CN101209347A - 纤维蛋白溶解剂药用组合物 - Google Patents

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CN101209347A CNA2007101529313A CN200710152931A CN101209347A CN 101209347 A CN101209347 A CN 101209347A CN A2007101529313 A CNA2007101529313 A CN A2007101529313A CN 200710152931 A CN200710152931 A CN 200710152931A CN 101209347 A CN101209347 A CN 101209347A
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Abstract

本发明涉及纤维蛋白溶解剂药用组合物。具体地说，本发明涉及包含金属蛋白酶纤维蛋白溶解剂(纤溶酶(fibrolase)或NAT)的药用组合物、制备冻干组合物的方法以及用于制备水性药用组合物的药盒和方法以及该方法的用途。

Description

纤维蛋白溶解剂药用组合物
本申请是申请日为2000年9月29日，申请号为00816379.0，发明名称为“纤维蛋白溶解剂药用组合物”的发明专利申请的分案申请。
发明领域
本发明涉及纤维蛋白溶解剂的新型药用组合物。更具体地说，本发明涉及纤维蛋白溶解酶(fibrolase)及“新型作用血栓溶解剂”(NAT)各自的冷冻液体组合物和冻干组合物以及它们的生产和使用方法。
发明背景
一般来说，多肽在水溶液中稳定性较差，通常会发生化学降解和物理降解，导致加工和贮存期间生物活性丧失。尤其在水溶液时遇到的另一个问题是水解，如脱氨和肽键断裂。这些问题是根据生物活性给予患者规定剂量的治疗活性多肽存在的严重问题。
为减少多肽的降解，通常使水型药用组合物冷藏或冷冻备用。作为替代方法，经常采用冷冻干燥方法稳定多肽以便可以长期贮存，尤其是当所述多肽在液体组合物中相对不稳定时。一个冷冻干燥循环通常包括以下三个步骤：冷冻、初次干燥、二次干燥；Williams和Polli，Journal of Parenteral Science and Technology，第38卷，第2期，第48-59页(1984)。
在冷冻步骤中，将所述溶液冷却直至充分冷冻。在这一步骤中，溶液中大量水形成冰。冰在初次干燥步骤中升华，该步骤是利用真空将冷冻室内压降至冰蒸发压以下进行的。最后，在第二个干燥步骤中，在室内压降低和存放架温度升高下除去吸附或结合水。这一过程获得称作冻干饼的物质。此后所述冻干饼可在使用前复制。
复制冻干物质的标准方法是加回一定体积的纯水(通常相当于冻干期间除去的水体积)，但是有时复制胃肠外给药药物时使用抗菌剂稀释液；Chen，Drug Development and Industrial Pharmacy，第18卷，第11-12期，第1311-1354页(1992)。
冷冻干燥被认为是去除多肽溶液中多余水份的最好方法之一。冷冻干燥工艺可获得稳定且适合长期贮运的产品。冷冻干燥产品可在室温下贮存，因此更易于贮运及分销到更广泛的地理市场，例如可能没有冷藏条件的国外市场。
人们已经注意到，某些情况下赋形剂对冻干产品起稳定剂的作用；Carpenter等，Developments in Biological Standardization，第74卷，第225-239页(1991)。例如已知的赋形剂包括多元醇类(包括甘露醇、山梨醇和甘油)；糖类(包括葡萄糖和蔗糖)及氨基酸类(包括丙氨酸、甘氨酸和谷氨酸)。
此外，多元醇和糖也经常用来保护多肽免受冷冻和干燥引起的破坏并提高在干燥状态下贮存时的稳定性。一般来说，糖类尤其是二糖在冷冻干燥过程和贮存期间均有效。也有报道，其它类型分子包括单糖和二糖及诸如PVP的聚合物用作冻干产品的稳定剂。
发明概述
本发明涉及纤溶酶(fibrolase)及“新型作用血栓溶解剂”(NAT)的稳定药用组合物，其中有些是适于在冷冻状态下贮存的液体组合物，而其它适于冷冻干燥贮存。
因为纤溶酶和NAT的纤维蛋白溶解特性，本发明的组合物可用于体内溶解血凝块，因此可治疗性给药。
对于本发明目的，术语“NAT”指具有纤维蛋白溶解活性的金属蛋白酶，其特征在于SEQ ID NO：1。所述NAT多肽由SEQ ID NO：2的cDNA分子编码，但是编码相同多肽的任何DNA分子变异体序列可用于按照下文提及的方法进行表达和生产。
纤溶酶是已知的金属蛋白酶，曾经描述于科学文献和专利文献；参见Randolph等，Protein Science，Cambridge University Press(1992)，第590-600页，及1989年7月12日公布的欧洲专利申请第0 323 722号(Valenzuela等)。通常本发明组合物中所用的纤溶酶属于SEQ ID NO：3，它由SEQ ID NO：4的cDNA分子编码(或其编码相同氨基酸序列的变异体)。
纤溶酶和NAT不同于其它治疗体内凝血块的治疗药，例如尿激酶、链激酶和tPA，它们是纤溶酶原激活物。与所述药物不同，纤溶酶和NAT直接作用于凝血块而降解纤维蛋白和纤维蛋白原。
除治疗有效量纤溶酶或NAT外，本发明的药用组合物在药学上可接受的缓冲剂中包含锌稳定剂以及任选增量剂，包含或不含其它赋形剂，它们合在一起提供可长期贮存的稳定冷冻产品或稳定冻干产品。
