CN101198625A - 抗il-22ra抗体和结合伴侣及其在炎症中的使用方法 - Google Patents

Abstract

本发明涉及阻断、抑制、减少、拮抗或中和IL－22和/或IL－2的多肽分子。IL－20和IL－22是涉及炎症过程和人疾病的细胞因子。IL－22RA(zcytorll)是IL－20和IL－22的共同的受体。本发明包括抗IL－22RA抗体和结合伴侣，以及使用这样的抗体和结合伴侣拮抗IL－22和/或IL－20的方法。

Description

抗IL-22RA抗体和结合伴侣及其在炎症中的使用方法

技术领域

本发明涉及阻断、抑制、减少、拮抗或中和IL-22和/或IL-2的多肽分子。具体而言，本发明提供了IL-22RA抗体和结合伴侣，即可溶性IL-22RA受体和中和性抗IL-22RA抗体。本发明进一步提供了所述拮抗剂在炎性疾病中的使用，以及相关的组合物和方法。

背景技术

相关申请的引用

本申请要求2004年10月22日提交的美国临时申请系列号60/621,553的利益，该临时申请在此引用作为参考。

细胞因子是介导各种生物学效应的可溶性小蛋白，所述效应包括生长的调节和许多细胞类型的分化(参见，例如，Arai等人，Annu.Rev.Biochem.59：783(1990)；Mosmann，Curr.Opin.Immunol.3：311(1991)；Paul和Seder，Cell 76：241(1994))。构成细胞因子群体的蛋白包括白细胞介素、干扰素、集落刺激因子、肿瘤坏死因子和其他调节分子。例如，人白细胞介素-17是刺激白细胞介素-6、细胞内粘着分子1、白细胞介素-8、粒细胞巨噬细胞集落刺激因子和前列腺素E2表达的细胞因子，并且在CD34+造血前体优先地成熟为嗜中性粒细胞中起着重要作用(Yao等人，J.Immuno1. 155：5483(1995)；Fossiez等人，J.Exp.Med.183：2593(1996))。

结合细胞因子的受体一般由一种或多种整联膜蛋白构成，所述膜蛋白高度亲和性地结合细胞因子并将该结合事件通过某些受体亚基的细胞质部分传导给细胞。根据细胞因子受体的细胞外配体结合结构域的相似性可以将细胞因子受体分成几类。例如，负责结合和/或传递干扰素效果的受体链是II类细胞因子受体家族的成员，基于其200个残基的细胞外结构域的特征。

细胞因子和其受体所表现出的的体内活性表明了对其他的细胞因子、细胞因子受体、细胞因子激动剂和细胞因子拮抗剂的临床应用潜力和对其的需求。例如，促炎细胞因子家族所表现出的体内活性说明促炎分子的拮抗剂的巨大临床潜力和对其的需求。本发明通过提供促炎细胞因子IL-20和IL-22的拮抗剂来满足该需求。本发明的这些拮抗剂可以阻断、抑制、降低、拮抗或中和IL-22、IL-20、或IL-20与IL-22两者的活性，所述的拮抗剂包括可溶性IL-22RA受体和中和性抗IL-22RA抗体。本发明进一步提供了所述的拮抗剂在炎性疾病中的使用，以及相关的组合物和方法。

发明内容

1.概述

和其它发明相比，本发明提供了新型的名为“Zcytor11”或“IL-22RA”的可溶性受体、和IL-22RA细胞因子受体的中和性抗体的使用。本发明还提供了可溶性IL-22RA多肽片段和融合蛋白质，其用于人炎症和自身免疫疾病。本发明的抗IL-22RA抗体和可溶性IL-22RA受体，包括本发明的中和性抗IL-22RA抗体，能够在治疗特定的人类疾病中用于阻断、抑制、降低、拮抗或中和IL-22或IL-20、或IL-20与IL-22这两者的活性，所述疾病例如牛皮癣、牛皮癣性关节炎、关节炎、内毒素血症、炎性肠病(IBD)、结肠炎和如此处所述的其它炎症病症。

SEQ ID NO：I提供了编码人Zcytor11(IL-22RA)的说明性核苷酸序列；编码的多肽显示于SEQ ID NO：2。IL-22RA是IL-20和IL-22这两者的受体亚基。Zcytor11(IL-22RA)公开于共同拥有的美国专利申请号5,965,704、共同拥有的WIPO公开号WO 02/12345和共同拥有的WIPO公开号WO 02/072607。对编码IL-22RA(SEQ ID NO：1)的人cDNA克隆的分析揭示了一个编码574个氨基酸(SEQ ID NO：2)的开放阅读框，其包含一个大约211个氨基酸残基(SEQ ID NO：2的残基18-228；SEQ ID NO：3)的细胞外配体结合结构域，一个大约23个氨基酸残基(SEQ ID NO：2的残基229-251)的跨膜结构域，和一个大约313个氨基酸残基(SEQ ID NO：2的残基252-574)的细胞内结构域。因此，本发明的分子包括了含有细胞因子结合结构域的多肽，该结合结构域含有SEQ ID NO：2的氨基酸残基18-228；SEQ ID NO：3。在本发明的一个可溶性受体实施方案中，可溶性IL-22R被融合到重链(代表性地显示于SEQ ID NO：4)恒定区。本领域的技术人员能够意识到这些结构域的边界是近似的。可以在结构域的末端删减残基。

如下所述，本发明提供了包含这样的氨基酸序列的分离的多肽，该序列和参照氨基酸序列SEQ ID NO：2的18-228具有至少70％、至少80％或至少90％、或超过95％例如96％、97％、98％或大于99％或更大的同一性，该序列也显示于SEQ ID NO：3，其中所述分离的多肽特异性地结合这样的抗体，该抗体特异性地结合包含SEQ ID NO：3的氨基酸序列的多肽。说明性多肽包括包含SEQ ID NO：3或SEQ ID NO：3的氨基酸序列的多肽。并且，本发明也提供了和上面公开的一样结合IL-22(例如，显示于SEQ ID NO：6的人IL-22多肽序列)的分离的多肽。人IL-22多核苷酸序列显示于SEQ ID NO：5。小鼠IL-22多核苷酸序列显示于SEQ ID NO：10，相对应的多肽显示于SEQ ID NO：11。本发明还提供了分离的多肽，和上面公开的一样结合IL-20(例如，显示于SEQID NO：8的人IL-20多肽序列；WIPO公开号WO 99/27103)。人IL-20多核苷酸序列显示于SEQ ID NO：7。

本发明还提供了包含SEQ ID NO：3氨基酸序列的至少15个连续氨基酸残基的分离的多肽和表位。说明性多肽包括包含或由SEQ ID NO：3、其抗原表位或其功能性IL-20或IL-22结合片段构成的多肽。

本发明还包括变体IL-22RA多肽，变体多肽的氨基酸序列和SEQID NO：3的氨基酸残基具有至少70％的同一性、至少80％的同一性、至少90％的同一性、至少95％的同一性或大于95％例如96％，97％，98％或超过99％或更高的同一性，其中变体多肽的氨基酸序列和SEQ IDNO：3的相应的氨基酸序列之间的任何差异是由于一个或多个保守性氨基酸替代造成的。此处描述了这些保守性氨基酸替代。此外，本发明也提供了上面公开的结合、阻断、抑制、降低、拮抗或中和IL-22或IL-20的活性的分离的多肽。

本发明进一步提供了特异性结合这些多肽的抗体和抗体片段。示例性抗体包括中和抗体、多克隆抗体、鼠类单克隆抗体、衍生自鼠类单克隆抗体的人源化抗体和人单克隆抗体。说明性的抗体片段包括F(ab′)₂、F(ab)₂、Fab′、Fab、Fv、scFv和最小识别单位。中和抗体优先结合IL-22RA，这样就阻断、抑制、减少、拮抗或中和IL-20和IL-22与IL-22RA的相互作用；本发明也可包含阻断、抑制、减少、拮抗或中和IL-20或IL-22与IL-22RA的结合的抗-IL-22RA中和抗体。即，本发明的抗-IL-22RA中和抗体可单独地结合、阻断、抑制、减少、拮抗或中和各IL-20或IL-22，或同时结合、阻断、抑制、减少、拮抗或中和IL-20和IL-22。本发明还包括包含此处描述的载体和肽、多肽或抗体的组合物。

此外，本发明提供了这样的药物组合物，其包含药物可接受载体和这样的表达载体中的或包含这些表达载体的重组病毒中的至少一种。本发明还包括包含此处描述的药物可接受的载体和多肽或抗体的药物组合物。

本发明也涉及这样的抗独特型抗体、或抗独特型抗体片段，所述抗体或抗体片段与特异性结合包含SEQ ID NO：3的氨基酸序列的多肽或其片段的抗体或抗体片段特异性结合。示例性抗独特型抗体与特异性结合由SEQ ID NO：3构成的多肽的抗体特异性结合。

本发明也提供了包含IL-22RA多肽和免疫球蛋白部分的融合蛋白。在这些融合蛋白中，免疫球蛋白部分可以是免疫球蛋白重链恒定区，例如人F_c片段。本发明也包括分离的编码这些融合蛋白的核酸分子。

本发明也提供了结合这样的多肽的多克隆和单克隆抗体，所述多肽包含IL-22RA细胞外结构域，例如单体、同型二聚体、异二聚体和多聚体受体，包括可溶性受体。此外，可使用这些抗体拮抗IL-22RA配体IL-22(SEQ ID NO：6)和IL-20(SEQ ID NO：8)单独地或一起地和IL-22RA受体的结合。

另外，人牛皮癣损伤和人特应性皮炎皮肤样本中出现IL-22和IL-20过量表达或上调，表明IL-22象IL-20一样也参与人牛皮癣、特应性皮炎或其它皮肤和上皮组织炎性疾病。另外，如此处所述，在转基因小鼠中过量表达IL-20或IL-22表现出表皮增厚和免疫细胞参与特征的牛皮癣表型；并且给正常小鼠增加注射IL-22表现出表皮增厚和免疫细胞参与特征的牛皮癣表型，可以用可溶性受体拮抗剂IL-22RA2(zcytor16；WIPO Publication No.WO 01/40467)去除此表型。这些体内数据进一步表明，促炎性IL-22参与牛皮癣、特应性皮炎或其它皮肤和上皮组织炎性疾病。同样，拮抗IL-22和IL-20活性，例如IL-22RA可溶性受体和抗体，也包括本发明中的抗人IL-22RA单克隆和中和抗体，可用于炎性疾病的治疗，尤其是作为IL-22和IL-20单独或共同拮抗剂用于治疗牛皮癣。另外，IL-22活性拮抗剂，例如IL-22RA可溶性受体和抗体，也包括本发明的抗-人-IL-22RA单克隆和中和抗体，可用于其它炎性疾病的治疗，例如作为结合、阻断、抑制、降低、拮抗或中和IL-22和IL-20(单独或一起)用于治疗特应性皮炎、IBD、结肠炎、内毒素血症、关节炎、类风湿性关节炎和牛皮癣关节炎成人呼吸道疾病(ARD)、感染性休克、多器官衰竭、炎性肺损伤例如哮喘或支气管炎、细菌性肺炎、牛皮癣、湿疹、特应性和接触性皮炎、和炎性肠病例如溃疡性结肠炎和局限性肠炎。

通过参考下面的详细描述，本发明的这些方面和其他方面将变得明了。此外，下面给出了各种参考资料并以其全文在此引用作为参考。

2.定义

在下面的描述中，广泛地使用了许多术语。提供下列定义以帮助理解本发明。

如此处所用，“核酸”或“核酸分子”是指多核苷酸，例如脱氧核糖核酸(DNA)或核糖核酸(RNA)、寡核苷酸、由聚合酶链式反应(PCR)产生的片段以及通过连接作用、剪断作用(scission)、内切核酸酶作用和外切核酸酶作用中的任一种产生的片段。核酸分子可由天然存在的核苷酸的单体构成(例如DNA和RNA)、或天然发生的核苷酸的类似物(例如，天然存在的核苷酸的α-对映体形式)的单体构成、或这两种单体的组合构成。修饰的核苷酸可在糖部分和/或嘧啶或嘌呤碱基部分具有变化。糖修饰作用包括，例如，用卤素、烷基、胺基和叠氮基替换一个或多个羟基，或可将糖官能化为醚或酯类的形式。此外，可用立体化学和电子相似的结构例如氮杂-糖和碳环糖类似物替代整个糖部分。碱基部分中修饰的示例包括烷基化的嘌呤和嘧啶、酰化的嘌呤或嘧啶、或其他熟知的杂环取代。可通过磷酸二酯键或这些键的类似键连接核酸单体。磷酸二酯键的类似物包括硫代磷酸酯、二硫代磷酸酯、硒代磷酸酯、二硒代磷酸酯、phosphoroanilothioate、phosphoranilidate、氨基磷酸(phosphoramidate)等。术语“核酸分子”也包括所谓的“肽核酸”，其包含附着至聚酰胺主链的天然发生的或修饰的核酸碱基。核酸可以是单链的或双链的。

术语“核酸分子的互补链”是指和参照核苷酸序列相比，具有互补的核苷酸序列和相反的方向的核酸分子。例如，序列5′ATGCACGGG3′和5′CCCTGCAT 3′互补。

术语“简并核苷酸序列”是指和编码多肽的参照核酸分子相比，包含一个或多个简并密码子的核苷酸序列。简并密码子包含不同的核苷酸三联体，但编码相同的氨基酸残基(即，GAU和GAC三联体各自编码Asp)。

术语“结构基因”是指转录成信使RNA(mRNA)的核酸分子，然后该RNA被翻译成特定多肽特有的氨基酸序列。

“分离的核酸分子”是未整合入生物体的基因组DNA中的核酸分子。例如，已从细胞的基因组中分离的编码生长因子的DNA分子是分离的DNA分子。分离的核酸分子的另一个示例是未整合入生物的基因组中的化学合成的核酸分子。已从特定的物种分离的核酸分子比来自该物种的染色体的完全DNA分子小。

“核酸分子构建体”是这样的单链或双链的核酸分子，即其通过人工干预被修饰，从而包含以自然界中不存在的排列方式组合和并列的核酸的片段。

“线性DNA”是指具有游离5′和3′末端的非环形DNA分子。可通过酶促降解或物理破坏从封闭的环形DNA分子例如质粒制备线性DNA。

“互补DNA(cDNA)”是通过逆转录酶从mRNA模板形成的单链DNA分子。一般地，使用和mRNA的部分互补的引物起始反转录。本领域技术人员也使用术语“cDNA”表示由这样的单链DNA分子和其互补DNA链构成的双链DNA分子。术语“cDNA”也指从RNA模板合成的cDNA分子的克隆。

