核苷酸的甲基化状态。在一个实施例中，切割识别位点可以被甲基化掩盖。

限制性内切核酸酶可以用来产生多种核酸分子片段的大小。例如，CviJI是一种在两碱基和三碱基DNA序列之间识别的限制性内切核酸酶。通过CviJI的彻底消化可以得到平均长度为16～64个核苷酸的DNA片段。因此，通过CviJI的部分消化可以以一种类似于剪切或声波降解法的“准”随机方式断裂DNA。CviJI通常在G和C之间切割RGCY，得到易于克隆的平末端，其中R是任何一种嘌呤而Y是任何一种嘧啶。在存在1mM ATP和20％二甲基亚砜时，切割的特异性变松散，并且CviJI还切割RGCN和YGCY位点。在这些“星”的条件下，CviJI切割产生准随机消化，此时消化的或切割的DNA可以为选定大小的。

在另一个具体实施方式中，CviJI可以用来特异性切割具有甲基化CpG重复的核酸序列。在这种具体实施方式中，CviJI在所述“星”的条件下应用，使得大多数NGCY和RGCN序列被CviJI切割。例如，当靶核酸分子或扩增产物用重亚硫酸盐处理时，靶核酸分子或扩增产物中存在GC二核苷酸可以意味甲基化C核苷酸的存在；因此，在NGCY或RGCN上切割则可以表示在切割位点上存在甲基化C。

用于利用限制性内切核酸酶断裂核酸分子的方法在本领域是广为人知的。在一个示例性方案中，制备20～50μl的反应混合物，含有：DNA 1～3μg；限制酶缓冲液1X；以及限制性内切核酸酶(2单位/1μgDNA)。合适的缓冲液在本领域也是已知的，包括合适的离子强度、辅助因子、以及可选的pH缓冲液，为酶促活性提供最优条件。特异性酶需要的特异性缓冲液，其通常可从所述酶的供应商处得到。一个示例性的缓冲液是谷氨酸钾缓冲液(KGB)。Hannish，J.and M.McClelland，″Activity of DNA modification and restrictionenzymes in KGB，a potassium glutamate buffer，″Gene Anal.Tech 5：105(1988)；McClelland，M.et al.″A single buffer for all restriction endonucleases，″Nucl.Acids Res.16：364(1988)反应混合物在37℃下孵育1小时或者任何产生预期大小或尺寸范围的片段所需要的时间段。反应可以通过在65℃或80℃(根据需要)加热混合物而终止。可替换的，反应可以通过用例如EDTA螯合二价阳离子如Mg²⁺而终止。

在特殊的具体实施方式中，可以使用多于一种酶来断裂核酸分子。如果酶在相似条件(例如离子强度、温度或pH)下均有活性，则多种酶可以用于同一个反应中；或者多种酶可以用于序列反应中。典型的，多种酶均可以用于标准缓冲液例如KGB。当使用限制酶时，所述核酸分子可以被部分或彻底消化。

DNAse也可以用来产生核酸分子片段。Anderson，S.”ShotgumDNA sequencing using cloned DNase I-generated fragments，″Nucl.Acids Res.9：3015-3027(1981).DNaseI(脱氧核糖核酸酶I)是一种将双链和单链DNA非特异性消化成多核苷酸和单核苷酸的内切核酸酶。酶能够对单链和双链DNA以及染色质起作用。

II型脱氧核糖核酸酶用于核酸研究中的多种应用包括在酸性pH下的DNA测序和消化。来自于猪脾脏的脱氧核糖核酸酶II的分子量为38,000道尔顿。酶是具有二聚体结构的糖蛋白内切核酸酶。离子强度为0.15M时，最优的pH范围是4.5～5.0。脱氧核糖核酸酶II水解天然和变性DNA中的脱氧核糖核苷酸linkage，产生具有3’-磷酸的产物。在pH值为5.6～5.9时，还可以作用于p-硝基苯基磷酸二酯。Ehrlich，S.D.et al.″Studies on acid deoxyribonuclease.IX.5′-Hydroxy-terminal and penultimate nucleotides of oligonucleotides obtained from calf thymusdeoxyribonucleic acid，″Biochemistry 10(11)：2000-2009(1971).

内切核酸酶可以对具体类型的核酸分子特异。例如，内切核酸酶可以对DNA或RNA特异性，或对单链或双链核酸分子特异。内切核酸酶可以为序列特异或非序列特异。例如，核糖核酸酶H是一种特异性降解RNA-DNA杂交体中的RNA链的内切核酸酶。核糖核酸酶A是一种在C和U残基上特异性攻击单链RNA链的内切核酸酶。核糖核酸酶A催化切割位于核苷酸的5’核糖和连接于邻近嘧啶核苷酸3’核糖的磷酸基团之间的磷酸二酯键。所得到的2’，3’-环磷酸可以水解为相应的3’-磷酸核苷。RNaseT1仅在G核糖核苷酸上消化RNA，在鸟苷酸残基的3’-羟基和侧翼核苷酸的5’-羟基之间切割。RNaseU2仅在A核糖核苷酸上消化RNA。碱基特异性消化的实例可以在Stanssens等人.WO 00/66771公开申请中查到。

Benzonase^TM、核酸酶P1以及磷酸二酯酶I是适于产生200个碱基对或小于200个碱基的核酸分子片段的非特异性内切核酸酶。Benzonase^TM(Novagen，Madison，WI)是一种基因工程内切核酸酶，其降解所有形式的DNA和RNA(单链、双链、线性和环状)，且可以用于宽范围的操作条件。酶将核酸彻底消化成长度为终止为2～5碱基寡核苷酸的5’-一磷酸，。美国专利第5,173,418号中提供了用于Benzonase^TM的核苷酸和氨基酸序列，用于如本文提供的方法的核酸断裂可以通过二核苷酸(“2切割酶”)或松散型二核苷酸(“1-1/2切割酶”或“1-1/4切割酶”)切割特异性而实现。二核苷酸特异性切割试剂为本领域技术人员所通晓(参见，例如WO 94/21663；Cannistraro et al.Eur.J.Biochem.181：363-370(1989)；Stevens etal.J.Bacteriol.164：57-62(1985)；Marotta et al.Biochemistry 12：2901-2904(1973).

核苷酸特异性切割可以通过靶核酸分子或扩增产物的酶促和/或化学修饰而加以控制。例如，感兴趣的靶核酸分子转录物可以用常规底物和α-硫代底物(α-thio-substrate)的混合物来合成，随后磷硫酰核苷酸间linkage可以通过使用诸如烷基卤(例如碘乙酰胺、碘乙醇)或2，3-环氧-1-丙醇的试剂烷化而加以修饰。预计通过这种修饰形成的磷硫酰键不是RNase的底物。其他不被RNase切割的示例性核苷酸包括2’氟代核苷酸、2’脱氧核苷酸和2’氨基核苷酸。在利用这种步骤的一个实施例中，根据所需要的切割特异性，通过整合非可水解的核苷酸可将RNaseA的切割特异性限制于CpN或UpN二核苷酸。因此，在一个RNaseA对CpG核苷酸特异的实例中，转录物(靶分子)可以通过将αS-dUTP、αS-ATP、αS-CTP和GTP核苷酸整合入转录物而制备。有用的二核苷酸特异性切割试剂的集合可以通过利用其他RNase而进一步扩充，例如RNase-U2和RNase-T1。在单特异性RNase例如RNase-T1情况下，根据选择哪种核苷酸为非可切割，利用非可切割核苷酸可以将CpN键的切割限制于四种可能的CpN键中的任何三个、两个或一个。这些选择性修饰策略还可以用来防止在同聚物束上每一个碱基的切割，通过选择性修饰同聚物束内某些核苷酸以使得修饰核苷酸对切割抗性较弱或较强。

c.核酸酶断裂

利用核酸酶从核酸分子末端去除多种不同长度的碱基，可将大单链核酸分子断裂成小核酸分子。用于去除单链核酸分子末端的示例性核酸酶包括但不限于S1、Bal31以及绿豆核酸酶。例如，绿豆核酸酶将单链DNA降解成5’末端带有磷酸基团的单或多核苷酸。双链核酸如果暴露于非常大量的这种酶，也可以被彻底消化。

内切核酸酶是还可以从核酸分子例如DNA分子末端切割核苷酸的蛋白质。已知存在5’内切核酸酶(从DNA链的5’末端切割DNA)和3’内切核酸酶(从链的3’末端切割DNA)。例如，内切核酸酶III是3’至5’内切核酸酶，其从DNA链的3’末端释放5’单核苷酸；酶是水解3’-末端的磷酸一酯的DNA3’-磷酸酶；而且酶是AP内切核酸酶，其在无嘌呤或无嘧啶位点切割磷酸二酯键，以生成无碱基的5’磷酸脱氧核糖残基的5’末端。另外，酶具有RNase H活性；它将优先降解DNA-RNA杂交双链中的RNA，其可能是通过外切核酸裂解。在哺乳动物细胞中，主要的DNA 3’-外切核酸酶是DNaseIII(也称TREX-1)。因此，通过利用外切核酸酶降解核酸分子的末端可以形成片段。

d.核酸的酶断裂

催化性DNA和RNA在本领域是已知的，并且可以用来切割核酸分子以产生核酸分子片段。Santoro，S.W.and Joyce，G.F.″A general purpose RNA-cleaving DNA enzyme，″Proc.Natl.Acad.Sci.USA 94：4262-4266(1997).作为单链分子的DNA可以折叠成类似于RNA的三维结构，而且2’-羟基对于催化作用是非必需的。如同核糖核酸酶，通过选择也可以使DNAzyme依赖辅助因子。在用于RNA水解的组氨酸依赖的DNAzyme，已经证明这一点。美国专利第6,326,174号和第6,194,180号披露了脱氧核糖核酸酶、催化性和酶促性DNA分子，其能够切割核酸序列或分子，尤其是RNA。

核糖核酸酶用于切割核酸分子在本领域是已知的，而核糖核酸酶是催化化学反应例如切割共价键的RNA。Uhlenbeck揭示了一种小的活性核酶“锤头状核酶”，其中所述催化链和底物链是分开的(Uhlenbeck，Nature 328：596-600(1987))。这种核酶通过碱基配对相互作用结合底物RNA、切割被结合的靶RNA、释放切割产物并再循环，因此核酶可以多次重复这个过程。Haseloff和Gerlach列举了能够反向作用的小锤头状核酶的设计原则(Haseloff et al.Nature，334：585-591(1988))。研究人员已经开发了多种具有高切割特异性的不同锤头状核酶，而设计具有预期底物特异性的锤头状核酶的一般途径在本领域是已知的，如美国专利5,646,020号和6,096,020号所示例的。具有反向切割活性的核酶的另一种类型是起源于δ肝炎病毒基因组的δ核酶。Ananvoranich和Perrault阐述了δ核酶切割底物特异性的因素(Ananvoranich et al.J.Biol.Chem.273：13812-13188(1998))。发夹型核酶也可用于反向切割，且发夹型核酶的底物特异性原则也是已知的(参见，例如Perez-Ruiz et al.J.Biol.Chem.274：29376-29380(1999))。本领域的技术人员可以利用已知的底物特异性原则来选择核酶，并设计可获得预期核酸分子切割特异性的核酶序列。

DNA切割酶或DNase可以用来识别并切割DNA双链中的一条。多种切割酶是已知的。其中，例如具有下列酶切位点的NY2A

NY2A：5′...R AG...3′

3′...YTC...5′where R＝A or Gand Y＝C or T

NYS1：5′...CC[A/G/T]...3′

切割酶和NYS 1切割酶：3′...GG[T/C/A]...5′.

随后对来自切割酶反应的产物进行化学处理，引起磷酸骨架的切割并产生片段。

Fen-1断裂方法涉及Fen-1酶，该酶是位点特异性核酸酶，已知为“侧翼”内切核酸酶(美国专利5,843,669、5,874,283和6,090,606号)。这种酶识别并切割由杂交到靶核酸DNA链的两个寡核苷酸交迭产生的DNA“侧翼”。这种切割是高度特异的，并且可以识别单碱基变异，可检测感兴趣核苷酸基因座的单个甲基化碱基。Fen-1酶可以是诸如核酸酶的Fen-1例如人类、鼠类和Xenopus XPG酶和酵母RAD2核酸酶，或者诸如内切核酸酶的Fen-1，来自于例如M.jannschii，P.furiosus和P.woesei。

另一个可用的技术是DNA嵌合体的切割，三重(tripartite)DNA-RNA-DNA探针被杂交到靶核酸分子上，例如M肺结核特异性序列。一旦加入RNAseH，三联探针的RNA部分被降解，释放出DNA部分(Yule，Bio/Technology 12：1335(1994))。

2.核酸分子的物理性断裂

核酸分子断裂可以利用物理或机械力而实现，包括机械剪切力和声波降解法。例如，核酸分子的物理性断裂可以利用流体动力实现。典型的，通过反复推动含有核酸分子的溶液使其进出配有针头的注射器，可剪切溶液中的核酸分子。Thorstenson，Y.R.et al.″An Automated Hydrodynamic Process forControlled，Unbiased DNA Shearing，″Genome Research 8：848-855(1998)；Davison，P.F.Proc.Natl.Acad.Sci.USA 45：1560-1568(1959)；Davison，P.F.Nature 185：918-920(1960)；Schriefer，L.A.et al.″Low pressure DNA shearing：a method for random DNA sequence analysis，″Nucl.Acids Res.18：7455-7456(1990)典型的，用皮下针头剪切DNA产生的多数片段在1～2kb的范围内，尽管少数片段可以短至300bp。

用于剪切核酸分子包括基因组DNA的设备已有市售。示例性设备利用注射器抽吸，通过推动DNA样品经过突然缩小的小平面而产生流体动力性剪切力。Thorstenson，Y.R.et al.″An AutomatedHydrodynamic Process for Controlled，Unbiased DNA Shearing，″Genome Research 8：848-855(1998)剪切体积通常为100～250μl，且处理时间小于15min。样品的剪切可以通过计算机控制而完全自动化。

Oefner等人开发的流体动力点渗透剪切法是一种利用流体动力剪切核酸分子的方法。Oefner，P.J.et al.″Efficient randomsubcloning of DNA sheared in a recirculating point-sink flow system，″Nucl.Acids Res.24(20)：3879-3886(1996).“点渗透”指的是流体动力在这种系统中流动的理论模型。应变速率张量描述施加于分子上的动力及因此导致的分子破裂。DNA断裂归因于这种张量的“剪切”力，这类断裂的方法称为剪切。断裂既可以由剪切力引起(当流体在细孔或针孔内时)，也可以由伸张应变力引起(当流体接近针孔时)。点渗透剪切可利用诸如HPLC泵的泵施加压力而强迫核酸分子(例如DNA)穿过非常小的直径管而实现。所得到的片段具有严格的尺寸范围，其中最大片段约为最小片段的两倍。片段的大小与流动速率成反比。

核酸分子片段还可以通过振荡溶液中的大核酸分子而获得，例如通过混合、掺杂(blending)、搅动或涡旋溶液。Hershey，A.D.and Burgi，E.J.Mol.Biol.2：143-152(1960)；Rosenberg，H.S.and Bendich，A.J.Am.Chem.Soc.82：3198-3201(1960).溶液可以用不同长度的时间进行振荡，直到获得预期大小或大小范围的片段。向溶液中加入珠子或粒子有助于断裂核酸分子。

一种物理性断裂核酸分子的合适方法是基于声波裂解所述核酸分子。Deininger，P.L.″Approaches to rapid DNA sequence analysis，″Anal.Biochem.129：216-223(1983).典型的，利用声波裂解法产生核酸分子片段如下实施：将含有缓冲的核酸分子的微离心管置于超声波仪(例如，杯型破碎头超声波仪)内的冰水浴中，并用最大输出和连续功率以短脉冲超声不同的次数。短脉冲可以持续约10秒。参见例如Bankier，A.T.et al.″Random cloning and sequencing by theM13/dideoxynucleotide chain termination method，″Meth.Enzymol.155：51-93(1987).在一个示例性的声波裂解方案中，根据声波裂解的条件如持续时间和声波裂解强度，声波裂解大核酸分子得到的片段范围为300～500bp或2～10kb。Kawata，Y.et al.″Preparation of a Genomic Library Using TA Vector，″Prep.Biochem & Biotechnol.29(1)：91-100(1999).

在声波裂解期间，增加温度可以得到不均匀的片段分布模式，为此，水浴的温度可以小心监测，必要时可以加入新鲜的冰水。一个确定超声裂解法的特异条件的示例性方案包括将溶于350μl合适缓冲液中的约100μg核酸分子样品，分成10份，每份35μl，其中5份进行较多次10秒脉冲超声。在每一次10秒脉冲之间，将所述管置于冰水浴中至少约1min，以冷却核酸分子样品。如需要，在每个样品之间，可以重置超声波仪内的冰水浴。将样品离心以回收浓缩物，并将其中一份在琼脂糖凝胶上电泳，与分子量标记物(sizemarker)作比较。根据从琼脂糖凝胶电泳检测的片段分子量范围，剩余的5个管可以相应的声波裂解以获得预期片段大小。

还可以利用喷雾器实现核酸分子的断裂。Bodenteich，A.Chissoe，S.Wang，Y.-F.and Roe，B.A.(1994)In Adams，M.D.Fields，C.and Venter，J.C.(eds)Automated DNA Sequencing and Analysis.Academic Press，San Diego，CA.喷雾器在本领域是已知的，且已有市售。一个利用喷雾器断裂核酸分子的示例性方案包括将2毫升含有25～50％甘油的缓冲的核酸分子溶液(约50μg)置于冰水浴中，然后溶液暴露于压力8～10psi的气体蒸汽例如氮气，达2.5分钟。应该理解，可以使用任何气体尤其是惰性气体。气体压力是片段大小的首要决定因素。变化压力可以产生不同的片段大小。冰水浴用于喷雾法，可以用来生成分布均匀的片段。类似的，可以利用高压雾化喷射器而生成片段。Cavalieri，L.F.and Rosenberg，B.H.J.Am.Chem.Soc.81：5136-5139(1959).

另一种用于断裂核酸分子的方法利用缓冲的核酸分子溶液的反复冷冻和融化。核酸分子样品可以按照需要冷冻和融化，产生预期大小或大小范围的片段。另外，可以用离子或粒子轰击核酸样品，以产生多种大小的片段。例如，核酸分子可以在真空下暴露于萃取离子束。在7kV*q下，离子从电子束离子陷阱萃取，并指到靶核酸分子上。核酸分子可以照射任何时间长度，典型的为几小时，直到例如获得100个离子/μm²的总流量。

还可以通过照射核酸分子而实现核酸分子断裂。典型的，诸如γ射线或x射线的照射将足够用来断裂核酸分子。通过调整暴露于照射的强度和持续时间可以调整片段大小。也可以利用紫外线照射。还可以调整暴露的强度和持续时间而将对核酸分子的非预期效应降到最低。

煮沸核酸分子也可以产生片段。典型的，在恒定振荡下将核酸分子溶液煮沸达几小时，可以获得约500bp的片段。片段的大小可以随着煮沸的持续时间而变化。

3.核酸分子的化学性断裂

化学性断裂可用来断裂核酸分子，以碱基特异性或无需碱基特异性。核酸分子可以通过化学反应而断裂，包括例如水解反应包括碱水解和酸水解。因为RNA(或非配对碱基)在碱性条件下不稳定，所以碱性条件可以用来断裂含有切割酶或RNA的核酸分子。见Nordhoff et al.″Ion stability of nucleic acids in infrared matrix-assistedlaser desorption/ionization mass spectrometry，″Nucl.Acids Res.21(15)：3347-3357(1993).DNA在酸存在下尤其是强酸例如6M HCl存在时可以被水解。温度可以升高到室温以上，以促进水解。根据反应条件和反应时间的长度，核酸分子可以被断裂成多种大小包括单碱基片段。在精密条件下，水解可以打断脱氧核苷与嘌呤和嘧啶碱基之间的磷酸酯键以及N-糖苷键。

一个用于产生核酸分子片段的示例性的酸/碱水解的方案是已知的(参见例如Sargent et al.Meth.Enz 152：432(1988))。简单而言，1克DNA溶于50毫升0.1N NaOH中；加入1.5毫升浓盐酸，并迅速混合溶液。DNA将立刻沉淀，搅动不应该超过几秒以防止形成大的聚集体。样品在室温下孵育20min以部分脱嘌呤(depurinate)DNA。随后，加入2毫升10N NaOH(0.1N的OH-浓度)，并搅动样品直到DNA完全重溶；然后将样品在65℃下孵育30分钟以水解DNA。典型尺寸范围可以在250～1000个核苷酸之间，但根据水解条件可以变动到更低或更高范围。

化学性切割也可为特异性的。例如，选定的核酸分子可以通过烷化而切割，尤其是磷硫酰修饰的核酸分子(参见，例如：K.A.Browne，″Metal ion-catalyzed nucleic Acid alkylation and fragmentation，″J.Am.Chem.Soc.124(27)：7950-7962(2002))。磷硫酰修饰的烷化使得核酸分子易于在修饰位点被切割。I.G.Gut和S.Beck描述了将DNA烷化用于质谱分析的方法。I.G.Gut and S.Beck，″A procedure for selective DNA alkylation and detectionby mass spectrometry，″Nucl.Acids Res.23(8)：1367-1373(1995).

多种用于碱基特异性和碱基非特异性化学切割寡核苷酸的其他化合物和方法在本领域是已知的，并预期用于本文提供的断裂方法中。例如，碱基特异性切割可以利用化合物而实现，例如甲酸哌啶、哌啶、二甲基硫酸盐、肼和氯化钠、肼。例如，利用二甲基硫酸盐和哌啶可以在G核苷酸碱基特异性切割DNA；利用二甲基硫酸盐、哌啶和酸可以在A和G核苷酸碱基特异性切割DNA；利用肼和哌啶可以在C和T核苷酸碱基特异性切割DNA；利用肼、哌啶和氯化钠可以在C核苷酸碱基特异性切割DNA；利用强碱可以在A核苷酸碱基特异性切割DNA，在C核苷酸切割特异性较低。

4.断裂方法的组合

片段可以利用本文描述的断裂方法的任何组合而形成，例如利用碱基特异性切割方法的组合、酶或剪切与序列特异性酶的组合。用于产生特异性片段的方法可以与用于产生随机片段的方法组合。另外，用于产生随机片段的不同方法可以组合，并且用于产生特异性片段的不同方法可以组合。例如，一种或多种在特异位点切割核酸分子的酶可以与一种或多种在不同位点特异性切割核酸分子的酶联合应用。在另一个实施例中，切割特定种类核酸分子的酶可以联合应用，例如，RNase与DNase或单链特异核酸酶的组合可以与双链特异核酸酶联合应用，或者外切核酸酶可以与内切核酸酶联合应用。在另一个实施例中，随机切割核酸分子的酶可以与特异性切割核酸分子的酶联合应用。断裂法的联合应用指的是在核酸分子上一种接一种或同时实施一种和多种方法。

如本文所预期的，联合应用可以包括在核酸分子样品的第一部分应用第二断裂法，而在核酸分子样品的第二部分应用第二断裂法。两个样品在随后的检测和质量测定方法中可以分别分析，或者可以集中到一起，在随后的检测和质量测定方法中可以同时分析。断裂法的组合可以包括2种或多种断裂法、3种或多种断裂法、或者4种或多种断裂法。

a.碱基特异性断裂

作为靶核酸分子甲基化状态的函数，靶核酸分子或扩增产物的序列修饰可以得到反映靶核酸分子甲基化状态的碱基特异性切割模式。因此，具有相同核苷酸序列的两种核酸分子甲基化状态的差异，可以导致两种核酸分子的碱基特异性切割模式的差异。反映靶核酸分子甲基化状态改变的碱基特异性切割模式的类型改变包括：核苷酸的甲基化或缺乏甲基化，其可以在核酸分子中引入新的可切割位点，并且得到两个较短片段而非一个较大片段；核苷酸的甲基化或缺乏甲基化，其可以将不可切割位点引入到靶核酸分子中，并且得到一个较大片段而非两个较短片段；甲基化或缺乏甲基化，可导致片段核苷酸组成的变化，造成质量位移。这三种在碱基特异性切割模式中的变化，在表2中加以例证，该表是形成自重亚硫酸盐处理的核酸分子的转录物的碱基特异性切割。这些碱基特异性切割模式变化中的每一种可以包含可以用于DNA甲基化分析的信息，如本文所描述的。

表2

                未甲基化      变化类型    甲基化

                TAAATGTAT                 TAAACGTAT

RNAseAC特异性切割	TAAATGTAT	新信号	TAAAC GTAT
				RNAseAT特异性切割	TAAAT GT AT	连接信号	T   AAACGTAT
RNAseT1G特异性切割	TAAATG TAT	质量位移	TAAACG TAT

特定的核苷酸序列TAAACGCAT的理论切割片段，该片段如果在第5位胞嘧啶为甲基化，则通过重亚硫酸盐处理转化成TAAACGTAT，如果不是甲基化的则将转化成TAAATGTAT。

可用于甲基化状态鉴定中的片段质量模式包括存在片段、缺乏片段以及相对于参照物的片段质量。利用片段质量鉴定甲基化状态可以通过将片段质量与参考核酸序列、参考片段质量或推算出的片段质量进行比较。利用片段质量鉴定甲基化状态可以与确定全部或部分靶核酸分子核苷酸序列联合实施。利用片段质量鉴定甲基化状态还可以仅通过测定片段质量而进行，无需与参照物或核酸序列进行比较。

i.缺乏片段

缺乏片段可以鉴定核酸为甲基化或未甲基化，或者鉴定其含有一个或多个甲基化或未甲基化核苷酸，以及还可以用来鉴定靶核酸分子中甲基化或未甲基化核苷酸的数量。缺乏片段可以鉴定甲基化或未甲基化核苷酸的基因座，或者可以鉴定核苷酸基因座的甲基化状态。

可以进行单个碱基特异性切割反应以确定靶核酸分子中任何核苷酸碱基是否为甲基化或未甲基化。在一个具体实施方式中，在U核糖核苷酸(对于转录物或其反向链，为A核糖核苷酸)上特异性切割的单个碱基特异性切割反应，当靶核酸分子含有一个或多个未甲基化C核苷酸并用重亚硫酸盐进行处理时，可以得到N个靶核酸分子片段(其中N＝两个或多个)。在这种实施例中，存在最大数量的可能片段(即N＝M+Q+1，其中M是核酸分子中存在的C核苷酸总数，而Q是核酸分子中存在的U核苷酸总数)可以表示靶核酸分子的每一个C核苷酸均为未甲基化的。存在小于最大数量的片段(即：N＜M+Q+1)可以表示一个或多个C核苷酸是甲基化的(例如，甲基化C核苷酸的数量＝(M+Q+1)-N)。