一方面，本发明提供包含纤溶酶或NAT、水溶性锌盐、柠檬酸缓冲剂、任选其它选自水溶性钙盐的稳定剂及任选增量剂(如甘露醇)的可冷冻的药用组合物。也可加入表面活性剂如吐温80(BASF，Gurnee，Illinois)以提高冻融稳定性。可加入Tris缓冲剂(Sigma，St.Louis Missouri)或其它缓冲能力高于pH 7.0的缓冲剂使pH稳定在74或7.4以上。
在本发明的另一方面，所述药用组合物可以是可冻干的或已冻干的药用组合物，它包含纤溶酶或NAT、锌稳定剂(如水溶性锌盐)和柠檬酸缓冲剂，该组合物含有或不含其它赋形剂(例如增量剂，诸如甘露醇、甘氨酸等)。所述冻干组合物也可以含有作为冻干保护剂的二糖，例如蔗糖或海藻糖。可加入表面活性剂如吐温80保护金属蛋白酶(纤溶酶或NAT)免受冷冻干燥应力。最好使用pKa在8.0±0.5范围内的合适缓冲剂(如Tris)，使pH保持于8.0±0.5。
本发明还包括制备冻干组合物的方法，该方法包括以下步骤：(i)将纤溶酶或NAT与缓冲剂和水溶性锌盐及任何所需的任选成分混合，(ii)冷冻干燥该混合物。
另外，本发明提供制备药用组合物水溶液的药盒，它包含装有上述冻干组合物的第一个容器及装有其生理学上可接受溶剂的第二个容器。
此外，本发明的再一方面包括包含以下步骤的方法：复制所述冻干组合物；将复制组合物给予需要溶解血凝块的患者。
发明详述
按照本领域技术人员已熟知的标准重组表达方法，可使用各种宿主-载体系统表达纤溶酶或NAT多肽的编码序列，由此获得用于所述组合物的纤维蛋白溶解活性多肽。所述系统包括但不限于真核生物细胞系统如感染病毒(如牛痘病毒、腺病毒等)的哺乳动物细胞系统；感染病毒(如杆状病毒)的昆虫细胞系统；微生物如含酵母菌载体的酵母菌；或原核生物细胞系统如用噬菌体DNA、质粒DNA或粘粒DNA转化的细菌(如大肠杆菌)。这些载体的表达元件在其强度和特异性上各不相同。根据所使用的宿主-载体系统，可使用众多合适转录和翻译元件中的任何一种元件。
因其效率较高，优选采用酵母表达系统(如巴斯德毕赤酵母(pichiapastoris))进行重组表达，这类系统的详细描述可见美国专利第4,855,231号(Stroman等)、美国专利第4,812,405号(Lair等)、美国专利第4,818,700号(Cregg等)、美国专利第4,885,242号(Cregg)及美国专利第4,837,148号(Cregg)，它们的公开内容通过引用结合到本文中。纤溶酶在所述系统中的表达通常涉及SEQ ID NO：5的DNA分子，它编码“成熟”多肽(核苷酸784-1392)之外还编码“前原”序列(核苷酸1-783)。NAT在所述系统中的表达通常涉及SEQ ID NO：6的DNA分子，它编码“成熟”多肽(核苷酸784-1386)之外还编码“前原”序列(核苷酸1-783)。
关于NAT及其制备方法的进一步细节可见与本申请同时提交的普通转让的共同未决专利申请序号_____(代理人参考号A-596)，其通过引用结合到本文中。
制备、纯化并分析所述多肽(纤溶酶或NAT)活性(使用本领域技术人员已知的纤维蛋白溶解剂的方法)后，可按照本发明将其配制成药用组合物。
在本发明组合物(不论是冷冻还是冻干组合物)中，加入稳定剂(也可称为“玻璃形成(glass-forming)添加剂”)以防止或减少纤溶酶或NAT的沉淀及化学降解，可能为其中任何一种情况。在室温下溶液出现混浊表明所述多肽发生了沉淀。术语“稳定剂”是指能够防止纤溶酶或NAT在水性介质中发生聚集或其它物理降解及化学降解(如自溶、脱氨、氧化等)的赋形剂。
已经发现，与使用无机或其它类型有机化合物防止多肽聚集和/或分解的制剂相比，加入锌稳定剂，更具体地说加入水溶性锌盐，可提高金属蛋白酶(纤溶酶或NAT)在各类型组合物中的稳定性。特别是锌浓度高于0.01mM稳定金属蛋白酶，前提条件是锌浓度高于1mM显著限制纤溶酶或NAT的溶解度。因此，建议锌浓度范围约0.01mM-1mM，合适锌盐的实例是醋酸锌、硫酸锌及氯化锌。
按照本发明的冷冻液体组合物可特别任选(但不是必须)还包括水溶性钙盐作为附加稳定剂。实例有醋酸钙、硫酸钙或氯化钙，它们的浓度优选约0.001-0.02mM，更优选约0.01±0.002mM。
除上述稳定剂之外，如果需要，可使用其它在药用组合物中常规采用的稳定剂，如蔗糖、海藻糖或甘氨酸。通常这类稳定剂的加入量微少，例如约0.1％-0.5％(w/v)。也可以加入常规量表面活性剂稳定剂如吐温20或吐温80(BASF)。
如果需要，所述冷冻液体和冻干组合物也可包括增量剂/渗透压调节剂。优选加入约2％-8％(重量/体积，w/v)浓度的甘露醇，通常浓度约为5％(w/v)。
还发现药学上可接受的缓冲剂和pH的选择也影响本发明组合物的稳定性。纤溶酶或NAT在高于中性pH(7.0)时最稳定。当融化所述冷冻组合物或复制所述冻干组合物时，在pH 7.0以下时两种金属蛋白酶均出现明显沉淀。选择的所述组合物中的缓冲系统是生理学上相容的，而且使复制溶液以及冷冻干燥前溶液保持所需pH。优选所述缓冲剂的pH缓冲能力约pH 7.0-8.5。
准确地说，优选柠檬酸缓冲剂(即柠檬酸或柠檬酸盐)以约20-110mM浓度、最优选约100mM浓度加入到冷冻液体组合物中及以约20mM浓度加入到冻干组合物中。柠檬酸盐在本发明组合物中用作缓冲剂和稳定剂。无论使用柠檬酸本身还是其盐，选择柠檬酸缓冲剂将所述组合物的pH调节至如上所述的所需pH值范围内(对于所述冻干组合物，在复制后进行调节)。其它缓冲剂如Tris可以适当有效量加入，以保持pH 7.0以上的足够缓冲能力。