“启动子”是指导结构基因转录的核苷酸序列。一般地，启动子位于基因的5′非编码区，邻近结构基因的转录起始位点。在转录的起始中发挥作用的启动子内的序列元件的特征通常在于一致核苷酸序列。这些启动子元件包括RNA聚合酶结合位点、TATA序列、CAAT序列、分化特异性元件(differentiation-specific elements)(DSEs；McGehee等人，Mol.Endocrinol.7：551(1993))、环AMP效应元件(CREs)、血清效应元件(serum response elements)(SREs；Treisman，Seminars in Cancer Biol.1：47(1990))、糖皮质类固醇应答元件(GREs)和其他转录因子例如CRE/ATF(O′Reilly等人，J.Biol.Chem.267：19938(1992))、AP2(Ye等人，J.Biol.Chem.269：25728(1994))、SP1、cAMP效应元件结合蛋白(CREB；Loeken，Gene Expr.3：253(1993))和八聚体因子(octamer factors)(参见，一般，Watson等人，eds.，Molecular Biology of the Gene，第4版.(TheBenjamin/Cummings Publishing Company，I nc.1987)，和Lemaigre和Rousseau，Biochem.J.303：1(1994))的结合位点。如果启动子是可诱导的启动子，那么转录速率应答诱导剂而增加。相反地，如果启动子是组成型启动子，则不能通过诱导剂调控转录速率。阻抑型启动子也是已知的。

“核心启动子”包含启动子发挥作用所必需的核苷酸序列，包括TATA盒和转录起始位点。根据该定义，核心启动子在可增强活性或提供组织特异性活性的特异性序列不存在的情况可以具有或可以不具有可检测的活性。

“调控元件”是调节核心启动子的活性的核苷酸序列。例如，调控元件可包含这样的核苷酸序列，该序列结合使转录专门地或优先地在特定的细胞、组织或器官中进行的细胞因子。这些类型的调控元件一般和以“细胞特异性”、“组织特异性”或“器官特异性”的方式表达的基因关联。

“增强子”是这样的类型的调控元件，无论增强子相对于转录起始位点的距离或排列方向如何，其都可增加转录的功效。

“异源DNA”是指在给定的宿主细胞内非天然存在的DNA分子或DNA分子的群体。相对于特定的宿主细胞异源的DNA分子可包含来源于宿主细胞物种的DNA(即，内源DNA)，只要将该宿主DNA和非宿主DNA(即，外源DNA)组合。例如，包含这样的编码多肽的非宿主DNA片段的DNA分子被认为是异源DNA分子，所述非宿主DNA片段有效地连接至包含转录启动子的宿主DNA片段。相反地，异源DNA分子可包含有效地和外源启动子连接的内源基因。作为另一个说明性示例，如果包含来源于野生型细胞的基因的DNA分子被导入缺少该野生型基因的突变细胞，则该DNA分子被认为是异源DNA。

“多肽”是无论天然产生的或通过合成产生的、通过肽键连接的氨基酸残基的多聚体。少于大约10个氨基酸残基的多肽通常称为“肽”。

“蛋白”是包含一个或多个多肽链的大分子。蛋白也可包含非肽组分，例如糖类。可通过这样的细胞给蛋白加上糖和其他非肽取代基，在所述细胞中，产生该蛋白，所述糖和其他非肽取代基随细胞类型的变化而变化。此处以其氨基酸主链的结构定义蛋白；取代基例如糖基一般不指明，虽然如此，但其仍可以存在。

由非宿主DNA分子编码的肽或多肽是“异源”肽或多肽。

“克隆载体”是能够在宿主细胞中自主复制的核酸分子例如质粒、粘粒或噬菌体。克隆载体一般包含一个或少数限制性内切核酸酶识别位点和编码这样的标记基因的核苷酸序列，所述识别位点允许以可确定的方式插入核酸分子而不丢失载体的基本生物学功能，所述标记基因适合用于鉴定和选择用该克隆载体转化的细胞。标记基因一般包括提供四环素抗性或氨苄青霉素抗性的基因。

“表达载体”是编码在宿主细胞中表达的基因的核酸分子。一般地，表达载体包含转录启动子、基因和转录终止子。基因表达一般置于启动子的控制之下，这样的基因被认为“有效地连接至”启动子。类似地，如果调控元件调控核心启动子的活性，那么该调控元件和核心启动子是有效地连接的。

“重组宿主”是包含异源核酸分子例如克隆载体或表达载体的细胞。在本文中，重组宿主的一个示例是从表达载体产生IL-22RA的细胞。相反地，可通过是IL-22RA的“天然来源”或缺少表达载体的细胞产生IL-22RA。

“整合转化子”是这样的重组宿主细胞，在该重组细胞中，异源DNA已被整合入该细胞的基因组。

“融合蛋白”是通过包含至少2个基因的核苷酸序列的核酸分子表达的杂合蛋白。例如，融合蛋白可包含和结合亲和基质的多肽融合的IL-22RA多肽的至少一部分。这样的融合蛋白提供了使用亲和层析法分离大量IL-22RA的手段。

术语“受体”是指结合称为“配体”的生物活性分子的细胞关联性蛋白。该相互作用介导配体对细胞的效应。受体可以是膜结合受体、细胞溶胶或细胞核中的受体；单体(例如，促甲状腺激素受体、β-肾上腺素能受体)或多聚体(例如，PDGF受体、生长激素受体、IL-3受体、GM-CSF受体、G-CSF受体、促红细胞生成素受体和IL-6受体)。膜结合受体的特征在于包含细胞外配体结合结构域和细胞内效应结构域(通常参与信号转导)的多结构域结构。在某些膜结合受体中，细胞外配体结合结构域和细胞内效应结构域位于分开的、包含完整功能性受体的多肽中。

一般地，配体和受体的结合导致受体的构象变化，这使效应结构域和细胞内其他分子之间产生相互作用，该相互作用依次导致细胞的代谢作用上的改变。通常和受体-配体相互作用关联的代谢事件包括基因转录、磷酸化作用、去磷酸化作用、环AMP产物的增加、细胞钙的动员、膜脂质的动员、细胞粘着、肌醇脂质的水解和磷脂的水解。

“可溶性受体”是不和细胞膜结合的受体多肽。可溶性受体是最普遍的缺少跨膜和细胞质结构域、以及和细胞膜的其他连接例如通过糖基磷酸肌醇(gpi)的连接的配体结合性受体。可溶性受体可包含额外的氨基酸残基，例如提供多肽的纯化或提供多肽至基质的附着位点的亲和标签、或免疫球蛋白恒定区序列。许多细胞表面受体具有天然发生的、可溶性对应物，该对应物通过蛋白水解作用产生或通过可变剪接的mRNA翻译产生。可溶性受体可以是单体、同二聚体、异二聚体或多聚体，多聚体受体一般包含不超过9个亚基，优选地不超过6个亚基和最优选地不超过3个亚基。当受体多肽缺乏充分的跨膜和细胞内多肽片段以至不能分别提供膜锚定或信号转导时，认为其基本上不含有这些片段。I型和II型细胞因子受体的可溶性受体一般包含细胞外细胞因子结合结构域，无跨膜结构域和细胞内结构域。例如，代表性可溶性受体包括如SEQ ID NO：44和SEQ ID NO：45中所示的CRF2-4(a.k.a.，IL-10RB)(Genbank编号Z17227)的可溶性受体；如SEQ IDNO：46中所示的IL-10RA(Genbank编号U00672和NM_001558)的一个可溶性受体；如SEQ ID NO：47中所示的pDIRSl(a.k.a.，IL-20RB)(Genbank编号AY358305)的一个可溶性受体；如SEQ ID NO：3中所示的IL-22RA(美国专利号5,965,704)的一个可溶性受体。描述已知的I型或II型细胞因子受体序列包含细胞外细胞因子结合结构域的序列，无跨膜结构域和细胞内结构域，完全在本领域技术人员的水平之内。此外，本领域技术人员可使用遗传密码子容易地确定编码这些可溶性受体多肽的多核苷酸。

术语“分泌信号序列”是指编码这样的肽(“分泌肽”)的DNA序列，该肽，作为更大的多肽的组成部分，指导该更大的多肽通过合成其的细胞的分泌途径。在通过分泌途径的运输过程中，一般切断更大的肽以除去分泌肽。

“分离的多肽”是这样的多肽，即其基本上不含在天然状态下和该多肽结合的污染性细胞组分例如糖、脂质或其他蛋白性质的杂质。一般地，分离的多肽的制剂包含以高度纯化的形式即至少大约80％的纯度、至少大约90％的纯度、至少大约95％的纯度、高于95％的纯度例如96％、97％或98％或更高的纯度或高于99％的纯度的该多肽。显示特定蛋白制剂包含分离的多肽的一个方法是通过蛋白制剂的十二烷基硫酸钠(SDS)-聚丙烯酰胺凝胶电泳和凝胶的考马斯亮蓝染色后，显现出单一的条带来进行显示。然而，术语“分离的”不排除相同的多肽以可选择的物理形式例如二聚体或可选择地糖基化或衍生形式存在。

此处使用术语“氨基端”和“羧基端”表示多肽中的位置。在上下文允许的情况下，使用这些关于多肽的特定序列或部分的术语表示临近或相对的位置。例如，多肽内的某些位于参照序列的羧基端的序列位于临近参照序列的羧基末端，但不必在全长多肽的羧基末端。

术语“表达”是指基因产物的生物合成。例如，在结构基因的情况下，表达包括将结构基因转录成mRNA和将mRNA翻译成一种或多种多肽。

此处使用术语“剪接变体”表示从基因转录的RNA的可变形式。剪接变异通过使用转录的RNA分子内的可变剪接位点天然地产生，或其较不普遍地产生于分开转录的RNA分子之间，其可产生转录自相同基因的几种mRNA。剪接变体可编码具有改变的氨基酸序列的多肽。此处也使用术语剪接变体表示由转录自基因的mRNA的剪接变体编码的多肽。

如此处所用的，术语“免疫调节剂”包括细胞因子、干细胞生长因子、淋巴毒素、共刺激分子、造血因子等、和这些分子的合成的类似物。

术语“互补/反互补对(complement/anti-complement pair)”是指在合适的条件下形成非共价结合的稳定配对的不相同的部分。例如，生物素和抗生物素蛋白(或链霉抗生物素蛋白)是互补/反互补对的原型成员。其他互补/反互补对包括受体/配体对、抗体/抗原(或半抗原或表位)对、有义/反义多核苷酸对等。在想要随后分离互补/反互补对的情况下，互补/反互补对优选地具有低于109M^-1的结合亲和力。

“抗独特型抗体”是和免疫球蛋白的可变区结构域结合的抗体。在本说明书中，抗独特型抗体和抗-IL-22RA抗体的可变区结合，从而，抗独特型抗体模拟了IL-22RA的表位。

“抗体片段”是抗体的部分例如F(ab′)₂、F(ab)₂、Fab′、Fab等。无论怎样的结构，抗体片段和被该完整的抗体识别的相同抗原结合。例如，抗-IL-22RA单克隆抗体片段结合IL-22RA的表位。

术语“抗体片段”也包括结合特定抗原的合成的或经基因工程改造的多肽，例如由轻链可变区构成的多肽、由重链和轻链可变区构成的“Fv”片段、其中轻链和重链可变区通过肽连接体连接的重组单链多肽分子(“scFv蛋白”)和由模拟高变区的氨基酸残基构成的最小识别单位。

“嵌合抗体”是这样的重组蛋白，该重组蛋白包含来自啮齿类抗体的可变结构域和互补决定区，同时抗体的剩余部分来源于人抗体。

“人源化抗体”是这样的重组蛋白，在该重组蛋白中，单克隆抗体的鼠类互补决定区已从鼠类免疫球蛋白的重链和轻链可变区转移入人可变结构域。这样的人源化抗体的构建在本领域技术人员的技术范围之内，所述人源化抗体是衍生自鼠类抗体、在人中用于治疗用途的抗体，例如结合或中和人蛋白的抗体。

如此处所用的，“治疗剂”是被缀合至抗体部分以产生用于治疗的缀合物的分子或原子。治疗剂的示例包括药物、毒素、免疫调节剂、螯合剂、硼化合物、光活化剂或染料以及放射性同位素。

“可检测的标记物”是可被缀合至抗体部分以产生用于诊断的分子的分子或原子。可检测的标记物的示例包括螯合剂、光活化剂、放射性同位素、荧光剂、顺磁性离子或其他标志物部分。

术语“亲和标签”此处用于表示可附着至第二多肽以提供第二多肽的纯化或检测或提供第二多肽附着至基质的位点的多肽片段。原则上，可将可获得其抗体或其他特异性结合剂的任何多肽或蛋白用作亲和标签。亲和标签包括多组氨酸片段、A蛋白(Nilsson等人，EMBO J.4：1075(1985)；Nilsson等人，Methods Enzymol.198：3(1991))、谷胱苷肽S转移酶(Smith和Johnson，Gene 67：31(1988))、Glu-Glu亲和标签(Grussenmeyer等人，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 82：7952(1985))、P物质、FLAG肽(Hopp等人，Biotechnology 6：1204(1988))、链霉抗生物素结合肽或其他抗原表位或结合结构域。一般参见，Ford等人，Protein Expression and Purification 2：95(1991)。可从提供商(例如，Pharmacia Biotech，Piscataway，NJ)商购获得编码亲和标签的DNA分子。

“裸露抗体”是完整的抗体，和抗体片段相反，其不与治疗剂缀合。裸露抗体包括多克隆抗体和单克隆抗体，以及某些重组抗体例如嵌合抗体和人源化抗体。

如此处所用的，术语“抗体组分”包括完整的抗体和抗体片段。

“免疫交联物”是交联抗体组分的治疗剂或可检测标记物。

如此处所用的，术语“抗体融合蛋白”是指包含抗体组分和IL-22RA多肽组分的重组分子。抗体融合蛋白的示例包括包含IL-22RA细胞外结构域和Fc结构域或抗原结合区的蛋白。

“靶多肽”或“靶肽”是这样的氨基酸序列，该氨基酸序列包含至少一个表位并在靶细胞例如肿瘤细胞或携带感染剂抗原的细胞上表达。T细胞识别由主要组织相容性复合物分子呈递的靶多肽或靶肽的肽表位和一般裂解靶细胞或将其他免疫细胞招募至靶细胞的位置，从而杀死靶细胞。

“抗原肽”是这样的肽，该肽结合主要组织相容性复合物分子以形成被T细胞识别的MHC-肽复合物，从而在呈递至T细胞后诱导细胞毒性淋巴细胞应答。因此，抗原肽能够结合合适的主要组织相容性复合物分子和诱导细胞毒性T细胞应答，例如细胞裂解或抗靶细胞(其结合或表达该抗原)的特异性细胞因子释放。可将抗原肽结合在抗原呈递细胞或靶细胞上的I类或II类主要组织相容性复合物分子。

在真核生物中，RNA聚合酶II催化结构基因的转录，产生mRNA。可设计核酸分子使之包含这样的RNA聚合酶II的模板，在该模板中RNA转录物具有和特定的mRNA的序列互补的序列。所述RNA转录本被称为“反义RNA”，编码反义RNA的核酸分子被称为“反义基因”。反义RNA分子能够结合mRNA分子，导致mRNA翻译的抑制。

“对IL-22RA特异性的反义寡核苷酸”或“IL-22RA反义寡核苷酸”是这样的寡核苷酸，该寡核苷酸具有(a)能够和IL-22RA基因的部分形成稳定的三链体的序列，或(b)能够和IL-22RA基因的mRNA转录物的部分形成稳定的双链体的序列。

“核酶”是包含催化中心的核酸分子。该术语包括RNA酶、自我拼接RNAs、自我切割RNA和进行这些催化功能的核酸分子。编码核酶的核酸分子被称为“核酶基因”。

“外在引导序列(external guide sequence)”是这样的核酸分子，该分子指导内源核酶，RN酶P至特定种类的细胞内mRNA，导致通过RN酶P产生的mRNA的断裂。编码外在引导序列的核酸分子被称为“外在引导序列基因”。