还可能鉴定缺乏的片段，且利用片段的identity(特性)来鉴定甲基化或未甲基化核苷酸的基因座，并因此确定一个或多个核苷酸基因座的甲基化状态。在这种方法中，一个或多个缺乏的片段可以与参考片段质量、参考核苷酸序列例如靶核酸序列、或者片段质量和/或序列的数据库进行比较，而且通过比较，可以鉴定靶核酸分子序列中一个或多个缺乏片段的位置。例如，重亚硫酸盐处理的靶核酸分子的U特异性切割可以得到的切割模式，相对于参照物，缺乏一个或多个片段。缺乏参照物片段可以表示在缺乏一个片段序列的5’和(/或3’末端存在一个或两个甲基化的胞嘧啶基因座。鉴定靶核酸序列中缺乏片段的位置以及甲基化核苷酸片段内基因座可以鉴定靶核酸中的甲基化核苷酸基因座。另外，某些观察到的片段可以作为缺乏切割的结果而产生，并因此代替两个或多个缺乏片段而存在。观察到的片段和缺乏片段与参考片段的比较可以用来确定缺乏片段的数量和位置，并从而确定观察到的片段代表的甲基化核苷酸基因座的数量(例如，当观察到的片段代替两个缺乏片段而存在时，一个核苷酸可以是甲基化的；当观察到的片段代替三个缺乏片段而存在时，两个核苷酸可以是甲基化的)。因此，鉴定靶核酸序列中缺乏片段的位置以及甲基化的核苷酸片段内的基因座可以鉴定靶核酸序列中甲基化的核苷酸基因座，且可以用来确定基因座是甲基化的。

缺乏第一片段可以造成第二片段的缺乏以及第三片段的存在(例如，当在第一和第二片段之间无切割时，产生第三片段)。利用诸如本文所描述的那些方法，本领域的技术人员可以将这种来自于片段缺乏的信息中的任何一种或全部，用于鉴定一个或多个缺乏片段的位置、鉴定新片段的定位，从而鉴定：靶核酸分子为甲基化的或未甲基化的或含有一个或多个甲基化或未甲基化核苷酸；靶核酸分子中甲基化或未甲基化核苷酸的数量；甲基化或未甲基化核苷酸的基因座；或核苷酸基因座的甲基化状态。

在另一个实施例中，缺乏一个或多个片段可以表示靶核酸分子中存在一个或多个未甲基化核苷酸。当靶核酸分子用重亚硫酸盐处理并随后进行C特异性切割时，峰值的数量将比靶核酸中存在的甲基化胞嘧啶的数量多一个。当存在的片段小于最大数量时，缺乏片段的数量可以等于未甲基化胞嘧啶的数量。另外，C特异性切割的缺乏片段和存在片段与参照物的比较可以用来鉴定未甲基化胞嘧啶的基因座。

缺乏片段还可以用来鉴定具体核苷酸基因座的甲基化状态，甚至无需鉴定参考核酸分子中由片段代表的核苷酸序列部分。例如，当用重亚硫酸盐处理在已知核苷酸基因座具有单个C核苷酸的靶核酸分子时，在C特异性切割后缺乏一个片段(即仅存在一个“片段”而非两个片段)可以鉴定核苷基因座为未甲基化的。在另一个实施例中，当靶核酸分子不含T核苷酸而仅含一个C核苷酸时，在U特异性切割后缺乏片段(即仅存在一个“片段”而非两个片段)可以鉴定核苷基因座为甲基化的。

ii.存在片段

存在片段质量可以鉴定所述靶核酸为甲基化的或未甲基化的、或者含有甲基化或未甲基化核苷酸，还可以用来鉴定靶核酸分子中甲基化或未甲基化核苷酸的数量。存在片段质量还可以鉴定甲基化或未甲基化核苷酸基因座，或可以鉴定核苷酸基因座的甲基化状态。

在一个实施例中，当重亚硫酸盐处理的含有一个或多个甲基化C核苷酸的靶核酸分子在特异性切割C核苷酸(或在反向转录物的G核糖核苷酸)的反应中被碱基特异性切割时，可以得到两个或多个核酸分子片段。在这种实施例中，存在片段的数量可以表示靶核酸分子中为甲基化的不同C核苷酸的数量(典型的，N-1个甲基化的C核苷酸，其中N是不同核酸分子片段的数量)。例如，当进行C特异性切割反应时，完全非甲基化的靶核酸分子得到的核酸分子不具有任何切割位点，不产生任何切割产物，并且因此仅得到一个“片段”(即全长核酸分子)。当使用含有一个甲基化胞嘧啶的靶核酸分子时，核酸分子被切割一次，以产生两个切割片段。因此，核酸分子的单个碱基特异性切割反应，随后检测切割片段，可以用来鉴定靶核酸分子为甲基化的、或含有甲基化核苷酸，并且还可以用来鉴定靶核酸分子中甲基化核苷酸的数量。进行这种甲基化状态鉴定，需要或无需将片段质量与来自于参考核酸的参考核酸序列或者片段测定值或推算值进行比较；或者需要或无需确定靶核酸分子的核苷酸序列。

存在片段还可以用来鉴定未甲基化核苷酸，并且还可以鉴定未甲基化核苷酸的数量。例如，当进行重亚硫酸盐处理的靶核酸分子的U特异性切割时，任何未甲基化C核苷酸将被转化成U/T，而且将在U特异性切割中被切割。比靶核酸中存在的U核苷酸的数量多两个或多个片段时，可以表示靶核酸分子中存在一个或多个未甲基化的胞嘧啶(即M＝N-(Q+1)个片段，其中M是核酸分子中存在的未甲基化C核苷酸的数量，N是片段的数量，而Q是核酸分子中存在的U核苷酸的总数)。因此，存在的片段可以表示靶核酸分子含有未甲基化的胞嘧啶，还可以表示靶核酸分子中未甲基化的胞嘧啶的数量。

还可能鉴定存在的片段，且利用片段的特性来鉴定甲基化或未甲基化核苷酸的基因座，并因此确定核苷酸基因座的甲基化状态。在这种方法中，一个或多个存在的片段可以与参考片段质量、参考核苷酸序列例如靶核酸序列、或者片段质量和/或序列的数据库进行比较，而且通过这种比较，可以鉴定靶核酸分子序列中一个或多个存在片段的位置。例如，在观察到的样品片段中存在参考片段可以表示在缺乏片段序列的5’和/或3’末端存在一个或两个甲基化或未甲基化的胞嘧啶基因座。某些观察到的片段可以作为缺乏切割的结果而产生，并因此代替两个或多个缺乏片段而存在。观察到的片段和缺乏片段与参考片段的比较可以用来确定由观察到的片段代表的甲基化或未甲基化的核苷酸基因座的数量。因此，鉴定靶核酸序列中观察到的片段的位置以及甲基化或未甲基化的核苷酸片段内的基因座可以用来确定基因座是甲基化或未甲基化的，且可以用来鉴定一个或多个核苷酸基因座的甲基化状态。

存在第一片段可以造成第二片段的存在以及第三片段的缺乏(例如，当存在第三片段的切割时，则产生第一和第二片段)。利用诸如本文所描述的方法，本领域的技术人员可以将这种来自于片段存在的信息中的任何一种或全部用于鉴定一个或多个其他片段的位置、鉴定缺乏片段的位置，从而鉴定：靶核酸分子为甲基化的或未甲基化的或含有一个或多个甲基化或未甲基化核苷酸；靶核酸分子中甲基化或未甲基化核苷酸的数量；甲基化或未甲基化核苷酸的基因座；或者核苷酸基因座的甲基化状态。

存在一个片段还可以用来鉴定具体核苷酸基因座的甲基化状态，甚至无需鉴定参考核酸分子中由片段代表的核苷酸序列部分。例如，当用重亚硫酸盐处理在已知核苷酸基因座具有单个C核苷酸的靶核酸分子时，在C特异性切割后存在两个或多个片段可以鉴定核苷基因座为甲基化的。在另一个实施例中，当靶核酸分子不含T核苷酸而仅含一个C核苷酸时，在U特异性切割后存在两个或多个片段可以鉴定核苷基因座为未甲基化的。

iii.与参照物的比较

片段的质量或相对质量可以通过与参考质量进行比较而确定，其中参考质量可以是参考核酸分子或参考核酸分子一个片段的分子量表示(representation)。相对于参考质量的片段质量位移、或与参考质量相同的片段质量可以鉴定靶核酸为甲基化或未甲基化的、或含有甲基化或未甲基化的核苷酸，或可以用来鉴定靶核酸分子中甲基化或未甲基化核苷酸的数量。在另一个具体实施方式中，相对于参考质量的片段质量位移或与参考质量相同的片段质量可以鉴定甲基化或未甲基化核苷酸的基因座，或可以鉴定核苷酸基因座的甲基化状态。

在一个实施例中，在G核糖核苷酸(或对于反向链的转录物，为C核糖核苷酸)上特异性切割的碱基特异性切割可以得到含有C核苷酸基因座的片段。当靶核酸分子中一个或多个C核苷酸基因座为未甲基化时，片段在那些基因座上将含有U或T核苷酸。当靶核酸分子中一个或多个C核苷酸基因座为甲基化时，片段在那些基因座上将含有C核苷酸。C和U核苷酸之间的质量差异是1Da(当两者均为脱氧核糖核苷酸或者两者均为核糖核苷酸时)，而在C和T核苷酸之间的质量差异是15Da(当两者均为脱氧核糖核苷酸或者两者均为核糖核苷酸时)。因此，用一个U或T取代C时，将分别引起1Da和15Da片段的质量位移。当片段含有多个C核苷酸基因座时，由一个或多个U或T核苷酸取代C核苷酸产生的质量位移可以确定靶核酸分子中甲基化和未甲基化C核苷酸基因座的数量。例如，对于靶核酸分子内含有5个C核苷酸基因座的RNA片段，如果其中三个C核苷酸基因座为未甲基化的，相对于代表5个甲基化的C核苷酸基因座的参照物，将观察到3Da的质量位移，而相对于代表5个未甲基化的C核苷酸基因座的参照物，将观察到2Da的质量位移。

尽管C和U的质量仅相差1Da，多种本文披露或本领域已知的方法中的任何一种可以用来增加代表C的核苷酸与代表U的核苷酸之间的差异，使得质量位移更易于测定。可替换的，T可以用于取代U以增加相对于C的质量位移。

利用参考序列或片段或数据库可以用来表示测定的片段具有与参考序列/片段相同或不同的组成。例如，参考片段与测定的片段质量相同时可以鉴定测定的片段具有与参考片段相同的核苷酸组成。在另一个实施例中，参考片段与测定的片段质量不同时可以鉴定相对于参考片段测定的片段具有与之不同的核苷酸组成。另外，参考片段与测定的片段之间的质量差异可以用来鉴定测定的片段的核苷酸组成。例如，相对于测定的片段，参考片段的质量增加2Da可以表示：相对于测定的片段，参考片段含有2个其他的U核苷酸，以及相对于参考片段测定的片段含有两个其他的胞嘧啶。因此，测定的片段具有与参考片段相同的质量可以用来鉴定靶核酸为甲基化或未甲基化的、或含有甲基化或未甲基化核苷酸，用来鉴定靶核酸分子中甲基化或未甲基化核苷酸的数量，用来鉴定甲基化或未甲基化核苷酸的基因座，或用来鉴定核苷酸基因座的甲基化状态。另外，相对于参考片段，测定的片段具有质量位移可以用来鉴定靶核酸为甲基化或未甲基化的、或含有甲基化或未甲基化核苷酸，鉴定靶核酸分子中甲基化或未甲基化核苷酸的数量，鉴定甲基化或未甲基化核苷酸的基因座，或鉴定核苷酸基因座的甲基化状态。

可以实施碱基特异性切割反应以鉴定靶核酸分子中一个或多个甲基化或未甲基化核苷酸的基因座。碱基特异性切割并将片段与参照物比较可以用来鉴定所有甲基化或未甲基化基因座，或鉴定靶核酸分子中所有基因座的甲基化状态。例如，可以进行单个碱基特异性切割反应，并将得到的片段与来自参考核酸的片段进行比较。测定的核酸分子片段与参考核酸片段的比较可以用来鉴定所述靶核酸分子中甲基化或未甲基化核苷酸的基因座。在另一个实施例中，当靶核酸分子的断裂模式与已知胞嘧啶核苷酸基因座甲基化状态的参考核酸匹配时，参考核酸可以用来鉴定靶核酸分子中胞嘧啶基因座的甲基化状态。在另一个实施例中，可以进行单个碱基特异性切割反应，并将得到的片段与两个或多个参考核酸的序列或切割模式进行比较。在这种实施例中，如果参考核酸分子的切割模式与测定的片段质量匹配，则其序列可以鉴定为与靶核酸分子序列相同。参考核酸片段和断裂模式可以通过实验确定或可以利用本领域已知的或本文描述的方法进行推测。

在一个具体实施方式中，来自同一次测定的两个测定片段(例如，来自同一个质谱的两个质量峰值)可以用作彼此的参考片段。例如，当核酸样品含有异质核酸时(例如，当样品含有来自多个生物体的基因组DNA时)，可以使用这种方法。在这种具体实施方式中，可以实施一个或多个碱基特异性切割反应以形成核酸分子片段，其中一个或多个片段的质量位移可以表示存在或缺乏一个或多个甲基化核苷酸，例如甲基化胞嘧啶。例如，扩增产物可以利用RNaseT1进行G特异性切割，当靶核酸分子在特定的C核苷酸均为甲基化时，含有该特定核苷酸基因座的片段可以具有相同的第一质量(first mass)。当所有靶核酸分子在该特定C核苷酸均为未甲基化时，含有该核苷酸基因座的片段可以具有相同的第二质量(second mass)。当样品含有在特定C核苷酸基因座为甲基化的核酸分子以及在该C核苷酸基因座为未甲基化的核酸分子的混合物时，断裂可以得到具有第一质量和第二质量的片段。这些片段可以互相作为参考片段进行比较，以确定在特定核苷酸基因座甲基化核苷酸相对于未甲基化核苷酸的量。例如，确定第一质量和第二质量峰值大小的比值可以确定在该C核苷酸为甲基化的核酸分子数量相对于在该C核苷酸为未甲基化的核酸分子数量。半甲基化DNA样品(例如，来自二倍体细胞的DNA，其中两个相关核酸区域中的一个区域含有甲基化的核苷酸而另一个区域含有未甲基化的核苷酸)可以得到数量相当的甲基化和未甲基化核酸分子片段(即：比约为50/50)。

在另一个具体实施方式中，来自于不同质量测定的片段(例如，来自于不同质谱的两个质量峰值)可以作为彼此的参考片段。例如，这种方法可以用来比较两个或多个样品例如两个或多个异质样品中甲基化核酸分子的相对量。可替换的，来自不同质量测定的片段可以进行比较，其中一个片段对应于未知或检测样品，而另一个片段对应于已知参照物。在这些具体实施方式中，可以实施一个或多个碱基特异性切割反应以形成核酸分子片段，其中一个或多个片段中的质量位移可以表示存在或缺乏一个或多个甲基化核苷酸例如甲基化胞嘧啶。例如，扩增产物可以利用RNaseT1进行G特异性切割。当靶核酸分子在特定的C核苷酸均为甲基化时，含有该特定核苷酸基因座的片段可以具有相同的第一质量。当所有靶核酸分子在该特定C核苷酸均为未甲基化时，含有该核苷酸基因座的片段可以具有相同的第二质量。当样品含有在特定C核苷酸基因座为甲基化的核酸分子以及在该C核酸基因座为未甲基化的核酸分子的混合物时，断裂可以得到第一质量和第二质量的片段。在这种实施例中，一个或两个片段可以与另一个样品的片段或参考物进行比较，以确定在特定核苷酸基因座甲基化核苷酸相对于未甲基化核苷酸的量。例如，确定第一样品中片段、第二样品的第二片段或者参照物的峰值大小的比，可以确定相对于第二样品或参照物，其甲基化程度为增加或减少；或确定在该C核苷酸为甲基化的核酸分子数量相对于在该C核苷酸为未甲基化的核酸分子数量。在一个实施例中，将进行比较的片段的强度加以标准化。例如，两个样品或一个样品和一个参照物，可以往其中加入已知量的标记核酸或者可以以在特定样品中相对恒定的标记核酸分子进行标准化，例如组成性表达的管家基因。在这种实施例中，待比较片段的强度首先用标记核酸分子进行标准化，片段相对于标记的量可以互相比较，确定两个样品中或样品相对于参照物的甲基化的量，或者确定在该C核苷酸为甲基化的核酸分子数量相对于在该C核苷酸为未甲基化的核酸分子数量。

在另一个具体实施方式中，相对量可以通过比较三个片段而测定。当甲基化核苷酸的存在引起切割而甲基化缺乏不引起切割时，将得到两个较小的甲基化核酸分子片段和一个较大的未甲基化核酸分子片段。在这种情况下，两个片段的测定量可以与一个片段的测定量进行比较，以推算甲基化核苷酸与未甲基化核苷酸的比。在另一个具体实施方式中，当核苷酸为甲基化时产生一个较大片段，而当核苷酸为未甲基化时形成两个较小片段；在这种情况下，将一个片段的测定值与两个片段的测定值进行比较，以推算甲基化核苷酸与未甲基化核苷酸的比。

b.多个碱基特异性切割反应

在其他具体实施方式中，两个或多个碱基特异性切割反应可以用来提供靶核酸分子中特定核苷酸基因座的甲基化状态信息。例如，第一碱基特异性切割反应可以用来鉴定特定核苷酸基因座的甲基化状态(即：任何靶核酸分子在该核苷酸基因座是否是甲基化的)，而第二碱基特异性切割反应可以用来鉴定在该核苷酸基因座甲基化核苷酸相对于未甲基化核苷酸的量。

两个或多个碱基特异性切割反应还可以用来提供冗余信息，用来确证对核苷酸基因座是甲基化或未甲基化的鉴定，还可以用来提供定量测定的其他信息，例如存在于靶核酸分子特定核苷酸基因座的甲基化与未甲基化核苷酸的比。两个或多个碱基特异性切割反应还可以用来确定大的靶核酸分子的甲基化状态。例如，靶核酸分子可能太大，而不能在单个碱基特异性切割反应中测定所有的核酸分子片段的准确质量，因此靶核酸分子中某些核苷酸的甲基化状态可能是不可测定的。当两个或多个另外的碱基特异性切割反应用来产生另外的一组或多组核酸分子片段时，可以测定每个覆盖靶核酸分子不同区域的碱基特异性切割反应的核酸分子片段，而且可以比单个碱基特异性切割反应提供关于较大数量的靶核酸分子核苷酸基因座甲基化状态的信息。在一个具体实施方式中，当进行两个或多个碱基特异性切割反应时，可以确定所有待讨论的核苷酸基因座的甲基化状态。

本领域的技术人员可以决定达到预期的甲基化状态鉴定完整性和冗余度水平所必需的切割反应的数量，利用如根据核酸分子的断裂和质量测定来确定核苷酸序列的方法。本文描述了利用切割和质量测定来确定核苷酸序列的示例性方法，并且可以在2003年4月25日提交的另案在审的的美国临时申请序列号60/466/006(代理人案号P2070)以及于2002年11月27日提交的60/429/895(代理人案号P2073)中查到，而且在本领域是已知的，如在Stanssens等人.Genome Res.14：126-133(2004)中所例证的。

c.序列信息和甲基化状态鉴定

靶核酸分子中一个或多个甲基化或未甲基化的核苷酸基因座可以在鉴定靶核酸分子的核苷酸序列之后或同时进行鉴定。当甲基化或未甲基化核苷酸基因座在核苷酸序列鉴定之后进行鉴定时，核苷酸序列可以通过已知的测序方法获得，或者通过查阅包含靶核酸分子序列的数据库例如公共数据库而获得。

核苷酸序列确定方法还可以基于本文提供的断裂和质量测定方法，因此，甲基化状态鉴定和核苷酸序列确定可以同时进行。当使用甲基化特异性试剂例如重亚硫酸盐，作为靶核酸分子甲基化状态的函数而修饰所述序列时，靶核酸分子的序列确定可以与第二靶核酸分子的序列确定一起进行。这种第二核酸分子可以包括处理过的靶核酸分子或未处理的靶核酸分子的反向链。这样，预处理核苷酸序列(其可以在确定处理过的核苷酸序列之后进行确定)可以用来区分未修饰的核苷酸和来自于甲基化核苷酸的修饰的核苷酸(例如，可以区分来自于野生型靶核酸分子核苷酸序列的T核苷酸和来自于重亚硫酸盐处理的未甲基化C核苷酸的T核苷酸)。

示例性的核苷酸序列确定方法包括：构建并仔细研究测序图；对候选序列评分并确定序列变异；以及其他本领域已知的方法。例如，当进行部分或随机断裂时，用于确定靶核酸分子序列的方法可以包括的步骤例如断裂靶核酸分子，确定至少两个片段的分子量，确定至少两个片段的可能组成，根据每个片段中未被切割的切割位点的数量将至少两个片段的可能组成进行排序，构建至少一个理论上能表示至少两个片段的规则(ordered)组成的测序图，对一个或多个潜在的候选序列进行评分并确定拟合度的秩次，以及仔细研究traverse至少一个测序图以重建靶生物分子的一个或多个潜在的候选序列。利用部分或随机切割确定核苷酸序列的示例性方法可以在2003年4月25日提交的另案在审的美国临时申请序列号60/466/006(代理人案号P2070)中查到。

在另一个实施例中，当进行完全断裂时，用于确定靶核酸分组序列的方法可以包括的步骤例如通过用一种或多种特异性切割试剂接触分子将靶核酸分子切割成片段，使用同样的切割试剂将一个或多个参考核酸分子切割或模拟切割成片段，确定靶核酸分子和参考核酸片段的质量信号，鉴定靶核酸分子与一个或多个参考核酸分子之间差异的片段，确定相应于为复合体(compomer)witnesses的差异片段的复合体，其中复合体为片段的核苷酸碱基组成，确定候选序列相对于每一复合体witnesses的序列变异，对候选序列进行评分，以及确定多个靶核酸分子中的序列变异。利用完全断裂确定核苷酸序列的示例性方法可以在2002年11月27日提交的另案在审美国临时申请序列号60/429/895(代理人案号P2073)中查到。

F.靶核酸分子片段的检测

如本文列出的，用于甲基化状态鉴定的方法可以包括核酸分子检测方法。这些检测方法包括本领域中已知的方法。核酸分子检测方法包括凝胶电泳、毛细管电泳、杂交方法例如Southern或Northern印迹分析、核酸阵列杂交、质谱分析以及其他这种方法。在一个具体实施方式中，核酸分子可以通过确定一个或多个靶核酸分子片段的分子质量而检测，其中所述靶核酸分子片段利用本文披露的或本领域已知的方法而形成。例如，一个或多个靶核酸分子的质量可以利用质谱分析而确定，包括MALDI-TOF质谱分析。

1.质谱分析

在本文提供的方法中，可以进行质谱分析以确定原子、分子或分子片段的荷质比。典型的，可以利用质谱仪检测原子、分子或分子片段的质量。多种质谱分析形式中的任何一种可以被利用，包括任何离子源、配置和检测器。这些形式包括但不限于基质辅助激光解吸电离飞行时间质谱(MALDI-TOF)、电喷雾电离(ESi)、IR-MALDI(参见，例如公开的国际PCT申请99/57318号以及美国专利5,118,937号)、离子回旋共振质谱仪Ion CyclotronResonance(ICR)、傅里叶变换线性/反射仪(RETOF)以及其组合(参见，例如Aebersold and Mann，March 13，2003，Nature，422：198-207(例如，在图2中)，为适合应用于本文提供的方法的示例性质谱分析方法的综述)。典型的，MALDI方法包括UV-MALDI或IR-MALDI。核酸可以通过本领域已知的依赖质谱分析的检测方法和方案而进行分析(参见，例如美国专利5,605,798号、6,043,031号、6,197,498号、6,428,955号、6,268,131号以及国际专利申请WO96/29431号、国际PCT申请WO98/20019号以及美国专利公开20030129589号)。这些方法可以通过本领域已知的方法和设备而自动化(参见例如美国专利公开20020009394，其中描述了一种自动化加工线)。

中等分辨率仪器，包括但不限于弯曲场反射或延迟引出飞行时间MS仪器，也可以改善DNA检测用于测序或诊断。两种方法中的任何一个均能够检测≥30mer的链中9Da(Δm(A-T))的位移。

a.质谱分析样品

当使用诸如MALDI的质谱分析法进行分析时，可将纳升体积的样品装载于芯片上，应用这样的体积可得到定量或半定量的质谱分析结果。例如，在所得的质谱中的峰下面积与样品成分的相对浓度成比例。用于制备和使用这种芯片的方法在本领域是已知的，如在美国专利6,024,925号、美国公开申请20010008615以及PCT申请PCT/US97/20195(WO 98/20020)号中所例证的；用于制备和使用这种芯片的方法还在共同另案在审的美国申请序列号08/786,988、09/364/774以及09/297,575中提供。用于进行这些分析的芯片和试剂盒商购自SEQUNOM，商标为MassARRAY^TM。MassARRAY^TM系统包含小型化阵列例如

对于MALDI-TOF(基质辅助激光解吸电离飞行时间质谱)质谱分析迅速传送结果很有用。可以准确区分不带标签的遗传变异体相关的DNA片段大小中单个碱基的变化。

i.被测定的核酸分子的特征

在一个具体实施方式中，测定在断裂步骤中形成的所有核酸分子片段的质量。靶核酸分子片段或扩增产物片段的测定质量还可以称为“样品”测定质量，与来自参考核酸片段的“参考”质量形成对比。

在另一个具体实施方式中，用质谱法测定其质量的核酸分子片段的长度为不长于75个核苷酸、不长于60个核苷酸、不长于50个核苷酸、不长于40个核苷酸、不长于35个核苷酸、不长于30个核苷酸、不长于27个核苷酸、不长于25个核苷酸、不长于23个核苷酸、不长于22个核苷酸、不长于21个核苷酸、不长于20个核苷酸、不长于19个核苷酸、或不长于18个核苷酸。

在另一个具体实施方式中，用质谱法测定其质量的核酸分子片段的长度为不少于3个核苷酸、不少于4个核苷酸、不少于5个核苷酸、不少于6个核苷酸、不少于7个核苷酸、不少于8个核苷酸、不少于9个核苷酸、不少于10个核苷酸、不少于12个核苷酸、不少于15个核苷酸、不少于18个核苷酸、不少于20个核苷酸、不少于25个核苷酸、不少于30个核苷酸或不少于35个核苷酸。