除溶解纤溶酶或NAT之外，需要冷冻的优选液体组合物包含浓度约0.08-0.12mM的醋酸锌、浓度约0.008-0.012mM的醋酸钙及浓度约95-105mM的柠檬酸(或柠檬酸钠)，pH约7.4。另一种优选液体组合物包含纤溶酶或NAT、浓度约0.08-0.12mM的醋酸锌、浓度约18-22mM的柠檬酸(或柠檬酸钠)、浓度约0.02-0.06mM的Tris、浓度约3％-6％(w/v)的甘露醇及浓度约0.008％-0.012％(w/v)的吐温80，pH约8.0。
除纤溶酶或NAT之外，优选的可冻干组合物包含浓度约0.08-0.12mM的硫酸锌、浓度约18-22mM的柠檬酸(或柠檬酸钠)、浓度约3-6mM的Tris、浓度约3％-6％(w/v)的甘露醇及浓度约0.008％-0.012％(w/v)的吐温80，pH约8.0。
按照本发明的所有组合物，纤溶酶或NAT浓度约0.1-50mg/ml，更优选浓度约5-40mg/ml，最优选浓度约10-15mg/ml。
这些组合物中赋形剂的相对比例取决于若干因素。例如所述金属蛋白酶和增量剂(如甘露醇)的含量影响稳定所述组合物所需的锌含量(如果存在钙的话，也影响其含量)。所述组合物中所用稳定剂的量取决于冷冻干燥或其它加工工艺或贮存期间保持纤溶酶或NAT结构完整性所需的量。
在所述组合物中还可包含本领域已知的其它赋形剂，前提是它们在生理学上相容并且对纤溶酶或NAT绝对无害。例如所述组合物可包含微量添加剂，例如防腐剂、张力调节剂、抗氧化剂或其它聚合物(如粘度调节剂或膨胀剂)。基于对其它药用组合物的了解和经验，本领域技术人员可以很容易地确定药学上有用的适当添加剂。参见例如Remington′s Pharmaceutical Sciences(最新版)，MackPublishing Company，Easton，PA。
预计所述组合物如果是冷冻组合物，则在-30℃稳定至少2年，如果是冻干组合物，在2-8℃下稳定2年。这种长期稳定性对延长所述药用产品的有效期及长途运输是有益的。
另一方面，本发明还提供制备冻干组合物的方法，它包括如下步骤：
a)将没有纤溶酶或NAT的所述组合物成分的混合物pH调节至7.6-8.2；
b)将含纤溶酶或NAT的溶液缓冲交换入步骤(a)的组合物溶液中，然后加入有效量表面活性剂；
c)冷冻干燥步骤(b)的混合物。
用复制介质复制时，在有效减少干燥纤溶酶或NAT多肽聚集的条件下，混合纤溶酶或NAT及有效量的所述赋形剂，所述复制介质例如为可与选定给药途径相容且对所述金属蛋白酶无不良影响的溶剂，例如无菌水、生理盐水溶液、葡萄糖溶液或其它水性溶剂(例如醇类，如乙醇、正丙醇或异丙醇、丁醇或它们的混合物)以及任选其它组分如抗菌剂。
在冷冻干燥前的适当时间可将所述赋形剂与所述金属蛋白酶混合。混合所述赋形剂和金属蛋白酶的时间应足以制备合适的混合物；优选进行约1-30分钟的混合。
随后，可用标准方法冷冻干燥、贮存及复制所配制的金属蛋白酶；参见Pikal，同上。冷冻干燥及复制纤溶酶或NAT的具体条件不是特别关键，只要所选择的条件不降解金属蛋白酶且对所述稳定剂无害即可。优选的冻干循环包括在-40℃下冷冻所述组合物，在-12℃下对冷冻的样品进行退火，并在-30至-35℃下进行20-50小时的初次干燥，及在20℃下进行20-40小时的二次干燥。通常复制后不久即可使用所述复制组合物。
NAT和纤溶酶最好给予到凝血块部位局部以达到最有效的治疗。与纤溶酶一样，NAT在全身血液循环中与α2巨球蛋白共价结合。纤溶酶或NAT与α2巨球蛋白复合时，均不能作用于目标底物(即纤维蛋白或纤维蛋白原)，从而基本上无效，除非纤溶酶或NAT水平超过α2巨球蛋白的最高天然水平。因此，最好通过动脉内或静脉内导管将本发明组合物直接给予到血凝块部位。
具体实施方案介绍
以下实施例进一步阐明本发明。
通过在巴斯德毕赤酵母中表达制备实施例1-3中使用的重组NAT(SEQ ID NO：1)。关于适当表达系统和方法的详情可参见以上引用的Stroman等、Lair等、Cregg等及Cregg专利。所有化学制品不是分析纯就是USP级。
实施例1
冷冻液体组合物的制备
通过混合所述成分，制备含100mM柠檬酸、0.01mM醋酸钙及0.1mM硫酸锌的水溶液，将pH调节至7.4。通过透析(或者可使用超滤)将含NAT的溶液缓冲交换入所述溶液。将所得NAT溶液浓缩至10mg/ml并在-30℃下冷冻贮存备用。
实施例2
冷冻干燥组合物的制备
可冷冻干燥组合物的制备。通过混合各组分，制备含5mM Tris、20mM柠檬酸、5％(w/v)甘露醇、0.5％(w/v)蔗糖及0.1mM硫酸锌的水溶液，将pH调节至8.0。通过透析(可用超滤替代)将含NAT的溶液缓冲交换入所述组合物溶液中。将所得NAT溶液浓缩至10-12mg/ml。加入吐温80达到0.01％(w/v)的终浓度。将所述溶液在2-8℃下贮存以备冷冻干燥。
制备冷冻干燥产品的冷冻干燥循环。将以上制备的组合物首先在冷冻干燥器中在-40℃下冷冻。退火温度设定为-12℃；初次干燥温度设定为-30℃；二次干燥温度设定为20℃。所得冷冻干燥饼呈现良好形态，按照Karl Fischer滴定方法检测，其含水量低于3％；见Fischer，Angew Chemie，第48卷，第394页(1935)。完成所述冷冻干燥过程后，将所述冷冻干燥饼放入小瓶中，在冷冻干燥器中下压上面的金属架真空下完全密封橡皮塞。然后用13-mm弹落式(flip-off)铝盖卷压密封瓶子，将其置于设定在不同温度下的恒温箱中。
实施例3
分析复制的冻干样品