术语“变体IL-22RA基因”是指编码具有这样的氨基酸序列的多肽的核酸分子，该序列是SEQ ID NO：3的变体。这些变体包括天然发生的IL-22RA基因的多态性，和包含SEQ ID NO：3的氨基酸序列的保守性氨基酸替代的合成的基因。IL-22RA基因的其他变体形式是包含此处描述的核苷酸序列的插入或缺失的核酸分子。变体IL-22RA基因可通过例如在严紧条件下，确定该基因是否和具有SEQ ID NO：1或其互补序列杂交来进行鉴定。

可选择地，可通过序列比较来鉴定变体IL-22RA基因。当就最大对应性进行比对时，如果两个氨基酸序列的氨基酸残基相同，那么这两个氨基酸序列具有“100％氨基酸序列同一性”。类似地，当就最大对应性进行比对时，如果两个核苷酸序列的核苷酸残基相同，那么这两个核苷酸序列具有“100％的核苷酸序列同一性”。可使用标准软件程序，例如由DNASTAR(Madison，Wisconsin)生产的LASERGENE生物信息学计算套件中包含的程序，进行序列比较。用于通过确定最优比对来比较两个核苷酸或氨基酸序列的其他方法对于本领域技术人员来说是熟悉的(参见，例如，Peruski和Peruski，The Internet and theNew Biology：Tools for Genomic and Molecular Research(ASM Press，Inc.1997)，Wu等人(eds.)，“Information Superhighway andComputer Databases of Nucleic Acids and Proteins，”in Methodsin Gene Biotechnology，pages 123-151(CRC Press，Inc.1997)，和Bishop(ed.)，Guide to Human Genome Computing，第2版(Academic Press，Inc.1998))。

下面描述用于确定序列同一性的特定方法。不管用于鉴定变体IL-22RA基因或变体IL-22RA多肽的特定方法如何，可功能性地表征变体基因或由变体基因编码的多肽特异性结合抗IL-22RA抗体的能力。也可通过使用此处描述的生物学或生物化学测定法功能性地表征变体IL-22RA基因或变体IL-22RA多肽结合其配体例如IL-22的能力。

此处所用的术语“等位变体”是指占据相同染色体基因座的基因的两种或更多种可选择形式的任一形式。等位变异天然地通过突变产生，其可导致群体内的表型多态性。基因突变可以是沉默的(在编码的多肽上无变化)或可以编码具有改变的氨基酸序列的多肽。此处也使用术语等位变体表示由基因的等位变体编码的蛋白。

术语“直系同源物(orthologs)”是指从一个物种获得的这样的多肽或蛋白，所述多肽或蛋白是来自不同物种的多肽或蛋白的功能性对应物。直系同源物中的序列差异是物种形成的结果。

“旁系同源物(Paralogs)”是由生物产生的不同的但结构相关的蛋白。据认为旁系同源物是通过基因复制产生的。例如，α-球蛋白、β-球蛋白和肌红蛋白是相互的旁系同源物。

本发明包括IL-22RA基因的功能性片段。在本发明的说明书中，IL-22RA基因的“功能性片段”是指编码IL-22RA多肽的部分的核酸分子，该多肽的部分是此处描述的结构域或至少特异性地结合抗-IL-22RA抗体。

由于标准分析方法的不精确性的原因，聚合物的分子量和长度理解为近似值。当该值表达为“大约”X或“近似”X时，所述的X的值被理解为精确到±10％。

3.IL-22RA多核苷酸或基因的产生

可通过使用基于SEQ ID NO：1的多核苷酸探针筛选人cDNA或基因组文库来获得编码人IL-22RA基因的核酸分子。这些技术是标准的和已建立好的，可使用购自商业提供者的克隆试剂盒进行这些技术。参见，例如，Ausubel等人(eds.)，Short Protocols in MolecularBiology，第3版，John Wiley和Sons 1995；Wu等人，Methods in GeneBiotechnology，CRC Press，Inc.1997；Aviv和Leder，Proc.Nat’l Acad.Sci.USA 69：1408(1972)；Huynh等人，“Constructing andScreening cDNA Libraries in λgt10 and λgt11，”in DNA Cloning：A Practical Approach Vol.I，Glover(ed.)，page 49(IRL Press，1985)；Wu(1997)at pages 47-52。

也可使用聚合酶链式反应(PCR)和这样的寡核苷酸引物获得编码人IL-22RA基因的核酸分子，所述寡核苷酸引物具有基于IL-22RA基因或cDNA的核苷酸序列的核苷酸序列。用PCR筛选库的常用方法来自，例如，Yu等人，“Use of the Polymerase Chain Reaction to ScreenPhage Libraries，”in Methods in Molecular Biology，第15卷：PCRProtocols：Current Methods and Applications，White(ed.)，Humana Press，Inc.，1993。此外，用PCR分离相关基因的技术被描述于，例如，Preston，“Use of Degenerate Oligonucleotide Primersand the Polymerase Chain Reaction to Clone Gene Family Members，”in Methods in Molecular Biology，第15卷：PCR Protocols：Current Methods and Applications，White(ed.)，Humana Press，Inc.1993。作为另一选择，可通过使用交互引物(mutually priming)长寡核苷酸和此处描述的(参见，例如Ausubel(1995))核苷酸序列合成核酸分子来获得IL-22RA基因。使用聚合酶链式反应的已建立的技术提供了合成长度至少为2千碱基的DNA分子的能力(Adang等人，Plant Molec.Biol.21：1131(1993)，Bambot等人，PCR Methods andApplications 2：266(1993)，Dillon等人，“Use of the PolymeraseChain Reaction for the Rapid Construction of Synthetic Genes，”in Methods in Molecular Biology，第15卷：PCR Protocols：Current Methods and Applications，White(ed.)，pages 263-268，(Humana Press，Inc.1993)，和Holowachuk等人，PCR Methods Appl.4：299(1995))。关于多核苷酸合成的综述，参见，例如，Glick和Pasternak，Molecular Biotechnology，Principles andApplications of Recombinant DNA(ASM Press 1994)，Itakura等人，Annu.Rev.Biochem.53：323(1984)，和Climie等人，Proc.Nat′l Acad.Sci.USA 87：633(1990)。

4.IL-22RA基因变体的产生

本发明提供了编码此处公开的IL-22RA多肽的多种核酸分子，包括DNA和RNA分子。本领域技术人员容易地认识到，考虑到遗传密码的简并性，在这些多核苷酸分子中可能存在相当多的序列变化。此外，本发明也提供了分离的可溶性单体、同型二聚体、异二聚体和多聚体受体多肽，所述受体多肽包含至少一个和SEQ ID NO：3的受体多肽基本上同源的IL-22RA受体亚基。因此，本发明涉及包含SEQ ID NO：1的简并核苷酸的IL-22RA多肽编码性核酸分子和其RNA等同物。

表1列出了单字母密码以表示简并核苷酸的位置。“方案”是由密码字母表示的核苷酸。“互补物”表示互补核苷酸的密码。例如，密码Y表示C或T，其互补物R表示A或G，A对于T是互补的，G对于C是互补的。

表1

核苷酸	方案	互补物	方案
				A	A	T	T
C	C	G	G
				G	G	C	C

T	T	A	A
				R	A|G	Y	C|T
Y	C|T	R	A|G
				M	A|C	K	G|T
K	G|T	M	A|C
				S	C|G	S	C|G
W	A|T	W	A|T
				H	A|C|T	D	A|G|T
B	C|G|T	V	A|C|G
				V	A|C|G	B	C|G|T
D	A|G|T	H	A|C|T
				N	A|C|G|T	N	A|C|G|T

简并密码子，包括给定的氨基酸的所有可能的密码子，列于表2。

表2

氨基酸	单字母代码	密码子	简并密码子
				Cys	C	TGC TGT	TGY
Ser	S	AGC AGT TCA TCC TCG TCT	WSN
				Thr	T	ACA ACC ACG ACT	ACN
Pro	P	CCA CCC CCG CCT	CCN
				Ala	A	GCA GCC GCG GCT	GCN
Gly	G	GGA GGC GGG GGT	GGN
				Asn	N	AAC AAT	AAY
Asp	D	GAC GAT	GAY
				Glu	E	GAA GAG	GAR
Gln	Q	CAA CAG	CAR
				His	H	CAC CAT	CAY
Arg	R	AGA AGG CGA CGC CGG CGT	MGN
				Lys	K	AAA AAG	AAR
Met	M	ATG	ATG
				Ile	I	ATA ATC ATT	ATH

Leu	L	CTA CTC CTG CTT TTA TTG	YTN
				Val	V	GTA GTC GTG GTT	GTN
Phe	F	TTC TTT	TTY
				Tyr	Y	TAC TAT	TAY
Trp	W	TGG	TGG
				Ter	.	TAA TAG TGA	TRR
Asn|Asp	B		RAY
				Glu|Gln	Z		SAR
Any	X		NNN

本领域技术人员将认识到，在确定简并密码子(其代表了编码氨基酸的所有可能的密码子)中引入了不确定性。例如，丝氨酸的简并密码子(WSN)，在一些情况下，可编码精氨酸(AGR)，精氨酸的简并密码子(MGN)，在一些情况下，可编码丝氨酸(AGY)。类似的关系存在于编码苯丙氨酸和亮氨酸的密码子之间。因此，由简并序列包含的一些多核苷酸可编码变体氨基酸序列，但本领域技术人员通过参考SEQID NO：3的氨基酸序列可容易地鉴定这些变体序列。可按此处的描述容易地对变体序列进行功能性检测。

不同的物种可展示“偏爱密码子使用(preferential codonusage)”。一般参见，Grantham等人，Nucl.Acids Res.8：1893(1980)，Haas等人Curr.Biol.6：315(1996)，Wain-Hobs on等人，Gene13：355(1981)，Grosjean和Fiers，Gene 18：199(1982)，Holm，Nuc.Acids Res.14：3075(1986)，Ikemura，J.Mol.Biol.158：573(1982)，Sharp和Matassi，Curr.Opin.Genet.Dev.4：851(1994)，Kane，Curr.Opin.Biotechnol.6：494(1995)，和Makrides，Microbiol.Rev.60：512(1996)。如此处所用的，术语“偏爱密码子使用”或“偏爱密码子”是本领域的术语，其是指在某些物种的细胞中最频繁使用的蛋白翻译密码子，从而偏向使用编码各氨基酸的可能的密码子(参见表2)中的一个或少数几个代表。例如，氨基酸苏氨酸(Thr)可由ACA、ACC、ACG或ACT编码，但在哺乳动物细胞中ACC是最常使用的密码子；在其他物种中，例如，昆虫细胞、酵母、病毒或细菌中，不同的Thr密码子是优选的。可通过本领域中已知的各种方法将特定物种的偏爱密码子导入本发明的多核苷酸中。将偏爱密码子序列导入重组DNA可以，例如，通过使蛋白在特定的细胞类型或物种中更有效地翻译来增加蛋白的生产。因此，此处公开的简并密码子序列用作这样的模板，该模板用于在本领域内普遍使用的和此处公开的各种细胞类型和物种中多核苷酸的最优化表达。在不同物种中进行表达可以检验和优化包含偏爱密码子的序列，并按此处公开对其进行功能性检验。

可通过各种方法，例如通过使用完整的或部分的人cDNA或用基于公开的序列的一组或多组简并探针进行探测来分离编码IL-22RA的cDNA。也可使用聚合酶链式反应和根据此处公开的代表性人IL-22RA序列设计的引物来克隆cDNA。此外，可使用cDNA文库转化或转染宿主细胞，可用抗IL-22RA多肽的抗体检测目的cDNA的表达。

本领域技术人员认识到，SEQ ID NO：1中公开的序列代表人IL-22RA的单个等位基因，认识到预期发生其等位变异和可变剪接。可按照标准的方法通过探测来自不同的个体的cDNA或基因组文库来克隆该序列的等位基因变体。此处公开的核苷酸序列的等位变体，包括包含沉默突变的变体和其中突变导致氨基酸序列改变的变体，在本发明的范围之内，作为此处公开的氨基酸序列的等位变体的蛋白也在本发明的范围之内。从可变剪接的mRNA产生的、保持IL-22RA多肽的性质的cDNA分子包含在本发明的范围之内，由该cDNA和mRNA编码的多肽也在本发明的范围之内。可按照本领域已知的标准方法，通过探测来自不同个体或组织的cDNA或基因组文库来克隆这些序列的等位变体和剪接变体。

通过使用上述方法，本领域的普通技术人员可制备各种包含可溶性IL-22RA受体亚基的多肽，所述多肽和SEQ ID NO：1的氨基酸基本上同源，或编码SEQ ID NO：3的氨基酸或其等位变体并保持野生型IL-22RA受体的配体结合特性。这些多肽也可以包括此处一般公开的其他的多肽区段。

在本发明的某些实施方案中，在严紧条件下，分离的核酸分子可和包含此处公开的核酸序列互补。例如，这些核酸分子可在严紧条件下和包含SEQ ID NO：1的核苷酸序列的核酸分子或和包含与SEQ IDNO：1互补的核苷酸序列的核酸分子或其片段杂交。

一般地，选择严紧条件，使其在确定的离子强度和pH下比特定序列的热解链点(thermal melting point)(T_m)低大约5℃。T_m是这样的温度，在该温度下，(在确定的离子强度和pH下)50％的靶序列和完全匹配的探针杂交。杂交后，可在严紧条件下或在高度严紧条件下洗涤核酸分子以除去非杂交核酸分子。参见，例如，Sambrook等人，Molecular Cloning：A Laboratory Manual，第2版(Cold SpringHarbor Press 1989)；Ausubel等人，(eds.)，Current Protocols inMolecular Biology(John Wiley and Sons，Inc.1987)；Berger和Kimmel(eds.)，Guide to Molecular Cloning Techniques，(Academic Press，Inc.1987)；和We tmur，Crit.Rev.Biochem.Mol.Biol.26：227(1990))。序列分析软件例如OLIGO 6.0(LSR；Long Lake，MN)和Primer Premier 4.0(Premier Biosoft International；PaloAlto，CA)，以及存在于因特网上的软件，都是可获得的用于基于用户定义的标准分析给定的序列和计算T_m的工具。采用杂交和洗涤条件以使之适合用于特定多核苷酸的杂交在本领域技术人员的能力范围之内。

本发明也提供了这样的分离的IL-22RA多肽，该肽和SEQ ID NO：3的多肽或其直系同源物具有基本上相似的序列同一性。此处使用的术语“基本上相似的序列同一性”是指多肽和SEQ ID NO：3显示的序列或其直向同源物具有至少70％、至少80％、至少90％、至少95％例如96％、97％、98％或高于95％的序列同一性。例如，可使用变体和直系同源IL-22RA受体产生针对人IL-22RA的免疫应答和交叉反应性抗体。可按此处所描述对这些抗体进行人源化和修饰，将其治疗性地用于治疗牛皮癣、牛皮癣性关节炎、IBD、结肠炎、内毒素血症以及此处描述的其他治疗性应用。