在一个具体实施方式中，进行质量测定的核酸分子片段是RNA。在另一个具体实施方式中，进行质量测定的靶核酸分子片段是DNA。在另外一个具体实施方式中，进行质量测定的靶核酸分子片段包含一个修饰的或非典型核苷酸(即：在DNA中除了脱氧C、T、G或A以外的核苷酸，或在RNA中除了C、G或A以外的核苷酸)。例如，转录反应的核酸分子产物可以含有核糖核苷酸和脱氧核糖核苷酸的组合物。在另一个实施例中，核酸分子可以含有典型存在的核苷酸以及质量修饰的核苷酸，或者可以含有典型存在的核苷酸以及非天然存在的核苷酸。

ii.调节

在进行质谱分析之前，可以处理核酸分子以提高分辨率。这些过程称为分子的调节。例如，分子可以加以“调节”以降低挥发所需的激光能量，和/或者将断裂最小化。多种用于核酸分子调节的方法在本领域是已知的。调节的一个实例是修饰核酸分子的磷酸二酯骨架(例如，通过阳离子交换)，对于消除由于每个核苷酸单位结合的阳离子的异质性引起的峰加宽可以是有用的。在另一个实施例中，用烷化剂例如碘化烷、碘乙酰胺、β-碘乙醇、或2，3-环氧-1-丙醇接触核酸分子，可以将核酸分子的单硫代磷酸二酯键转化成磷酸三酯键。类似的，使用例如三烷基甲硅烷基氯化物(trialkylsilylchlorides)可以将磷酸二酯键转化成不带电的衍生物。进一步调节可以包括整合可降低脱嘌呤(MS期间的断裂)敏感性的核苷酸，例如：嘌呤类似物如N7-或N9-deazapurine核苷酸，或RNA构建单元或利用寡核苷酸三酯或整合烷化的磷硫酰官能团、或采用寡核苷酸模拟物例如PNA。

iii.多重以及质量修饰

为了某些应用，可以同时检测多于一个核酸分子片段。在其他应用中，例如可以利用不同固相支持物上的寡核苷酸或寡核苷酸模拟阵列进行平行处理。“多重”可以通过几种不同的方法学而实现。例如，来自几个不同核酸分子的片段可以同时进行质量测定法。典型的，在多重质量测定中，核酸分子片段应该是足够可区分的，使得可能同时检测多种核酸分子。通过利用将使用的质量测定方法确保片段的质量为可区分的，而实现核酸分子片段的可区分性。这一点可以通过序列本身(组成或长度)或者通过将质量修饰官能团引入一个或多个核酸分子而实现。

在一个具体实施方式中，待进行质量测定的核酸分子含有连接到该分子上的一个或多个质量修饰基团。质量修饰基团在本领域是已知的，且可以连接到核酸分子片段的3’末端或5’末端，可以连接到核酸碱基或者核苷酸的糖基上，或者可以连接到核苷酸之间磷酸二酯键的取代物上。一种简单的质量修饰可以通过将H用卤素如F、Cl、Br和(或)I或拟卤素例如SCN、NCS取代而实现，或者通过利用不同的烷基、芳基、芳烷基基团例如甲基、乙基、丙基、异丙基、t-丁基、己基、苯基、或官能团例如N₃、CH₂F、CHF₂、CF₃、Si(CH₃)₃、Si(CH₃)₂C₂H₅、Si(CH₃)₂(C₂H₅)₂、Si(CH₃)(C₂H₅)₂、Si(C₂H₅)₃。另外一种质量修饰可以通过核酸分子(例如，检测器(D))或三磷酸核苷连接同肽(homo-)或异肽(heteropeptides)而实现。一个在产生质量修饰的种类(质量增加57)中非常有用的实例是连接寡甘氨酸，例如可以实现质量修饰74、131、188、245。还可以使用简单的寡酰胺，例如可以获得质量修饰74、88、102、116等。

质量修饰还可以包括寡/聚乙烯乙二醇衍生物。寡/聚乙烯乙二醇还可以通过较低的烷基例如甲基、乙基、丙基、异丙基、t-丁基和其他合适的取代基而单烷化。其他化学物质也可以用于质量修饰的化合物中(参见，例如那些在Oligonucleotides and Analogues，，A Practical Approach，F.Eckstein，editor，IRL Press，Oxford，1991中描述的)。

质量修饰基团可以连接到例如：寡核苷酸的5’末端、核酸碱基、磷酸骨架、核苷2’位置和/或末端3’位置上。质量修饰基团的实例包括例如卤素、叠氮基、或类型XR，其中X是连接基团而R是质量修饰官能团。例如，质量修饰官能团可以用来将确定的质量增加值引入到寡核苷酸分子，如本文所描述的。在磷酸二酯键引入的修饰例如通过α-硫代三磷酸核苷，其优点在于这些修饰不干扰精确的Watson-Crick碱基配对并且还可进行完整的核酸分子的一步合成后位点特异性修饰，例如通过烷化反应(参见，例如Nakamaye et al.Nucl.Acids Res.16：9947-9959(1988))。示例性的质量修饰官能团是硼修饰的核酸，通过聚合酶可以有效地将其整合入核酸中(参见例如Porter et al.Biochemistry 34：11963-11969(1995)；Hasan et al.Nucl.Acids Res.24：2150-2157(1996)；Li et al.Nucl.Acids Res.23：4495-4501(1995))。

此外，可以加入质量修饰官能团，以影响链终止，例如通过将其连接到三磷酸核苷中糖环的3’位。对于本领域的技术人员，多种组合显而易见的可以用于本文提供的方法中。这样，本领域的技术人员将认识到，通过官能团和连接位置的多种变异和组合，链延长的三磷酸核苷也可以以相似的方式进行质量修饰。

不同的质量修饰的核苷酸可以用来同时模拟检测多种不同的核酸片段。在一个具体实施方式中，质量修饰可以在扩增期间被整合。在另一个具体实施方式中，不同靶核酸分子的多重可以通过质量修饰一种或多种靶核酸分子而实现，如需要，其中每种不同的靶核酸分子可以进行不同的质量修饰。

2.其他质量测定方法

本领域中已知的其他质量测定方法可以用于质量测定的方法中，包括电泳方法例如凝胶电泳和毛细管电泳，以及层析方法包括分子筛层析和反相层析。

3.确定质量峰的特征

利用诸如本文描述的质量分析方法，可以获得靶核酸分子片段相关的信息。可从质量测定获得的其他质量峰的信息包括峰的信噪比、峰面积(例如可由峰下面积或半高峰宽来代表)、峰高、峰宽、相对于一个或多个其他质量峰的峰面积、相对于一个或多个其他质量峰的峰高以及相对于一个或多个其他质量峰的峰宽。这些质量峰特征可以用于现有的甲基化鉴定方法中，例如通过扩增片段的至少一个质量峰特征与一个或多个参考核酸的一个或多个质量峰特征的比较，而鉴定靶核酸分子核苷酸基因座甲基化状态的方法。

4.基于杂交的检测方法

在本文的方法中可以采用基于杂交的检测方法。通常，这种方法检测具有特定核苷酸序列的核酸的存在，通过检测探针寡核苷酸与样品核酸之间的杂交而实现，例如靶核酸分子、靶核酸分子片段，其中探针寡核苷酸可以用可检测的或可结合的基团标记，或者可以连接到底物或固相支持物上。大量基于杂交的核酸检测方法在本领域是已知的，包括但不限于Southern印迹分析、Nouthern印迹分析、基于芯片的杂交方法和原位杂交。探针寡核苷酸可以连接到底物或固相支持物上例如珠子、膜或板；可以含有可检测的成分例如荧光化合物、化学发光化合物、放射性核素、可切割质量标记物；或者可以含有可结合成分例如生物素、磁珠或多组氨酸。

在一个具体实施方式中，待用杂交检测的核酸分子或核酸分子片段的序列是已知序列。因此，探针寡核苷酸可以设计为与核酸分子或核酸分子片段的特定序列杂交。探针寡核苷酸与核酸分子或核酸分子片段的杂交可以用来鉴定靶核酸分子含有一个或多个甲基化核苷酸，鉴定靶核酸分子上一个或多个甲基化核苷酸基因座，或鉴定靶核酸分子中一个或多个核苷酸基因座的甲基化状态。探针寡核苷酸与核酸分子或核酸分子片段的杂交还可以用来鉴定靶核酸分子不含有任何甲基化的核苷酸或鉴定靶核酸分子上一个或多个未甲基化的核苷酸基因座。

G.片段测定分析

靶核酸分子可以根据靶核酸分子的甲基化状态扩增，然后根据本文提供的方法进行断裂，并且片段的存在可以根据本文提供的方法进行测定例如通过质谱分析。片段的测定例如片段质量的测定可以提供大量关于靶核酸分子中甲基化的信息。例如，片段质量可以告知靶核酸分子是否含有甲基化核苷酸、核苷酸基因座是否为甲基化的、以及甲基化或未甲基化核苷酸基因座的位置。片段测定可以与参照物(可以包括参考质量)进行比较，或者仅片段数量即可提供关于靶核酸分子中甲基化的信息。同一个靶核酸分子的不同断裂模式可以提供关于靶核酸分子中甲基化的其他和/或交迭信息。

1.甲基化状态鉴定

片段测定可用来鉴定靶核酸分子的甲基化状态或鉴定靶核酸分子特定核苷酸基因座的甲基化状态。片段测定可用来鉴定靶核酸分子是否含有一个或多个甲基化或未甲基化的核苷酸，例如分别为甲基胞嘧啶或胞嘧啶；确定靶核酸分子中存在的甲基化或未甲基化核苷酸的数量，例如分别为甲基胞嘧啶或胞嘧啶；鉴定核苷酸基因座在靶核酸分子中例如胞嘧啶基因座是甲基化或未甲基化的；鉴定甲基化或未甲基化核苷酸在靶核酸分子中的核苷酸基因座，例如分别为甲基胞嘧啶或胞嘧啶；确定样品中甲基化的靶核酸分子相对于未甲基化的靶核酸分子的比；确定在靶核酸分子上特定核苷酸基因座的甲基化核苷酸相对于该基因座未甲基化核苷酸的比；以及提供冗余信息以进一步确证本文提供的任何一个确定。

片段测定可用来鉴定靶核酸分子是否含有甲基化或未甲基化的核苷酸，或者用来鉴定靶核酸分子中存在的甲基化或未甲基化核苷酸的数量，其中靶核酸分子或扩增产物在单个碱基特异性切割反应中断裂。片段测定可用来鉴定两个或多个靶核酸分子是否含有甲基化或未甲基化的核苷酸，或者用来鉴定两个或多个靶核酸分子中存在的甲基化或未甲基化核苷酸的数量，其中靶核酸分子或扩增产物在单个碱基特异性切割反应中断裂。片段测定可用来鉴定靶核酸分子是否含有甲基化或未甲基化的核苷酸，或者用来鉴定靶核酸分子中存在的甲基化或未甲基化核苷酸的数量，其中靶核酸分子或扩增产物在两个或多个碱基特异性切割反应中断裂。片段测定可用来鉴定两个或多个靶核酸分子是否含有甲基化或未甲基化的核苷酸，或者用来鉴定两个或多个靶核酸分子中存在的甲基化或未甲基化核苷酸的数量，其中靶核酸分子或扩增产物在两个或多个碱基特异性切割反应中断裂。

a.无需参照物的鉴定方法

片段测定可用来鉴定靶核酸分子是否含有甲基化或未甲基化的核苷酸，或者用来鉴定靶核酸分子中存在的甲基化或未甲基化核苷酸的数量，需要或无需将片段测定与一个或多个参考分子、序列、片段或质量进行比较。例如，当靶核酸分子用重亚硫酸盐进行处理、然后进行C特异性切割反应时，两个或多个不同片段质量的存在可以无需参照任何其他核苷酸分子或序列或片段或质量(例如，不与参考核核苷酸质量或参考核苷酸序列进行比较)，即可表示靶核酸分子中一个或多个C核苷酸是甲基化的。在另一个实施例中，当靶核酸分子用重亚硫酸盐进行处理、然后进行C特异性切割反应时，两个或多个不同片段质量的存在可以无需参照任何其他核苷酸分子或序列或片段或质量，即可表示靶核酸分子中甲基化的C核苷酸的数量。

b.利用参照物的鉴定方法

在其他具体实施方式中，一个或多个参照物可以用于甲基化鉴定方法。在某些情况下，对于靶核酸分子所在的区域，可能存在之前已知的序列(例如，公共数据库序列)。在这些情况下，参考核酸可以通过试验获得，而片段质量可以利用本领域已知的方法或本文披露的方法通过实验来测定。在这些情况下，对于特定的参考核酸组成、甲基化特异性试剂以及断裂方法，还可以推算参考核酸分子片段序列和质量，。

在其他情况下，即使靶核酸分子的序列未知，但由靶核酸分子包含的区域的核酸片段质量模式可以是已知的。例如，已知的核酸片段质量模式可以为来自于特定核酸分子的碱基特异性切割的质量模式，所述特定核酸分子具有已知的甲基化状态，和/或含有已知数量的甲基化或未甲基化核苷酸。在一个实施例中，一个个体染色体的一部分可能具有已知的甲基化状态或已知数量的甲基化或未甲基化核苷酸以及一组已知的片段质量，但该部分的核苷酸序列部分或全部未知。在这种情况下，甲基化鉴定方法可以比较靶核酸分子或扩增产物片段的测定质量与一种或多种试验确定的参考质量模式，以确定靶核酸的甲基化状态或者靶核酸中甲基化或未甲基化核苷酸的数量。

i.核酸分子序列已知

当靶核酸分子的序列已知时，推算或实验的方法可以鉴定一种或多种可以用于甲基化鉴定方法中的片段测定。实验的方法可以在已知含有甲基化的核苷酸的参考核酸分子上、已知不含有甲基化核苷酸或已知在特定基因座含有甲基化或未甲基化核苷酸的参考核酸上来实施，这种参考核酸分子可以用甲基化特异性试剂处理、切割，且可以测定质量片段。利用含有确定的甲基化或未甲基化核苷酸基因座的参考核酸分子序列可以产生推算，并预测作为甲基化特异性试剂处理和切割的结果而产生的质量片段。例如，在已知核苷酸基因座具有甲基化胞嘧啶的参考核酸分子可以用重亚硫酸盐处理、转录、用RNaseT1碱基特异性切割所述转录物并测定所述切割片段的质量。利用已知核苷酸序列信息或与未甲基化参考核酸分子的切割进行比较，可以鉴定表示所述甲基化胞嘧啶的片段质量。来自于用重亚硫酸盐和RNaseT1处理的靶核酸分子的片段质量可以与参考片段质量进行比较，以表示甲基化胞嘧啶的存在或缺乏。

在实验确定或推算的情况下，试剂、核苷酸组成(例如：RNA、DNA、质量修饰的核苷酸)、以及所使用的碱基特异性切割将与那些用于靶核酸分子的相同。例如，参考核酸分子和靶核酸分子均用重亚硫酸盐处理、转录并用RNaseT1进行碱基特异性切割。

本文提供的方法还包括在甲基化鉴定方法中利用一种或多种但少于全部的片段质量。例如，一个参考核酸片段质量可以用来鉴定靶核酸分子含有至少一个甲基化或未甲基化核苷酸、一个参考核酸片段可以用来鉴定靶核酸分子核苷酸基因座的甲基化状态、一个参考核酸片段可以用来鉴定核苷酸基因座为甲基化或未甲基化的。

推算可以用来预测断裂模式，以鉴定与靶核酸分子或扩增的产物片段的一个或多个测定质量峰值特征相同或不同的质量。这种推算方法可以产生所有质量峰值特征中的任何一个或全部，包括质量、峰面积以及质量峰值的信噪比。靶核酸分子或扩增的产物片段的一个或多个测定质量峰值特征区别于来自未甲基化参考核苷酸序列片段的推算的质量峰值特征，可以鉴定靶核酸分子为甲基化的，且可以提供一个或多个甲基化核苷酸的基因座。靶核酸分子或扩增的产物片段的一个或多个测定质量峰值特征区别于来自甲基化参考核苷酸序列片段的推算的质量峰值特征，可以鉴定靶核酸分子为未甲基化的，且可以提供一个或多个未甲基化核苷酸的基因座。靶核酸分子或扩增的产物片段的一个或多个测定质量峰值特征与来自未甲基化参考核苷酸序列片段的推算的质量峰值特征相同，可以鉴定靶核酸分子为未甲基化的，且可以提供一个或多个未甲基化核苷酸的基因座。靶核酸分子或扩增的产物片段的一个或多个测定质量峰值特征与来自未甲基化参考核苷酸序列片段的推算的质量峰值特征相同，可以鉴定靶核酸分子为甲基化的，且可以提供一个或多个甲基化核苷酸的基因座。

通过重复推算这些不同的甲基化参考核酸分子，可能产生几种互相区别(且相互排斥)的片段质量模式以及可以用来鉴定靶核酸分子为甲基化或未甲基化的一种或多种质量峰值特征的几种不同组合，且可以提供一个或多个甲基化或未甲基化核苷酸的基因座。样品核酸分子片段的测定可以产生样品片段质量，其中所有片段质量或含有一个或多个样品片段质量的一部分可以与推算的表示甲基化状态的片段质量的一个或多个组合进行比较，而且推算的表示甲基化状态的片段质量的一个或多个组合可以与试验的片段质量峰值进行联系。然后，样品核酸分子的甲基化状态可以鉴定为推算的片段质量总和与试验的质量峰值最密切相关的参考核酸的甲基化状态，可选的，假如相关性高于用户定义的阈值量。

样品质量(或峰值特征)与参考质量(或峰值特征)的相关性可以用本领域的技术人员已知的多种方式中的任何一种来实施。例如，具有特定的观察或推算的质量和强度(例如，峰面积或信噪比)的参考质量可以仅存在于多种参考质量模式中的一种。检测具有基本相同的质量和强度(例如，在实验误差以内相同的质量和强度)的样品质量，可以用来鉴定同一个靶核酸分子内的核苷酸基因座具有与参考核酸的核苷酸基因座相同的甲基化状态。样品质量和参考质量之间的相关性可以利用统计学方法包括回归方法例如线性或非线性回归以及其他已知用于数据相关性的方法来实施。

在一个具体实施方式中，用户可以定义一个阈值，设定了参考核酸以足够可能性来鉴定靶核酸分子中甲基化或缺乏甲基化所必需的最小相关性。当不存在高于阈值的相关性时，则没有一个靶核酸能以足够可能性来鉴定靶核酸分子中甲基化或缺乏甲基化。当在一个或多个参考质量与样品靶核酸分子质量之间存在高于阈值的相关性时，具有最高相关性的参考核酸可以鉴定靶核酸分子中的甲基化或缺乏甲基化。

通过实验确定的质量和质量峰值特征可以与本文描述的推算的质量和质量峰值特征在靶核酸甲基化鉴定方法中的应用相同的方式来应用。另外，可以从参考核酸分子的实验性确定、推算或二者的组合而得到参考质量和/或质量峰值的数据库，所述数据库可以与本文描述的推算的质量和质量峰值特征在靶核酸甲基化鉴定方法中的应用相同的方式来应用。

ii.核酸分子序列未知

在一个具体实施方式中，靶核酸分子中存在甲基化或未甲基化的核苷酸可以利用核酸分子片段的质量模式来鉴定，而无需了解靶核酸分子的序列。例如，核酸分子片段的测定质量可以与一个或多个参考核酸分子片段进行比较，包括参考质量模式例如含有多个质量峰值的质谱，其中参考核酸分子中甲基化或未甲基化核苷酸的存在或缺乏是已知的，其中参考质量或参考质量模式与测定的质量或测定的质量模式相同则鉴定靶核酸分子具有与参考核酸分子相同的甲基化或未甲基化核苷酸，而参考质量或参考质量模式与测定的质量或测定的质量模式不同时则鉴定靶核酸分子具有不同于参考核酸分子的核苷酸甲基化状态。在这些方法中，对于鉴定靶核酸分子中存在甲基化或未甲基化核苷酸来说，靶核酸或参考核酸的核苷酸序列都是不必要。

实验性方法可以在核苷酸序列未知但已知含有甲基化核苷酸或已知含有未甲基化核苷酸的参考核酸分子上进行。这种参考核酸分子可以用甲基化特异性试剂处理、切割，且可以测定质量片段。这些参考核酸片段质量可以用来确定靶核酸分子中是否含有甲基化或未甲基化核苷酸以及确定靶核酸分子中存在的甲基化或未甲基化核苷酸的量。这种确定可以通过比较靶核酸分子片段的一种或多种质量(或质量峰值特征)与来自一种或多种参考核酸分子片段的一种或多种质量(或质量峰值特征)而实现。

在一种示例性的方法中，从样品靶核酸分子片段测定的一种或多种质量峰值特征，可以与从来自一种或多种参考核酸分子的一个或多个片段测定的一种或多种质量峰值特征进行比较，而且一种或多种参考核酸分子质量峰值可以与样品靶核酸质量峰值进行联系。然后，样品靶核酸分子的甲基化状态可以鉴定为和其所具有的一种或多种质量峰值与样品靶核酸分子的质量峰值最密切相关的参考核酸的甲基化状态相当，并且可选的，假设相关性高于用户定义的阈值量。因此，当含有靶核酸分子的区域的核苷酸序列未知时，即使待讨论的序列或部分的定位均不是已知的，靶核酸分子甲基化状态的鉴定可以通过鉴定特定的参考核酸具有相同的甲基化状态而实现。

c.质量峰值特征的应用

测定的质量可以具有三个或更多的鉴定特征，包括测定的质量、峰面积(例如，质量峰值下的面积)、以及质量信号的信噪比。本文预期少至1个或少至2个质量峰值特征可以用于本文披露的靶核酸分子甲基化鉴定方法中。当靶核酸分子的核苷酸序列已知时，一个或多个质量峰值的组合可以用来鉴定靶核酸分子中核苷酸的甲基化状态，其中所述组合表示一种或多种预测的质量峰值特征作为核苷酸序列和预测的靶核酸分子甲基化状态的结果。

在一个具体实施方式中，两个或多个质量峰值的特征用来鉴定靶核酸分子的甲基化状态。在这个方法中，两种或多种质量峰值特征的组合称为“模式”。例如，模式可以是两个或多个核酸分子片段的质量。在另一个实施例中，模式可以是两个或多个核酸分子片段的质量和强度。可以根据本文披露的甲基化鉴定方法使用靶核酸分子片段的质量峰值特征的模式。例如，来自样品靶核酸分子的模式可以与一个或多个参考核酸分子片段模式进行比较，与样品靶核酸分子片段模式最密切相关的参考片段模式表示样品核酸分子中的甲基化与匹配的参考核酸分子的甲基化相当。

2.获自片段测定分析的信息

本文提供的方法可以用来提供多种有关样品的不同类型信息中的任何一种。例如，方法可以用来检测样品中少量甲基化或未甲基化靶核酸分子，检测不完全胞嘧啶转化，以及鉴定靶核酸分子中多个核苷酸基因座的甲基化状态。

a.检测小量甲基化或未甲基化核酸

在一个具体实施方式中，本文提供的方法可以用来检测样品中小量甲基化或未甲基化靶核酸分子。作为多种因素中任何一种的结果，甲基化或未甲基化靶核酸分子可以小量存在于多种样品中的任何一种。例如，因为所述样品本身非常小或者因为甲基化或未甲基化靶核酸分子相对于样品中核酸总量非常小，甲基化或未甲基化靶核酸分子可以小量存在，。因此，现有方法可以用来检测小样品中的甲基化或未甲基化靶核酸分子，以及可以用来检测含有相对大量背景核酸的样品中的甲基化或未甲基化靶核酸分子。

在另一个实施例中，甲基化靶核酸分子可以小量存在于含有小量新生物细胞的组织样品中，其中甲基化靶核酸分子仅存在于新生物细胞中。因此，相对于样品中存在的DNA总量或核酸分子总量，甲基化靶核酸分子可以小量存在。当甲基化靶核酸分子以相对小量存在时，利用未甲基化特异性的方法扩增靶核酸分子，可以得到扩增的核酸分子的集合，其中来自于甲基化靶核酸分子的扩增的靶核酸分子以相对小量存在，以至于扩增的靶核酸分子不能被检测，或者扩增的甲基化靶核酸分子的检测不大于确证存在甲基化靶核酸分子必需的信噪比。

甲基化靶核酸分子可以小量存在于样品中，因为例如样品含有异质DNA。异质DNA可以来自于含有两种或多种生物体DNA的DNA样品。异质DNA还可以来自于含有单一生物体两种或多种细胞的DNA样品，其中两种或多种细胞的表遗传学状态不同。

根据具体实施方式，其中小量甲基化靶核酸分子存在于样品中，本文提供的方法可以用来检测甲基化靶核酸分子。例如，本文提供的甲基化特异性扩增方法可以用来增加甲基化或未甲基化靶核酸分子的相对量或者既增加来自于用试剂处理甲基化靶核酸分子的核酸分子的总量又增加其相对量，其中所述试剂根据其甲基化状态而修饰靶核酸分子(在这种具体实施方式中，靶核酸分子和来自于处理的靶核酸分子的核酸分子可以替代使用)，即：甲基化或未甲基化靶核酸分子的扩增可以用来增加样品中存在的甲基化或未甲基化靶核酸分子的总量，并且由此增加可利用本文提供的质量测定方法进行检测的甲基化或未甲基化靶核酸分子片段的量。另外，甲基化或未甲基化靶核酸分子的甲基化特异性扩增可以用来选择性增加样品中存在的甲基化或未甲基化靶核酸分子的量，而无需增加背景或非需要核酸分子或样品中存在的其他核酸的量，因此增加可利用本文提供的质量测定方法进行检测的甲基化或未甲基化靶核酸分子片段的相对量。因此，利用本文提供的方法，即使其以小量存在时，甲基化或未甲基化靶核酸分子可以被检测。本文提供的方法可以用来检测样品中存在的甲基化或未甲基化靶核酸分子，其量可以小至1pg、5pg、10pg、50pg、100pg、500pg或1ng。本文提供的方法可以用来检测样品中存在的甲基化或未甲基化靶核酸分子，其相对量可以小至0.001％、0.005％、0.01％、0.05％或0.1％。

b.区分甲基化状态和不完全转化

在另一个具体实施方式中，本文提供的方法可以用来区分来自含有甲基化核苷酸的靶核酸分子的片段与来自靶核酸分子中未甲基化核苷酸不完全转化的片段。作为靶核酸分子甲基化状态的函数而修饰核酸分子序列的方法可能是不完全的，得到处理过的未甲基化核酸分子的异质性混合物，其中处理过的未甲基化核酸分子的一部分具有与处理过的甲基化核酸分子相同的核苷酸序列，或者其中处理过的靶核酸分子上的未甲基化基因座的一部分具有与处理过的核酸分子上的甲基化基因座相同的序列，结果也可以称为不完全转化。在处理步骤之后，可以利用本文提供的质量测定方法区分来自不完全转化的片段和来自真正甲基化核苷酸的片段。

核酸分子均质混合物的不完全转化得到处理过的核酸分子的异质混合物。如果不完全转化的位点不位于扩增引物杂交位点，不完全转化的位点在随后的任何扩增步骤中将保持异质，而且将得到由质量测定检测的核酸分子片段的异质混合物。异质核酸分子片段将包含一些核酸片段可表示特定核苷酸的甲基化尽管核苷酸为未甲基化的(即含有未被转化核苷酸的片段)，以及核酸片段可表示在该核苷酸的未甲基化(即含有被转化核苷酸的片段)。异质核酸分子片段还可能含有一些核酸片段，其中特定核苷酸始终鉴定为甲基化。

质量测定方法可以用来区分部分转化和真正的甲基化核苷酸，通过检测表示在特定核苷酸表示的未甲基化的核酸分子片段。既存在表示未甲基化的核酸分子片段又存在表示在同一核苷酸甲基化的核酸分子片段，可以表示核苷酸在该基因座的转化不完全，而且在该基因座的核苷酸在样品核酸分子中不是甲基化的。相反，存在适中表示在核苷酸基因座甲基化的靶核酸分子片段可以表示核苷酸基因座在样品核酸分子中是甲基化的。