样品时间点分析。在预定时间间隔将样品瓶从恒温箱中取出以进行时间点分析。首先用0.9ml无菌水即：“注射用水”(McGaw Inc.Irvine，CA)复制所述冻干样品饼。肉眼检查复制样品溶液的透明度。通过HPLC、UV-Vis光谱法及酶活性分析所滤过溶液，对这些冻干样品中保留的可溶性NAT进行定量。
根据上述分析，所述冻干制品复制之后，NAT回收率为90％以上。
UV/Vis吸收。将150-200μl NAT溶液加入光径为1-cm的石英玻璃杯中。于HP 8452A双极阵列分光光度计(Hewlett-Packard Co.Wilmington，DE)上测量UV/Vis吸光度。根据氨基酸组成计算，使用在280nm波长下A0.1％＝1.05确定NAT浓度；可参见Edelhoch，Biochemistry，第6卷，第1948-1954页(1967)。所述冻干制品再水化之后，当在350nm下测量吸光度时，未观察到可检测的混浊度。高效液相色谱。使用配备获取数据的HP 3D Chemstation的HP 1050液相色谱系统(Hewlett-Packard Co.)进行NAT样品的HPLC分析。使用HP双极阵列检测器检测NAT在280nm及214nm下的吸光度。
在由51.5％的缓冲液A(2％异丙醇、0.1％TFA)和48.5％的缓冲液B(90％乙腈、2％异丙醇、0.1％TFA)组成、流速为0.6ml/min的流动相中，将样品注入Zorbax 300SB-C8柱(4.6×250mm)(Hewlett-Packard Co.)以进行反相HPLC(RP-HPLC)。缓冲液B保持6分钟，然后在20分钟内直线增加至51％。在此浓度保持1分钟，然后进行8分钟的浓度升并在90％保持5分钟。最后，缓冲液B在3分钟内迅速下降至48.5％。用此方法检测的冻干后NAT回收率高于92％。
在由90％的缓冲液A(20mM Tris，pH 8.5)和10％的缓冲液B(20mM Tris、250mM NaCl，pH 8.5)组成、流速为0.5ml/min的流动相中，将样品注入Tosohaas DEAE-5PW柱(7.5×75mm)(Tosohaas，Montgomeryville，Alabama)以进行离子交换HPLC(IEX-HPLC)。然后施用梯度浓度，在20分钟内由10％的缓冲液B增加到75％的缓冲液B，然后在1分钟内从75％的缓冲液B提高到90％的缓冲液B。然后保持缓冲液B5分钟，接着在4分钟内降至10％的缓冲液B。通过本方法检测的冻干后NAT回收率高于90％。
将样品加载于Tosohaas G-2000SWXL柱(300×7.8mm)中以进行尺寸排阻HPLC(SEC-HPLC)。使用含15mM磷酸钠pH 7.0和0.140M氯化钠的缓冲液在0.8ml/min的流速下进行等度洗脱。通过本方法检测的冻干后NAT回收率高于95％。
生物测定。筛选样品对纤维蛋白凝块的活性。将浓度范围为0.01-1.0mg/ml的NAT系列稀释度的微量样品等分加至96孔板中预先形成的纤维蛋白凝块上。所述样品温育18小时，通过在500nm波长下的吸光度对纤维蛋白凝块的溶解进行定量。将各制剂的吸光度-NAT浓度曲线与制备的NAT标准品相比较以确定其相对活性。相对于所述对照(非冷冻干燥)样品，冷冻干燥后的NAT纤维蛋白溶解活性没有可检测的差异。
在4℃下融解所述冷冻液体组合物，使用相同的方法检测，也得到了类似的检测结果。
对上述发明在某些细节上的描述其目的在于清楚了解本发明。在不偏离后附的权利要求书限定的本发明范围的情况下，可进行形式和细节上的各种其它组合，这也是显而易见的。
实施例4
用重组纤溶酶代替NAT重复实施例1和2的步骤，以制得类似的冷冻液体药用组合物和冻干药用组合物。
序列表
<110>Kendrick，Brent S.
     Peterson，Brian A.
<120>纤维蛋白溶解剂药用组合物
<130>A-578
<140>N/A
<141>1999-10-01
<160>6
<170>PatentIn Ver.2.0
<210>1
<211>201
<212>PRT
<213>人工序列
<220>
<223>人工序列描述：NAT(Agkistrodon Contortrix纤溶酶类似物)
<400>1
Ser Phe Pro Gln Arg Tyr Val Gln Leu Val Ile Val Ala Asp His Arg
  1               5                  10                  15
Met Asn Thr Lys Tyr Asn Gly Asp Ser Asp Lys Ile Arg Gln Trp Val
             20                  25                  30
His Gln Ile Val Asn Thr Ile Asn Glu Ile Tyr Arg Pro Leu Asn Ile
         35                  40                  45
Gln Phe Thr Leu Val Gly Leu Glu Ile Trp Ser Asn Gln Asp Leu Ile
     50                  55                  60
Thr Val Thr Ser Val Ser His Asp Thr Leu Ala Ser Phe Gly Asn Trp