本发明也涉及这样的IL-22RA变体核酸分子，可使用2个标准来鉴定该变体核酸分子：编码的多肽和SEQ ID NO：3的氨基酸序列之间的相似性的确定，和杂交测定法。这些IL-22RA变体包括这样的核酸分子，即(1)在这样的严紧洗涤条件下保持和具有SEQ ID NO：1的核苷酸序列(或其互补链)的核酸分子杂交的核酸分子，在所述严紧洗涤条件下，洗涤严紧度为55-65℃下的含0.1％SDS的0.5x-2x SSC，和(2)编码和SEQ ID NO：3的氨基酸序列具有至少70％、至少80％、至少90％、至少95％或高于95％例如96％、97％、98％或99％的序列同一性的核酸分子。可选择地，可将IL-22RA变体表征为这样的核酸，即(1)在这样的高度严紧洗涤条件下保持和具有SEQ ID NO：1的核苷酸序列(或其互补链)的核酸分子杂交的核酸分子，在所述高度严紧洗涤条件中，洗涤严紧度为50-65℃下的含0.1％SDS的0.1x-0.2x SSC，和(2)编码和SEQ ID NO：3的氨基酸序列具有至少70％、至少80％、至少90％、至少95％或高于95％例如96％、97％、98％或99％或更高的序列同一性的多肽。

通过常规方法确定百分比序列同一性。参见，例如，Altschul等人，Bull.Math.Bio.48：603(1986)，和Henikoff和Henikoff，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 89：10915(1992)。简而言之，通过使用值为10的缺口开放罚分、值为1的缺口延伸罚分和表3(氨基酸以标准的单字母代码标示)中所示的Henikoff和Henikoff(同上)“BLOSUM62”评分矩阵，排列2个氨基酸序列以最优化比对评分。然后将百分比同一性计算为：([相同匹配的总数]/[较长序列的长度加上引入至较长序列以比对2个序列的缺口的数目])(100)。

表3

   A   R   N   D   C   Q   E   G   H   I   L   K   M   F   P   S   T   W   Y   V

A  4

R  -1  5

N  -2  0   6

D  -2  -2  1   6

C  0   -3  -3  -3  9

Q  -1  1   0   0   -3  5

E  -1  0   0   2   -4  2   5

G  0   -2  0   -1  -3  -2  -2  6

H  -2  0   1   -1  -3  0   0   -2  8

I  -1  -3  -3  -3  -1  -3  -3  -4  -3  4

L  -1  -2  -3  -4  -1  -2  -3  -4  -3  2   4

K  -1  2   0   -1  -3  1   1   -2  -1  -3  -2  5

M  -1  -1  -2  -3  -1  0   -2  -3  -2  1   2   -1  5

F  -2  -3  -3  -3  -2  -3  -3  -3  -1  0   0   -3  0   6

P  -1  -2  -2  -1  -3  -1  -1  -2  -2  -3  -3  -3  -2  -4  7

S  1   -1  1   0   -1  0   0   0   -1  -2  -2  0   -1  -2  -1  4

W  -3  -3  -4  -4  -2  -2  -3  -2  -2  -3  -2  -3  -1  1   -4  -3  -2  11

Y  -2  -2  -2  -3  -2  -1  -2  -3  2   -1  -1  -2  -1  3   -3  -2  -2  2   7

V  0   -3  -3  -3  -1  -2  -2  -3  -3  3   1   -2  1   -1  -2  -2  0   -3  -1  4

本领域技术人员知道存在许多可获得的用于比对两个氨基酸序列的已建立的算法。Pearson和Lipman的“FASTA”相似性搜索算法是用于检查此处公开的氨基酸序列和假定的IL-22RA变体的氨基酸序列所共有的相似性水平的合适的蛋白质比对方法。FASTA算法由Pearson和Lipman，Proc.Nat′l Acad.Sci.USA 85：2444(1988)，和Pearson，Meth.Enzymol.183：63(1990)进行描述。简而言之，FASTA首先在不考虑保守性氨基酸替代、插入或缺失的情况下，通过鉴定查询序列(例如，SEQ ID NO：2或SEQ ID NO：3)和测试序列共有的具有最高一致性密度(如果ktup变量＝1)或成对一致性(如果ktup＝2)的区域来表征序列相似性。然后通过使用氨基酸替代矩阵比较所有成对氨基酸的相似性来给具有最高密度的一致性的10个区域重新打分，“修剪”所述区域的末端使之只包含对最高分值有贡献的残基。如果存在几个具有高于“截止”值的评分(基于序列长度和ktup值通过预设的公式计算的)的区域，那么检查经修剪的起始区域以确定是否可连接该区域以形成具有缺口的近似比对。最后，使用考虑氨基酸插入和缺失的Needleman-Wunsch-Seller s算法的修改方案(Needleman和Wunsch，J.Mol.Biol.48：444(1970)；Sellers，SIAM J.Appl.Math.26：787(1974))对两个氨基酸序列的最高评分区域进行比对。FASTA分析的说明性参数是：ktup＝1、缺口开放罚分＝10、缺口延伸罚分＝1、取代矩阵＝BLOSUM62。可通过修改评分矩阵文件(“SMATRIX”)来将这些参数引入FASTA程序中，如在Pearson，Meth.Enzymol.183：63(1990)的附录2中所解释的。

也可利用上面公开的比率，使用FASTA确定核酸分子的序列同一性。对于核苷酸序列的比较，ktup值可在1至6之间，优选地从3至6的范围内变化，最优选地是3，如上所述设置其他参数。

本发明包括编码这样的多肽的核酸分子，该多肽和此处公开的氨基酸序列相比具有保守性氨基酸改变。例如，可获得包含SEQ ID NO：3的一个或多个氨基酸替代的变体，在该变体中，烷基氨基酸在IL-22RA氨基酸序列中替代烷基氨基酸，芳香族氨基酸在IL-22RA氨基酸序列中替代芳香族氨基酸，含硫氨基酸在IL-22RA氨基酸序列中替代含硫氨基酸，包含羟基的氨基酸在IL-22RA氨基酸序列中替代包含羟基的氨基酸，酸性氨基酸在IL-22RA氨基酸序列中替代酸性氨基酸，碱性氨基酸在IL-22RA氨基酸序列中替代碱性氨基酸，二元单羧基氨基酸(dibasic monocarboxylic amino acid)在IL-22RA氨基酸序列中替代二元单羧基氨基酸。在普通氨基酸中，例如，通过下列组中的各组内的氨基酸之间的替代来举例说明“保守性氨基酸替代”：(1)甘氨酸、丙氨酸、缬氨酸、亮氨酸和异亮氨酸，(2)苯丙氨酸、酪氨酸和色氨酸，(3)丝氨酸和苏氨酸，(4)天冬氨酸和谷氨酸，(5)谷氨酰胺和天冬酰胺，和(6)赖氨酸、精氨酸和组氨酸。BLOSUM62表是氨基酸取代矩阵，其产生自代表超过500组关联蛋白的高度保守区域的蛋白序列区段的大约2,000个局部多重比对(Henikoff和Henikoff，Proc.Nat′l Acad.Sci.USA 89：10915(1992))。因此，可使用BLOSUM62取代频率定义可被引入本发明的氨基酸序列的保守性氨基酸替代。尽管可能只基于化学性质(如上所述的性质)设计氨基酸替代，但术语“保守性氨基酸替代”优选地是指由大于-1的BLOSUM62值代表的替代。例如，如果替代的特征在于为0、1、2或3的BLOSUM62值，那么该氨基酸替代是保守的。根据该系统，优选的保守性氨基酸替代的特征在于至少为1(例如，1、2或3)的BLOSUM62值，更优选的保守性氨基酸替代的特征在于至少为2(例如2或3)的BLOSUM62值。IL-22RA的特定的变体的特征在于其和对应的氨基酸序列(例如，SEQ ID NO：3)具有至少70％、至少80％、至少90％、至少95％或高于95％例如96％、97％、98％或99％或更高的序列同一性，其中氨基酸序列上的变异是由于一个或多个保守性氨基酸替代造成的。

可通过例如用核苷酸替代SEQ ID NO：1中列举的核苷酸来在IL-22RA基因中引入保守性氨基酸变换。可通过寡核苷酸指导的诱变、接头分区诱变、使用聚合酶链式反应的诱变等(参见Ausubel(1995)；和McPherson(ed.)，Directed Mutagenesis：A Practical Approach(IRL Press 1991))来获得这些“保守性氨基酸”变体。可就特异性地结合抗IL-22RA抗体的能力鉴定变体IL-22RA多肽。

本发明的蛋白也可包含非天然发生的氨基酸残基。非天然发生的氨基酸残基包括，但不限于，反式-3-甲基脯氨酸、2，4-甲醇基脯氨酸、顺式-4-羟脯氨酸、反式-4-羟脯氨酸、N-甲基甘氨酸、别苏氨酸、甲基苏氨酸、羟乙基半胱氨酸、羟乙基高半胱氨酸、硝基谷氨酰胺、高谷氨酰胺(homoglutamine)、哌可酸、噻唑烷羧酸、脱氢脯氨酸、3-和4-甲基脯氨酸、3，3-二甲脯氨酸、叔-亮氨酸、正缬氨酸、2-氮杂苯丙氨酸、3-氮杂苯丙氨酸、4-氮杂苯丙氨酸和4-氟苯丙氨酸。用于将非天然发生的氨基酸残基整合入蛋白的几种方法在本领域是已知的。例如，可使用其中使用经化学方法氨基酰化的抑制型tRNA抑制无义突变的体外系统。用于合成氨基酸和氨基酰化的tRNA的方法在本领域是已知的。一般在包含大肠杆菌(E.coli)S30提取物和可商购获得的酶和其他试剂的无细胞系统中转录和翻译包含无义突变的质粒。通过层析纯化蛋白。参见，例如Robertson等人，J.Am.Chem.Soc.113：2722(1991)，Ellman等人，Methods Enzymol.202：301(1991)，Chung等人，Science 259：806(1993)，和Chung等人，Proc.Nat’l Acad.Sci.USA 90：10145(1993)。

在第二种方法中，通过显微注射突变的mRNA和化学氨基酰化的抑制型tRNA来在爪蟾卵中进行翻译(Turcatti等人，J.Biol.Chem.271：19991(1996))。在第三种方法中，在要被替代的天然氨基酸(例如，苯丙氨酸)不存在的情况下和在想要的非天然发生的氨基酸(例如，2-氮杂苯丙氨酸、3-氮杂苯丙氨酸、4-氮杂苯丙氨酸或4-氟苯丙氨酸)存在的情况下培养大肠杆菌细胞。将非天然发生的氨基酸整合入蛋白以替代其天然的对应物。参见，Koide等人，Biochem.33：7470(1994)。通过体外化学修饰可将天然发生的氨基酸残基转化成非天然发生的种类。可将化学修饰和定点诱变结合以进一步扩展替代的范围(Wynn和Richards，Protein Sci.2：395(1993))。

可使用有限数目的非保守性氨基酸、非遗传密码子编码的氨基酸、非天然发生的氨基酸和非天然氨基酸替代IL-22RA的氨基酸残基。

可根据本领域已知的方法，例如定点诱变或丙氨酸扫描述诱变(Cunningham和Wells，Science 244：1081(1989)，Bass等人，Proc.Nat′l Acad.Sci.USA 88：4498(1991)，Coombs和Corey，“Site-Directed Mutagenesis and Protein Engineering，”inProteins：Analysis and Design，Angeletti(ed.)，pages 259-311(Academic Press，Inc.1998))鉴定本发明的多肽中的必需氨基酸。在后一种技术中，在分子中的每一个残基上引入单个丙氨酸突变，就生物学活性检测所得的突变分子以鉴定对于该分子的活性是至关重要的氨基酸残基。也参见，Hilton等人，J.Biol.Chem.271：4699(1996)。

尽管可使用序列分析进一步确定IL-22RA的配体结合区域，但也可通过结构(例如通过这些技术如核磁共振、晶体学、电子衍射或光亲和标记，结合假定的接触位点氨基酸的突变确定的结构)的物理分析确定在IL-22RA的结合活性(例如IL-22RA和IL-22配体结合，或和抗IL-22RA抗体的结合)中起作用的氨基酸。参见，例如，de Vos等人，Science 255：306(1992)，Smith等人，J.Mol.Biol.224：899(1992)，和Wlodaver等人，FEBS Lett.309：59(1992)。

可使用已知的诱变和筛选的方法，例如由Reidhaar-Olson和Sauer(Science 241：53(1988))或Bowie和Sauer(Proc.Nat’l Acad.Sci.USA 86：2152(1989))公开的方法产生和检测多个氨基酸替代。简而言之，这些发明者公开了这样的方法，该方法用于同时随机化多肽中的两个或更多个位点，选择功能性多肽，然后测定诱变处理的多肽的序列以确定各位点上的可允许的替代的谱。可使用的其他方法包括噬菌体展示法(例如，Lowman等人，Biochem.30：10832(1991)，Ladner等人，美国专利号5,223,409，Huse，国际公开号WO 92/06204，和局部定点诱变(Derbyshire等人，Gene 46：145(1986)，和Ner等人，DNA 7：127，(1988))。此外，可将生物素或FITC标记的IL-22RA用于IL-22RA配体的表达克隆。

也可由Stemmer，Nature 370：389(1994)，Stemmer，Proc.Nat’l Acad.Sci.USA 91：10747(1994)，和国际公开号WO 97/20078公开的DNA改组产生公开的IL-22RA核苷酸和多肽序列的变体。简而言之，通过亲本DNA的随机片段的体外同源重组，然后使用导致随机引入的点突变的PCR进行重新装配来产生变体DNA分子。可使用亲本DNA分子的家族例如来自不同物种的等位变体或DNA分子来修饰该技术，从而将其他的可变性引入该方法。通过选择想要的突变同时进行抗有害变化的选择来就想要的活性进行选择或筛选，然后再进行另外的重复诱变和检测提供了序列的快速“进化”。

可将此处公开的诱变方法和高通量、自动化的筛选方法结合，以在宿主细胞中检测克隆的、诱变处理的多肽的活性。可使用现代化设备从宿主细胞回收编码生物学活性多肽或结合抗-IL-22RA抗体的多肽的诱变处理的DNA分子并对其进行快速测序。这些方法使得能够快速确定目的多肽中的单个氨基酸的重要性，并可用于未知结构的多肽。

本发明也包括IL-22RA多肽的“功能性片段”和编码这些功能性片段的核酸分子。可进行核酸分子的常规删除分析以获得编码IL-22RA多肽的核酸分子的功能性片段。作为说明，可用Bal31核酸酶降解具有SEQ ID NO：1的核苷酸序列的DNA分子以获得系列嵌套缺失片段。然后将所述片段以符合正确的读框方式插入表达载体，就结合抗IL-22RA抗体的活性分离和检测表达的多肽。外切核酸酶降解的一个替代方案是使用寡核苷酸定位诱变以引入缺失或终止密码子，从而确定想要的片段的产生。可选择地，可使用聚合酶链式反应合成IL-22RA基因的特定片段。