在一个具体实施方式中，来自于甲基化核苷酸或甲基化基因座的片段不必须是均质的。即：在一个断裂模式中的某些片段可以反映在一个基因座的甲基化核苷酸而其他片段反映在该基因座的未甲基化核苷酸，即使基因座始终是甲基化的。这可以来源于均质样品，例如当断裂不完全时；还可以来源于非完全均质的样品。本文提供的方法可以用来鉴定基因座为甲基化的，即使存在异质片段。在一个实施例中，当反映甲基化基因座的片段数量大于反映未甲基化基因座的片段数量时，在靶核酸中基因座是甲基化的；而当反映甲基化基因座的片段数量小于反映未甲基化基因座的片段数量时，在靶核酸中基因座是未甲基化的。因此，反映甲基化的片段相对于反映未甲基化的片段的比可以用来确定在特定基因座的甲基化。在一个实施例中，如果甲基化片段与未甲基化片段的比值大于1，则基因座是甲基化的，反之亦然。在另一个实施例中，如果甲基化片段与未甲基化片段的比值大于2、3或4，则基因座是甲基化的；而如果甲基化片段与未甲基化片段的比值小于1/2、1/3或1/4，则基因座是未甲基化的。在后者的实施例中，比值约为1可以得到不确定的结果，其中无法鉴定特定基因座的甲基化状态。

在另一个具体实施方式中，靶核酸分子的片段与参考核酸分子进行比较。例如，靶核酸分子可以用重亚硫酸盐进行处理、扩增并断裂，且片段可以反映一个或多个胞嘧啶基因座的不完全重亚硫酸盐转化。靶核酸分子的断裂可以与甲基化状态已知的参考核酸分子进行比较，且所述参考核酸分子也已经重亚硫酸盐进行处理、扩增并断裂。例如，当参考核酸仅含有未甲基化胞嘧啶时，断裂模式可以反映在一个或多个基因座不完全转化的基线量。在这些方法的范围之内，每个核苷酸基因座可以以不同的量转化，因此在断裂模式中反映的不完全转化的基线量，对于每一个核苷酸基因座可以变动。将参考核酸分子断裂模式与靶核酸分子进行比较时，当靶核酸分子的一个或多个片段大于或小于基线量时，则一个或多个基因座可以鉴定为至少部分甲基化。建立不完全转化基线的参考核酸，可以用于例如一些方法中，其中靶核酸分子在异质核酸样品中例如含有正常细胞和肿瘤细胞的组织样品、来自多个个体的集合样品、或者来自单个生物体或单个细胞的异质二倍体DNA。在这种情况下，对一个量来说，如果一个或多个片段大于或小于由参考核酸建立的基线量，则该量反映在一个或多个基因座为甲基化的核苷酸相对量。这种方法还可以用于均质核酸样品中以类似的校正不完全转化。

c.确定在两个或多个基因座的甲基化状态

在另一个具体实施方式中，本文提供的方法可以用来鉴定靶核酸分子中两个或多个核苷酸基因座的甲基化状态。可以用于本文提供的方法的靶核酸分子可以含有两个或多个其甲基化状态待定的核苷酸基因座。例如，靶核酸分子可以含有一个或多个核苷酸基因座，其甲基化状态待定且位于靶核酸分子的引物杂交区(或扩增阻滞剂杂交区)。且这种靶核酸分子还可以含有一个或多个核苷酸基因座，其甲基化状态待定且不位于与引物(或扩增阻滞剂)杂交的区域。本文披露的方法提供了通过两种方法来鉴定核苷酸基因座的甲基化状态：扩增和片段检测。例如，位于杂交区的基因座的甲基化状态可以通过扩增靶核酸来确定，而位于不与引物(或扩增阻滞剂)杂交的区域中基因座的甲基化状态可以通过本文提供的断裂和检测方法来确定。而且，扩增方法和片段检测方法均可以用来鉴定两个或多个核苷酸基因座的甲基化状态，得到大量靶核酸分子的核苷酸基因座，其甲基化状态可以利用本文提供的方法进行鉴定。

在一个具体实施方式中，位于不与引物(或扩增阻滞剂)杂交的区域中的核苷酸基因座不用于本文提供的甲基化特异性扩增步骤中，因此，本文提供的方法可以用来鉴定一个或多个核苷酸基因座的甲基化状态，其中这种鉴定是通过质量峰值分析而非通过杂交或扩增方法来实施。可以利用质量峰值分析而非通过杂交或扩增方法来鉴定其甲基化状态的核苷酸基因座的数量可以为2个或更多、3个或更多、5个或更多、7个或更多、9个或更多、11个或更多、13个或更多、15个或更多、17个或更多、20个或更多、25个或更多、30个或更多、35个或更多、40个或更多、45个或更多、50个或更多、60个或更多、70个或更多、或者80个或更多。

d.特异性扩增的确证

在另一个具体实施方式中，本文提供的方法可用来确证与甲基化状态特异性扩增引物互补的靶核酸分子的特异性扩增。本文提供的方法还可用来区分与甲基化状态特异性扩增引物互补的靶核酸分子的特异性扩增以及来自于靶核酸分子和甲基化状态特异性扩增引物之间错配的扩增。本文提供的方法还可用来确定靶核酸分子中可与一个或多个甲基化特异性引物杂交的区域内一个或多个核苷酸的甲基化状态。例如，本文提供的方法可用来测定通过甲基化状态特异性扩增引物而扩增形成的扩增产物或其片段的质量，所述测定的质量可以用来确证是否发生甲基化特异性扩增，是否在甲基化状态特异性引物和靶核酸分子之间的发生错配，或者靶核酸分子中甲基化特异性引物结合区内一个或多个核苷酸是否为甲基化的。在另一个实施例中，本文提供的方法可以用来确定由扩增产物的断裂形成的断裂产物的数量，而扩增产物通过用甲基化状态特异性扩增引物扩增而产生，而断裂产物的数量可以用来确证是否发生甲基化状态特异性扩增，或是否在甲基化状态特异性引物和靶核酸分子之间发生错配，或者靶核酸分子中甲基化特异性引物结合区内一个或多个核苷酸是否为甲基化的。

i.区别错配杂交

因为某些现象例如错配杂交或不完全胞嘧啶转化可以引起靶核酸分子的扩增而不能准确反映靶核酸分子的甲基化状态，因而传统的甲基化特异性PCR方法倾向于假阳性结果。例如，当扩增作为错配杂交的结果而发生时，甲基化特异性PCR的每个扩增产物不再含有关于引物杂交区内靶核酸分子的序列信息。在几轮扩增之后，扩增产物的数量远大于靶核酸分子的数量，并且关于引物杂交区内靶核酸分子核苷酸序列的信息基本上被丢失。结果，可以产生不能准确反映靶核酸分子甲基化状态的扩增产物，这种结果通常命名为假阳性结果。

现有方法可以用来区分假阳性结果和真阳性结果，后者的扩增产物结果确实准确地反映靶核酸分子的甲基化状态。当甲基化发生于核酸区域时(例如，CpG岛)，经常发生于区域内一个以上核苷酸。例如，含有一个甲基化CpG的CpG岛通常将含有一个或多个其它的甲基化CpG。本文提供的方法可以用来确定在甲基化特异性扩增时不与一个或多个甲基化特异性引物杂交的靶核酸分子区域内的核苷酸甲基化状态。通过评估不被甲基化特异性引物结合的靶核酸分子区域中核苷酸的甲基化状态，有可能确定引物结合的靶核酸分子区域中一个或多个核苷酸的甲基化状态。

例如，在靶核酸分子较大比例的核苷酸中或在靶核酸分子几乎没有一个核苷酸中，CpG岛可以含有甲基化的胞嘧啶核苷酸。在这种实例中，通过鉴定靶核酸分子中甲基化特异性引物不与其杂交的一部分内一个或多个核苷酸基因座的甲基化状态，用甲基化特异性引物(或扩增阻滞剂)进行的靶核酸扩增可以鉴定为假阳性扩增或真阳性扩增。

例如，当甲基化状态特异性引物通过杂交到含有一个或多个C核苷酸的靶核酸分子核苷酸序列而用来扩增经重亚硫酸盐处理的靶核酸分子时，如果靶核酸区域内不被甲基化状态特异性引物杂交的C核苷酸中没有一个是甲基化的，甲基化状态特异性扩增反应可以确定为假阳性。即：当甲基化状态特异性扩增反应产生一个结果，其中唯一的甲基化C核苷酸位于甲基化状态特异性引物杂交区；来自这种甲基化状态特异性扩增的结果可用来推断没有发生甲基化特异性扩增、而是在甲基化状态特异性引物和靶核酸分子之间发生了错配，并且靶核酸分子中甲基化特异性引物结合区内的一个或多个C核苷酸不是甲基化的。

在另一个实施例中，当甲基化状态特异性引物通过杂交到含有一个或多个U或T核苷酸而取代一个或多个C核苷酸(即：重亚硫酸盐转化的未甲基化C核苷酸)的靶核酸分子核苷酸序列而用来扩增经重亚硫酸盐处理的靶核酸分子时，如果不被甲基化状态特异性引物杂交的靶核酸分子区域内的多个C核苷酸是甲基化的，则甲基化状态特异性扩增反应可以确定为假阳性。即：当甲基化状态特异性扩增反应产生一个结果，其中唯一的甲基化C核苷酸位于甲基化状态特异性引物杂交区；来自这种甲基化状态特异性扩增的结果可用来推断没有发生甲基化状态特异性扩增、而是在甲基化状态特异性引物和靶核酸分子之间发生了错配，并且靶核酸分子中甲基化特异性引物结合区内的一个或多个C核苷酸不是甲基化的。

在另一个实施例中，例如，当甲基化状态特异性引物通过杂交到含有一个或多个C核苷酸的靶核酸分子核苷酸序列而用来扩增经重亚硫酸盐处理的靶核酸分子时，如果靶核酸区域内不被甲基化状态特异性引物杂交的C核苷酸中没有一个是甲基化的，甲基化状态特异性扩增反应可以确定为真阳性。即：当甲基化状态特异性扩增反应产生一个结果，其中多个甲基化C核苷酸位于甲基化状态特异性引物杂交区之外；来自这种甲基化状态特异性扩增的结果可用来推断发生了甲基化特异性扩增、而没有在甲基化状态特异性引物和靶核酸分子之间发生错配，并且靶核酸分子中甲基化特异性引物结合区内的一个或多个C核苷酸是甲基化的。

在另一个实施例中，当甲基化状态特异性引物通过杂交到含有一个或多个U或T核苷酸而取代一个或多个C核苷酸(即：重亚硫酸盐转化的未甲基化C核苷酸)的靶核酸分子核苷酸序列而用来扩增经重亚硫酸盐处理的靶核酸分子时，如果不被甲基化状态特异性引物杂交的靶核酸区域内的C核苷酸中没有一个是甲基化的，则甲基化状态特异性扩增反应可以确定为真阳性。即：当甲基化状态特异性扩增反应产生一个结果，其中多个未甲基化C核苷酸位于甲基化状态特异性引物杂交区之外；来自这种甲基化状态特异性扩增的结果可用来推断发生甲基化特异性扩增、而没有在甲基化状态特异性引物和靶核酸分子之间发生错配，并且靶核酸分子中甲基化特异性引物结合区内的一个或多个C核苷酸是未甲基化的。

上述实例中的一些指的是一些情况，其中未被甲基化特异性引物结合的区域内的核苷酸没有一个是甲基化或未甲基化的，而且当这种核苷酸中没有一个是甲基化或未甲基化的时，甲基化状态特异性引物结合区内的核苷酸甲基化状态可以确定为同样状态。如应用于上述实例，本文还预期了一些情况，其中在靶核酸分子的较大比率核苷酸中或在靶核酸分子几乎没有一个核苷酸中，核苷酸的甲基化状态是相同的。例如，当靶核酸分子中100个核苷酸长的非杂交区内仅有一个胞嘧啶被确定为甲基化时，可以推算非杂交区中几乎没有一个核苷酸是甲基化的，而且因此，在甲基化状态特异性引物杂交区内的核苷酸也是未甲基化的。典型的，对于某些情况其中几乎没有一个核苷酸是甲基化或未甲基化的，少于约20％的核苷酸(例如，少于20％的胞嘧啶)是甲基化或未甲基化的。通常，当几乎没有一个核苷酸是甲基化或未甲基化时，少于约10％或少于约5％的核苷酸是甲基化或未甲基化的。典型的，对于某些情况其中大多数核苷酸是甲基化或未甲基化的，至少50％的核苷酸(例如，至少约50％胞嘧啶)是甲基化或未甲基化的。通常，当大多数核苷酸是甲基化或未甲基化的时，多于约70％或多于约85％的核苷酸是甲基化或未甲基化的。

在另一个实施例中，当存在含有两个或多个已知甲基化状态的基因座参考核酸序列时，本文提供的方法可以用来确证是否发生甲基化状态特异性扩增、是否在甲基化状态特异性引物和靶核酸分子之间发生错配，或者靶核酸分子中甲基化特异性引物结合区内一个或多个核苷酸是否为甲基化的。尤其是，当两个或多个基因座的甲基化状态相相关性时，本文提供的方法可以用来确证是否发生甲基化特异性扩增，是否在甲基化状态特异性引物和靶核酸分子之间发生错配，或者靶核酸分子中甲基化特异性引物结合区内一个或多个核苷酸是否为甲基化的。例如，当第一甲基化胞嘧啶和第二甲基化胞嘧啶之间存在相关性时，鉴定第一胞嘧啶为甲基化也可以用来鉴定第二胞嘧啶为甲基化的。因此，当靶核酸分子区域内未被甲基化特异性引物杂交的胞嘧啶鉴定为甲基化时，靶核酸分子区域内被甲基化特异性引物杂交的胞嘧啶也可鉴定为甲基化的。本领域的技术人员可以根据胞嘧啶基因座的甲基化状态以及所使用的甲基化状态特异性引物，推断是否发生了甲基化特异性扩增以及是否发生了错配杂交。类似的，当甲基化胞嘧啶与未甲基化胞嘧啶相相关性时，鉴定两个基因座之一则可以鉴定两者；根据胞嘧啶基因座的甲基化状态以及所使用的甲基化状态特异性引物，本领域的技术人员可以推断是否发生了甲基化特异性扩增以及是否发生了错配杂交。类似的，当一个未甲基化胞嘧啶与另一个未甲基化胞嘧啶相相关性时，鉴定两个基因座之一则可以鉴定两者；根据胞嘧啶基因座的甲基化状态以及所使用的甲基化状态特异性引物，本领域的技术人员可以推断是否发生了甲基化特异性扩增以及是否发生了错配杂交。

用于区分假阳性和真阳性的方法可以利用本文提供的任何一种方法而实施。例如，将片段质量与参考质量进行比较，所述片段质量相对于参考质量的位移可以表示靶核酸分子中不与甲基化状态特异性引物杂交的靶核酸分子区域内核苷酸的甲基化状态，而且因此可以根据实验设计以及待确定的甲基化状态推断发生了假阳性扩增或真阳性扩增。在另一个实施例中，将片段质量与参考质量进行比较，在片段质量与参考质量之间的相同质量可以表示靶核酸分子中不与甲基化状态特异性引物杂交的靶核酸分子区域内核苷酸的甲基化状态，而且因此可以根据实验设计推断发生了假阳性扩增或真阳性扩增。在另一个实施例中，将样品片段的数量与参考质量的数量进行比较，在片段数量相对于参考数量之间的差异可以表示靶核酸分子中不与甲基化状态特异性引物杂交的靶核酸分子区域内核苷酸的甲基化状态，而且因此可以根据实验设计推断发生了假阳性扩增或真阳性扩增。在另一个实施例中，将样品片段的数量与参考质量的数量进行比较，所述片段数量相对于参考数量相同时，可以表示靶核酸分子中不与甲基化状态特异性引物杂交的靶核酸分子区域内核苷酸的甲基化状态，而且因此可以根据实验设计推断发生了假阳性扩增或真阳性扩增。在另一个实施例中，确定样品片段的数量，当观察到三个或多个片段时，可以表示靶核酸分子中不与甲基化状态特异性引物杂交的靶核酸分子区域内核苷酸的甲基化状态和靶核酸分子中与甲基化状态特异性引物杂交的靶核酸分子区域内核苷酸的甲基化状态相同，并且因此可以用来推断发生了真阳性扩增。在另一个实施例中，确定样品片段的数量，当观察到三个或较少片段时，可以表示靶核酸分子中不与甲基化状态特异性引物杂交的靶核酸分子区域内核苷酸的甲基化状态不同于靶核酸分子中与甲基化状态特异性引物杂交的靶核酸分子区域内核苷酸的甲基化状态，并且因此可以用来推断发生了假阳性扩增。

ii.区别不完全转化

假阳性扩增还可以来自于不完全转化。当发生不完全转化时，例如，通过重亚硫酸盐将未甲基化胞嘧啶不完全转化成尿嘧啶，甲基化状态特异性引物可以杂交到未转化的核苷酸上，产生的扩增产物不能准确反映靶核酸的甲基化状态。本文提供的方法可以用来确定当发生不完全转化时，可以用来区分不完全转化的核苷酸与甲基化或未甲基化核苷酸，且可以用来确定不完全转化发生的程度。在确定已经发生不完全转化的情况下，本领域的技术人员可以确定不完全转化的程度并推断甲基化特异性扩增作为不完全转化结果发生的可能性，引起假阳性扩增。例如，当多于约5％、多于约10％或多于约20％的核苷酸为不完全转化时，甲基化特异性扩增可被确定为假阳性扩增。因此，本文还提供了一些方法，用于确定利用甲基化状态特异性扩增引物，是否由于不完全转化而发生靶核酸分子的假阳性扩增。本文提供的方法还可以用来区分完全转化的与甲基化状态特异性扩增引物互补的靶核酸分子扩增和来自不完全转化的靶核酸分子与甲基化状态特异性引物杂交的扩增；这种方法包括确定是否发生不完全转化，如果发生不完全转化，则可推断扩增来自不完全转化的靶核酸分子与甲基化状态特异性引物的杂交。

本文提供的方法还可以用来确定靶核酸分子中与一个或多个甲基化特异性引物杂交的区域内一个或多个核苷酸的甲基化状态。例如，本文提供的方法可以用来确定位于甲基化状态特异性引物不与其杂交的靶核酸分子部分内的核苷酸是否为真实的甲基化还是仅仅为不完全转化，如在本文其他部分更充分描述的。如果位于甲基化状态特异性引物不与其杂交的靶核酸分子部分内的核苷酸确定为甲基化的，则本文提供的方法可以用来确定甲基化状态特异性引物杂交区内的核苷酸也为甲基化的，且尽管发生了不完全转化，但还是发生了真甲基化特异性扩增。

在另一个实施例中，本文提供的方法可以用来确定位于甲基化状态特异性引物不与其杂交的靶核酸分子部分内的核苷酸是否为真实的未甲基化还是仅仅为不完全转化。如果位于甲基化状态特异性引物不与其杂交的靶核酸分子部分内的核苷酸确定为未甲基化的，则本文提供的方法可以用来确定甲基化状态特异性引物杂交区内的核苷酸也为未甲基化的，且尽管发生了不完全转化，但还是发生了真甲基化特异性扩增。

在另一个实施例中，本文提供的方法可以用来确定位于甲基化状态特异性引物不与其杂交的靶核酸分子部分内的核苷酸是否为真实的甲基化还是仅仅为不完全转化。如果位于甲基化状态特异性引物不与其杂交的靶核酸分子部分内的少数或没有核苷酸确定为甲基化的，则本文提供的方法可以用来确定甲基化状态特异性引物杂交区内的核苷酸为未甲基化的，且发生了假甲基化特异性扩增。

在另一个实施例中，本文提供的方法可以用来确定位于甲基化状态特异性引物不与其杂交的靶核酸分子部分内的核苷酸是否为真实的未甲基化还是仅仅为不完全转化。如果位于甲基化状态特异性引物不与其杂交的靶核酸分子部分内的少数或没有核苷酸确定为未甲基化的，则本文提供的方法可以用来确定甲基化状态特异性引物杂交区内的核苷酸为甲基化的，且发生了假甲基化特异性扩增。

如在本文披露的，相对于参考片段的片段数量或相对于相对质量的片段质量测定片段数量可以用来确定假阳性扩增是否作为不完全转化的结果而发生，所用方式与本文描述的关于假扩增是否作为错配杂交的结果而发生的方式相同。

2.分析两条靶核酸分子链

当靶核酸分子上至少一个核苷酸为甲基化或未甲基化的时，用可以修饰靶核酸分子序列作为靶核酸分子甲基化状态函数的试剂处理靶核酸分子，可以得到处理过的靶核酸分子的两条不再完全互补的链(即：含有至少一个错配)。例如，用重亚硫酸盐处理的含有至少一个未甲基化胞嘧啶的靶核酸将在未甲基化胞嘧啶的位点含有错配的U-G碱基对。处理后、扩增前靶核酸分子的两条链将不会与处理后、扩增后靶核酸分子的两条链相混淆，因为前一组两条链是不互补的，而后一组两条链是互补的。

在一个具体实施方式中，处理后、扩增前的两条非互补链可用来鉴定靶核酸分子的甲基化状态。例如，靶核酸分子的两条链可以含有甲基化和/或未甲基化胞嘧啶，且用重亚硫酸盐处理双链靶核酸分子可以根据每条链各自的甲基化状态而不根据互补链的甲基化状态，而引起序列修饰。因此，为了鉴定每条链的甲基化状态，将每条链根据本文提供的方法分别进行分析。因此，本文还提供了用于鉴定靶核酸分子甲基化状态的方法，通过：用可以修饰靶核酸分子一个或多个核苷酸作为靶核酸分子甲基化状态的函数的试剂处理靶核酸分子，然后分离处理过的靶核酸分子的两条链，并利用如本文提供的扩增、断裂和质量测定方法鉴定两条链中每一条的甲基化状态。

在另一个具体实施方式中，使用两条链可以发挥使用参考核酸类似的作用。例如，当用重亚硫酸盐处理靶核酸分子时，未甲基化的C核苷酸将被转化成U(在DNA中，为T)核苷酸，但是互补链的相应G核苷酸以及甲基化的C核苷酸将不会被转化。匹配的C-G碱基对基因座可以表示存在甲基化的胞嘧啶，而错配的U-G(T-G)碱基对基因座可以表示存在未甲基化的胞嘧啶。在另一个实施例中，当用重亚硫酸盐处理靶核酸分子时，第一条链的C特异性断裂可以表示在该链上甲基化C核苷酸的数量和基因座，而第二条链的G特异性断裂可以表示在所述第一条链上甲基化和未甲基化C核苷酸的全部数量和基因座。结合来自两条链的切割信息可以确定第一条链内甲基化和未甲基化C核苷酸的数量和基因座。

4.切割模式中的信息

来源于本文提供的断裂和测定方法的片段测定，例如碱基特异性切割，可以提供关于靶核酸分子甲基化状态以及靶核酸分子上甲基化核苷酸位置的信息。

在一个具体实施方式中，全部或几乎全部靶核酸分子片段质量提供关于甲基化或未甲基化核苷酸基因座存在的冗余信息。例如，通过碱基特异性切割的核酸分子断裂，可以产生多个核酸片段，且可以测定片段质量。核酸分子片段将含有5’末端和3’末端，其中每个末端可以作为断裂的结果而产生，或者为原始未切割的核酸分子的5’末端或3’末端。当两个末端均作为断裂的结果而产生时，则每个末端均含有断裂信息。例如，当重亚硫酸盐处理的核酸片段的两个末端均来源于利用RNaseA的C特异性切割时，所述3’末端将含有对应于核酸分子中第一甲基化C的C核苷酸，而所述5’末端将含有与对应于核酸分子中第二甲基化C的C核苷酸紧邻的核苷酸。因此，存在这样一个片段可以鉴定靶核酸分子含有至少两个甲基化的C核苷酸。另外，如果已知这样一个核酸分子片段在核酸分子序列中的位置，片段可以表示两个核酸分子序列在核酸分子中的存在和基因座。检测相邻的靶核酸分子片段可以提供交迭信息，而且因此可以用来提供甲基化核苷酸鉴定中的冗余度。例如，如果两个相邻片段中的一个不能利用质量测定方法进行检测，则这种冗余度可能非常有用。例如，当一个片段太小或太大而不能利用质谱分析精确测定时，相邻片段的测定还可以允许确定靶核酸分子的甲基化状态以及靶核酸分子上甲基化核苷酸的基因座。

扩增的靶核酸分子样品可以分成两个或多个部分，且可对每一部份实施不同的扩增步骤。例如，当对靶核酸分子样品的两个不同部分实施两种碱基特异性切割反应时，从第一部分的质量峰值获得的信息可以与从第二部分的质量峰值获得的信息部分或完全冗余，作为所述交迭信息的结果得到增强的冗余度，并作为所述非交迭信息的结果得到增加的覆盖(如在该上下文中使用的覆盖指的是待定的靶核酸基因座甲基化信息的完整性)。例如，可以对两个分离的靶核酸分子样品部分实施两种不同的碱基特异性切割反应(每个样品一种碱基特异性切割)，而且当合并来自两个切割反应的片段测定时，则可以提供关于待分析核苷酸基因座的甲基化状态的信息，也可以提供待分析的一个或多个核苷酸基因座的冗余度。在另一个具体实施方式中，对四种靶核酸分子样品进行四种碱基特异性切割反应，可以提供关于所有待分析核苷酸基因座的甲基化状态的信息，还可以提供所有待分析核苷酸基因座中90％或更多的冗余信息。

H.应用

本文提供的方法可以用于多个应用中，包括上述讨论的那些应用、鉴定新的甲基化位点、鉴定受试者DNA的甲基化状态、确定全部甲基化DNA的一部分、以及平行确定两种或多种靶核酸分子的甲基化状态。

1.甲基化的发现

基因组DNA中甲基化或未甲基化核苷酸可以影响DNA的结构包括染色质结构，还可以影响基因表达。DNA中的胞嘧啶可以为甲基化的。大多数甲基胞嘧啶位于转位子内，甲基胞嘧啶还经常在鸟嘌呤形成“CpG”基序时观察到。CpG基序在基因组中不常见，但是经常与其他CpG基序成簇出现，以形成“CpG岛”。CpG岛通常为500个碱基或更长，且含有至少55％G和C，并观察到高于预期CpG频率至少0.65。CpG岛已经在启动子区域发现，且认为这些CpG岛影响基因表达并在多种疾病包括多种癌症中发挥作用。甲基化核苷酸例如CpG岛中的甲基化胞嘧啶仍然正在被发现。现有的方法提供迅速而灵敏的途径以发现其他甲基化的核苷酸，尤其是甲基化胞嘧啶例如在CpG基序和CpG岛中的那些甲基化胞嘧啶。缺乏甲基化有可能在DNA结构和/或基因表达中发挥作用。因此，现有方法还用于发现未甲基化核苷酸，尤其是未甲基化胞嘧啶例如CpG基序和CpG岛中的那些未甲基化胞嘧啶。