 65                  70                  75                  80
Arg Glu Thr Asp Leu Leu Arg Arg Gln Arg His Asp Asn Ala Gln Leu
                 85                  90                  95
Leu Thr Ala Ile Asp Phe Asp Gly Asp Thr Val Gly Leu Ala Tyr Val
            100                 105                 110
Gly Gly Met Cys Gln Leu Lys His Ser Thr Gly Val Ile Gln Asp His
        115                 120                 125
Ser Ala Ile Asn Leu Leu Val Ala Leu Thr Met Ala His Glu Leu Gly
    130                 135                 140
His Asn Leu Gly Met Asn His Asp Gly Asn Gln Cys His Cys Gly Ala
145                 150                 155                 160
Asn Ser Cys Val Met Ala Ala Met Leu Ser Asp Gln Pro Ser Lys Leu
                165                 170                 175
Phe Ser Asp Cys Ser Lys Lys Asp Tyr Gln Thr Phe Leu Thr Val Asn
            180                 185                 190
Asn Pro Gln Cys Ile Leu Asn Lys Pro
        195                 200
<210>2
<211>603
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>人工序列描述：编码NAT(纤溶酶类似物)
<400>2
tctttcccac aaagatacgt acagctggtt atcgttgctg accaccgtat gaacactaaa 60
tacaacggtg actctgacaa aatccgtcaa tgggtgcacc aaatcgtcaa caccattaac 120
gaaatctaca gaccactgaa catccaattc actttggttg gtttggaaat ctggtccaac 180
caagatttga tcaccgttac ttctgtatcc cacgacactc tggcatcctt cggtaactgg 240
cgtgaaaccg acctgctgcg tcgccaacgt catgataacg ctcaactgct gaccgctatc 300
<211>203
<212>PRT
<213>Agkistrodon Contortrix
<220>
<223>Agkistrodon Contortrix天然纤溶酶
<400>3
Gln Gln Arg Phe Pro Gln Arg Tyr Val Gln Leu Val Ile Val Ala Asp
  1               5                  10                  15
His Arg Met Asn Thr Lys Tyr Asn Gly Asp Ser Asp Lys Ile Arg Gln
             20                  25                  30
Trp Val His Gln Ile Val Asn Thr Ile Asn Glu Ile Tyr Arg Pro Leu
         35                  40                  45
Asn Ile Gln Phe Thr Leu Val Gly Leu Glu Ile Trp Ser Asn Gln Asp
     50                  55                  60
Leu Ile Thr Val Thr Ser Val Ser His Asp Thr Leu Ala Ser phe Gly
 65                  70                  75                  80
Asn Trp Arg Glu Thr Asp Leu Leu Arg Arg Gln Arg His Asp Asn Ala
                 85                  90                  95
Gln Leu Leu Thr Ala Ile Asp Phe Asp Gly Asp Thr Val Gly Leu Ala
            100                 105                 110