通过已由Horisberger和Di Marco，Pharmac.Ther.66：507(1995)概述的关于在干扰素的任一末端或两个末端截断的研究来举例说明该一般方法。此外，由例如Treuter等人，Molec.Gen.Genet.240：113(1993)，Content等人，“Expression and preliminarydeletion analysis of the 42 kDa 2-5A synthetase induced by humaninterferon，”in Biological Interferon Systems，Proceedings ofISIR-TNO Meeting on Interferon Systems，Cantell(ed.)，pages65-72(Nijhoff 1987)，Herschman，“The EGF Receptor，”inControl of Animal Cell Proliferation，第1卷，Boynton等人，(eds.)pages 169-199(Academic Press 1985)，Coumailleau等人，J.Biol.Chem.270：29270(1995)；Fukunaga等人，J.Biol.Chem.270：25291(1995)；Yamaguchi等人，Biochem.Pharmacol.50：1295(1995)，和Meisel等人，Plant Molec.Biol.30：1(1996)描述用于蛋白的功能性分析的标准技术。

对此处公开的特定序列的分析提供了一组例证性功能性片段，见表4。编码此处所述的附加的人IL-22RA功能性变体结构域的核苷酸(没有示于表4)可以参考SEQ ID NO：1进行确定。这些功能性片段包括例如下述核苷酸序列：SEQ ID NO：1的核苷酸85-381、206-717和SEQ ID NO：1的核苷酸85-717，以及相对应的分别显示于SEQ IDNO：2和SEQ ID NO：3的编码的氨基酸序列。

表4

IL-22RA特征	氨基酸残基(SEQ ID NO：2)	核苷酸(SEQ ID NO：1)
			第一Ig结构域	18-116	85-381
第二Ig结构域	125-228	206-717
			这两个Ig结构域	18-228	85-717

本发明也涉及和此处公开的氨基酸序列相比具有氨基酸改变的IL-22RA基因的功能性片段。如上所述，可通过确定和公开的核苷酸和氨基酸序列的同一性的水平，基于结构来鉴定变体IL-22RA基因。基于结构鉴定变体基因的可选择的方法是确定编码潜在的变体IL-22RA基因的核酸分子是否可与包含核苷酸序列例如SEQ ID NO：1的核酸分子杂交。

本发明也包括使用IL-22RA多肽的功能性片段、抗原表位、IL-22RA多肽的具有表位的部分、和编码这些功能性片段、抗原表位、IL-22RA多肽的具有表位的部分的核酸分子。使用这些片段产生用于产生这样的抗体和结合伴侣的多肽，所述抗体和结合伴侣结合、阻断、抑制、减少、拮抗或中和IL-22或IL-20和IL-22一起的活性。此处定义的“功能性”IL-22RA多肽或其片段的特征在于其阻断、抑制、减少、拮抗或中和IL-20或IL-22的炎症性、增殖性或分化活性的能力，在于其诱导或抑制特化的细胞功能的能力，或在于其特异性结合抗-IL-22RA抗体、细胞、IL-20或IL-22的能力。如此处前面所描述的，IL-22RA的特征在于此处所描述的独特的II型细胞因子受体结构和结构域。因此，本发明还涉及使用这样的融合蛋白，该融合蛋白包含：(a)包含上述的结构域中的一个或多个结构域的多肽分子；和(b)包含这些结构域中的一个或多个结构域的功能性片段。融合蛋白的其他多肽部分可由另一种II型细胞因子受体例如IL-10R、IL-13R、IL-20RA、IL-20RB、IL-10RB(CRF2-4)、IL-22RA2提供，或由有助于融合蛋白分泌的非天然的和/或非关联的分泌信号肽提供。

本发明也提供包含此处描述的IL-22RA多肽的具有表位的部分的多肽片段或肽。这些片段或肽可包含“免疫原表位”，该表位是当将整个蛋白用于免疫时引起抗体反应的蛋白的部分。可使用标准的方法鉴定具有免疫原表位的肽(参见，例如Geysen等人，Proc.Nat，l Acad.Sci.USA 81：3998(1983))。

相反地，多肽片段或肽可包含“抗原表位”，该表位是抗体可特异性结合的蛋白分子的区域。某些表位由氨基酸的线性或连续片段构成，这样的表位的抗原性不会被变性剂破坏。在本领域已知，可使用能模拟蛋白的表位的相对短的合成肽刺激抗该蛋白的抗体的产生(参见，例如，Sutcliffe等人，Science 219：660(1983))。因此，本发明的具有抗原表位的肽、抗原性肽、表位和多肽用于产生和此处描述的多肽结合的抗体以及鉴定和筛选这样的抗-IL-22RA单克隆抗体，该单克隆抗体是中和性的，其可结合、阻断、抑制、减少、拮抗或中和IL-22和IL-20(单独地或一起地)的活性。本发明的这些中和单克隆抗体可结合IL-22RA抗原表位。可使用Hopp/Woods亲水性分布图确定SEQ ID NO：3的最具抗原性潜能的区域(Hopp等人，Proc.Natl. Acad.Sci.78：3824-3828，1981；Hopp，J.Immun.Meth.88：1-18，1986和Triquier等人，Protein Engineering 11：153-169，1998)。该图基于滑动六残基窗口(sliding six-residue window)。忽略埋藏的G、S和T残基以及暴露的H、Y和W残基。在IL-22RA中，可通过本领域技术人员确定这些区域。此外，SEQ ID NO：3中的IL-22RA抗原表位，如使用例如DNASTAR Protean程序(DNASTAR，Inc.，Madison，WI)进行Jameson-Wolf作图预测的表位，用作优选的抗原表位，其可通过本领域技术人员进行确定。这些抗原表位包括(1)SEQ IDNO：3的氨基酸残基1(脯氨酸)至6(天冬氨酸)；(2)SEQ ID NO：3的氨基酸残基26(丝氨酸)至32(脯氨酸)；(3)SEQ ID NO：3的氨基酸残基41(赖氨酸)至47(天冬氨酸)；(4)SEQ ID NO：3的氨基酸残基49(缬氨酸)至62(半胱氨酸)；(5)SEQ ID NO：3的氨基酸残基41(赖氨酸)至62(半胱氨酸)；(6)SEQ ID NO：3的氨基酸残基84(丙氨酸)至97(丝氨酸)；(7)SEQ ID NO：3的氨基酸残基103(苏氨酸)至108(天冬氨酸)；(8)SEQ ID NO：3的氨基酸残基130(精氨酸)至135(组氨酸)；(9)SEQ ID NO：3的氨基酸残基164(甘氨酸)至166(赖氨酸)；(10)SEQ ID NO：3的氨基酸残基175(酪氨酸)至179(谷氨酸)；(11)SEQ ID NO：3的氨基酸残基193(赖氨酸)至196(丙氨酸)；(12)SEQ ID NO：3的氨基酸残基203(赖氨酸)至209(苏氨酸)。另外的表位包括如下肽，有可能用CnBr切割非还原的全长人IL-22RA得到：肽6(SEQ IDNO：56)、肽7(SEQ ID NO：57)肽8(SEQ ID NO：58)；肽9(SEQ IDNO：59)；肽10(SEQ ID NO：60)；和肽11(SEQ ID NO：61)。半胱氨酸形成二硫键，导致肽7(SEQ ID NO：57)和10(SEQ ID NO：60)有可能发生交联。特别是，SEQ ID NO：56对应于SEQ ID NO：3的氨基酸残基1(脯氨酸)至92(蛋氨酸)，SEQ ID NO：57对应于SEQ ID NO：3的氨基酸残基93(苏氨酸)至120(蛋氨酸)，SEQ ID NO：58对应于SEQ ID NO：3的氨基酸残基121(赖氨酸)至160(蛋氨酸)，SEQ IDNO：59对应于SEQ ID NO：3的氨基酸残基161(组氨酸)至185(蛋氨酸)，SEQ ID NO：60对应于SEQ ID NO：3的氨基酸残基186(异亮氨酸)至199(蛋氨酸)，SEQ ID NO：61对应于SEQ ID NO：3的氨基酸残基200(半胱氨酸)至211(苏氨酸)。另外，SEQ ID NO：2(以及SEQ ID NO：3的相应残基)的残基对配体-受体结合很重要，包括SEQID NO：2的酪氨酸-60，苯丙氨酸-164，酪氨酸-93，精氨酸-112，赖氨酸-210，和谷氨酸-211和(SEQ ID NO：3的相应残基)。另外，SEQ IDNO：2的主要残基(和SEQ ID NO：3的相应残基)对配体-受体直接结合重要，包括SEQ ID NO：2的酪氨酸-60，和苯丙氨酸-164(和SEQ IDNO：3的相应残基)，并且次级残基包括残基包括SEQ ID NO：2的酪氨酸-93、精氨酸-112、赖氨酸-210、和谷氨酸-211(和SEQ ID NO：3的相应残基)。在优选的实例中，本发明的中和抗体结合的抗原表位将包括SEQ ID NO：2的残基(和SEQ ID NO：3的相应残基)，这些残基对配体-受体结合很重要，例如，IL-22RA和IL-20或IL-22(分别或一起)。

具有抗原表位的肽和多肽可包含此处公开的氨基酸序列的至少4至10个氨基酸、至少10至15个氨基酸或大约15至大约30个氨基酸。如此处所描述的，可通过使IL-22RA片段化或通过化学肽合成产生这些具有表位的肽和多肽。此外，可通过随机肽文库的噬菌体展示选择表位(参见，例如，Lane和Stephen，Curr.Opin.Immunol.5：268(1993)，和Cortese等人，Curr.Opin.Biotechnol.7：616(1996))。由例如，Mole，“Epitope Mapping，”in Methods in MolecularBiology，第10卷，Manson(ed.)，pages 105-116(The Humana Press，Inc.1992)，Price，“Production and Characterization ofSynthetic Peptide-Derived Antibodies，”in MonoclonalAntibodies：Production，Engineering，and Clinical Application，Ritter和Ladyman(eds.)，pages 60-84(Cambridge UniversityPress 1995)，和Coligan等人(eds.)，Current Protocols inImmunology，pages 9.3.1-9.3.5和pages 9.4.1-9.4.11(John Wiley& Sons 1997)描述用于鉴定表位和从包含表位的小肽产生抗体的标准方法。

对于任何IL-22RA多肽，包括变体和融合蛋白，通过使用上面的表1和表2中所示的信息，本领域技术人员可容易地产生编码该变体的完全简并多核苷酸序列。此外，本领域技术人员可使用标准软件，基于此处描述的核苷酸和氨基酸序列设计IL-22RA变体。

5.IL-22RA多肽的产生

可在进行常规的技术之后，在重组宿主细胞中产生本发明的多肽，包括全长多肽、可溶性单体、同型二聚体、异二聚体和多聚体受体；全长受体；受体片段(例如，配体结合片段和抗原表位)、功能性片段和融合蛋白。为表达IL-22RA基因，必须将编码多肽的核酸分子有效地连接至在表达载体中控制转录表达的调控序列，然后将其导入宿主细胞。除了转录调控序列例如启动子和增强子外，表达载体可包含翻译调控序列和适合用于筛选具有表达载体的细胞的标记基因。

适合用于在真核细胞中生产外源蛋白的表达载体一般包含(1)原核DNA元件，所述元件编码细菌复制起点和抗生素抗性标记物，从而提供生长和在细菌宿主中选择表达载体；(2)控制转录起始的真核DNA元件，例如启动子，和(3)控制转录本的加工的DNA元件，例如转录终止/聚腺苷酰化序列。如上所述，表达载体也可包括编码指导异源多肽进入宿主细胞的分泌途径的分泌序列。例如，IL-22RA表达载体可包含IL-22RA基因和来源于任何分泌基因的分泌序列。

本发明的IL-22RA蛋白可在哺乳动物细胞中表达。合适的哺乳动物宿主细胞的示例包括非洲绿猴肾细胞(Vero；ATCC CRL 1587)、人胚胎肾细胞(293-HEK；ATCC CRL 1573)、幼仓鼠肾细胞(BHK-21、BHK-570；ATCC CRL 8544、ATCC CRL 10314)、犬肾细胞(MDCK、ATCC CCL 34)、中国仓鼠卵巢细胞(CHO-K1、ATCC CCL61、CHO DG44(Chasin等人，Som.Cell.Molec.Genet.12：555，1986))、大鼠垂体细胞(GH1；ATCCCCL82)、HeLa S3细胞(ATCC CCL2.2)、大鼠肝细胞瘤细胞(H-4-II-E；ATCC CRL 1548)、SV40转化的猴肾细胞(COS-1；ATCC CRL 1650)和鼠类胚胎细胞(NIH-3T3；ATCC CRL 1658)。

对于哺乳动物宿主，转录和翻译调控信号可来自哺乳动物病毒，例如，腺病毒、牛乳头状瘤病毒、猿猴病毒等，其中调控信号和具有高水平的表达的特定基因关联。也可从哺乳动物基因例如肌动蛋白、胶原蛋白、肌球蛋白和金属硫蛋白的基因获得合适的转录和翻译调控序列。

转录调控序列包括足以指导RNA合成起始的启动子区域。合适的真核启动子包括小鼠金属硫蛋白I基因的启动子(Hamer等人，J.Molec.Appl.Genet.1：273(1982))、疱疹病毒的TK启动子(McKnight，Cell 31：355(1982))、SV40早期启动子(Benoist等人，Nature290：304(1981))、劳斯肉瘤病毒启动子(Gorman等人，Proc.Nat′lAcad.Sci.USA 79：6777(1982))、细胞巨化病毒启动子(Foecking等人，Gene 45：101(1980))和小鼠乳腺瘤病毒启动子(一般参见，Etcheverry，“Expression of Engineered Proteins in MammalianCell Culture，”in Protein Engineering：Principles and Practice，Cleland等人(eds.)，pages 163-181(John Wiley & Sons，Inc.1996))。

可选择地，如果原核启动子受真核启动子的调控，那么该原核启动子，例如噬菌体T3 RNA聚合酶启动子，可用于在哺乳动物细胞中控制IL-22RA基因的表达(Zhou等人，Mol.Cell.Biol.10：4529(1990)，和Kaufman等人，Nucl.Acids Res.19：4485(1991))。

在某些实施方案中，将编码IL-22RA可溶性受体多肽、或IL-22RA多肽的片段的DNA序列有效地连接至其表达所必需的表达载体内的其他基因元件，通常包括转录启动子和终止子。所述载体一般也包含一种或多种选择标记物和一个或多个复制起始位点，尽管本领域技术人员认识到，在某些系统内，可在分开的载体上提供选择标志物，和通过将外源DNA整合入宿主细胞基因组中来提供其的复制。启动子、终止子、选择标志物、载体和其他元件的选择在本领域技术人员的水平之内的常规设计范围之内。在文献中描述了许多这些元件，并且其也可从提供商商购获得。可将可溶性受体复合物的多个组分以分开的表达载体的形式共转染，或可将所述多个组分包含在单个表达载体内。表达蛋白复合物的多个组分的这些技术在本领域是熟知的。

可使用各种标准方法(包括磷酸钙转染法、脂质体介导的转染、显微注射介导的递送、电穿孔等)将表达载体导入宿主细胞。可选择和繁殖转染细胞以提供包含稳定地整合入宿主细胞基因组的表达载体的重组宿主细胞。由例如，Ausubel(1995)和Murray(ed.)，GeneTransfer and Expression Protocols(Humana Press 1991)描述用于将载体导入真核细胞的技术和使用显性选择标记物选择这些稳定的转化子的技术。