可以利用本文提供的方法发现之前未表征化的甲基化核苷酸，其中扩增中使用的引物可以具有计划的、预定义序列或具有随机序列。为了本具体实施方式的目的，计划的或预定义序列指的是用于一个或多个已知DNA区域杂交的序列(例如，染色体上的已知位置、已知的启动子区域、已知的转位子或反转录转位子)。为了本具体实施方式的目的，随机序列指的是不计划用于任何特定DNA区域杂交的序列。在一个实施例中，具有计划序列或随机序列的引物对中的一条引物可以含有一个或多个G核苷酸，其中所述G核苷酸与样品DNA的C核苷酸杂交。当样品DNA在引物杂交前用重亚硫酸盐进行处理时，含有G核苷酸的引物可以选择性杂交到含有甲基化C核苷酸的DNA序列上。甲基化DNA的扩增、断裂以及质量测定可以利用本文提供的方法而实施。可选的，甲基化扩增的DNA可以利用已知方法或本文提供的方法进行测序。可替换的，当样品DNA在引物杂交前用重亚硫酸盐进行处理且所述重亚硫酸盐处理的DNA用至少一个步骤扩增时，引物序列可以含有一个或多个C核苷酸，其中C核苷酸与新合成链中的G核苷酸杂交，而所述新合成链与重亚硫酸盐处理的链互补。

在另一个实施例中，具有计划序列或随机序列的引物对中的一条引物可以含有一个或多个A核苷酸，其中所述A核苷酸与样品DNA的U核苷酸杂交。当样品DNA在引物杂交前用重亚硫酸盐进行处理时，含有A核苷酸的引物可以选择性杂交到含有未甲基化C核苷酸的DNA序列上。未甲基化含胞嘧啶的DNA的扩增、断裂以及质量测定可以利用本文提供的方法而实施。可选的，扩增的DNA可以利用已知方法或本文提供的方法进行测序。可替换的，当样品DNA在引物杂交前用重亚硫酸盐进行处理且重亚硫酸盐处理的DNA用至少一个步骤扩增时，引物序列可以含有一个或多个T或U核苷酸，其中T或U核苷酸与新合成链中的A核苷酸杂交，而所述新合成链与重亚硫酸盐处理的链互补。

在一个具体实施方式中，存在一个或多个甲基化核苷酸可以鉴定为异常或不同于这种生物体内那些核苷酸基因座的典型核苷酸。在一个具体实施方式中，存在一个或多个甲基化核苷酸可以鉴定为正常或与这种生物体内那些核苷酸基因座的典型核苷酸相同。在另一个具体实施方式中，存在一个或多个未甲基化核苷酸可以鉴定为异常或不同于这种生物体内在那些核苷酸基因座的典型核苷酸。在一个具体实施方式中，存在一个或多个未甲基化核苷酸可以鉴定为正常或与这种生物体内在那些核苷酸基因座的典型核苷酸相同。

a.疾病相关的发现

在一个具体实施方式中，存在或缺乏一个或多个甲基化或未甲基化核苷酸可以鉴定为表示与甲基化或未甲基化DNA相关的疾病状态，例如肿瘤性疾病。在另一个具体实施方式中，存在或缺乏一个或多个甲基化或未甲基化核苷酸可以鉴定为表示正常、健康或无疾病状态。在另一个具体实施方式中，样品中甲基化靶核酸分子相对于未甲基化靶核酸分子的异常率，可以表示与甲基化或未甲基化DNA相关的疾病状态，例如肿瘤性疾病。例如，与正常个体中的相对量比较，相对多量或相对少量的甲基化靶核酸分子可以表示与甲基化或未甲基化DNA相关的疾病状态，例如肿瘤性疾病。在另一个具体实施方式中，在靶核酸分子中一个核苷酸基因座的甲基化核苷酸相对于在该基因座的未甲基化核苷酸的异常率，可以表示与甲基化或未甲基化DNA相关的疾病状态，例如肿瘤性疾病。例如，与正常个体中的相对量比较，相对多量或相对少量的甲基化核苷酸基因座可以表示与甲基化或未甲基化DNA相关的疾病状态，例如肿瘤性疾病。

与一个或多个核苷酸的甲基化修饰相关的疾病包括，例如：白血病(Aoki E et al.″Methylation status of the p15INK4B gene in hematopoieticprogenitors and peripheral blood cells in myelodysplastic syndromes″Leukemia 14(4)：586-593(2000)；Nosaka，K.et al.″Increasing methylation of the CDKN2A gene is associated with the progression ofadult T-cell leukemia″Cancer Res 60(4)：1043-1048(2000)；Asimakopoulos FA et al.″ABL1methylation is a distinct molecular event associated with clonal evolution of chronic myeloid leukemia″Blood 94(7)：2452-2460(1999)；Fajkusova L.et al.″Detailed Mapping of Methylcytosine Positions atthe CpG lsland Surrounding the Pa Promoter at the bcr-abl Locus in CML Patients and in Two CellLines，K562 and BV173″Blood Cells Mol Dis 26(3)：193-204(2000)；Litz C E et al.″Methylation statusof the major breakpoint cluster region in Philadelphia chromosome negative leukemias″Leukemia6(1)：35-41(1992))、头颈癌(Sanchez-Cespedes M.et al.″Gene promoter hypermethylationin tumors and serum of head and neck cancer patients″Cancer Res 60(4)：892-895(2000))，Hodgkin′sdisease(Garcia J.F.et al.″Loss of p16 protein expression associated with methylation of the p16INK4Agene is a frequcnt finding in Hodgkin′s disease″Lab Invest 79(12)：1453-1459(1999))、胃癌(Yanagisawa Y.et al.″Methylation of the hMLH1 promoter in familial gastric cancer withmicrosatellite instability″ Int J Cancer 85(1)：50-53(2000))、前列腺癌(Rennie P.S.et al.″Epigenetic mechanisms for progression of prostate cancer″Cancer Metastasis Rev 17(4)：401-409(1998-99)、肾癌(Clifford，S.C.et al.″Inactivation of the von Hippel-Lindau(VHL)tumorsuppressor gene and allelic losses at chromosome arm 3p in primary renal cell carcinoma：evidence for aVHL-independent pathway in clear cell renal tumourigenesis″Genes Chromosomes Cancer 22(3)：200-209(1998))，膀胱癌(Sardi，I.et al.″Molecular genetic alterations of c-myc oncogene insuperficial and locally advanced bladder cancer″Eur Urol 33(4)：424-430(1998))、乳腺癌(Mancini，D.N.et al.″CpG methylation within the 5′regulatory region of the BRCA1 gene is tumorspecific and includes a putative CREB binding site″Oncogene 16(9)：1161-1169(1998)；Zrihan-Licht S.et al.″DNA methyIation status ofthe MUC1 gene coding for a breast-cancer-associated protein″IntJ.Cancer 62(3)：245-251(1995)；Kass，D.H.et al.″Examination of DNA methylation of chromosomalhot spots associated with breast cancer″Anticancer Res 13(5A)：1245-1251(1993))Burlitt’s 淋巴瘤(Tao，Q.et al.″Epstein-Barr virus(EBV)in endemic Burkitt′s lymphoma：molecular analysis of primarytumor tissue″Blood 91(4)：1373-1381(1998))、Wilms瘤(Kleymenova，E.V.et al.″Identification ofa tumor-specific methylation site in the Wilms tumor suppressor gene″Oncogene 16(6)：713-720(1998))，Prader-Willi/Angelman综合征(Zeschnigh et al.″Imprinted segments in the human genome：differentDNA methylation patterns in the Prader-Willi/Angelman syndrome region as determined by the genomicsequencing method″Human Mol.Genetics(6)3：387-395(1997)；Fang P et al.″The spectrum ofmutations in UBE3A causing Angelman syndrome″Hum Mol Genet 8(1)：129-135(1999))，ICF综合征(Tuck-Muller et al.″CMDNA hypomethylation and unusual chromosome instability in celllines from ICF syndrome patients″Cytogenet Cell Genet 89(1-2)：121-128(2000))，皮肤纤维瘤(Chen，T.C.et al.″Dermatofibroma is a clonal proliferative disease″J Cutan Pathol 27(1)：36-39(2000))，高血压(Lee，S.D.et al.″Monoclonal endothelial cell proliferation is present in primarybut not secondary pulmonary hypertension″J Clin Invest 101(5)：927-934(1998))，小儿神经性疾病(Campos-Castello，J.et al.″The phenomenon of genomic″imprinting″and its implications inclinical neuropediatrics″Rev Neurol 28(1)：69-73(1999))，孤独症(Klauck，S.M.et al.″Moleculargenetic analysis of the FMR-1 gene in a large collection of autistic patients″Hum Genet 100(2)：224-229(1997))，溃疡性结肠炎(Gloria，L.et al.″DNA hypomethylation and proliferative activity areincreased in the rectal mucosa of patients with long-standing ulcerative colitis″Cancer 78(11)：2300-2306(1996))，脆弱X综合征(Hornstra，I.K.et al.″High resolution methylation analysis of theFMR1 gene trinucleotide repeat region in fragile X syndrome″Hum Mol Genet 2(10)：1659-1665(1993))，以及Huntington’s 病(FerIuga，J.et al.″Possible organ and age-related epigenetic factors inHuntington′s disease and colorectal carcinoma″Med Hypotheses 29(1)：51-54(1998)).与DNA的表遗传学状态相关的其他疾病包括低级星型细胞瘤、间变性星型细胞瘤、胶质母细胞瘤、髓母细胞瘤、结肠癌、肺癌、胰腺癌、子宫内膜癌、神经母细胞瘤、头痛、性交不适、原发性粘液水肿、恶性贫血、Addison’s病、重症肌无力、青少年性糖尿病、血小板减少性紫癜、多发性硬化、风湿性关节炎、硬化病；以及其他疾病例如CNS功能不良、损伤或疾病；攻击或行为障碍的症状；脑损伤的临床、心理和社会后果；精神障碍和人格疾病；功能不良；胃肠道的损伤和疾病；呼吸系统功能不良、损伤或疾病；病变、炎症、感染、免疫性和/或相关的恢复；机体功能不良、损伤或疾病，作为发育过程中的异常；皮肤、肌肉、结缔组织或骨骼的功能不良、损伤或疾病；内分泌和代谢功能不良、损伤或疾病；且还可以与非预期药物相互作用相联系。

b.多重分析

用于高通量鉴定来自多个靶核酸分子的核酸甲基化状态的方法，也是本文所预期的。多重指的是同时鉴定一个以上靶核酸分子的甲基化状态。用于实施多重反应的方法，尤其是与质谱分析联用是已知的(参见，例如美国专利6,043,031号以及国际PCT申请WO 97/37041号)。

多重提供的优点即：与必须对每个单个靶核酸分子必须实施独立的质谱分析相比，多个靶核酸分子可以在几个甚至单一质谱中分析其甲基化信息。本文提供的方法可以应用于高通量、高度自动化过程，用于高速准确地阐述核酸甲基化。

多重可以用来鉴定两个或多个核酸分子的甲基化状态，或鉴定两个或多个核酸分子中一个或多个核苷酸基因座的甲基化状态。在一个具体实施方式中，本文披露的方法可以用来鉴定靶核酸分子的甲基化状态，而所述靶核酸分子来自于多种不同的样品包括不同的细胞类型、不同的组织类型、不同生物体、不同菌株、不同种属、或者新细胞、新组织、新生物体、新菌株或新种属。这种来自一个以上来源的多重样品还可以称为集合。鉴定来自不同样品的靶核酸分子的甲基化状态可以用于，例如确定细胞的肿瘤性或转移性状态、诊断受试者包括例如患有遗传、感染、自身免疫或肿瘤性疾病的患者；区分细胞类型、组织类型、菌株类型或生物体类型；确定两种或多种基因之间表达的相关性以及基因表达与细胞形态学(例如细胞的有丝分裂或减数分裂状态)之间的相关性。

来自于两种或多种来源的生物样片的混合物可以合并成一个单一的混合物用于本文的分析。例如，本文提供的方法可以用于鉴定不同来源的多拷贝靶核酸分子的甲基化状态，并因此鉴定生物样品的核酸混合物中靶核酸分子甲基化状态的变异。生物样品的混合物还可以包括但不限于来自个体集合的核酸、来自一个或多个个体的核酸的不同区域、起源于单一组织或细胞类型的均质肿瘤样品、或含有一种以上组织或细胞类型的异质肿瘤样品、或起源于原发瘤的细胞系。还有一些预期的方法例如单倍体型方法，其中可以检测同一区域内每个单倍体的甲基化状态。

在另一个具体实施方式中，根据本文提供的方法可以实施的多重方法包括鉴定来自单一受试者的两种或多种靶核酸分子的甲基化状态。例如，受试者两个或多个标记物的甲基化状态可以表示受试者的疾病状态(例如肿瘤状态)或者可表示受试者的疾病或肿瘤倾向。两个或多个标记物的甲基化状态还可以用来表示患病细胞的起源。例如，某些基因(例如p15、E-钙粘蛋白和降钙素)附近的CpG岛内的甲基化可以表示急性骨髓白血病而非前列腺癌，而谷光甘肽-S转移酶蛋白-1基因附近的CpG岛内的甲基化可以表示前列腺癌而非急性骨髓白血病。因此，鉴定个体内两个或多个靶核酸甲基化状态的多重方法，可以用来确定个体内的疾病状态或其倾向，还可以用来确定个体内可能存在或可能发生的疾病类型。这种多重方法可以包括一组靶核酸标记物，其中一个或多个靶核酸标记物内存在或缺乏甲基化可以表示受试者的疾病状态(例如肿瘤状态)，或可以表示受试者的疾病或肿瘤倾向，或可用来表示患病细胞的起源。

c.靶核酸分子片段作为标记物

在其他具体实施方式中，反映靶核酸分子甲基化状态的靶核酸分子片段可以用作大靶核酸分子序列或部分的标记物或指示剂。这种具体实施方式不需要确定靶核酸分子的序列，但可以包括确定靶核酸分子的序列或部分，或简单确定靶核酸分子片段的质量峰值模式。这种方法可以包括，例如基因定位、指纹法和指纹法相关方法以及其他方法包括利用靶核酸分子片段作为靶核酸分子甲基化状态的指示剂。例如，含有甲基化胞嘧啶的特定序列可以在生物体全基因组中仅发生几次，故在基因组图谱或DNA指纹中，含有甲基化胞嘧啶的特定序列可以用作为唯一标识符。指纹法利用扩增步骤例如扩增的核糖体DNA限制性分析(ARDRA)、随机扩增的多态性DNA分析(RAPD)、限制性片段长度多态性(RFLP)以及扩增的片段长度多态性(AFLP)，可以与本文披露的甲基化检测方法联合应用。

在一个具体实施方式中，可以用修饰靶核酸分子序列作为靶核酸分子甲基化状态的函数的试剂来处理靶核酸分子，可以形成靶核酸分子的片段，并确定片段的质量，以生成质量峰值的模式，其特征在于一个、两个、三个或多个特征例如质量、峰面积以及质量峰值的信噪比。这种质量峰值的模式可以用作靶核酸分子甲基化状态的指示剂。

在一个具体实施方式中，靶核酸分子片段可以来自于非相邻的核苷酸序列。扩增和切割方法可以用来形成来自染色体或基因组广大区域的靶核酸分子片段。这些片段中的一部分可以进一步扩增并用作甲基化指纹法标记物。作为进一步扩增的可替换方法，一部分选定的片段通过结合或杂交的方法例如将选定的片段杂交到捕获寡核苷酸探针上可以与所述片段的剩余部分分开。这种具体实施方式可以使用下列物质作为靶核酸分子：来自一个或多个不同生物体例如一个种群或菌株群的基因、染色体片段、YAC、BAC、全染色体、全基因组，多个基因、染色体片段、YAC、BAC、全染色体、全基因组。用于扩增部分核酸片段的方法在本领域是已知的，例如美国专利6,045,994号披露的AFLP。

3.甲基化分析

确定特定靶核酸分子中存在或缺乏甲基化，可以用来提供关于生物样品的大量信息。例如，特定核酸区域的甲基化分析可以提供关于受试者疾病的信息，可以鉴定生物体或病原体，可以推算核酸区域或核苷酸基因座的甲基化频率，并且可以鉴定甲基化相关的等位基因。

a.疾病相关分析

甲基化水平升高或降低已经与多种疾病相相关性。在确定位点的甲基化或缺乏甲基化可以与疾病状态或无疾病状态相相关性。本文披露的方法可以用于确定受试者的疾病倾向、诊断疾病以及确定患病受试者的治疗方案的方法中。

多个核苷酸基因座和/或核酸区域的甲基化状态已知可与疾病、疾病结果以及成功治疗疾病相相关性，而且还可以用来区分根据症状、组织样品或者血液或血清样品难于区分的疾病类型。例如，CpG岛甲基化指示剂表现型(CIMP)存在于卵巢癌的某些类型，而不存在于其他类型中(Strathdee，et al.Am.J.Pathol.158：1121-1127(2001))。在另一个实施例中，甲基化可以用来区分类癌瘤和胰腺内分泌肿瘤，二者具有不同的预期结果以及疾病治疗方案(Chan et al.Oncogene22：924-934(2003))。在另一个实施例中，H.pylori依赖的胃粘膜相关淋巴组织(MALT)淋巴瘤其特征在于含有几个甲基化核酸区域，而在非H.pylori依赖的MALT淋巴瘤中那些核酸区域不是甲基化的(Kaneko et al.Gut 52：641-646(2003))。在另一个实施例中，存在于结直肠癌的CIMP通常不包含异常的p53表达，而且可用5-氟尿嘧啶有效治疗，而这种治疗对于CIMP-结直肠癌不是同等有效(Van Rijnsoever et al.Clin.Cancer Res.9：2898-2903(2003))。类似的与疾病、疾病结果和疾病治疗的关系已经与低甲基化或未甲基化核酸区域或者未甲基化核苷酸基因座相相关性。

与受试者疾病状态相关的方法可以如下实施：从受试者收集样品，用修饰靶核酸分子序列的作为靶核酸分子甲基化状态的函数的试剂处理样品，将所述样品进行甲基化特异性扩增，然后检测一个或多个与疾病或无疾病状态相关的片段。在一个具体实施方式中，利用本领域已知的或本文披露的方法，断裂扩增的靶核酸分子。在另一个具体实施方式中，通过测定靶核酸分子或靶核酸分子片段的质量来检测所述片段。靶核酸分子或靶核酸分子片段还可以利用本领域已知的或本文披露的基于杂交的检测方法进行检测。靶核酸分子或靶核酸分子片段的检测可以鉴定靶核酸分子的甲基化状态或靶核酸分子一个或多个核苷酸基因座的甲基化状态。靶核酸分子的甲基化状态或靶核酸分子一个或多个核苷酸基因座的甲基化状态的鉴定，可以表示受试者对一种或多种疾病的倾向、受试者的疾病状态、或者对于受试者来说为适当或不适当的疾病治疗过程。

来自受试者的样品可以为任何形式，包括固态物质例如组织、细胞、细胞团、细胞提取物或活检，或者生物流体例如尿液、血液、组织间液、腹膜液、血浆、淋巴液、腹水、汗液、唾液、滤泡液、乳汁、非乳汁乳腺分泌物、血清、脑脊液、粪便、精液、肺部痰液、羊膜液、感染或炎症区的渗出物、含有颊细胞的漱口液、滑膜液或者由受试者产生的任何其他液态样品。另外，所述样品可以为从组织收集的样品，包括但不限于骨髓、上皮、胃、前列腺、肾、膀胱、乳腺、结肠、肺、胰腺、子宫内膜、神经元和肌肉。样品可以包括器官以及病理样品例如福尔马林固定石蜡包埋的样品。如需要，固态物质可以与液体混合或纯化或扩增或以其他方式处理。采用本文描述的方法进行分析的样品可以在一个或多个纯化步骤中处理，以提高样品中所需细胞或核酸的纯度，样品也可以无需任何提高所需细胞或核酸纯度的纯化步骤，而采用本文描述的方法进行分析。

在一个具体实施方式中，检测甲基化靶核酸分子或靶核酸分子中一个或多个甲基化核苷酸基因座可以表示对与一种或多种甲基化DNA相关的疾病的倾向增强。在另一个具体实施方式中，检测甲基化靶核酸分子或靶核酸分子中一个或多个甲基化核苷酸基因座可以表示对与一种或多种甲基化DNA相关的疾病的倾向减弱。在另一个具体实施方式中，检测未甲基化靶核酸分子或靶核酸分子中一个或多个未甲基化核苷酸基因座可以表示对与一种或多种甲基化DNA相关的疾病的倾向减弱。在另一个具体实施方式中，检测未甲基化靶核酸分子或靶核酸分子中一个或多个未甲基化核苷酸基因座可以表示对与一种或多种甲基化DNA相关的疾病的倾向增强。

检测甲基化靶核酸分子或靶核酸分子中一个或多个甲基化核苷酸基因座可以表示受试者中存在甲基化状态相关的疾病。在另一个具体实施方式中，检测甲基化靶核酸分子或靶核酸分子中一个或多个甲基化核苷酸基因座可以表示受试者中缺乏甲基化状态相关的疾病。在另一个具体实施方式中，检测未甲基化靶核酸分子或靶核酸分子中一个或多个未甲基化核苷酸基因座可以表示受试者中缺乏甲基化状态相关的疾病。在另一个具体实施方式中，检测未甲基化靶核酸分子或靶核酸分子中一个或多个未甲基化核苷酸基因座可以表示受试者中存在甲基化状态相关的疾病。

检测甲基化靶核酸分子或靶核酸分子中一个或多个甲基化核苷酸基因座可以表示疾病治疗方案的效果增强。在另一个具体实施方式中，检测甲基化靶核酸分子或靶核酸分子中一个或多个甲基化核苷酸基因座可以表示疾病治疗方案的效果减弱。在另一个具体实施方式中，检测未甲基化靶核酸分子或靶核酸分子中一个或多个未甲基化核苷酸基因座可以表示疾病治疗方案的效果增强。在另外一个具体实施方式中，检测未甲基化靶核酸分子或靶核酸分子中一个或多个未甲基化核苷酸基因座可以表示疾病治疗方案的效果减弱。治疗方案可以包括给予药物化合物或组合物包括化学治疗化合物或组合物、外科手术或其他医学手术、物理治疗、职业治疗、饮食改良以及行为矫正。

b.生物体鉴定

本文提供的方法可以用来鉴定生物体或区别一个生物体与其它生物体不同。在一个具体实施方式中，可以鉴定人类样品。甲基化区域可以作为有用的标记物，用于人类鉴定、父子关系和母子关系检测、基因定位、迁移和遗传纠纷、孪生子配型检测、人类生育检测、培养的人类细胞的质量控制、鉴定人类遗骨、以及法医中检测精液样品、血斑和其他物质。这种甲基化区域还可以作为有用的标记物，用于商业化的动物育种和系谱分析以及商业化的植物育种。农作物和动物的经济重要性特征可以通过鉴定甲基化区域来鉴定。靶核酸分子(如基因组DNA)可以获自一个长的靶核酸分子区域和/或多个短的靶核酸分子区域。在其他具体实施方式中，方法可以用于鉴定非人类生物体例如非人类动物、鸟类、植物、真菌和细菌。

c.病原体鉴定和分型

利用本文提供的甲基化鉴定方法来鉴定微生物菌株的过程或方法也是本文所预期的。微生物选自多种生物体包括但不限于细菌、真菌、原生生物、纤毛虫以及病毒。微生物不限于具体属、种、菌株或血清型。微生物可以通过确定甲基化状态和/或靶微生物核酸相对于一个或多个参考核酸的甲基化状态变异来鉴定。参考核酸可以获自例如来自相同属或不同属、种株或血清型的其他微生物，或者获自宿主原核或真核生物。

细菌病原体的鉴定和分型在感染性疾病的临床处理中很关键。微生物的精确鉴定不仅用来区分疾病状态和健康状态，还用来确定是否以及哪种抗生素或其他抗微生物治疗是适于治疗的。病原体分型的传统方法已经利用了多种表型特征包括生长特征、颜色、细胞或克隆形态、抗生素敏感性、染色、气味以及与特异性抗体的反应性来鉴定细菌。所有这些方法需要培养病原体，而因此具有多种严重不足包括高额材料和人力消耗、操作者暴露危险、由于错配导致的假阳性以及由于存货细胞数量少或由于多种病原体的苛刻培养条件而导致的假阴性。另外，培养方法需要相对长时间以实现诊断，而且因为这种感染可能危害生命的性质，抗生物治疗通常在可以获得结果之前才启动。

在许多情况下，病原体与构成正常菌丛的生物体类似，而且可能利用本文引用的所述表型方法不能区分无毒株。在这些情况下，确定致病菌株的存在可能需要由本文提供的甲基化检测方法提供较高的分辨率。例如，基于甲基化状态的靶核酸分子序列修饰，随后是断裂以及利用MALDI/TOF质谱分析法检测片段，然后筛查甲基化状态变异，能够可靠的区分仅有一个甲基化核苷酸不同的靶核酸分子，并且可将甲基化特异性扩增的区分能力与通过MALDI-TOF MS提供的速度和信息相结合。类似的，通过比较一个或多个质量峰值或质量峰值模式而鉴定靶核酸分子中核苷酸甲基化状态的方法，可以用来检测这种序列变异。

d.单体型分析

本文提供的方法可以用来检测单体型。在任何二倍体细胞中，在含有一个或多个有区别的甲基化变异的任何基因或其他染色体区段可以存在两种单体型。确定单体型对于理解多种表型的遗传基础非常有价值，包括疾病诱因或易感性、对治疗性干预的反应以及其他医学、畜牧业和农业感兴趣的表型。

单体型分析程序允许选择来自一个个体两条同源染色体中一条的DNA部分以及鉴定该DNA部分上可能的甲基化位点。通过分别鉴定靶核酸分子的甲基化状态或对应于DNA两个单体拷贝中每一个的靶核酸分子的核苷酸基因座的甲基化状态，可以实施单体型分析的程序。还可以通过收集DNA两个单体拷贝，同时鉴定靶核酸分子的甲基化状态或对应于DNA两个单体拷贝的靶核酸分子的核苷酸基因座的甲基化状态，来实施单体型分析。典型的，同时鉴定的方法产生的结果表示两个单体型拷贝均为未甲基化的、两个单体型拷贝均为甲基化的、或者一个单体型拷贝是未甲基化的而另一个单体型拷贝是甲基化的。这些结果可以通过例如鉴定与甲基化的靶核酸分子相关的质量峰值和/或鉴定与未甲基化的靶核酸分子相关的质量峰值而确定。仅存在与甲基化的靶核酸分子相关的质量峰值，可以表示两个单体型拷贝均为甲基化的。仅存在与未甲基化的靶核酸分子相关的质量峰值，可以表示两个单体型拷贝均为未甲基化的。既存在与甲基化的靶核酸分子相关的质量峰值又存在与未甲基化的靶核酸分子相关的质量峰值，可以表示一个单体型拷贝是甲基化的而另一个单体型拷贝是未甲基化的。当既存在与甲基化的靶核酸分子相关的质量峰值又存在与未甲基化的靶核酸分子相关的质量峰值时，产生峰值的核酸片段的相对量可以利用本文提供的方法确定；典型的，当一个单体型是甲基化的而另一个单体型不是甲基化的时，则单体型分析将提供约50/50的比。