Tyr Val Gly Gly Met Cys Gln Leu Lys His Ser Thr Gly Val Ile Gln
        115                 120                 125
Asp His Ser Ala Ile Asn Leu Leu Val Ala Leu Thr Met Ala His Glu
    130                 135                 140
Leu Gly His Asn Leu Gly Met Asn His Asp Gly Asn Gln Cys His Cys
145                 150                 155                 160
Gly Ala Asn Ser Cys Val Met Ala Ala Met Leu Ser Asp Gln Pro Ser
                165                 170                 175
Lys Leu Phe Ser Asp Cys Ser Lys Lys Asp Tyr Gln Thr Phe Leu Thr
            180                 185                 190
Val Asn Asn Pro Gln Cys Ile Leu Asn Lys Pro
        195                 200
<210>4
<211>609
<212>DNA
<213>Agkistrodon Contortrix
<220>
<223>编码Agkistrodon Contortrix天然纤溶酶
<400>4
caacaaagat tcccacaaag atacgtacag ctggttatcg ttgctgacca ccgtatgaac 60
actaaataca acggtgactc tgacaaaatc cgtcaatggg tgcaccaaat cgtcaacacc 120
attaacgaaa tctacagacc actgaacatc caattcactt tggttggttt ggaaatctgg 180
tccaaccaag atttgatcac cgttacttct gtatcccacg acactctggc atccttcggt 240
aactggcgtg aaaccgacct gctgcgtcgc caacgtcatg ataacgctca actgctgacc 300
gctatcgact tcgacggtga tactgttggt ctggcttacg ttggtggcat gtgtcaactg 360
aaacattcta ctggtgttat ccaggaccac tccgctatta acctgctggt tgctctgacc 420
atggcacacg aactgggtca taacctgggt atgaaccacg atggcaacca gtgtcactgc 480
ggtgcaaact cctgtgttat ggctgctatg ctgtccgatc aaccatccaa actgttctcc 540
gactgctcta agaaagacta ccagaccttc ctgaccgtta acaacccgca gtgtatcctg 600
aacaaaccg                                                         609
<210>5
<211>1392
<212>DNA
<213>Agkistrodon Contortrix
<220>
<223>Agkistrodon Contortrix天然纤溶酶原
<400>5
atgagatttc cttcaatttt tactgctgtt ttattcgcag catcctccgc attagctgct 60
ccagtcaaca ctacaacaga agatgaaacg gcacaaattc cggctgaagc tgtcatcggt 120
tactcagatt tagaagggga tttcgatgtt gctgttttgc cattttccaa cagcacaaat 180
aacgggttat tgtttataaa tactactatt gccagcattg ctgctaaaga agaaggggta 240
tctctcgaga aaagagaggc tgaagcttct tctattatct tggaatctgg taacgttaac 300
gattacgaag ttgtttatcc aagaaaggtc actccagttc ctaggggtgc tgttcaacca 360
aagtacgaag atgccatgca atacgaattc aaggttaaca gtgaaccagt tgtcttgcac 420
ttggaaaaaa acaaaggttt gttctctgaa gattactctg aaactcatta ctccccagat 480
ggtagagaaa ttactactta cccattgggt gaagatcact gttactacca tggtagaatc 540
gaaaacgatg ctgactccac tgcttctatc tctgcttgta acggtttgaa gggtcatttc 600