例如，一种合适的选择性标记物是提供对抗生素新霉素的抗性的基因。在该情况下，在新霉素类型药物例如G-418等存在的情况下进行选择。也可使用选择系统增加目的基因的表达水平，即称为“扩增”的方法。通过在低水平选择剂存在的情况下培养转染子，然后增加选择剂的量以筛选产生高水平的被导入基因的产物的细胞来进行扩增。合适的可扩增的选择标记物是二氢叶酸还原酶(DHFR)，其可提供对氨甲蝶呤的抗性。也可使用其他抗性基因(例如，潮霉素抗性基因、广谱抗药基因、嘌呤霉素乙酰转移酶基因)。可选择地，可通过这些方法例如FACS分选法或磁珠分离技术，使用引入改变的表型的标记物，例如绿色荧光蛋白或细胞表面蛋白例如CD4、CD8、I类MHC、胎盘碱性磷酸酶，从未转染的细胞中将转染的细胞分选出来。

也可通过使用病毒递送系统培养哺乳动物细胞来生产IL-22RA多肽。用于此目的的示例性病毒包括腺病毒、逆转录病毒、疱疹病毒、痘苗病毒和腺伴随病毒(AAV)。腺病毒，是双链DNA病毒，是目前研究最透彻的用于递送异源核酸的基因转移载体(关于综述，参见Becker等人，Meth.Cell Biol.43：161(1994)，和Douglas和Curiel，Science & Medicine 4：44(1997))。腺病毒系统的有利方面包括容纳相对大的DNA插入物、培养至高滴度的能力、感染广泛的哺乳动物细胞类型的能力和允许和大量可获得的包含不同启动子的载体一起使用的适应性。

通过删除腺病毒基因组的部分，可容纳更大的异源DNA的插入物(高达7kb)。可通过直接连接或通过和共转染的质粒的同源重组将这些插入物整合入病毒DNA。将必需的E1基因从病毒载体中删除是个选择，这导致不能复制，除非由宿主细胞提供E1基因才能进行复制。腺病毒转染的人293细胞(ATCC号CRL-1573、45504、45505)，可以例如贴壁细胞方式或以相对高的细胞密度的悬浮培养方式进行培养以产生大量的蛋白(参见，Garnier等人，Cytotechnol.15：145(1994))。

IL-22RA也可在其他高等真核细胞例如鸟类、真菌、昆虫、酵母或植物细胞中表达。杆状病毒系统提供了将克隆的IL-22RA基因导入昆虫细胞的有效方法。合适的表达载体基于苜蓿银纹夜蛾(Autographacalifornica)多核型多角体病毒(AcMNPV)，其包括熟知的启动子例如果蝇热激蛋白(hsp)70启动子、苜蓿银纹夜蛾多核型多角体病毒立刻早期基因启动子(ie-1)和晚早期39K启动子、杆状病毒p10启动子和果蝇金属硫蛋白启动子。制备重组杆状病毒的第二种方法使用由Luckow(Luckow，等人，J.Virol.67：4566(1993))描述的基于转座子的系统。使用转移载体的该系统以BAC-to-BAC试剂盒(LifeTechnologies，Rockyille，MD)的形式出售。该系统使用转移载体，即包含Tn7转座子的PFASTBAC(Life Technologies)，将编码IL-22RA多肽的DNA转入杆状病毒基因组，该病毒基因组以称为“杆粒”的大质粒形式保持在大肠杆菌中。参见，Hill-Perkins和Possee，J.Gen.Virol.71：971(1990)，Bonning，等人，J.Gen.Virol.75：1551(1994)，和Chazenbalk，和Rapoport，J.Biol.Chem.270：1543(1995)。此外，转移载体可包含在表达的IL-22RA多肽的C-或N-末端和编码表位标签的例如Glu-Glu表位标签(Grussenmeyer等人，Proc.Nat′l Acad.Sci.82：7952(1985))的DNA按读码框融合的融合物。通过使用本领域已知的技术，将包含IL-22RA基因的转移载体转化入大肠杆菌，筛选包含指示重组杆状病毒的间断lacZ基因的杆粒。然后使用常用技术分离包含重组杆状病毒基因组的杆粒DNA。

可将用作说明的PFASTBAC载体改造至变化相当大的程度。例如，可除去多角体蛋白启动子并用杆状病毒碱性蛋白启动子(也称作Pcor、p6.9或MP启动子)替代，该碱性蛋白启动子在杆状病毒感染早期表达，并且已显示有利于表达分泌蛋白(参见，例如，Hill-Perkins和Possee，J.Gen.Virol.71：971(1990)，Bonning，等人，J.Gen.Virol.75：1551(1994)，和Chazenbalk和Rapoport，J.Biol.Chem.270：1543(1995)。在这些转移载体构建体中，可使用碱性蛋白启动子的短的或长的形式。此外，可构建用来源于昆虫蛋白的分泌信号序列取代天然的IL-22RA分泌信号序列的转移载体。例如，可在构建体中使用来自蜕皮甾类葡糖基转移酶(EGT)，蜜蜂的蜂毒素Melittin(Invitrogen Corporation；Carlsbad，CA)或杆状病毒gp67(PharMingen：San Diego，CA)的分泌信号序列替代天然的IL-22RA分泌信号序列。

使用重组病毒或杆粒转染宿主细胞。合适的昆虫宿主细胞包括来源于IPLB-Sf-21(草地夜蛾蛹卵巢细胞系)的细胞系，例如Sf9(ATCCCRL 1711)、Sf21AE和Sf21(Invitrogen Corporation；San Diego，CA)、和果蝇Schneider-2细胞以及来源于粉纹夜蛾(Trichoplusiani)(美国专利号，5,300,435)的HIGH FIVEO细胞系(Invitrogen)。可使用可商购获得的无血清培养基培养和维持细胞。对于Sf9细胞合适的培养基是Sf900I I^TM(Life Technologies)或ESF 921^TM(Expression Systems)；和对于粉纹夜蛾细胞使用的培养基是Ex-cellO405^TM(JRH Biosciences，Lenexa，KS)或Express FiveO^TM(Life Technologies)。当使用重组病毒时，一般将细胞从大约2-5×10⁵个细胞的接种密度培养至1-2×10⁶个细胞的密度，此时以0.1至10、更一般地接近3的感染复数(MOI)加入重组病毒贮存物。

由Bailey等人，“Manipulation of Baculovirus Vectors，”inMethods in Molecular Biology，第7卷：Gene Transfer andExpression Protocols，Murray(ed.)，pages 147-168(The HumanaPress，Inc.1991)，Patel等人，“The baculovirus expressionsystem，”in DNA Cloning 2：Expression Systems，第2版，Glover等人(eds.)，pages 205-244(Oxford University Press 1995)，Ausubel(1995)at pages 16-37至16-57，Richardson(ed.)，Baculovirus Expression Protocols(The Humana Press，Inc.1995)，和Lucknow，“Insect Cell Expression Technology，”in ProteinEngineering：Principles and Practice，Cleland等人(eds.)，pages 183-218(John Wiley & Sons，Inc.1996)提供用于在杆状病毒系统中生产重组蛋白的已建立的技术。

也可使用真菌细胞，包括酵母细胞，表达此处描述的基因。在该方面特别有益的酵母种类包括酿酒酵母(Saccharomycescerevisiae)、巴斯德毕赤氏酵母(Pichia pastoris)和甲醇毕赤酵母(Pichia methanolica)。用于在酵母中表达的合适的启动子包括来自GAL1(半乳糖)、PGK(磷酸甘油激酶)、ADH(醇脱氢酶)、AOX1(醇氧化酶)、HIS4(组氨醇脱氢酶)等的启动子。已设计了许多醇母克隆载体并且可容易地获得其。这些载体包括基于YIp的载体，例如YIp5，YRp载体，例如YRp17，YEp载体例如YEp13和YCp载体，例如YCp19。由例如，Kawasaki，美国专利号4,599,311，Kawasaki等人，美国专利号4,931,373，Brake，美国专利号4,870,008，Welch等人，美国专利号5,037,743，和Murray等人，美国专利号4,845,075公开了用外源DNA转化酿酒酵母细胞和从其生产重组多肽的方法。通过由选择标记物确定的表型，通常为抗药性或在特定营养物(例如，亮氨酸)不存在的情况下的生长能力，选择转化的细胞。用于酿酒酵母的合适的载体系统是由Kawasaki等人(美国专利号4,931,373)公开的POT1载体系统，该系统使得能够通过将细胞培养在含有葡萄糖的培养基上来选择转化的细胞。用于醇母的其他合适的启动子和终止子包括来自糖酵解酶基因(参见，例如，Kawasaki，美国专利号4,599,311，Kingsman等人，美国专利号4,615,974，和Bitter，美国专利号4,977,092)和醇脱氢酶基因的启动子和终止子。也参见美国专利号4,990,446、5,063,154、5,139,936和4,661,454。

用于其他酵母，包括多形汉逊氏酵母(Hansenula polymorpha)、粟酒裂殖糖酵母(Schizosaccharomyces pombe)、乳克鲁维氏酵母(Kluyveromyces lactis)、脆壁克鲁维氏酵母(Kluyveromycesfragilis)、玉蜀黍黑粉菌(ustilago maydis)、巴斯德毕赤氏酵母、甲醇毕赤酵母、季也蒙氏毕赤氏酵母(Pichia guillermondii)和麦芽糖假丝酵母(Candida maltosa)的转化系统在本领域是已知的。参见，例如，Gleeson等人，J.Gen.Microbiol.132：3459(1986)，和Cregg，美国专利号4,882,279。根据McKnight等人，美国专利号4,935,349的方法可使用曲霉(Aspergillus)细胞。Sumino等人，美国专利号5,162,228公开了转化产黄顶头孢霉菌(Acremoniumchrysogenum)的方法。Lambowitz，美国专利号4,486,533公开了转化脉孢菌(Neurospora)的方法。

例如，由Raymond，美国专利号5,716,808，Raymond，美国专利号5,736,383，Raymond等人，Yeast 14：11-23(1998)，和国际公开号WO 97/17450、WO 97/17451、WO 98/02536和WO 98/02565中公开了使用甲醇毕赤酵母作为宿主生产重组蛋白的用途。通常以双链、环形质粒的方式制备用于转化甲醇毕赤酵母的DNA分子，在转化前，优选地将该质粒线性化。为了在甲醇毕赤酵母中生产多肽，质粒中的启动子和终止子可以是甲醇毕赤酵母基因例如甲醇毕赤酵母醇利用基因(AUG1或AUG2)的启动子和终止子。其他有用的启动子包括二羟基丙酮合酶(DHAS)、甲酸脱氢酶(FMD)和过氧化氢酶(CAT)基因的启动子。为了帮助将DNA整合入宿主染色体，优选地使质粒的整个表达片段在两个侧翼连接宿主的DNA序列。用于甲醇毕赤酵母的合适的选择标记物是甲醇毕赤酵母ADE2基因，该基因编码磷酸核糖5-氨基咪唑羧化酶(AIRC；EC 4.1.1.21)，其允许ade2宿主细胞在缺少腺嘌呤的情况下生长。为了进行其中想要最少量地使用甲醇的大规模的、工业化的生产方法，可使用其中删除了甲醇利用基因(AUG1和AUG2)的宿主细胞。为了生产分泌蛋白，宿主细胞可以在液泡蛋白酶基因(PEP4和PRB1)上具有缺陷。使用电穿孔帮助将包含编码目的多肽的DNA的质粒导入甲醇毕赤酵母细胞。可使用呈指数式衰减、具有从2.5至4.5kV/cm(优选地大约3.75kV/cm)的场强的脉冲电场和从1至40毫秒(最优选地大约20毫秒)的时间常数(t)进行电穿孔来转化甲醇毕赤酵母细胞。

也可将表达载体导入植物原生质体、完整的植物组织或分离的植物细胞。用于将表达载体导入植物组织的方法包括用根癌农杆菌(Agrobacterium tumefaciens)直接感染或共培养植物组织、显微注射介导的递送、DNA注射、电穿孔等。参见，例如，Horsch等人，Science227：1229(1985)，Klein等人，Biotechnology 10：268(1992)，和Miki等人，“Procedures for Introducing Foreign DNA intoPlants，”in Methods in Plant Molecular Biology andBiotechnology，Glick等人(eds.)，pages 67-88(CRC Press，1993)。

可选择地，可在原核宿主细胞中表达IL-22RA基因。可用于在原核宿主中表达IL-22RA多肽的合适的启动子对于本领域技术人员来说是熟知的，其包括能够识别T4、T3、Sp6和T7聚合酶的启动子、λ噬菌体的P_R和P_L启动子、大肠杆菌的trp、recA、热激、lacUV5、tac、lpp-lacSpr、phoA和lacZ启动子、枯草芽孢杆菌(B.subtilis)的启动子、芽孢杆菌(Bacillus)的噬菌体的启动子、链霉菌(Streptomyces)的启动子、λ噬菌体的int启动子、pBR322的bla启动子和氯霉素乙酰转移酶基因的CAT启动子。已由Glick，J.Ind.Microbiol.1：277(1987)，Watson等人，Molecular Biology of theGene，4th Ed.(Benjamin Cummins 1987)，和Ausubel等人(1995)对原核启动子进行了综述。

合适的原核宿主包括大肠杆菌和枯草芽孢杆菌。大肠杆菌的合适的株系包括BL21(DE3)、BL21(DE3)pLysS、BL21(DE3)pLysE、DH1、DH4I、DH5、DH5I、DH5IF′、DH5IMCR、DH10B、DH10B/p3、DH11S、C600、HB101、JM101、JM105、JM109、JM110、K38、RR1、Y1088、Y1089、CSH18、ER1451和ER1647(参见，例如，Brown(ed.)，Molecular BiologyLabfax(Academic Press 1991))。枯草芽孢杆菌的合适的株系包括BR151、YB886、MI119、MI120和B170(参见，例如，Hardy，“BacillusCloning Methods，”in DNA Cloning：A Practical Approach，Glover(ed.)(IRL Press 1985))。

当在细菌例如大肠杆菌中表达IL-22RA多肽时，可将多肽保留在细胞质中，通常以不溶性颗粒的形式保留，或可通过细菌分泌序列直接将多肽分泌至周质间隙。在前一种情况下，裂解细胞，回收所述颗粒并使用例如异硫氰酸胍或尿素使之变性。然后通过稀释变性剂(例如通过对尿素溶液和还原和氧化谷胱甘肽的组合透析来进行稀释)，之后对缓冲盐溶液进行透析来重折叠和二聚化变性的多肽。在后一种情况下，可从周质间隙以可溶性和功能性的形式回收多肽，通过破裂细胞(通过，例如，超声处理或渗透休克)以释放周质间隙的内容物和回收蛋白进行回收，从而避免了对变性和重折叠的需要。

用于在原核宿主中表达蛋白的方法对于本领域技术人员来说是熟知的(参见，例如，Williams等人，“Expression of foreignproteins in E.coli using plasmid vectors and purification ofspecific polyclonal antibodies，”in DNA Cloning 2：ExpressionSystems，第2版，Glover等人(eds.)，page 15(Oxford UniversityPress 1995)，Ward等人，“Genetic Manipulation and Expressionof Antibodies，”in Monoclonal Antibodies：Principles andApplications，page 137(Wiley-Liss，Inc.1995)，和Georgiou，“Expression of Proteinsin Bacteria，”in Protein Engineering：Principles and Practice，Cleland等人(ed s.)，page 101(JohnWiley & Sons，Inc.1996))。