单体型的直接分辨率可以产生的信息含量增加，从而改善任何相关疾病的诊断或鉴定与那些疾病相关的相关性。

e.确定甲基化频率

本文描述的方法对于鉴定一个或多个核酸区域或核苷酸非常有用，其甲基化状态与通过年龄、种族、性别、其他疾病、对环境条件的相似暴露、相似摄入(例如食物、酒精、烟草)或其他标准分组的人群相关。本文披露的用于比较来自样品的靶核酸分子甲基化相对量的方法可以用来确定一个人群中核酸区域或核苷酸为甲基化的可能性。例如，样品可以含有来自一个人群两个或多个成员的DNA，而本文披露的甲基化状态鉴定方法可以用来确定甲基化的核酸区域或核苷酸的量相对于未甲基化的核酸区域或核苷酸的量。已知在某些水平与疾病相关的核酸区域或核苷酸甲基化状态也可以用来确定人群中的成员被甲基化相关疾病影响的易感性。确定人群中甲基化状态的变化也可以鉴定之前未知的甲基化位置并最终鉴定疾病发生和进展涉及的基因或通路。

f.鉴定等位基因

本文提供的甲基化状态鉴定方法可以用来鉴定或提供一个或多个其它等位基因存在的可能性。例如，鉴定具体基因座的甲基化状态可以用来鉴定或提供一个SNP在同一基因座、远端基因座或近端基因座发生的可能性。已知等位基因是连锁的，且以高于等位基因随机遗传预期的的比率而遗传。等位基因比随机遗传预期的更经常同时发生，称为连锁不平衡。

如本领域已知的，核酸区域(例如CpG岛)或核苷酸基因座的甲基化状态可以与多个不同的等位基因连锁。已知与甲基化连锁的等位基因类型包括SNP、微卫星(如，微卫星不稳定性)、缺失、纯合性缺失、印记或者印记缺失以及其他甲基化或未甲基化的区域。本文所使用的等位基因指的是核苷酸基因座或感兴趣的核苷酸基因座，包括常见或“野生型”基因座，也包括变异的基因座(变异的等位基因)。例如，p14甲基化与微卫星不稳定性的存在以及结肠癌中p53突变的缺乏相关(Shen et al.Gastroenterology 124：626-633(2003))。在另一个实施例中，hMLH1基因启动子的超甲基化与微卫星不稳定性相关(Kim et al.J.Pathol.200：23-31(2003))。在另一个实施例中，BRAF基因的突变与hMLH1基因启动子甲基化相关(Deng et al.Clin.Cancer Res.10：191-195(2004))。在另一个实施例中，几个基因的超甲基化与微卫星不稳定性、GA转换以及DNA中双链断裂相关(Esteller，Eur.J.Cancer 36：2294-2300(2000))。在另一个实施例中，超甲基化与纯合性缺失的增加相关(Eden et al.Science 300：455(2003))。在另一个实施例中，母源等位基因特异性KvDMR1的缺失与DMR0的T382GSNP相关(Murrell et al.Hum.Mol.Genet.13：247-255(2004)。在另一个实施例中，SNP的存在于甲基化基因座的存在相关(Ober et al.Am.J.Hum.Genet.72：1425-1435(2003))。

通过鉴定一个或多个核酸区域(例如，一个或多个CpG岛)甲基化状态而鉴定或确定等位基因存在或缺乏的可能性增加的方法，包括在本文提供的方法中。连锁不平衡可以表示第一遗传或表遗传特征(例如：甲基化)与第二遗传或表遗传特征(例如：DNP等位基因)同时观察到的频率。因此，根据连锁不平衡的程度，鉴定一个或多个核酸区域或者一个或多个核苷酸基因座的甲基化状态可以用来鉴定等位基因存在或缺乏的可能性。本文提供的方法还可以用来鉴定在一个或多个甲基化或未甲基化核酸区域或一个或多个核苷酸基因座的甲基化状态与特定等位基因之间的连锁不平衡程度。这种方法可以包括选择特定等位基因、收集含有等位基因的两种或多种核酸样品以及确定等位基因与一个或多个甲基化或未甲基化核酸区域或一个或多个核苷酸基因座的甲基化状态同时观察到的频率。用于确定连锁的等位基因存在的方法在本领域是已知的，如在US20030190644中所例证的，而且可以与本文提供的甲基化状态鉴定方法联合使用。

4.组合物和试剂盒

在另一个具体实施方式中，存在提供的诊断系统，典型的为组合物或试剂盒的形式，其合适的包装材料中含有至少一种引物和一种试剂，用于实施本文描述的一种或多种断裂方法。例如，在一个具体实施方式中，诊断系统、组合物或试剂盒，含有一种或多种甲基化特异性引物，以及用于实施一种或多种碱基特异性切割反应的试剂例如甲基化特异性引物以及一种或多种RNase、DNase或者本文提供的方法中描述的其他化学试剂。诊断系统、组合物或试剂盒对于鉴定靶核酸分子的甲基化状态或靶核酸分子核苷酸基因座的甲基化状态非常有用。

诊断系统、组合物或试剂盒可以包括至少一种引物，典型的包括至少一种甲基化特异性引物的两种或多种引物；以及蛋白例如用于实施扩增、转录和/或断裂步骤的酶；以及独立包装的化学试剂，其量足够用于至少一次分析。诊断系统、组合物或试剂盒还可以包括一种或多种扩增阻滞剂、一种或多种dNTPs、一种或多种rdNTPs、dNTPs和rdNTPs的组合、一种或多种用于在质谱测定前调节靶核酸分子片段的混合物、一种或多种MALDI基质化合物、一种或多种质谱分析底物，如在本领域已知的和在本文描述的方法中提供的。

一种示例性的组合物可以包含：作为靶核酸分子甲基化状态修饰靶核酸分子一个或多个核苷酸的试剂，例如重亚硫酸盐；一种或多种用于特异性杂交到经试剂处理的靶核酸分子上的甲基化特异性引物，例如，一种或多种甲基化特异性PCR引物；以及一种或多种用于断裂扩增的靶核酸分子的化合物，例如包括RNaseA或RNaseT1的RNases。

本文还提供了组合物，包括本文提供的试剂盒以及一种或多种设备例如质谱仪、热循环控制装置、用于制备样品的装置例如组织匀浆器，如本领域已知或本文提供的。试剂盒还可以包括用于实施本文描述的甲基化鉴定方法的合适的缓冲液和溶液。

在试剂盒中应用的包装材料可以为一种或多种用来保存试剂盒内含物的物理性结构，而且可以用众所周知的方法构建，典型的，提供无菌、无污染的环境。包装材料可以带有一个标签表示试剂盒的内含物。另外，所述包装材料含有说明书，表明如何采用试剂盒内的物质来鉴定靶核酸分子的甲基化状态或靶核酸分子核苷酸基因座的甲基化状态。典型的，说明书包括切实的表达，描述试剂浓度或至少一种分析方法的参数例如待混合试剂和样品的相对量、试剂/样品混合物保持的时间长度、温度、缓冲液条件以及其他参数。所述试剂盒可以包括一种或多种容器，其能够容纳固定极限内用于甲基化鉴定方法中的引物、酶或其他反应物或者缓冲溶液。试剂盒还可以包括底物、支持物或用于实施甲基化鉴定方法的容器包括小瓶或试管、或者质谱分析底物例如Sequenom SpectroCHIP

底物。

具体实施方式

包括以下实施例是为了说明本发明，而不是限制本发明的范围。

实施例I

以下实施例说明了一种用于鉴定靶核酸分子分子甲基化状态的方法。

方法

重亚硫酸盐处理

根据Paulin et al.Nucl.Acids Res.26：5009-5011(1998)中提供的方法来实施重亚硫酸盐处理。用限制性内切核酸酶消化基因组DNA(2μg)，然后通过加入3M氢氧化钠将其变性并在37℃下孵育15min。将6.24M尿素/2M间位重亚硫酸钠(4M重亚硫酸盐)溶液以及10mM对苯二酚钠溶液加入到变性的DNA中以达到最终浓度为：5.36M尿素、3.44M重亚硫酸盐、0.5mM对苯二酚。将DNA溶液置于0.5ml管中并用矿物油覆盖，在PCR机器中进行20个循环，所述管反复加热到95℃达30秒并在55℃下孵育15min。除了采用BresacleanDNA纯化步骤(Geneworks，Adelaide，Australia)来使所述DNA脱盐外，重亚硫酸盐处理的DNA  进一步处理，如在Clark et al.Nucl.Acids Res.22：2990-2997(1994)描述的。

PCR和体外转录

感兴趣的靶核酸分子MGMT从经重亚硫酸盐处理的人基因组DNA中扩增，采用的引物合并了T7启动子序列[5′-CAG TAA TAC GAC TCA CTA TAG GGA GA]。PCR产物可选的克隆进pGEM-T载体系统(Promega)中，并从克隆的DNA再次扩增。

对于特异性未甲基化DNA的扩增，我们采用了下列基因特异性引物序列：

MGMT_U_T7_REV：cagtaatacgactcactatagggagaaggctttttcctatcacaaaaataatccac

MGMT_U_10MER_FOR：aggaagagaggggatttttattaagtgggtgttg.

对于甲基特异性扩增，我们采用了下列引物序列：

MGMT_M_T7_REV：cagtaatacgactcactatagggagaaggctcttttcctatcacaaaaataatccg

MGMT_M_10MER_FOR：aggaagagaggatttttattaagcgggcgtc.

所述PCR反应在5μl的总体积中进行，采用1pmol每种引物、40μM dNTP、0.1Uμl Hot Star Taq DNA聚合酶(Qiagen)、1.5mM MgCl₂以及随酶提供的缓冲液。这种反应混合物在95℃下预激活15min，反应混合物共扩增45个循环：95℃，20秒；62℃，30秒以及72℃，30秒，循环完成后，反应混合物在72℃下孵育3min。通过加入1.7μl水和0.3μl虾碱性磷酸酶，使未使用的dNTP脱磷酸，并在37℃下孵育20min。

一份2μl的PCR混合物(25～250ng扩增子)直接用作4μl转录反应的模板。采用突变的聚合酶(20单位T7R&DNA聚合酶；Epicentre，Madison，WI)将dCTP或dUTP/dTTP整合入转录物中。核糖核苷酸以1mM使用，而(可选的)dNTP底物以5mM使用。反应中的其他组分如由酶的供应商建议的。转录后，加入RNase切割体外转录物，然后混合物进一步用水稀释至27μl的最终体积。

所述方案在本领域是已知的，如Stanssens et al.Genome Res.14：126-133(2004)中所例证的。

样品调节以及质谱测定

通过往所述转录样品中加入6mgCLEAN Resin(Sequenom Inc.San Diego，CA)实现磷酸骨架的调节。将一份15nl的切割反应混合物机械性分配到用基质预负荷(SpectroCHIP；Sequenom Inc.San Diego，CA)的硅胶芯片上。质谱利用MassARRAY质谱仪(BRUKER-SEQUENOM)来收集。

基因组甲基化轮廓的发现

检测扩增子可以为包括25～30个CpG位点的400～500个碱基对的靶核酸分子。这种区域的上链和下链可以分别被分析。为了将其分成甲基化和未甲基化模板，可以扩增重亚硫酸盐处理的基因组DNA，并克隆扩增产物。在正向链C特异性切割而在反向链G特异性切割的反应中，可观察到质量信号模式的差异。单个切割反应产生的质量信号模式可以区分甲基化和未甲基化模板DNA。在那些由于甲基化保护使得胞嘧啶不能转化成尿嘧啶的链，将在扩增产物中携带切割位点。这些切割位点引起转录产物的断裂，片段长度由相邻甲基化CpG位点的距离而决定。未甲基化模板不含有胞嘧啶，因此不携带切割位点。所得到的全长转录产物不能通过MALDI-TOF检测。这些反应提供对于发现甲基化以及区分甲基化和未甲基化样品非常有用的质量模式，因为来源于未甲基化和甲基化DNA的片段差异容易测定。另外，这些模式适合鉴定在选择性PCR扩增后仅含有5％甲基化DNA的混合物中的甲基化。

甲基化比率分析

另一个碱基特异性切割反应适于鉴定甲基化比率。甲基化诱导的正向链上的C/T转换用反向链上的G/A转换来代表。当一个切割产物上包含多个CpG时，这些转换引起16道尔顿(G/A质量位移)的质量位移或其倍数。在甲基化引起信号的质量位移的反应中，一个信号代表甲基化的模板而另一个信号代表未甲基化模板。这些信号的强度可以进行比较以确定甲基化vs.未甲基化模板的比。而且，测定片段的碱基组成仅有一个或几个核苷酸不同，保证在MALDI-TOF测定过程中相等的解析和离子化性能。用于估计信号强度的方法例如“峰下面积”和“信噪比”可以产生相似的结果。根据靶核酸分子的序列，多个信号对可以用于确定信号强度之间的比。这种信息可以用来独立评估每个CpG位点的甲基化程度，或者如果全部CpG位点均为大约同等程度的甲基化，可以用来将甲基化含量在完整靶区域上进行平均。信号强度比值与所采用DNA之间的直接相关性可以确定模板甲基化范围为10％～90％。如果甲基化和未甲基化模板之间的比值低于10％或超过90％，代表较低量模板的信号仍然可以检测，但定量可能发生更高的误差。

甲基化模式分析

碱基特异性切割可以确定给定靶核酸分子内每个CpG的甲基化状态。C-特异性正向反应在扩增子内每个甲基化CpG产生一个切割位点。因此，理论上，每个甲基化CpG产生一个特异性片段，得到质谱内至少一个指示性信号。这些信号中的一些可能不是可检测的，因为其质量落在高或低质量截断值之外。现有的MALDI-TOF设备可以检测质量在约1000～11000Da之间的切割产物，等同于长度为约3～35个核苷酸的片段。仅一个反应的分析可以用于确定靶核酸分子内全部CpG位点中75％左右(根据靶核酸分子的大小、序列以及甲基化程度，可能会较大或较小)的甲基化状态。为了获得关于全部CpG位点的信息，两个反应已足够。使用4个反应有利于提供冗余信息。例如，当进行4个反应时，全部CpG位点中的90％以上可以用一个以上的信号代表。这意味着大多数或全部甲基化事件可以通过一个以上观察结果独立进行确证。这种冗余度在诊断性应用中非常有用。

结果

以下提供一个方法的实施例，其用来分析来自于PCR反应的碱基切割片段，其中计划PCR反应对于甲基化vs.未甲基化模板DNA的扩增是特异性的。所述方法允许消除当利用甲基化特异性引物的PCR反应引起未甲基化DNA的扩增时所产生的假阳性结果。简单而言，记录质量信号模式并与虚拟推算的断裂模式进行比较。通过比较获得的质量信号模式与虚拟推算的质量信号，甲基化状态确定为甲基化或未甲基化模板DNA。

附图说明

图1和图2示出了两个质谱的重叠：上面的波谱来源于“U”反应，用于特异性扩增未甲基化DNA(其中“U”相当于未甲基化，unmethylated)，下面的波谱来源于“M”反应，用于特异性扩增甲基化DNA(其中“M”相当于甲基化，methylated)。在图1和图2中，点线分别表示来源于未甲基化模板(图1)和甲基化模板(图2)的切割产物的参考质量信号。图1表示来源于未甲基化模板的切割产物在其预期质量中发现。上面波谱的全部信号在其预期质量中发现，如通过虚拟模拟推算的，因此表示未甲基化模板DNA的特异性扩增是成功的。相反，图2示出了来源于对甲基化模板DNA特异的扩增反应的切割产物不与预期质量相匹配。在3913道尔顿和2878道尔顿的信号不受甲基化影响而保持匹配，然而，在2525道尔顿和3473道尔顿的信号对应于未甲基化参照物中2509道尔顿和3457道尔顿。通过比较图1和图2，显而易见，来自甲基化特异性反应的切割产物在对未甲基化模板DNA特异的质量处进行检测。这表明所述甲基化特异性扩增反应实际上扩增未甲基化DNA并产生凝胶电泳上的假阳性结果，其可以通过质谱分析进行校正。

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本文参考的每个专利、专利申请、出版物以及文件结合于此供参考。引用上述专利、专利申请、出版物以及文件既不认可上述任何一个是恰当的前期技术，也不形成对这些出版物或文件的内容或日期的认可。单独而言，这些文件和并于此供参考，不应该认为是可断言或承认任何文件内容的任何部分对于满足任何国家或地区法定专利申请的披露要求而言是必要材料。尽管如此，保留在合适的时候依靠这些文件中的任何一个来提供检查机构或法庭认为对所声明的主题必要的材料的权利。

在不偏离本发明的基本方面时，可对上述内容进行修改。尽管本发明已经对一个或多个特异性具体实施方式以大量的细节进行描述，本领域的技术人员将认识到可以对本发明中明确披露的具体实施方式进行更改，然而这些修改和改进应在本发明的范围和精神之内。本发明本文恰当示例性进行描述，可以在缺乏本文非明确披露的要素时而实施。因此，例如在本文的每个情况下，术语“包括”“主要由、、、构成”以及“由、、、构成”中的任何一个可以用其他两个术语之一代替。因此，所采用的术语和表达法用作描述而非限制术语，不排除所示出和描述的特征的同等物或其部分，而且应认识到在本发明的范围内可能进行多种修改。本发明的具体实施方式在以下权利要求中列出。

Claims (182)

1.一种鉴定甲基化的核酸分子的方法，包括：

(a)用可将未甲基化的胞嘧啶修饰生成尿嘧啶的试剂处理靶核酸分子；

(b)用靶核酸结合区含有一个或多个鸟嘌呤核苷酸的引物特异性扩增处理过的靶核酸分子；

(c)碱基特异性地切割扩增产物；以及

(d)检测切割产物，其中两个或多个片段的存在表示靶核酸分子含有一个或多个甲基化的胞嘧啶。

2.一种鉴定甲基化的核酸分子的方法，包括：

(a)用可将未甲基化的胞嘧啶修饰生成尿嘧啶的试剂处理靶核酸分子；

(b)扩增处理过的靶核酸分子以形成第一扩增产物；

(c)用靶核酸结合区含有一个或多个胞嘧啶核苷酸的引物特异性扩增所述第一扩增产物以形成第二扩增产物；

(d)碱基特异性地切割第二扩增产物；以及

(e)检测切割产物，其中两个或多个片段的存在表示靶核酸分子含有一个或多个甲基化的胞嘧啶。

3.一种鉴定甲基化的核酸分子的方法，包括：

(a)用可将未甲基化的胞嘧啶修饰生成尿嘧啶的试剂处理靶核酸分子；

(b)用靶核酸结合区含有一个或多个鸟嘌呤核苷酸的引物特异性扩增处理过的靶核酸分子；

(c)碱基特异性地切割扩增产物；以及

(d)检测切割产物的质量，其中：与参考质量相比较，

一个或多个切割产物的质量变化表示所述靶分子含有一个或多个甲基化的胞嘧啶。

4.一种鉴定甲基化的核酸分子的方法，包括：

(a)用可将未甲基化的胞嘧啶修饰生成尿嘧啶的试剂处理靶核酸分子；

(b)扩增处理过的靶核酸分子以形成第一扩增产物；

(c)用靶核酸结合区含有一个或多个胞嘧啶核苷酸的引物特异性扩增所述第一扩增产物以形成第二扩增产物；

(d)碱基特异性地切割所述第二扩增产物；以及

(e)检测切割产物的质量，其中：与参考质量相比较，

一个或多个切割产物的质量变化表示所述靶分子含有一个或多个甲基化的胞嘧啶。

5.一种鉴定甲基化的核酸分子的方法，包括：

(a)用可将未甲基化的胞嘧啶修饰生成尿嘧啶的试剂处理靶核酸分子；

(b)用靶核酸结合区含有一个或多个鸟嘌呤核苷酸的引物特异性扩增处理过的靶核酸分子；

(c)碱基特异性地切割所述扩增产物；以及

(d)检测所述切割产物的质量，其中：一个或多个与参考质量相同的切割产物的质量表示所述靶分子含有一个或多个甲基化的胞嘧啶。

6.一种鉴定甲基化的核酸分子的方法，包括：

(a)用可将未甲基化的胞嘧啶修饰生成尿嘧啶的试剂处理靶核酸分子；

(b)扩增处理过的靶核酸分子以形成第一扩增产物；

(c)用靶核酸结合区含有一个或多个胞嘧啶核苷酸的引物特异性扩增所述第一扩增产物以形成第二扩增产物；

(d)碱基特异性地切割所述第二扩增产物；以及

(e)检测切割产物的质量，其中：一个或多个与参考质量相同的切割产物的质量表示所述靶分子含有一个或多个甲基化的胞嘧啶。

7.一种用于鉴定核酸中甲基化的核苷酸的核苷酸基因座的方法，包括：

(a)用可将未甲基化的胞嘧啶修饰生成尿嘧啶的试剂处理靶核酸分子；

(b)用靶核酸结合区含有一个或多个鸟嘌呤核苷酸的引物特异性扩增处理过的靶核酸分子；

(c)碱基特异性地切割扩增产物；以及

(d)检测切割产物的质量，其中：与参考质量相比较，

一个或多个切割产物的质量变化表示靶分子中的核苷酸基因座是甲基化的。

8.一种用于鉴定核酸中甲基化的核苷酸的核苷酸基因座的方法，包括：

(a)用可将未甲基化的胞嘧啶修饰生成尿嘧啶的试剂处理靶核酸分子；

(b)扩增处理过的靶核酸分子以形成第一扩增产物；

(c)用靶核酸结合区含有一个或多个胞嘧啶核苷酸的引物特异性扩增所述第一扩增产物，形成第二扩增产物；

(d)碱基特异性的切割所述第二扩增产物；以及

(e)检测切割产物的质量，其中：与参考质量相比较，一个或多个切割产物的质量变化表示靶分子中的核苷酸基因座是甲基化的。

9.一种用于鉴定核酸中甲基化的核苷酸的核苷酸基因座的方法，包括：

(a)用可将未甲基化的胞嘧啶修饰生成尿嘧啶的试剂处理靶核酸分子；

(b)用靶核酸结合区含有一个或多个鸟嘌呤核苷酸的引物特异性扩增处理过的靶核酸分子；

(c)碱基特异性地切割扩增产物；以及

(e)检测切割产物的质量，其中：一个或多个与参考质量相同的切割产物的质量，表示靶分子中的核苷酸基因座是甲基化的。

10.一种用于鉴定核酸中甲基化的核苷酸的核苷酸基因座的方法，包括：

(a)用可将未甲基化的胞嘧啶修饰生成尿嘧啶的试剂处理靶核酸分子；

(b)扩增处理过的靶核酸分子以形成第一扩增产物；

(c)用靶核酸结合区含有一个或多个胞嘧啶核苷酸的引物特异性扩增所述第一扩增产物以形成第二扩增产物；

(d)碱基特异性地切割所述第二扩增产物；以及

(e)检测切割产物的质量，其中：一个或多个与参考质量相同的切割产物的质量表示靶分子中的核苷酸基因座是甲基化的。

11.一种用于鉴定核酸中甲基化核苷酸的核苷酸基因座的方法，包括：

(a)用可将未甲基化的胞嘧啶修饰生成尿嘧啶的试剂处理靶核酸分子；

(b)用靶核酸结合区含有一个或多个鸟嘌呤核苷酸的引物特异性扩增处理过的靶核酸分子；

(c)碱基特异性地切割扩增产物；以及

(d)用相同的切割试剂切割或模拟切割参考核酸；

(e)检测(c)和(d)中生成的切割产物的质量；

(f)确定(c)中生成的片段和(d)中生成的片段之间的质量信号的差异；以及

(g)从质量信号的差异中确定一组减少的序列变异候选物，从而确定与参考核酸相比所述靶分子中的序列变异，其中核苷酸基因座的甲基化通过序列变异的核苷酸基因座来表示。

12.一种用于鉴定核酸中甲基化核苷酸的核苷酸基因座的方法，包括：

(a)用可将未甲基化的胞嘧啶修饰生成尿嘧啶的试剂处理靶核酸分子；

(b)扩增处理过的靶核酸分子以形成第一扩增产物；

(c)用靶核酸结合区含有一个或多个胞嘧啶核苷酸的引物特异性扩增所述第一扩增产物以形成第二扩增产物；

(d)碱基特异性的切割所述第二扩增产物；

(e)用相同的切割试剂切割或模拟切割参考核酸；

(f)检测(d)和(e)中生成的切割产物的质量；

(g)确定(d)中生成的片段和(e)中生成的片段之间的质量信号的差异；以及

(h)从质量信号的差异中确定一组减少的序列变异候选物，从而确定与参考核酸相比靶核酸中的序列变异，其中核苷酸基因座的甲基化通过序列变异的核苷酸基因座来表示。

13.一种鉴定甲基化核酸分子的方法，包括：

(a)处理靶核酸分子，以确定未甲基化的胞嘧啶核苷酸；

(b)用引物特异性扩增处理过的靶核酸分子，所述引物与含有一个或多个胞嘧啶核苷酸的靶核酸分子中的预先确定区特异性杂交；

(c)碱基特异性地切割所述扩增产物；以及

(d)检测切割产物的质量，其中：与参考质量相比较，一个或多个切割产物的质量变化表示所述靶分子含有一个或多个甲基化的胞嘧啶。

14.一种用于鉴定核酸中甲基化核苷酸的核苷酸基因座的方法，包括：

(a)处理靶核酸分子，以确定未甲基化的胞嘧啶核苷酸；

(b)用引物特异性扩增处理过的所述靶核酸分子，所述引物与含有一个或多个胞嘧啶核苷酸的靶核酸分子中的预先确定区特异性杂交；

(c)碱基特异性的切割所述扩增产物；以及

(d)检测切割产物的质量，其中：与参考质量相比较，一个或多个切割产物的质量变化表示靶分子中的核苷酸基因座是甲基化的。

15.一种用于鉴定甲基化的核酸中核苷酸基因座的甲基化状态的方法，包括：

(a)处理靶核酸分子，以确定未甲基化的胞嘧啶核苷酸；

(b)用引物特异性扩增处理过的靶核酸分子，所述引物与含有一个或多个胞嘧啶核苷酸的靶核酸分子的预先确定的第一个区域特异性杂交；

(c)碱基特异性地切割所述扩增产物；以及

(d)检测所述切割产物的质量，其中：与参考质量相比较，一个或多个切割产物的质量变化表示靶分子中的第二个区域的核苷酸基因座是甲基化的，其中所述第一个区域和所述第二个区域相互不交迭。