aagttgcaag gtgaaatgta cttgattgaa ccattggaat tgtccgactc tgaagcccat 660
gctgtctaca agtacgaaaa cgtcgaaaag gaagatgaag ccccaaagat gtgtggtgtt 720
acccaaaact gggaatcata tgaaccaatc aagaaggcct tccaattaaa cttgactaag 780
agacaacaaa gattcccaca aagatacgta cagctggtta tcgttgctga ccaccgtatg 840
aacactaaat acaacggtga ctctgacaaa atccgtcaat gggtgcacca aatcgtcaac 900
accattaacg aaatctacag accactgaac atccaattca ctttggttgg tttggaaatc 960
tggtccaacc aagatttgat caccgttact tctgtatccc acgacactct ggcatccttc 1020
ggtaactggc gtgaaaccga cctgctgcgt cgccaacgtc atgataacgc tcaactgctg 1080
accgctatcg acttcgacgg tgatactgtt ggtctggctt acgttggtgg catgtgtcaa 1140
ctgaaacatt ctactggtgt tatccaggac cactccgcta ttaacctgct ggttgctctg 1200
accatggcac acgaactggg tcataacctg ggtatgaacc acgatggcaa ccagtgtcac 1260
tgcggtgcaa actcctgtgt tatggctgct atgctgtccg atcaaccatc caaactgttc 1320
tccgactgct ctaagaaaga ctaccagacc ttcctgaccg ttaacaaccc gcagtgtatc 1380
ctgaacaaac cg                                                     1392
<210>6
<211>1386
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>人工序列描述：proNAT(Agkistrodon Contortrix纤溶酶原的类似
     物)
<400>6
atgagatttc cttcaatttt tactgctgtt ttattcgcag catcctccgc attagctgct 60
ccagtcaaca ctacaacaga agatgaaacg gcacaaattc cggctgaagc tgtcatcggt 120
tactcagatt tagaagggga tttcgatgtt gctgttttgc cattttccaa cagcacaaat 180
aacgggttat tgtttataaa tactactatt gccagcattg ctgctaaaga agaaggggta 240
tctctcgaga aaagagaggc tgaagcttct tctattatct tggaatctgg taacgttaac 300
gattacgaag ttgtttatcc aagaaaggtc actccagttc ctaggggtgc tgttcaacca 360
aagtacgaag atgccatgca atacgaattc aaggttaaca gtgaaccagt tgtcttgcac 420
ttggaaaaaa acaaaggttt gttctctgaa gattactctg aaactcatta ctccccagat 480
ggtagagaaa ttactactta cccattgggt gaagatcact gttactacca tggtagaatc 540
gaaaacgatg ctgactccac tgcttctatc tctgcttgta acggtttgaa gggtcatttc 600
aagttgcaag gtgaaatgta cttgattgaa ccattggaat tgtccgactc tgaagcccat 660
gctgtctaca agtacgaaaa cgtcgaaaag gaagatgaag ccccaaagat gtgtggtgtt 720
acccaaaact gggaatcata tgaaccaatc aagaaggcct tccaattaaa cttgactaag 780
agatctttcc cacaaagata cgtacagctg gttatcgttg ctgaccaccg tatgaacact 840
aaatacaacg gtgactctga caaaatccgt caatgggtgc accaaatcgt caacaccatt 900
aacgaaatct acagaccact gaacatccaa ttcactttgg ttggtttgga aatctggtcc 960
aaccaagatt tgatcaccgt tacttctgta tcccacgaca ctctggcatc cttcggtaac 1020
tggcgtgaaa ccgacctgct gcgtcgccaa cgtcatgata acgctcaact gctgaccgct 1080