用于将表达载体导入细菌、酵母、昆虫和植物细胞的标准方法由例如Ausubel(1995)提供。

用于表达和回收由哺乳动物细胞系统产生的外源蛋白的一般方法由例如Etcheverry，“Expression of Engineered Proteins inMammalian Cell Culture，”in Protein Engineering：Principlesand Practice，Cleland等人(eds.)，pages 163(Wiley-Liss，Inc.1996)提供。用于回收由细菌系统产生的蛋白的标准技术由例如Grisshammer等人，“Purification of over-produced proteins fromE.coli cells，”in DNA Cloning 2：Expression Systems，第2版，Glover等人(eds.)，pages 59-92(Oxford University Press 1995)提供。由Richardson(ed.)，Baculovirus Expression Protocols(TheHumana Press，Inc.1995)描述了用于从杆状病毒系统分离重组蛋白的已建立的方法。

作为选择，可通过完全的固相合成、部分固相方法、片段缩合或经典的溶液合成来合成本发明的多肽。这些合成方法对于本领域技术人员来说是熟知的(参见，例如，Merrifield，J.Am.Chem.Soc.85：2149(1963)，Stewart等人，“Solid Phase Peptide Synthesis”(第2版)，(Pierce Chemical Co.1984)，Bayer和Rapp，Chem.Pept.Prot.3：3(1986)，Atherton等人，Solid Phase Peptide Synthesis：A Practical Approach(IRL Press 1989)，Fields和Colowick，“Solid-Phase Peptide Synthesis，”Methods in Enzymology Volume289(Academic Press 1997)，和Lloyd-Williams等人，ChemicalApproaches to the Synthesis of Peptides and Proteins(CRC Press，Inc.1997))。总的化学合成策略上的变化，例如“天然的化学连接”和“表达的蛋白的连接”也是标准的(参见，例如，Dawson等人，Science266：776(1994)，Hackeng等人，Proc.Nat′l Acad.Sci.USA 94：7845(1997)，Dawson，Methods Enzymol.287：34(1997)，Muir等人，Proc.Nat′l Acad.Sci.USA 95：6705(1998)，和Severinov和Muir，J.Biol.Chem.273：16205(1998))。

本发明的肽和多肽包含SEQ ID NO：3的至少6个、至少9个或至少15个连续氨基酸残基。作为说明示例，多肽可包含SEQ ID NO：3的至少6个、至少9个或至少15个连续氨基酸残基。在本发明的某些实施方案中，多肽包含这些氨基酸序列的20、30、40、50、100或更多个连续残基。编码这些肽和多肽的核酸分子可用作聚合酶链式反应的引物和探针。

此外，IL-22RA多肽和其片段在高等真核细胞中可表达为单体、同型二聚体、异二聚体或多聚体。可使用这些细胞产生包含至少一个IL-22RA多肽(“包含IL-22RA的受体”或“包含IL-22RA的受体多肽”)的IL-22RA单体、同型二聚体、异二聚体和多聚体受体多肽，或可在筛选系统中将这些细胞用作测定细胞。在本发明的一个方面中，通过培养的细胞产生包含IL-22RA细胞外结构域的本发明的多肽，使用该细胞筛选受体的配体，包括天然配体，IL-22，或甚至天然配体的激动剂和拮抗剂。该方法概述如下，将编码受体的cDNA或基因和其表达所必需的其他基因元件(例如，转录启动子)组合在一起，将所得的表达载体插入宿主细胞。在各种筛选系统中选择和使用表达DNA和产生功能性受体的细胞。可在相同细胞中表达单体、同型二聚体、异二聚体和多聚体受体复合物的各组分。此外，也可将单体、同型二聚体、异二聚体和多聚体受体复合物的组分融合至跨膜结构域或其他膜融合部分以使能够装配复合物和筛选上述的转染子。

为了测定本发明的IL-20和IL-22的拮抗剂多肽和抗体，适合用于表达包含IL-22RA的受体或已知结合IL-20或IL-22以及转导受体介导的信号的其他受体(例如，表达IL-22RA/CRF2-4；和IL-20RA，IL-20RB，IL-22RA/IL-20RB，或IL-20RA/IL-20RB的细胞)的哺乳动物细胞包括表达可与IL-22RA(或IL-20RA)一起形成功能性复合物的其他受体亚基的细胞。这些亚基可以包括那些属于干扰素受体家族的或其它II型或I型细胞因子受体的，例如，CRF2-4(Genbank编号Z17227)、IL-10R(Genbank编号U00672和NM_001558)、IL-22RA(共同拥有的美国专利号5,965,704)、zcytor7(IL-20RA)(共同拥有的美国专利号5,945,511)、IL-20RA/IL-20RB(WIPO公布号WO01/46232)和IL-9R。使用和要表达的受体一样来自相同的物种的细胞也是优选。在优选的实施方案中，所述细胞依赖于外源提供的用于其扩增的造血生长因子。该类型的优选细胞系是人TF-1细胞系(ATCC编号CRL-2003)和AML-193细胞系(ATCC编号CRL-9589)，所述细胞系是GM-CSF依赖性人白血病细胞系和BaF3(Palacios和Steinmetz，Cell41：727-734，(1985))，所述BaF3是IL-3依赖性鼠类pre-B细胞系。其他细胞系包括BHK、COS-1和CHO细胞。可将适合的宿主细胞进行改造以产生必需的受体亚基或进行想要的细胞应答所需的其他细胞组分。该方法是有利的，因为可将细胞系进行改造以表达来自任何物种的受体亚基，从而克服由于物种特异性产生的潜在限制。可在来自相同的物种的细胞系中克隆和使用人受体cDNA的物种直向同源物，例如BaF3细胞系中的小鼠cDNA。因此可将依赖于一种造血生长因子例如GM-CSF或IL-3的细胞系进行改造，使之成为依赖于通过IL-22RA受体起作用的另一种细胞因子，例如IL-22。

在筛选测定法中使用表达功能性受体的细胞。各种合适的测定法在本领域中是已知的。这些测定法基于靶细胞中的生物学反应的检测。一个这样的测定法是细胞增殖测定法。在受试化合物存在或不存在的情况下培养细胞，通过例如测量氚标记的胸苷的整合或通过基于3-(4，5-二甲基噻唑-2-基)-2，5-二苯基溴化四唑鎓(MTT)(Mosman，J.Immunol.Meth.65：55-63，(1983))的代谢分解的比色测定法来检测细胞的增殖。一种替代的检测方式采用了进一步改造从而表达报告基因的细胞。将报告基因连接至对受体关联途径作出反应的启动子元件，该测定法检测报告基因的转录的激活。该方面中的优选的启动子元件是血清应答元件，或SRE。参见，例如，Shaw等人，Cell56：563-572，(1989)。优选的这样的报告基因是萤光素酶基因(de Wet等人，Mol.Cell.Biol.7：725，(1987))。通过使用本领域已知的方法(例如，Baumgartner等人，J.Biol.Chem.269：29094-29101，(1994)；Schenborn和Goiffin，Promega Notes 41：11，1993)检测发光来检测萤光素酶基因的表达。萤光素酶活性测定试剂盒可从例如Promega Corp.，Madison，WI商购获得。可使用该类型的靶细胞系筛选化学试剂文库、细胞条件化的培养基、真菌液体培养基、土壤样品、水样品等。例如，可对靶细胞测定细胞条件化的培养基样品的文库以鉴定产生配体的细胞。然后使用阳性细胞在哺乳动物表达载体中产生cDNA文库，将该文库分为亚文库、转染入宿主细胞并进行表达。然后测定来自转染的细胞的培养基样品，随后对亚文库再细分，再转染、传代培养，和再次测定阳性细胞以分离编码配体的克隆的cDNA。

本领域已知或能够构建几种IL-20应答性细胞系，例如Baf3/DIRS1/cytoR11细胞系(WIPO公开号WO 02/072607)。而且，已知几种IL-20应答性细胞系，(Dumontier等人，J.Immunol.164：1814-1819，2000；Dumoutier，L.等人，Proc.Nat′l.Acad.Sci.97：10144-10149，2000；Xie MH等人，J.Biol.Chem.275：31335-31339，2000；Kotenko SV等人，J.Biol.Chem.276：2725-2732，2001)以及表达IL-22受体亚基IL-22RA的细胞系。例如，下述细胞对IL-22应答：TK-10(Xie MH等，如前所述.)(人肾癌)；SW480(ATCC号CCL-228)(人结肠腺癌)；HepG2(ATCC号HB-8065)(人肝癌)；PC12(ATCC号CRL-1721)(鼠神经元细胞模型；大鼠嗜铬细胞瘤)和MES13(ATCC号CRL-1927)(鼠肾小球膜细胞细胞系)。另外，一些表达IL-22RA(IL-22受体)的细胞系也可以作为对IL-22应答的候选细胞系：A549(ATCC号CCL-185)(人肺癌)；G-361(ATCC号CRL-1424)(人黑素瘤)和Caki-1(ATCC号HTB-46)(人肾癌)。另外，能够构建IL-22应答细胞系，例如，此处所述的Baf3/cytoR11/CRF2-4细胞系(WIPO公开号WO 02/12345)。这些细胞能够用于评价IL-22RA作为IL-20或IL-22拮抗剂或抗炎因子的功能的检测。

由本发明提供的其他筛选方法包括杂合受体多肽的使用。这些杂合多肽大体分为2类。在第1类中，IL-22RA的细胞内结构域连接至第二受体的配体结合结构域。第2类杂合受体多肽包含IL-22RA(SEQID NO：3)的细胞外(配体结合)结构域和第二受体(优选造血细胞因子受体)的细胞内结构域和跨膜结构域。本发明的该第2类受体的杂合IL-22RA单体、同型二聚体、异二聚体和多聚体在已知能够对第二受体转导的信号作出应答的细胞中表达。这两类杂合受体一起能够鉴定用于开发检测IL-22或IL-20的测定法的反应性细胞类型。此外，可在IL-22或IL-20存在的情况下使用这些细胞，以在竞争型测定法中检测本发明的可溶性受体拮抗剂。在该测定法中，在本发明的可溶性受体存在的情况下，增殖或IL-22或IL-20的信号转导活性降低证明了拮抗活性。此外，也可使用IL-22RA可溶性受体结合测定法(基于细胞的测定法)，确定可溶性受体是否结合、阻断、抑制、减少、拮抗或中和IL-22或IL-20的活性。

6.IL-22RA融合蛋白和缀合物的产生

IL-22RA类似物的一个大类是具有这样的氨基酸序列的变体，该序列是此处公开的氨基酸序列的突变。如下面所描述的，由抗独特型抗体和其片段提供另一大类IL-22RA类似物。此外，可将包含抗独特型可变结构域的重组抗体用作类似物(参见，例如，Monfardini等人，Proc.Assoc.Am.Physicians 108：420(1996))。因为抗独特型IL-22RA抗体的可变结构域模拟IL-22RA，因此这些结构域可提供IL-22RA结合活性。产生抗独特型催化抗体的方法对于本领域技术人员来说是已知的(参见，例如，Joron等人，Ann.N Y Acad.Sci.672：216(1992)，Friboulet等人，Appl.Biochem.Biotechnol.47：229(1994)，和Avalle等人，Ann.N Y Acad.Sci.864：118(1998))。

通过使用组合文库提供鉴定IL-22RA类似物的另一种方法。由例如Kay等人，Phage Display of Peptides and Proteins(AcademicPress 1996)，Verdine，美国专利号5,783,384，Kay，等人，美国专利号5,747,334，和Kauffman等人，美国专利号5,723,323提供用于构建和筛选噬菌体展示和其他组合文库的方法。

IL-22RA多肽具有体内和体外用途。作为说明示例，可向细胞培养基中加入IL-22RA的可溶性形式以抑制由培养细胞产生的IL-22RA配体的作用。

可使用IL-22RA的融合蛋白在重组宿主中表达IL-22RA，和分离产生的IL-22RA。如下所述，特定的IL-22RA融合蛋白也在诊断和治疗上具有用途。一类融合蛋白包含引导来自重组宿主细胞的IL-22RA多肽的肽。为指导IL-22RA多肽进入真核宿主细胞的分泌途径，在IL-22RA表达载体中提供分泌信号序列(也称为信号肽，前导序列，前原(prepro)序列或前序列(pre sequence))。尽管分泌信号序列可来源于IL-22RA，但合适的信号序列也可以来自另一种分泌蛋白或从头合成。以这样的方式将分泌信号序列有效地连接至编码IL-22RA的序列，即，使得两个序列以正确的符合读框的方式连接和定位，从而指导新合成的多肽进入宿主细胞的分泌途径。分泌信号通常位于编码目的多肽的核苷酸序列的5’，尽管某些分泌信号序列可位于目的核苷酸序列的其他位置(参见，例如，Welch等人，美国专利号5,037,743；Holland等人，美国专利号5,143,830)。

尽管可将哺乳动物细胞产生的IL-22RA或另一种蛋白的分泌信号序列(例如，组织型纤溶酶原活化因子信号序列，如在例如美国专利号5,641,655中所描述的)用于在重组哺乳动物宿主表达IL-22RA，但在酵母细胞中表达时优选地使用酵母的信号序列。合适的酵母信号序列的示例是来源于酵母接合信息素α因子(由MFα1基因编码)、转化酶(由SUC2基因编码)、或酸性磷酸酶(由PH05基因编码)的信号序列。参见，例如，Romanos等人，“Expression of Cloned Genes in Yeast，”in DNA Cloning 2：A Practical Approach，第2版，Glover and Hames(eds.)，pages  123-167(Oxford University Press 1995)。

可通过表达编码细胞外结构域，例如包含SEQ ID NO：3的多肽或非人受体的对应区域的截短的DNA来制备IL-22RA可溶性受体多肽。优选地可以基本上不含跨膜和细胞内多肽片段的形式制备细胞外结构域多肽。为指导受体结构域通过宿主细胞外运，将受体DNA连接至编码分泌肽例如t-PA分泌肽的第二个DNA片段。为帮助分泌受体结构域的纯化，可将这样的C末端延伸物融合至受体多肽，所述C末端延伸物是例如多组氨酸标签、P物质、Flag^TM肽(Hopp等人，Biotechnology6：1204-1210，(1988)；可从Eastman Kodak Co.，New Haven，CT获得)或可获得其抗体或其他特异性结合剂的另外的多肽或蛋白。此外，也如上所述制备来自细胞外细胞因子结合结构域的IL-22RA抗原表位。