16.一种用于鉴定核酸中甲基化核苷酸的核苷酸基因座的方法，包括：

(a)处理靶核酸分子，以确定未甲基化的胞嘧啶核苷酸；

(b)用引物特异性扩增处理过的靶核酸分子，所述引物与靶核酸分子中的预先确定区或者预先确定区的互补序列特异性杂交，其中预先确定区含有一个或多个胞嘧啶核苷酸；

(c)碱基特异性地切割所述扩增产物；以及

(d)检测所述切割产物的质量，其中：与参考质量相比较，一个或多个切割产物的质量变化表示靶分子中的核苷酸基因座是甲基化的。

17.一种鉴定甲基化核酸分子的方法，包括：

(a)用可修饰未甲基化的选定的核苷酸生成不同的核苷酸的试剂处理靶核酸分子；

(b)用引物特异性扩增处理过的靶核酸分子，所述引物的靶核酸结合区含有一个或多个与选定核苷酸互补的核苷酸；

(c)碱基特异性地切割所述扩增产物；以及

(d)检测所述切割产物，其中两个或多个片段的存在表示所述靶核酸分子含有一个或多个甲基化的选定核苷酸。

18.一种鉴定甲基化核酸的方法，包括：

(a)用可修饰未甲基化的选定的核苷酸生成不同的核苷酸的试剂处理靶核酸分子；

(b)扩增处理过的靶核酸分子以形成第一扩增产物；

(c)用靶核酸结合区含有一个或多个所选核苷酸的引物特异性扩增所述第一扩增产物以形成第二扩增产物；

(d)碱基特异性地切割所述第二扩增产物；以及

(e)检测切割产物，其中两个或多个片段的存在表示靶核酸分子含有一个或多个甲基化的选定核苷酸。

19.一种鉴定核酸中甲基化或未甲基化的核苷酸的方法，包括：

(a)用从由可修饰未甲基化的选定的核苷酸生成不同核苷酸的试剂和可修饰甲基化的选定的核苷酸生成不同核苷酸的试剂组成的组中选择的试剂处理靶核酸分子；

(b)用引物特异性扩增处理过的靶核酸分子，所述引物选自由靶核酸结合区包含一个或多个与选定核苷酸互补的核苷酸的引物、靶核酸结合区包含一个或多个与选定核苷酸互补物相互补的核苷酸的引物、靶核酸结合区包含一个或多个与不同核苷酸互补的核苷酸的引物、靶核酸结合区包含一个或多个与不同核苷酸互补物相互补的核苷酸的引物组成的组；

(c)在碱基特异性切割条件下，处理所述扩增的核酸分子；以及

(d)检测切割处理的产物，其中鉴定靶核酸分子含有一个或多个甲基化或未甲基化的选定核苷酸可通过观察结果表示，而所述观察结果选自由存在两个或多个产物、仅存在单个产物、存在比参考产物数量多一个或多个的产物、存在比参考产物数量少一个或多个的产物、存在与参考产物数量相同的产物、与参考产物质量相比一个或多个产物质量的变化以及与参考产物质量相同的一个或多个产物所组成的组。

20.一种鉴定核酸中一个或多个甲基化核苷酸的方法，包括：

(a)用修饰作为选定核苷酸甲基化状态的函数的选定的核苷酸以生成不同核苷酸的试剂处理靶核酸分子；

(b)用引物接触处理过的靶核酸分子，而所述引物与含有一个或多个选定核苷酸或者一个或多个不同核苷酸的靶核酸区域特异性杂交；

(c)在核酸合成条件下处理接触过的所述靶核酸分子；

(d)在碱基特异性切割条件下处理合成的产物；以及

(e)检测切割处理的产物，根据检测的切割产物的数量，可以鉴定靶核酸中一个或多个甲基化的核苷酸。

21.一种鉴定核酸中一个或多个甲基化核苷酸的方法，包括：

(a)用可修饰作为选定核苷酸甲基化状态的函数的选定的核苷酸生成不同核苷酸的试剂处理靶核酸分子；

(b)用引物接触处理过的靶核酸分子，所述引物与含有一个或多个选定核苷酸或者一个或多个不同核苷酸的靶核酸区域特异性杂交；

(c)在核酸合成条件下处理接触过的所述靶核酸分子；

(d)在碱基特异性切割条件下处理合成的产物；

(e)检测切割处理的产物；以及

(f)与一个或多个参照比较一个或多个切割产物，据此鉴定靶核酸中一个或多个甲基化的核苷酸。

22.一种鉴定核酸中一个或多个未甲基化的核苷酸的方法，包括：

(a)用可修饰作为选定核苷酸甲基化状态的函数的选定的核苷酸以生成不同核苷酸的试剂处理靶核酸分子；

(b)用引物接触处理过的靶核酸分子，所述引物与含有一个或多个选定核苷酸或者一个或多个不同核苷酸的靶核酸区域特异性杂交；

(c)在核酸合成条件下处理接触过的所述靶核酸分子；

(d)在碱基特异性切割条件下处理合成的产物；以及

(e)检测切割处理的产物，根据检测的切割产物的数量，可以鉴定靶核酸中一个或多个未甲基化的核苷酸。

23.一种鉴定核酸中一个或多个未甲基化的核苷酸的方法，包括：

(a)用可修饰作为选定核苷酸甲基化状态的函数的选定的核苷酸以生成不同核苷酸的试剂处理靶核酸分子；

(b)用引物接触处理过的靶核酸分子，所述引物与含有一个或多个选定核苷酸或者一个或多个不同核苷酸的靶核酸区域特异性杂交；

(c)在核酸合成条件下处理接触过的所述靶核酸分子；

(d)在碱基特异性切割条件下处理合成的产物；

(e)检测切割处理的产物；以及

(f)与一个或多个参照比较一个或多个切割产物，据此鉴定靶核酸中一个或多个未甲基化的核苷酸。

24.一种鉴定核酸中一个或多个甲基化的核苷酸的方法，包括：

(a)用可修饰作为选定核苷酸甲基化状态的函数的选定的核苷酸以生成不同核苷酸的试剂处理靶核酸分子；

(b)扩增处理过的靶核酸分子以形成扩增产物；

(c)用引物接触处理过的靶核酸分子，所述引物与含有一个或多个选定核苷酸或者一个或多个不同核苷酸的靶核酸区域特异性杂交；

(d)在核酸合成条件下处理接触过的扩增产物；

(e)在碱基特异性切割条件下处理合成的产物；以及

(f)检测切割处理的产物，根据检测的切割产物的数量，可以鉴定靶核酸中一个或多个未甲基化的核苷酸。

25.一种鉴定核酸中一个或多个甲基化的核苷酸的方法，包括：

(a)用可修饰作为选定核苷酸甲基化状态的函数的选定的核苷酸生成不同核苷酸的试剂处理靶核酸分子；

(b)扩增处理过的靶核酸分子以形成扩增产物；

(c)用引物接触处理过的靶核酸分子，所述引物与含有一个或多个选定核苷酸或者一个或多个不同核苷酸的靶核酸区域特异性杂交；

(d)在核酸合成条件下处理接触过的扩增产物；

(e)在碱基特异性切割条件下处理合成的产物；

(f)检测切割处理的产物；以及

(g)与一个或多个参照比较一个或多个切割产物，据此鉴定靶核酸中一个或多个甲基化的核苷酸。

26.一种鉴定核酸中一个或多个未甲基化的核苷酸的方法，包括：

(a)用可修饰作为选定核苷酸甲基化状态的函数的选定的核苷酸生成不同核苷酸的试剂处理靶核酸分子；

(b)扩增处理过的靶核酸分子以形成扩增产物；

(c)用引物接触处理过的靶核酸分子，所述引物与含有一个或多个选定核苷酸或者一个或多个不同核苷酸的靶核酸区域特异性杂交；

(d)在核酸合成条件下处理接触过的扩增产物；

(e)在碱基特异性切割条件下处理合成的产物；以及

(f)检测切割处理的产物，根据检测的切割产物的数量，可以鉴定靶核酸中一个或多个未甲基化的核苷酸。

27.一种鉴定核酸中一个或多个未甲基化的核苷酸的方法，包括：

(a)用可修饰作为选定核苷酸甲基化状态的函数的选定的核苷酸生成不同核苷酸的试剂处理靶核酸分子；

(b)扩增处理过的靶核酸分子以形成扩增产物；

(c)用引物接触处理过的靶核酸分子，所述引物与含有一个或多个选定核苷酸或者一个或多个不同核苷酸的靶核酸区域特异性杂交；

(d)在核酸合成条件下处理接触过的扩增产物；

(e)在碱基特异性切割条件下处理合成的产物；

(f)检测切割处理的产物；以及

(g)与一个或多个参照比较一个或多个切割产物，据此鉴定靶核酸中一个或多个未甲基化的核苷酸。

28.一种鉴定核酸中甲基化或未甲基化的核苷酸的方法，包括：

(a)用从由可修饰未甲基化的选定的核苷酸生成不同核苷酸的试剂和可修饰甲基化的选定的核苷酸生成不同核苷酸的试剂组成的组中选择的试剂，处理靶核酸分子；

(b)特异性扩增处理过的靶核酸分子，通过选自由以下方法组成的组中的方法：

(i)用引物接触处理过的靶核酸分子，所述引物与含有一个或多个选定核苷酸或者一个或多个不同核苷酸的靶核酸区域特异性杂交；并在核酸合成条件下处理接触过的靶核酸分子；

(ii)扩增处理过的靶核酸分子以形成扩增产物；用引物接触扩增产物，所述引物与含有一个或多个选定核苷酸或者一个或多个不同核苷酸的靶核酸区域特异性杂交；并在核酸合成条件下处理接触过的扩增产物；

(c)用碱基特异性切割条件处理扩增产物；以及

(d)检测切割处理的产物，其中含有一个或多个甲基化或未甲基化的选定核苷酸的靶核酸分子可通过观察结果表示，而所述观察结果选自由存在两个或多个切割产物、仅存在单个切割产物、存在比参考核酸分子数量多的一个或多个的切割产物、存在比参考核酸分子数量少的一个或多个的切割产物、存在与参考核酸分子数量相同的切割产物、与参考核酸分子质量相比一个或多个产物质量的变化、以及一个或多个与参考核酸分子质量相同的切割产物所组成的组。

29.一种鉴定核酸中一个或多个甲基化或未甲基化的核苷酸的方法，包括：

(a)用可修饰作为选定核苷酸甲基化状态的函数的选定的核苷酸生成不同核苷酸的试剂处理靶核酸分子；

(b)用引物接触所述处理过的靶核酸分子，所述引物含有与选定核苷酸互补的一个或多个核苷酸或含有与不同核苷酸互补的一个或多个核苷酸；

(c)在核酸合成条件下处理所述接触过的靶核酸分子，据此核苷酸在杂交到靶核酸分子的引物上合成；

(d)在碱基特异性切割条件下处理所述合成产物；以及

(e)检测所述切割处理的产物，其中含有一个或多个甲基化或未甲基化的选定核苷酸的靶核酸分子根据切割产物的数量或者根据一个或多个切割产物与一个或多个参照物之间的比较来确定。

30.一种鉴定核酸中一个或多个甲基化或未甲基化的核苷酸的方法，包括：

(a)用可修饰作为选定核苷酸甲基化状态的函数的选定的核苷酸生成不同核苷酸的试剂处理靶核酸分子；

(b)扩增所述处理过的靶核酸分子以形成扩增产物；

(c)用引物接触所述处理过的靶核酸分子，所述引物含有与所述选定核苷酸互补的核苷酸互补的一个或多个核苷酸或含有与所述不同核苷酸互补的核苷酸互补的一个或多个核苷酸；

(d)在核酸合成条件下处理所述接触过的靶核酸分子，据此核苷酸在杂交到靶核酸分子的引物上合成；

(e)在碱基特异性切割条件下处理所述合成产物；以及

(f)检测所述切割处理的产物，其中含有一个或多个甲基化或未甲基化的选定核苷酸的靶核酸分子根据切割产物的数量或者根据一个或多个切割产物与一个或多个参照物之间的比较来确定。

31.一种区分假阳性甲基化特异性扩增和真甲基化特异性扩增的方法，包括以下步骤：

(a)用可修饰未甲基化的选定核苷酸生成不同核苷酸的试剂处理靶核酸分子；

(b)用与含有一个或多个选定核苷酸的第一个靶核酸区互补的甲基化状态特异性引物接触所述处理过的靶核酸分子；

(c)在核酸合成条件下处理所述接触过的靶核酸分子；

(d)在碱基特异性切割条件下处理所述合成产物；以及

(e)检测切割产物的质量，其中：与参考质量相比，一个或多个切割产物质量的变化表示靶核酸第二个区域中的核苷酸基因座是甲基化的，其中所述第二个区域与第一个区域不交迭，据此，第二个区域中存在一个或多个甲基化基因座确证真甲基化特异性扩增。

32.一种区分假阳性甲基化特异性扩增和真甲基化特异性扩增的方法，包括以下步骤：

(a)用可修饰未甲基化的选定核苷酸生成不同核苷酸的试剂处理靶核酸分子；

(b)用与含有一个或多个选定核苷酸的第一个靶核酸区互补的甲基化状态特异性引物接触所述处理过的靶核酸分子；

(c)在核酸合成条件下处理所述接触过的靶核酸分子；

(d)在碱基特异性切割条件下处理所述合成产物；以及

(e)检测切割产物的质量，其中：与参考质量相比，一个或多个切割产物质量的变化表示靶分子第二个区域中的核苷酸基因座是甲基化的，其中所述第二个区域与第一个区域不交迭，据此，一个或多个基因座的甲基化状态与参考核酸分子中相应基因座的甲基化状态进行比较，并且甲基化基因座与参考核酸分子的相关性确证了真甲基化特异性扩增。

33.一种在两个或多个核酸中鉴定一个或多个甲基化或未甲基化的核苷酸的方法，包括：

(a)用可修饰作为选定核苷酸的甲基化状态的函数的选定核苷酸生成不同核苷酸的试剂处理两个或多个不同的靶核酸分子；

(b)用引物接触所述处理过的靶核酸分子，所述引物含有一个或多个与选定核苷酸互补的核苷酸，或者含有一个或多个与不同核苷酸互补的核苷酸；

(c)在核酸合成条件下处理接触过的所述靶核酸分子，由此核苷酸被合成到杂交到靶核酸分子的引物上；

(d)在碱基特异性切割条件下处理所述合成产物；以及

(e)检测所述切割处理的产物，其中含有一个或多个甲基化或未甲基化的选定核苷酸的靶核酸分子根据一个或多个切割产物与一个或多个参照物之间的比较来确定。

34.一种在两个或多个核酸中鉴定一个或多个甲基化或未甲基化的核苷酸的方法，包括：

(a)用可修饰作为的选定核苷酸的甲基化状态的函数的选定核苷酸生成不同核苷酸的试剂处理两个或多个靶核酸分子；

(b)扩增所述处理过的靶核酸分子以形成扩增产物；

(c)用引物接触所述处理过的靶核酸分子，所述引物含有与选定核苷酸互补的核苷酸相互补的一个或多个核苷酸，或者含有与不同核苷酸互补的核苷酸相互补的一个或多个核苷酸；

(d)在核酸合成条件下处理所述接触过的靶核酸分子，据此，核苷酸在杂交到靶核酸分子的引物上合成；

(e)在碱基特异性切割条件下处理所述合成产物；以及

(f)检测所述切割处理的产物，其中含有一个或多个甲基化或未甲基化的选定核苷酸的靶核酸分子根据一个或多个切割产物与一个或多个参照物之间的比较来确定。

35.一种鉴定核酸中一个或多个甲基化或未甲基化的核苷酸的方法，包括：

(a)用可修饰作为的选定核苷酸的甲基化状态的函数的选定核苷酸生成不同核苷酸的试剂处理靶核酸分子；

(b)用引物接触所述处理过的靶核酸分子，所述引物含有一个或多个与选定核苷酸互补的核苷酸，或者含有一个或多个与不同核苷酸互补的核苷酸；

(c)在核酸合成条件下处理所述接触过的靶核酸分子，据此，核苷酸在杂交到所述靶核酸分子的引物上合成；

(d)在断裂条件下处理所述合成产物；以及

(e)通过质谱分析法检测断裂处理的产物，其中含有一个或多个甲基化或未甲基化的选定核苷酸的靶核酸分子根据断裂产物的数量或者根据一个或多个断裂产物与一个或多个参照物之间的比较来确定。

36.一种鉴定核酸中一个或多个甲基化或未甲基化的核苷酸的方法，包括：

(a)用可修饰作为选定核苷酸的甲基化状态的函数的选定的核苷酸生成不同核苷酸的试剂处理靶核酸分子；

(b)扩增所述处理过的靶核酸分子以形成扩增产物；

(c)用引物接触所述处理过的靶核酸分子，所述引物含有与选定核苷酸互补的核苷酸相互补的一个或多个核苷酸，或者含有与不同核苷酸互补的核苷酸相互补的一个或多个核苷酸；

(d)在核酸合成条件下处理所述接触过的靶核酸分子，据此，核苷酸在杂交到靶核酸分子杂交的引物上合成；

(e)在断裂条件下处理所述合成产物；以及

(f)通过质谱分析法检测断裂处理的产物，其中含有一个或多个甲基化或未甲基化的选定核苷酸的靶核酸分子根据断裂产物的数量或者根据一个或多个断裂产物与一个或多个参照物之间的比较来确定。

37.一种鉴定核酸中一个或多个甲基化或未甲基化的核苷酸的方法，包括：

(a)用可修饰作为选定核苷酸的甲基化状态的函数的选定的核苷酸生成不同核苷酸的试剂处理靶核酸分子；

(b)用封闭性寡核苷酸接触所述处理过的靶核酸分子，所述封闭性寡核苷酸含有一个或多个与选定核苷酸互补的核苷酸，或者含有一个或多个与不同核苷酸互补的核苷酸；

(c)在核酸合成条件下处理所述接触过的靶核酸分子，据此，当封闭性寡核苷酸与靶核酸分子杂交时，核苷酸合成被抑制；

(d)在碱基特异性切割条件下处理所述合成产物；以及

(e)检测所述切割处理的产物，其中含有一个或多个甲基化或未甲基化的选定核苷酸的靶核酸分子根据切割产物的数量或者根据一个或多个切割产物与一个或多个参照物之间的比较来确定。

38.一种鉴定核酸中一个或多个甲基化或未甲基化的核苷酸的方法，包括：

(a)用可修饰作为选定核苷酸的甲基化状态的函数的选定的核苷酸生成不同核苷酸的试剂处理靶核酸分子；

(b)扩增所述处理过的靶核酸分子以形成扩增产物；

(c)用封闭性寡核苷酸接触所述处理过的靶核酸分子，

所述封闭性寡核苷酸含有一个或多个与选定核苷酸互补的核苷酸，或者含有一个或多个与不同核苷酸互补的核苷酸；

(d)在核酸合成条件下处理所述接触过的靶核酸分子，其中当封闭性寡核苷酸与靶核酸分子杂交时，核苷酸合成被抑制；

(e)在碱基特异性切割条件下处理所述合成产物；以及

(f)检测所述切割处理的产物，其中含有一个或多个甲基化或未甲基化的选定核苷酸的靶核酸分子根据切割产物的数量或者根据一个或多个切割产物与一个或多个参照物之间的比较来确定。

39.一种鉴定核酸中一个或多个甲基化或未甲基化的核苷酸的方法，包括：

(a)用可修饰作为选定核苷酸的甲基化状态的函数的选定的核苷酸生成不同核苷酸的试剂处理靶核酸分子；

(b)用封闭性寡核苷酸接触所述处理过的靶核酸分子，所述封闭性寡核苷酸含有一个或多个与选定核苷酸互补的核苷酸，或者含有一个或多个与不同核苷酸互补的核苷酸；

(c)在核酸合成条件下处理所述接触过的靶核酸分子，其中当封闭性寡核苷酸与靶核酸分子杂交时，核苷酸合成被抑制；

(d)在断裂条件下处理所述合成产物；以及

(e)通过质谱分析法检测断裂处理的产物，其中含有一个或多个甲基化或未甲基化的选定核苷酸的靶核酸分子根据断裂产物的数量或者根据一个或多个断裂产物与一个或多个参照物之间的比较来确定。

40.一种鉴定核酸中一个或多个甲基化或未甲基化的核苷酸的方法，包括：

(a)用可修饰作为选定核苷酸的甲基化状态的函数的选定的核苷酸生成不同核苷酸的试剂处理靶核酸分子；

(b)扩增所述处理过的靶核酸分子以形成扩增产物；

(c)用封闭性寡核苷酸接触所述处理过的靶核酸分子，所述封闭性寡核苷酸含有一个或多个与选定核苷酸互补的核苷酸，或者含有一个或多个与不同核苷酸互补的核苷酸；

(d)在核酸合成条件下处理所述接触过的靶核酸分子，其中当封闭性寡核苷酸与靶核酸分子杂交时，核苷酸合成被抑制；

(e)在断裂条件下处理所述合成产物；以及

(f)通过质谱分析法检测断裂处理的产物，其中含有一个或多个甲基化或未甲基化的选定核苷酸的靶核酸分子根据断裂产物的数量或者根据一个或多个断裂产物与一个或多个参照物之间的比较来确定。

41.一种鉴定核酸中一个或多个甲基化或未甲基化的核苷酸的方法，包括：

(a)用可修饰作为选定核苷酸的甲基化状态的函数的选定的核苷酸生成不同核苷酸的试剂处理靶核酸分子；

(b)用切割试剂接触所述靶核酸分子，采用的切割试剂在含有一个或多个甲基化的选定核苷酸或者一个或多个未甲基化的选定核苷酸的位点选择性切割所述靶核酸，或者采用的切割试剂在含有一个或多个选定核苷酸或者一个或多个不同核苷酸的位点选择性切割所述处理过的靶核酸；

(c)在核酸合成条件下处理所述接触过的靶核酸分子，其中在步骤(b)中未被切割的靶核酸分子被扩增；

(d)在碱基特异性切割条件下处理所述扩增产物；以及

(e)检测所述切割处理的产物，其中含有一个或多个甲基化或未甲基化的选定核苷酸的靶核酸分子根据切割产物的数量或者根据一个或多个切割产物与一个或多个参照物之间的比较来确定。

42.一种鉴定核酸中一个或多个甲基化或未甲基化核苷酸的方法，包括：

(a)用可修饰作为选定核苷酸的甲基化状态的函数的选定的核苷酸生成不同核苷酸的试剂处理靶核酸分子；

(b)扩增所述处理过的靶核酸分子以形成扩增产物；

(c)用切割试剂接触所述靶核酸分子，采用的切割试剂在含有一个或多个甲基化的选定核苷酸或者一个或多个未甲基化的选定核苷酸的位点选择性切割所述靶核酸，或者采用的切割试剂在含有一个或多个选定核苷酸或者一个或多个不同核苷酸的位点选择性切割所述处理过的靶核酸；

(d)在核酸合成条件下处理所述接触过的靶核酸分子，其中在步骤(b)中未被切割的靶核酸分子被扩增；

(e)在碱基特异性切割条件下处理所述扩增产物；以及

(f)检测所述切割处理的产物，其中含有一个或多个甲基化或未甲基化的选定核苷酸的靶核酸分子根据切割产物的数量或根据一个或多个切割产物与一个或多个参照物之间的比较来确定。

43.一种鉴定核酸中一个或多个甲基化或未甲基化的核苷酸的方法，包括：

(a)用可修饰作为选定核苷酸的甲基化状态的函数的选定的核苷酸生成不同核苷酸的试剂处理靶核酸分子；

(b)用切割试剂接触所述靶核酸分子，采用的切割试剂在含有一个或多个甲基化的选定核苷酸或者一个或多个未甲基化的选定核苷酸的位点选择性切割所述靶核酸，或者采用的切割试剂在含有一个或多个选定核苷酸或者一个或多个不同核苷酸的位点选择性切割所述处理过的靶核酸；

(c)在核酸合成条件下处理所述接触过的靶核酸分子，其中在步骤(b)中未被切割的靶核酸分子被扩增；

(d)在断裂条件下处理所述扩增产物；以及

(e)通过质谱分析法检测断裂处理的产物，其中含有一个或多个甲基化或未甲基化的选定核苷酸的靶核酸分子根据断裂产物的数量或者根据一个或多个断裂产物与一个或多个参照物之间的比较来确定。

44.一种鉴定核酸中一个或多个甲基化或未甲基化的核苷酸的方法，包括：

(a)用可修饰作为选定核苷酸的甲基化状态的函数的选定的核苷酸生成不同核苷酸的试剂处理靶核酸分子；

(b)扩增所述处理过的靶核酸分子以形成扩增产物；

(c)用切割试剂接触所述靶核酸分子，采用的切割试剂在含有一个或多个甲基化的选定核苷酸或者一个或多个未甲基化的选定核苷酸的位点选择性切割所述靶核酸，或者采用的切割试剂在含有一个或多个选定核苷酸或者一个或多个不同核苷酸的位点选择性切割所述处理过的靶核酸；

(d)在核酸合成条件下处理所述接触过的靶核酸分子，其中在步骤(b)中未被切割的靶核酸分子被扩增；

(e)在断裂条件下处理所述扩增产物；以及

(f)通过质谱分析法检测断裂处理的产物，其中含有一个或多个甲基化或未甲基化的选定核苷酸的靶核酸分子根据断裂产物的数量或者根据一个或多个断裂产物与一个或多个参照物之间的比较来确定。

45.一种鉴定核酸中一个或多个甲基化或未甲基化的核苷酸的方法，包括：

(a)用引物接触所述靶核酸分子并在核酸合成条件下处理所述接触过的靶核酸分子，其中与靶核酸分子互补的链被合成；

(b)用甲基转移酶试剂接触所述靶核酸合成的产物双链，据此靶核酸的CpG序列中的甲基化存在于合成产物的互补CpG序列中；

(c)重复步骤(a)和(b)以形成第二个合成产物，所述第二个合成产物具有与靶核酸分子相同的核苷酸序列以及CpG核苷酸的甲基化状态；

(d)用可修饰作为选定核苷酸的甲基化状态的函数选定的核苷酸生成不同核苷酸的试剂处理合成产物；

(e)在碱基特异性切割条件下处理所述试剂处理过的产物；以及

(f)检测所述切割处理的产物，其中含有一个或多个甲基化或未甲基化的选定核苷酸的靶核酸分子根据切割产物的数量或者根据一个或多个切割产物与一个或多个参照物之间的比较来确定。

46.一种鉴定核酸中一个或多个甲基化或未甲基化的核苷酸的方法，包括：

(a)用引物接触所述靶核酸分子并在核酸合成条件下处理所述接触过的靶核酸分子，其中与所述靶核酸分子互补的链被合成；

(b)用甲基转移酶试剂接触所述靶核酸合成的产物双链，据此靶核酸的CpG序列中的甲基化也存在于合成产物的互补CpG序列中；

(c)重复步骤(b)和(c)，形成第二个合成产物，所述第二个合成产物具有与靶核酸分子相同的核苷酸序列以及CpG核苷酸的甲基化状态；

(d)用可修饰选定的作为选定核苷酸的甲基化状态的函数的核苷酸生成不同核苷酸的试剂处理合成产物；

(e)在断裂条件下处理所述试剂处理过的产物；以及

(f)通过质谱分析法检测所述断裂处理的产物，其中含有一个或多个甲基化或未甲基化的选定核苷酸的靶核酸分子根据断裂产物的数量或者根据一个或多个断裂产物与一个或多个参照物之间的比较来确定。

47.一种区分假阳性甲基化特异性扩增和真甲基化特异性扩增的方法，包括以下步骤：

(a)根据权利要求1～30或33～46中任何一个所述的方法，确定一个或多个核苷酸基因座的甲基化状态；以及

(b)确定任何一个甲基化核苷酸基因座是否定位于靶核酸分子中不与所述引物杂交的区域；据此，靶核酸分子中不与引物杂交的区域中一个或多个甲基化基因座的存在确证靶核酸的真甲基化特异性扩增。