atcgacttcg acggtgatac tgttggtctg gcttacgttg gtggcatgtg tcaactgaaa 1140
cattctactg gtgttatcca ggaccactcc gctattaacc tgctggttgc tctgaccatg 1200
gcacacgaac tgggtcataa cctgggtatg aaccacgatg gcaaccagtg tcactgcggt 1260
gcaaactcct gtgttatggc tgctatgctg tccgatcaac catccaaact gttctccgac 1320
tgctctaaga aagactacca gaccttcctg accgttaaca acccgcagtg tatcctgaac 1380
aaaccg                                                            1386

Claims (25)

1.一种药用组合物，它在药学上可接受的缓冲剂中包含金属蛋白酶纤维蛋白溶解剂、锌稳定剂以及任选的增量剂，其中金属蛋白酶纤维蛋白溶解剂与锌结合，直接降解纤维蛋白，当与α-2-巨球蛋白复合时失活。
2.权利要求1的药用组合物，其中所述锌稳定剂为选自硫酸锌、醋酸锌和氯化锌的水溶性锌盐。
3.权利要求1的药用组合物，其中所述缓冲剂为柠檬酸或水溶性柠檬酸盐。
4.权利要求1的药用组合物，其中所述增量剂为甘露醇。
5.权利要求1的药用组合物，其pH为6.5-8.5。
6.权利要求1的药用组合物，它为冷冻液体形式。
7.权利要求6的药用组合物，它任选包含水溶性钙盐。
8.权利要求7的药用组合物，其中所述水溶性钙盐选自醋酸钙、硫酸钙及氯化钙。
9.权利要求1的药用组合物，它为冷冻干燥的。
10.水性的权利要求1的药用组合物，其中：
金属蛋白酶纤维蛋白溶解剂的含量为0.1-50mg/ml；
锌稳定剂包含0.08-0.12mM硫酸锌；
药学上可接受的缓冲剂包含0.008-0.012mM醋酸钙及95-110mM柠檬酸或柠檬酸钠；
所述组合物的pH为7.4。
11.权利要求10的药用组合物，其中：
金属蛋白酶的含量为10mg/ml；
柠檬酸的浓度为100mM；
醋酸钙的浓度为0.01mM；
硫酸锌的浓度为0.1mM。
12.水性的权利要求1的药用组合物，其中：
金属蛋白酶纤维蛋白溶解剂的含量为0.1-50mg/ml；
锌稳定剂包含0.08-0.12mM醋酸锌；
药学上可接受的缓冲剂包含18-22mM柠檬酸或柠檬酸钠，以及0.02-0.06mM Tris；
存在增量剂，所述增量剂包含3％-6％(w/v)甘露醇；
存在其他稳定剂，所述其他稳定剂包含0.008％-0.012％(w/v)的表面活性剂；
所述组合物的pH为8.0。
13.水性的权利要求1的药用组合物，其中：
金属蛋白酶纤维蛋白溶解剂的含量为0.1-50mg/ml；
锌稳定剂包含0.08-0.12mM硫酸锌；
药学上可接受的缓冲剂包含18-22mM柠檬酸或柠檬酸钠，以及3-6mM Tris；
存在增量剂，所述增量剂包含3％-6％(w/v)甘露醇；
存在其他稳定剂，所述其他稳定剂包含0.008％-0.012％(w/v)的表面活性剂，以及任选的0.1％-0.5％(w/v)蔗糖；
所述组合物的pH为8.0。
14.权利要求13的药用组合物，其中：
金属蛋白酶的浓度为12mg/ml；
Tris的浓度为5mM；
柠檬酸的浓度为20mM；
甘露醇的浓度为5％(w/v)；
蔗糖的浓度为0.5％(w/v)；
表面活性剂的浓度为0.01％(w/v)；
硫酸锌的浓度为0.1mM；
所述组合物的pH为8.0。
15.一种制备冻干组合物的方法，它包括如下步骤：
a)在缓冲液中形成金属蛋白酶纤维蛋白溶解剂、锌盐、增量剂、起稳定作用的二糖及表面活性剂的混合物，其中金属蛋白酶纤维蛋白溶解剂与锌结合，直接降解纤维蛋白，当与α-2-巨球蛋白复合时失活；
b)冷冻干燥步骤(a)的混合物。
16.权利要求15的方法，其中所述组合物的pH在冷冻干燥前调至7.8-8.2。
17.权利要求15的方法，它包括以下步骤：
a)将含所述锌盐、增量剂及起稳定作用的二糖的溶液的pH调至7.6-8.2；
b)将含所述金属蛋白酶的混合物缓冲交换入步骤(a)的溶液中，然后加入有效量的表面活性剂；
c)冷冻干燥步骤(b)的混合物。
18.一种冻干药用组合物，它可按照权利要求15-17任一项的方法获得。
19.权利要求1-14任一项的组合物，它用于血凝块溶解治疗。
20.权利要求1-14任一项的组合物在制备用于血凝块溶解治疗的药物中的用途。
21.一种用于制备水性药用组合物的药盒，它包括两个容器，第一个容器装有锌稳定剂和金属蛋白酶纤维蛋白溶解剂的冻干组合物，其中金属蛋白酶纤维蛋白溶解剂与锌结合，直接降解纤维蛋白，当与α-2-巨球蛋白复合时失活；第二个容器装有用于所述冻干组合物的生理学上可接受的溶剂。
22.一种溶解纤维蛋白凝块的体外方法，其包括使纤维蛋白凝块与在药学上可接受的缓冲剂中的金属蛋白酶纤维蛋白溶解剂、锌稳定剂以及任选的增量剂接触，其中金属蛋白酶纤维蛋白溶解剂与锌结合，直接降解纤维蛋白，当与α-2-巨球蛋白复合时失活。
23.一种方法，其包括重建权利要求9或18的冻干药用组合物。
24.一种组合物，其可通过权利要求23的方法获得，用于血凝块溶解治疗。
25.权利要求23的方法在制备用于血凝块溶解治疗的药物中的用途。
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