48.一种区分假阳性甲基化特异性扩增和真甲基化特异性扩增的方法，包括以下步骤：

(a)根据权利要求1～30或33～46中任何一个所述的方法，确定一个或多个核苷酸基因座的甲基化状态；以及

(b)确定任何未甲基化的核苷酸基因座是否定位于靶核酸分子中不与引物杂交的区域；据此，靶核酸分子中不与引物杂交的区域存在一个或多个未甲基化基因座确证靶核酸的真甲基化特异性扩增。

49.一种区分假阳性甲基化特异性扩增和真甲基化特异性扩增的方法，包括以下步骤：

(a)根据权利要求1～30或33～46中任何一个所述的方法，确定一个或多个核苷酸基因座的甲基化状态；以及

(b)将定位于靶核酸分子中不与引物杂交的区域的一个或多个核苷酸基因座的甲基化状态与一个或多个参照物相比；据此，所述一个或多个核苷酸基因座与所述一个或多个参照物之间的相关性确证靶核酸的真甲基化特异性扩增。

50.一种区分假阳性甲基化特异性扩增和真甲基化特异性扩增的方法，包括以下步骤：

(a)根据权利要求1～30或33～46中任何一个所述的方法，确定一个或多个核苷酸基因座的甲基化状态；以及

(b)将定位于靶核酸分子中不与引物杂交的区域的一个或多个核苷酸基因座的甲基化状态与一个或多个参照物比较；据此，所述一个或多个核苷酸基因座与所述一个或多个参照物之间缺乏相关性确证了靶核酸的真甲基化特异性扩增。

51.一种区分假阳性甲基化特异性扩增和真甲基化特异性扩增的方法，包括以下步骤：

(a)根据权利要求1～30或33～46中任何一个所述的方法，确定一个或多个核苷酸基因座的甲基化状态；以及

(b)将定位于靶核酸分子中不与引物杂交的区域的一个或多个核苷酸基因座的甲基化状态与一个或多个参照物相比；

据此，所述一个或多个核苷酸基因座与所述一个或多个参照物之间的相关性确证了靶核酸的假阳性甲基化特异性扩增。

52.一种区分假阳性甲基化特异性扩增和真甲基化特异性扩增的方法，包括以下步骤：

(a)根据权利要求1～30或33～46中任何一个所述的方法，确定一个或多个核苷酸基因座的甲基化状态；以及

(b)将定位于靶核酸分子中不与引物杂交的区域的一个或多个核苷酸基因座的甲基化状态与一个或多个参照物相比；据此，所述一个或多个核苷酸基因座与所述一个或多个参照物之间缺乏相关性确证了靶核酸的假阳性甲基化特异性扩增。

53.根据权利要求1～52中任何一个所述的方法，其中所述一个或多个选定核苷酸基因座的甲基化状态加以鉴定。

54.根据权利要求1～53中任何一个所述的方法，其中一个或多个选定核苷酸基因座鉴定为甲基化的。

55.根据权利要求1～53中任何一个所述的方法，其中一个或多个选定核苷酸基因座鉴定为未甲基化的。

56.根据权利要求17～55中任何一个所述的方法，其中所述试剂修饰未甲基化的选定核苷酸生成不同核苷酸。

57.根据权利要求17～55中任何一个所述的方法，其中所述试剂修饰甲基化的选定核苷酸生成不同核苷酸。

58.根据权利要求17～57中任何一个所述的方法，其中所述引物含有一个或多个与选定核苷酸互补的核苷酸。

59.根据权利要求17～57中任何一个所述的方法，其中所述引物含有一个或多个与不同核苷酸互补的核苷酸。

60.根据权利要求17～57中任何一个所述的方法，其中所述引物含有一个或多个与选定核苷酸互补的核苷酸，还含有一个或多个与不同核苷酸互补的核苷酸。

61.根据权利要求1～60中任何一个所述的方法，其中两个或多个产物的存在表示所述靶核酸分子含有一个或多个甲基化核苷酸。

62.根据权利要求1～60中任何一个所述的方法，其中两个或多个产物的存在表示所述靶核酸分子含有一个或多个未甲基化核苷酸。

63.根据权利要求1～60中任何一个所述的方法，其中两个或多个产物的存在可以鉴定一个或多个核苷酸基因座的甲基化状态。

64.根据权利要求1～60中任何一个所述的方法，其中两个或多个产物的存在表示一个或多个甲基化核苷酸的基因座。

65.根据权利要求1～60中任何一个所述的方法，其中两个或多个产物的存在表示一个或多个未甲基化核苷酸的基因座。

66.根据权利要求1～60中任何一个所述的方法，其中仅单一产物的存在表示靶核酸分子含有一个或多个甲基化核苷酸。

67.根据权利要求1～60中任何一个所述的方法，其中仅单一产物的存在表示靶核酸分子含有一个或多个未甲基化核苷酸。

68.根据权利要求1～60中任何一个所述的方法，其中仅单一产物的存在可以鉴定一个或多个核苷酸基因座的甲基化状态。

69.根据权利要求1～60中任何一个所述的方法，其中仅单一产物的存在表示一个或多个甲基化核苷酸的基因座。

70.根据权利要求1～60中任何一个所述的方法，其中仅单一产物的存在表示一个或多个未甲基化核苷酸的基因座。

71.根据权利要求1～60中任何一个所述的方法，其中比参考产物数量多一个或多个产物的存在表示靶核酸分子含有一个或多个甲基化的核苷酸。

72.根据权利要求1～60中任何一个所述的方法，其中比参考产物数量多一个或多个产物的存在表示所述靶核酸分子含有一个或多个未甲基化的核苷酸。

73.根据权利要求1～60中任何一个所述的方法，其中比参考产物数量多的一个或多个产物的存在可以鉴定一个或多个核苷酸基因座的甲基化状态。

74.根据权利要求1～60中任何一个所述的方法，其中比参考产物数量多的一个或多个产物的存在表示一个或多个甲基化核苷酸的基因座。

75.根据权利要求1～60中任何一个所述的方法，其中比参考产物数量多的一个或多个产物的存在表示一个或多个未甲基化的核苷酸的基因座。

76.根据权利要求1～60中任何一个所述的方法，其中比参考产物数量少的一个或多个产物的存在表示靶核酸分子含有一个或多个甲基化的核苷酸。

77.根据权利要求1～60中任何一个所述的方法，其中比参考产物数量少的一个或多个产物的存在表示靶核酸分子含有一个或多个未甲基化的核苷酸。

78.根据权利要求1～60中任何一个所述的方法，其中比参考产物数量少的一个或多个产物的存在可以鉴定一个或多个核苷酸基因座的甲基化状态。

79.根据权利要求1～60中任何一个所述的方法，其中比参考产物数量少的一个或多个产物的存在表示一个或多个甲基化核苷酸的基因座。

80.根据权利要求1～60中任何一个所述的方法，其中比参考产物数量少的一个或多个产物的存在表示一个或多个甲基化核苷酸的基因座。

81.根据权利要求1～60中任何一个所述的方法，其中与参考产物数量相同的产物的存在表示靶核酸分子含有一个或多个甲基化的核苷酸。

82.根据权利要求1～60中任何一个所述的方法，其中与参考产物数量相同的产物的存在表示靶核酸分子含有一个或多个未甲基化的核苷酸。

83.根据权利要求1～60中任何一个所述的方法，其中与参考产物相同数量的产物的存在允许鉴定一个或多个核苷酸基因座的甲基化状态。

84.根据权利要求1～60中任何一个所述的方法，其中与参考产物相同数量的产物的存在表示一个或多个甲基化的核苷酸的基因座。

85.根据权利要求1～60中任何一个所述的方法，其中与参考产物相同数量的产物的存在表示一个或多个未甲基化的核苷酸的基因座。

86.根据权利要求1～60中任何一个所述的方法，其中与参考产物质量相比，一个或多个产物质量的变化表示靶核酸分子含有一个或多个甲基化的核苷酸。

87.根据权利要求1～60中任何一个所述的方法，其中与参考产物质量相比，一个或多个产物质量的变化表示靶核酸分子含有一个或多个未甲基化的核苷酸。

88.根据权利要求1～60中任何一个所述的方法，其中与参考产物质量相比，一个或多个产物质量的变化可以鉴定一个或多个核苷酸基因座的甲基化状态。

89.根据权利要求1～60中任何一个所述的方法，其中与参考产物质量相比，一个或多个产物质量的变化表示一个或多个甲基化核苷酸的基因座。

90.根据权利要求1～60中任何一个所述的方法，其中与参考产物质量相比，一个或多个产物质量的变化表示一个或多个未甲基化的核苷酸的基因座。

91.根据权利要求1～60中任何一个所述的方法，其中所述质量与参考产物质量相同的一个或多个产物的存在，表示靶核酸分子含有一个或多个甲基化的核苷酸。

92.根据权利要求1～60中任何一个所述的方法，其中所述质量与参考产物质量相同的一个或多个产物的存在，表示靶核酸分子含有一个或多个未甲基化的核苷酸。

93.根据权利要求1～60中任何一个所述的方法，其中所述质量与参考产物质量相同的一个或多个产物的存在，允许鉴定一个或多个核苷酸基因座的甲基化状态。

94.根据权利要求1～60中任何一个所述的方法，其中所述质量与参考产物质量相同的一个或多个产物的存在，表示一个或多个甲基化的核苷酸的基因座。

95.根据权利要求1～60中任何一个所述的方法，其中所述质量与参考产物质量相同的一个或多个产物的存在，表示一个或多个未甲基化的核苷酸的基因座。

96.一种揭示与疾病、疾病结果或者治疗方案结果相关的甲基化的方法，包括以下步骤：

(a)根据权利要求1～95中任何一个所述的方法，鉴定来自于一个或多个样品的一个或多个核酸分子中甲基化或未甲基化的核苷酸，所述样品从一个或多个具有已知疾病、疾病结果或者治疗方案的结果的受试者收集；

(b)根据权利要求1～95中任何一个所述的方法，鉴定来自于一个或多个样品的一个或多个核酸分子中甲基化或未甲基化的核苷酸，所述样品从一个或多个正常受试者收集；

(c)鉴定步骤(a)中所述一个或多个核酸分子与步骤(b)中所述一个或多个核酸分子之间差异的甲基化或未甲基化核苷酸；据此，根据差异的甲基化或未甲基化核苷酸鉴定与疾病、疾病结果或者治疗方案结果相关的甲基化。

97.一种诊断疾病、决定治疗方案或者确定受试者疾病结果的方法，包括以下步骤：

(a)根据权利要求1～95中任何一个所述的方法，鉴定来自于从受试者收集的一个或多个样品的一个或多个核酸分子中一个或多个甲基化或未甲基化的核苷酸；

(b)与同已知疾病、疾病结果或者治疗方案结果相关的一个或多个参考核酸分子比较所述一个或多个核酸分子中的甲基化或未甲基化核苷酸；据此，与参考核酸分子相同的甲基化或未甲基化核苷酸可以鉴定受试者的疾病、疾病结果或者治疗方案结果。

98.一种诊断疾病、决定治疗方案或者确定受试者疾病结果的方法，包括以下步骤：

(a)根据权利要求1～95中任何一个所述的方法，鉴定来自于从受试者收集的一个或多个样品的一个或多个核酸分子中一个或多个甲基化或未甲基化的核苷酸；

(b)与同与已知疾病、疾病结果或者治疗方案结果相关的一个或多个参考核酸分子比较所述一个或多个核酸分子中的甲基化或未甲基化核苷酸；据此，不同于参考核酸分子的甲基化或未甲基化核苷酸可以鉴定受试者的疾病、疾病结果或者治疗方案结果。

99.一种确定与等位基因相关的一个或多个核苷酸基因座的甲基化状态的方法，包括以下步骤：

(a)收集含有已知等位基因的核酸分子；

(b)根据权利要求1～95中任何一个所述的方法，鉴定含有所述已知等位基因的核酸分子中的一个或多个甲基化或未甲基化核苷酸基因座。

(c)鉴定不含有等位基因的核酸分子中的相应核苷酸基因座的甲基化状态；

(d)比较含有等位基因的核酸分子中核苷酸基因座的甲基化状态与缺乏等位基因的核酸分子中核苷酸基因座的甲基化状态，据此，一个或多个基因座甲基化状态频率的差异可鉴定与等位基因相关的不同基因座。

100.一种确定与一个或多个核苷酸基因座的甲基化状态相关的等位基因的方法，包括以下步骤：

(a)形成第一个含有一个或多个已知甲基化或未甲基化核苷酸基因座的核酸分子集合，所述基因座根据权利要求1～95中任何一个所述的方法加以鉴定；

(b)鉴定所述集合的核酸样品中的一个或多个等位基因存在的频率；

(c)鉴定第二个核酸分子集合中的一个或多个等位基因的等位基因存在的频率，所述第二个核酸分子集合相对于第一个集合的核酸分子含有甲基化状态不同的核苷酸基因座；以及

(d)比较第一个核酸分子集合中的等位基因频率与第二个核酸分子集合中的等位基因频率，据此，根据等位基因频率的差异可鉴定与等位基因相关的一个或多个基因座。

101.一种确定与等位基因相关的一个或多个核酸基因座的甲基化状态的方法，包括下列步骤：

(a)收集含有一个或多个已知甲基化或未甲基化核酸基因座的核酸分子，所述基因座按照权利要求1～95中任何一个所述的方法加以鉴定；

(b)鉴定一个或多个相对于正常核酸样品以较高或较低频率存在的等位基因；以及

(c)鉴定正常核酸样品中核酸基因座的甲基化状态，据此，根据一个或多个基因座甲基化状态频率的差异可鉴定与等位基因相关的不同基因座。

102.一种确定与一个或多个核酸基因座的甲基化状态相关的等位基因的方法，包括下列步骤：

(a)收集含有一个或多个已知等位基因的核酸分子；

(b)根据权利要求1～95中任何一个所述的方法，鉴定一个或多个相对于正常核酸样品以较高或较低频率存在的甲基化或未甲基化核酸基因座；

(c)鉴定正常核酸样品中所述等位基因的频率，据此，根据等位基因频率的差异可鉴定与一个或多个甲基化或未甲基化基因座相关的等位基因。

103.一种确定一个或多个等位基因可能的同一性的方法，包括下列步骤：

(a)鉴定核酸分子中一个或多个甲基化或未甲基化核苷酸；以及

(b)根据权利要求99～102，确定具有一个或多个甲基化或未甲基化核苷酸的一个或多个等位基因存在的频率，据此确定所述等位基因的可能的同一性。

104.根据权利要求1～103中任何一个所述的方法，其中所述检测步骤包括检测与两个或多个不同靶核酸分子相应的切割产物。

105.根据权利要求104所述的方法，其中所述两个或多个不同的靶核酸分子分别用修饰作为选定核苷酸甲基化状态的函数的选定的核苷酸以生成不同核苷酸的试剂进行处理。

106.根据权利要求104所述的方法，其中所述两个或多个不同的靶核酸分子在用修饰作为选定核苷酸甲基化状态的函数的选定的核苷酸以生成不同核苷酸的试剂处理前进行混合。

107.根据权利要求104～105所述的方法，其中所述两个或多个不同的靶核酸分子分别用引物进行接触。

108.根据权利要求104～106所述的方法，其中所述两个或多个不同的靶核酸分子在用引物接触所述靶核酸分子前进行混合。

109.根据权利要求104～105或107中任何一个所述的方法，其中所述两个或多个不同的靶核酸分子在核酸合成条件下分别进行处理。

110.根据权利要求104～108的任何一个所述的方法，其中所述两个或多个不同的靶核酸分子在核酸合成条件下处理前进行混合。

111.根据权利要求104～105、107或109中任何一个所述的方法，其中所述两个或多个不同的靶核酸分子在碱基特异性切割条件下分别进行处理。

112.根据权利要求104～110中任何一个所述的方法，其中所述两个或多个不同的靶核酸分子在碱基特异性切割条件下处理前进行混合。

113.根据权利要求1～112中任何一个所述的方法，其中所述碱基特异性切割反应是鸟嘌呤特异性切割反应。

114.根据权利要求1～112中任何一个所述的方法，其中所述碱基特异性切割反应是胞嘧啶特异性切割反应。

115.根据权利要求1～112中任何一个所述的方法，其中所述切割产物的数量大于引物的靶核酸结合区中鸟嘌呤的数量。

116.根据权利要求1～112中任何一个所述的方法，其中所述切割产物的数量大于引物的靶核酸结合区中胞嘧啶的数量。

117.根据权利要求1～116中任何一个所述的方法，其中所述一个或多个甲基化核苷酸基因座定位于核酸分子中引物不与其杂交的区域。

118.根据权利要求1～117中任何一个所述的方法，其中所述质量通过质谱分析法进行检测。

119.根据权利要求1～117中任何一个所述的方法，其中所述检测步骤包括检测所述切割产物的质量。

120.根据权利要求119所述的方法，其中所述质量通过质谱分析法进行检测。

121.根据权利要求1～120中任何一个所述的方法，其中所述质量通过MALDI-TOF质谱分析法进行检测。

122.根据权利要求1～121中任何一个所述的方法，其中所述扩增产物在碱基特异性切割条件下进行切割，而碱基特异性条件选自由化学条件、物理条件、酶性碱基特异性切割条件及其组合所组成的组。

123.根据权利要求1～122中任何一个所述的方法，其中所述扩增产物用化合物进行切割，而所述化合物选自由RNase、DNase、碱性化合物、甲酸哌啶、哌啶、硫酸二甲酯、肼、氯化钠及其组合所组成的组。

124.根据权利要求123所述的方法，其中所述RNase选自由RNaseA、RNase T1和RNase U2组成的组。

125.根据权利要求1～124中任何一个所述的方法，其中所述扩增产物分成两等分，并且对第一等分应用的碱基特异性切割步骤不同于对第二等分应用的碱基特异性切割步骤。

126.根据权利要求125所述的方法，其中所述第一等分用RNase A进行处理，所述第二等分用RNase T1进行处理。

127.根据权利要求1～126中任何一个所述的方法，其中所述扩增步骤包括转录。

128.根据权利要求127所述的方法，其中所述整合入转录物的三磷酸核苷包括三个rNTP和一个dNTP。

129.根据权利要求128所述的方法，其中所述一个dNTP选自由dCTP、dTTP、dATP和dGTP组成的组。

130.根据权利要求128所述的方法，其中所述一个dNTP选自由dCTP、和dTTP组成的组，所述转录物用RNase A进行切割。

131.根据权利要求1～130中任何一个所述的方法，其中所述扩增步骤还包括两个转录步骤，其中所述第一个转录步骤将rATP、rGTP、rCTP和dTTP整合入所述转录物，所述第二个转录步骤将rATP、rGTP、rUTP和dCTP整合入所述转录物。

132.根据权利要求131所述的方法，其中所述处理过的靶核酸分子分成两份，第一个转录步骤仅应用于第一等份，第二个转录步骤仅应用于第二等份。

133.根据权利要求1～132中任何一个所述的方法，其中所述扩增步骤包括PCR和转录，其中PCR产物是双链的，所述转录步骤包括两个转录反应，其中第一个转录反应包括转录PCR产物第一条链，第二个转录反应包括转录PCR产物第二条链。

134.根据权利要求133所述的方法，其中所述PCR产物分成两份，第一份含有PCR产物第一条链，第二份含有PCR产物第二条链。

135.根据权利要求1～134中任何一个所述的方法，其中所述靶核酸分子中一个或多个CpG二核苷酸的胞嘧啶核苷酸的甲基化状态加以鉴定。

136.根据权利要求135所述的方法，其中所述一个或多个CpG核苷酸定位于基因启动子区。

137.根据权利要求136所述的方法，其中所述基因启动子区是肿瘤抑制启动子区。

138.根据权利要求1～37中任何一个所述的方法，其中所述靶核酸分子CpG岛中一个或多个胞嘧啶核苷酸的甲基化状态加以鉴定。

139.根据权利要求1～138中任何一个所述的方法，据此确定未甲基化胞嘧啶。

140.根据权利要求17～139中任何一个所述的方法，据此将未甲基化胞嘧啶修饰以生成尿嘧啶。

141.根据权利要求1～140中任何一个所述的方法，其中所述试剂包括亚硫酸氢盐。

142.根据权利要求1～141中任何一个所述的方法，其中所述扩增步骤还包括将第二引物特异性杂交到含有一个或多个胞嘧啶核苷酸的靶核酸分子中预定第三区的互补物上，其中第二和第三区相互不交迭。

143.根据权利要求1～142中任何一个所述的方法，其中所述引物的3’一半含有一个或多个鸟嘌呤核苷酸。

144.根据权利要求1～143中任何一个所述的方法，其中所述引物的3’末端基本上由鸟嘌呤核苷酸组成。

145.根据权利要求1～142中任何一个所述的方法，其中所述引物的3’一半含有一个或多个胞嘧啶核苷酸。

146.根据权利要求1～142或145中任何一个所述的方法，其中所述引物的3’末端基本上由胞嘧啶核苷酸组成。

147.根据权利要求1～146中任何一个所述的方法，据此处理过的靶核酸分子含有一个或多个胞嘧啶核苷酸。

148.根据权利要求1～147中任何一个所述的方法，其中所述一个或多个样品测定的质量的强度与一个或多个参考物质量的强度进行比较。

149.根据权利要求1～147中任何一个所述的方法，其中收集两个或多个核酸样品，所述一个或多个样品测定的质量的强度与一个或多个参考质量的强度进行比较。

150.根据权利要求148或149所述的方法，据此区分不完全转化的靶核酸分子和甲基化的靶核酸分子。

151.根据权利要求1～146中任何一个所述的方法，其中所述第一次测定的质量的强度与第二次测定的质量的强度进行比较。

152.根据权利要求1～146中任何一个所述的方法，其中收集两个或多个核酸样品，第一次测定的质量的强度与第二次测定的质量的强度进行比较。

153.根据权利要求151或权利要求152所述的方法，其中所述第一次和第二次测定的质量来自于同一个样品。

154.根据权利要求151或权利要求152所述的方法，其中所述第一次和第二次测定的质量来自于不同样品。

155.根据权利要求151或权利要求152所述的方法，据此计算核苷酸基因座的甲基化核苷酸与该核苷酸基因座的未甲基化的核苷酸的比值。

156.一种用于根据权利要求1～155中任何一个所述方法鉴定甲基化核酸的组合物。

157.一种用于根据权利要求1～155中任何一个所述方法鉴定核酸中甲基化核苷酸的核苷酸基因座的组合物。

158.一种用于鉴定甲基化核酸的组合物，包括：

(a)试剂，修饰未甲基化胞嘧啶生成尿嘧啶；

(b)引物，其靶核酸分子结合区包含一个或多个鸟嘌呤核苷酸；以及

(c)试剂，用于碱基特异性断裂扩增的核酸产物。

159.权利要求158中所述的组合物，还包括第二引物。

160.一种用于鉴定甲基化核酸的组合物，包括：

(a)试剂，用于修饰未甲基化胞嘧啶生成尿嘧啶；

(b)引物，其靶核酸分子结合区不包含鸟嘌呤核苷酸；以及

(c)试剂，用于碱基特异性断裂扩增的核酸产物。

161.一种用于鉴定甲基化核酸的组合物，包括：

(a)试剂，用于修饰未甲基化胞嘧啶生成尿嘧啶；

(b)引物，其靶核酸分子结合区包含一个或多个鸟嘌呤核苷酸；

(c)第二引物，其靶核酸分子结合区包含一个或多个胞嘧啶核苷酸；以及

(d)试剂，用于碱基特异性断裂扩增的核酸产物。

162.根据权利要求161中所述的组合物，还包括第二引物。

163.一种用于鉴定甲基化核酸的组合物，包括：

(a)试剂，用于修饰未甲基化胞嘧啶生成尿嘧啶；

(b)第一引物，其靶核酸分子结合区不包含鸟嘌呤核苷酸；

(c)第二引物，其靶核酸分子结合区不包含胞嘧啶核苷酸；以及

(d)试剂，用于碱基特异性断裂扩增的核酸产物。

164.一种用于鉴定甲基化核酸的组合物，包括：

(a)试剂，用于修饰作为选定核苷酸甲基化状态的函数的选定核苷酸以生成不同核苷酸；

(b)引物，含有一个或多个与选定核苷酸互补的核苷酸或者含有一个或多个与不同核苷酸互补的核苷酸；以及

(c)试剂，用于碱基特异性断裂扩增的核酸产物。

165.根据权利要求158～164中任何一个所述的组合物，其中所述用于断裂扩增的核酸产物的试剂选自由RNase、DNase、碱性化合物、甲酸哌啶、哌啶、硫酸二甲酯、肼、氯化钠及其组合所组成的组。

166.根据权利要求158～165中任何一个所述的组合物，其中所述用于断裂扩增的核酸产物的试剂选自由RNase A、RNase T1和RNase U2所组成的组。

167.根据权利要求158～166中任何一个所述的组合物，其中所述用于修饰选定核苷酸的试剂选自由甲磺酸甲酯(methylmethane sulfonate)、甲磺酸乙酯(ethylmethanesulfonate)、硫酸二乙酯、亚硝基胍(N-甲基-N’-硝基-N-亚硝基胍)、亚硝酸、二(2-氯乙基)硫醚、2-氨基嘌呤、t-溴尿嘧啶、羟胺、亚硫酸氢钠、肼、甲酸、亚硝酸钠和5-甲基胞嘧啶DNA糖苷酶组成的组。

168.根据权利要求158～167中任何一个所述的组合物，其中所述用于修饰核苷酸的试剂是亚硫酸氢钠。

169.根据权利要求158～168中任何一个所述的组合物，还包括第二试剂，用于碱基特异性的断裂扩增的核酸产物。

170.根据权利要求169所述的组合物，其中所述断裂扩增的核酸产物第二试剂选自由RNase、DNase、碱性化合物、甲酸哌啶、哌啶、硫酸二甲酯、肼、氯化钠及其组合所组成的组。

171.根据权利要求158～170中任何一个所述的组合物，其中所述用于断裂扩增的核酸产物第二试剂选自由RNase A、RNase T1和RNase U2所组成的组。

172.根据权利要求158～171中任何一个所述的组合物，其中所述组合物包括RNase A和RNase T1。

173.根据权利要求158～172中任何一个所述的组合物，其中所述组合物还包括一个或多个三磷酸核糖核苷酸。

174.根据权利要求158～173中任何一个所述的组合物，其中所述组合物还包括一个或多个三磷酸脱氧核糖核苷酸。

175.根据权利要求158～174中任何一个所述的组合物，其中所述组合物还包括一个或多个与一个或多个三磷酸脱氧核糖核苷酸混合的三磷酸核糖核苷酸。

176.根据权利要求158～175中任何一个所述的组合物，其中所述组合物还包括核酸合成酶。

177.根据权利要求158～176中任何一个所述的组合物，其中所述组合物还包括RNA聚合酶。

178.根据权利要求158～177中任何一个所述的组合物，其中所述组合物还包括DNA聚合酶。

179.根据权利要求158～178中任何一个所述的组合物，其中所述组合物还包括MALDI基质化合物。

180.根据权利要求158～179中任何一个所述的组合物，其中所述组合物还包括MALDI底物。

181.一种试剂盒，含有权利要求158～180中任何一项所述的组合物，可选地包装有一个或多个用法说明书、试剂、用于使用所述组合物的装置。

182.根据权利要求181所述的试剂盒，其中所述用于使用所述组合物的装置选自由热循环器和质谱仪组成的组。

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