在可选择的方法中，可以和免疫球蛋白重链恒定区(通常为Fc片段)的融合物的方式表达IL-22RA的受体细胞外结构域或其他I型或II型细胞因子受体组分，典型的是Fc片段，该片段包含2个恒定区结构域和一个铰链区，但缺少可变区(参见，Sledziewski，AZ等人，美国专利号6,018,026和5,750,375)。本发明的可溶性IL-22RA多肽包括这些融合物。一种这样的融合物示于SEQ ID NO：4。这些融合物一般以多聚体分子的形式分泌，其中Fc部分相互之间通过二硫键连接，两个受体多肽相互之间非常紧密地靠近排列。该类型的融合物可用于从溶液中亲和纯化关联配体，作为体外测定工具，用于通过特异性地滴定完配体来阻断、抑制或减少体外信号，以及作为体内拮抗剂，通过肠胃外途径施用其以结合循环配体或从循环中将其清除。为纯化配体，在有助于受体-配体结合的条件(通常接近生理学温度、pH和离子强度)下，向包含配体的样品(例如，细胞条件化的培养基或组织提取物)加入IL-22RA嵌合体。然后通过使用固定在固体支持物(例如不溶性树脂小珠)的A蛋白进行混合来分离嵌合体-配体复合物。然后使用常规化学技术例如使用盐或pH梯度洗脱配体。在可选择的方法中，可将嵌合体自身结合至固体支持物，如上进行结合和洗脱。可在体内使用嵌合体以调节炎症反应，包括急性期反应例如血清淀粉样蛋白A(SAA)、C-反应性蛋白(CRP)等。可经肠胃外途径(例如，通过肌内、皮下或静脉内注射)施用具有高结合亲和力的嵌合体。循环分子结合配体并通过正常的生理学过程从循环中将其清除。为了用于测定法，通过Fc区域将嵌合体结合至支持物并用于ELISA形式。

为帮助分离本发明的抗IL-22RA和结合伴侣，可有利地使用这样的测定系统，该测定系统使用配体结合受体(或抗体，互补/反互补对的一个成员)或其结合片段以及商购可方便的获得的生物传感装置(BIAcore，Pharmacia Biosensor，Piscataway，NJ)。将这些受体、抗体、互补/反互补对的成员或片段固定在受体芯片的表面。由Karlsson，J.Immunol.Methods 145：229-40，1991和Cunningham和Wells，J.Mol.Biol.234：554-63，1993公开了该仪器的用途。使用胺或巯基化学试剂将受体、抗体、成员或片段共价地附着至葡聚糖纤维(其附着至流体小室内的金膜)。将受试样品通过所述小室。如果配体、表位或互补/反互补对的相对成员存在于样品中，其将分别和固定的受体、抗体或成员结合，从而导致介质的折射率发生变化，将该变化通过金膜的表面等离子体共振的变化来进行检测。该系统允许确定这样的结合和解离率，根据所述结合和解离率可计算结合亲和力和确定结合的化学计量学。可选择地，可使用SELDI(TM)技术(Ciphergen，Inc.，Palo Alto，CA)分析配体/受体结合。此外，上述BIACORE技术通常可用于竞争性实验以确定不同的单克隆抗体是否结合IL-22RA多肽上的相同或不同的表位，这样，其可用于帮助本发明的中和抗体的表位作图，所述中和抗体结合、阻断、抑制、减少、拮抗或中和IL-22或IL-20和IL-22两者。

也可在本领域已知的其他测定系统中使用配体结合性受体多肽。这些系统包括用于确定结合亲和力的Scatchard分析法(参见Scatchard，Ann.NY Acad.Sci.51：660-72，1949)和量热测定法calorimetric assays(Cunningham等人，Science 253：545-48，1991；Cunningham等人，Science 245：821-25，1991)。

本发明还提供了各种其他多肽融合物和包含一个或多个多肽融合物的关联多聚体蛋白。例如，可以融合物的形式制备可溶性IL-22RA受体，形成美国专利号5,155,027和5,567,584中公开的二聚化蛋白。该方面中的优选的二聚化蛋白包括免疫球蛋白恒定区结构域，例如，IgGγ1，和人κ轻链。免疫球蛋白-可溶性IL-22RA融合物可在经改造的细胞中表达，从而产生各种多聚体IL-22RA受体类似物。可将辅助结构域融合至可溶性IL-22RA受体，从而将其靶向特定细胞、组织或大分子(例如，胶原、或表达IL-22RA配体IL-22或IL-20的细胞)。可将IL-22RA多肽融合至2个或多个部分，例如用于纯化的亲和标签和靶向性结构域。多肽融合物也可包含1个或多个切割位点，特别是在结构域之间。参见，Tuan等人，Connective Tissue Research 34：1-9，1996。

在细菌细胞中，通常想要以融合蛋白的形式表达异源蛋白以减少所表达的蛋白的毒性、增加其稳定性和提高其回收。例如，可以包含谷胱甘肽S-转移酶多肽的融合蛋白的形式表达IL-22RA。谷胱甘肽S-转移酶融合蛋白通常是可溶性的，并且可容易地在固定的谷光甘肽柱子上从大肠杆菌裂解物中纯化其。在相似的方法中，可用直链淀粉树脂柱分离包含结合麦芽糖的蛋白多肽的IL-22RA融合蛋白，也可使用IgG-Sepharose纯化包含截断的A蛋白基因的C末端的融合蛋白。由例如Williams等人，“Expression of Foreign Proteins in E.coliUsing Plasmid Vectors and Purification of Specific PolyclonalAntibodies，”in DNA Cloning 2：A Practical Approach，第2版，Glover and Hames(Eds.)，pages 15-58(Oxford University Press1995)描述了用于在细菌细胞中以融合蛋白的形式表达异源多肽的已建立的技术。此外，可商购获得表达系统。例如，PINPOINT Xa蛋白纯化系统(Promega Corporation；Madison，WI)提供了使用包含抗生物素蛋白的树脂分离这样的融合蛋白的方法，该融合蛋白包含在表达期间被生物素化的多肽。

用于分离由原核或真核细胞表达的异源多肽的肽标签包括多组氨酸标签(其具有对镍螯合型树脂的亲和力)、c-myc标签、钙调蛋白结合蛋白(用钙调蛋白亲和层析分离的)、P物质、RYIRS标签(其结合抗-RYIRS抗体)、Glu-Glu标签和FLAG标签(其结合抗-FLAG抗体)。参见，例如，Luo等人，Ar ch.Biochem.Biophys.329：215(1996)，Morganti等人，Biotechnol.Appl.Biochem.23：67(1996)，和Zheng等人，Gene 186：55(1997)。可从例如Sigma-AldrichCorporation(St.Louis，MO)商购获得编码这些肽标签的核酸分子。

融合蛋白的另一种形式包含IL-22RA多肽和免疫球蛋白重链恒定区(通常是Fc片段)，所述恒定区包含2个或3个恒定区结构域和铰链区但缺少可变区。作为说明示例，Chang等人，美国专利号5,723,125，描述了包含人干扰素和人免疫球蛋白Fc片段的融合蛋白。通过肽连接体部分将干扰素的C端连接至Fc片段的N端。肽连接体的示例是主要包含T细胞惰性序列(其是免疫学惰性的)的肽。示例性肽连接体具有氨基酸序列：GGSGG SGGGG SGGGG S(SEQ ID NO：9)。在该融合蛋白中，示例性Fc部分是在溶液中稳定的，具有极少或没有补体激活活性的人γ4链。因此，本发明涉及包含IL-22RA部分和人Fc片段的IL-22RA融合蛋白，其中IL-22RA部分的C端通过肽连接体附着至Fc片段的N端，例如包含SEQ ID NO：4的氨基酸序列的肽。IL-22RA部分可以是IL-22RA分子或其片段。例如，融合蛋白可包含SEQ ID NO：3的氨基酸和Fc片段(例如，人Fc片段)(SEQ ID NO：4)。

在另一个变化中，IL-22RA融合蛋白包含IgG序列、共价连接至IgG序列的氨基末端的IL-22RA部分和共价地连接至IL-22RA部分的氨基末端的信号肽，其中所述IgG序列以下列顺序由下列元件构成：铰链区、CH₂结构域和CH₃结构域。因此，IgG序列缺少CH₁结构域。IL-22RA部分显示此处描述的IL-22RA活性，例如和IL-22RA的配体结合的能力。已由LaRochelle等人，EP 742830(WO 95/21258)描述了产生包含抗体和非抗体部分的融合蛋白的该一般方法。

可将包含IL-22RA部分和Fc部分的融合蛋白用作，例如，体外测定工具。例如，可使用IL-22RA-免疫球蛋白融合蛋白检测IL-22RA配体在生物学样品中的存在，其中IL-22RA部分用于结合配体，和大分子例如A蛋白或抗Fc抗体，用于将融合蛋白结合至固体支持物。可使用这些系统鉴定干扰IL-22RA配体，例如，IL-22或IL-20和IL-22两者与其受体的结合的激动剂和拮抗剂。

抗体融合蛋白的其他示例包括包含抗原结合结构域的多肽和包含IL-22RA细胞外结构域的IL-22RA片段。可使用这些分子靶向特定的组织以使之获得IL-22RA结合活性的益处。

本发明还提供了各种其他的多肽融合物。例如，可在本发明的IL-22RA和来自细胞因子受体家族的另一个成员的功能性等同结构域之间交换提供生物学活性的结构域的部分或全部。可在重组宿主细胞中表达多肽融合物以产生各种IL-22RA融合类似物。可将IL-22RA多肽融合至2个或多个部分或结构域，例如用于纯化的亲和标签和靶向性结构域。多肽融合物也可包含一个或多个切割位点，特别是在结构域之间。参见，例如，Tuan等人，Connective Tissue Research 34：1(1996)。

可通过本领域技术人员已知的方法，通过制备融合蛋白的各组分并通过化学方法将其缀合来制备融合蛋白。可选择地，可使用已知的技术产生按正确读框的方式编码融合蛋白的两种成分的多核苷酸，并通过此处描述的方法表达其。由例如Ausubel(1995)at pages 16-19至16-25描述用于酶促和化学切割融合蛋白的一般方法。

可通过由这些技术(如核磁共振、晶体学、电子衍射或光亲和标记)确定的结构的物理分析结合IL-22RA配体激动剂的假定的接触位点氨基酸的突变进一步表征IL-22RA结合结构域。参见，例如，de Vos等人，Science 255：306(1992)，Smith等人，J.Mol.Biol.224：899(1992)，和Wlodaver等人，FEBS Lett.309：59(1992)。

本发明也涉及经化学修饰的IL-22RA化合物，其中将IL-22RA多肽和聚合物连接。说明性IL-22RA多肽是缺少功能性跨膜结构域的可溶性多肽，例如由氨基酸残基SEQ ID NO：3构成的多肽。一般地，聚合物是水溶性的，这样IL-22RA缀合物不会在水环境例如生理学环境中沉淀。合适的聚合物的示例是已被修饰从而具有单一反应性基团的聚合物，例如用于酰化作用的活性酯或用于烷基化的醛。通过该方法，可控制聚合的程度。反应性醛的示例是聚乙二醇丙醛、单-(C1-C10)烷氧基、或其芳氧基衍生物(参见，例如，Harris，等人，美国专利号5,252,714)。聚合物可以是分枝的或不分枝的。此外，可使用聚合物的组合物产生IL-22RA缀合物。

用于治疗的IL-22RA缀合物可包含药物可接受的水溶性聚合物部分。适合的水溶性聚合物包括聚乙二醇(PEG)、单甲氧基-PEG、单-(C1-C10)烷氧基-PEG、芳氧基-PEG、聚-(N-乙烯基吡咯烷酮)PEG、2，2，2-三氟乙磺酰基单甲氧基PEG、PEG丙醛、二-琥珀酰亚胺碳酸酯PEG、丙二醇同聚物、共聚物、聚氧乙烯多元醇(例如，丙三醇)、聚乙烯醇、葡聚糖、纤维素或其他基于糖类的聚合物。合适的PEG可具有从大约600至大约60,000，包括，例如5,000、12,000、20,000和25,000的分子量。IL-22RA缀合物也可包含这些水溶性聚合物的组合物。

IL-22RA缀合物的一个示例包含IL-22RA部分和附着至IL-22RA部分的N端的聚烷基氧化物部分。PEG是合适的聚烷基氧化物。作为说明性示例，可用PEG修饰IL-22RA，该方法称为“PEG化”。可通过本领域已知的PEG化反应的任一种进行IL-22RA的PEG化(参见，例如，EP 0 154 316，Delgado等人，Critical Reviews in Therapeutic DrugCarrier Systems 9：249(1992)，Duncan和Spreafico，Clin.Pharmacokinet.27：290(1994)，和Francis等人，Int J Hematol68：1(1998))。例如，可通过和反应性聚乙二醇分子的酰化反应或烷基化反应进行PEG化。在可选择的方法中，通过缩合活化的PEG形成IL-22RA缀合物，其中PEG的末端羟基或氨基已被活化的连接体取代(参见，例如，Karasiewicz等人，美国专利号5,382,657)。

通过酰化作用进行的PEG化一般需要使活化的PEG的酯衍生物和IL-22RA多肽反应。活化的PEG的酯的示例是被酯化至N-羟基琥珀酰亚胺的PEG。如此处所用的，术语“酰化作用”包括下列类型的IL-22RA和水溶性聚合物之间的连接：酰胺、氨基甲酸、尿烷等连接。用于通过酰化作用制备PEG化的IL-22RA的方法一般包括步骤：(a)在使一个或多个PEG基团附着至IL-22RA的条件下，使IL-22RA多肽和PEG(例如PEG的醛衍生物的反应性酯)反应，和(b)获得反应产物。一般地，基于已知的参数和想要的结果确定酰化作用的最佳反应条件。例如，PEG：IL-22RA的比率越大，多PEG化的IL-22RA产物的百分比越高。

通过酰化作用获得的PEG化的产物一般是多PEG化IL-22RA产物，其中通过酰基连接性基团PEG化赖氨酸ε-氨基。连接键的示例是酰胺。一般地，所得的IL-22RA被至少95％单、二或三PEG化，尽管依赖于反应条件，可形成一些具有更高程度的PEG化的种类。可使用标准的纯化方法例如透析、超滤、离子交换层析、亲和层析等将PEG化种类和未缀合的IL-22RA多肽分离。

通过烷化作用进行的PEG化一般包括在还原剂存在的情况下使PEG的末端醛衍生物和IL-22RA反应。通过-CH₂-NH基团可将PEG基附着至多肽。

此外，可使用本领域已知的和此处描述的方法PEG化本发明的抗-IL-22RA抗体或抗体片段。

通过还原性烷化作用产生单PEG化的产物的衍生作用利用不同类型的可获得的伯氨基的不同反应性进行衍生作用。一般地，在允许利用赖氨酸残基的ε-氨基和蛋白的N端残基的α-氨基之间的pKa差异的pH下进行反应。通过这样的选择性衍生作用，控制包含反应性基团例如醛的水溶性聚合物的附着。和聚合物的缀和反应主要在蛋白的N端上发生，而无其他反应性基团例如赖氨酸侧链氨基的显著修饰。本发明提供了基本上均一的IL-22RA单聚合物缀合物制剂。

产生单聚合物IL-22RA缀合分子的基本上均一的群体的还原性烷化作用可包括步骤：(a)在还原性烷化作用的条件下，在适合于允许IL-22RA的氨基端上的α氨基进行选择性修饰的pH下，使IL-22RA多肽和反应性PEG反应，和(b)获得反应产物。用于还原性烷化作用的还原剂在水溶液中应当是稳定的并且只能够还原在还原性烷化作用的最初过程中形成的希夫碱。说明性还原剂包括硼氢化钠、氰基硼氢化钠、二甲胺硼烷(dimethylamine borane)、三甲胺硼烷和吡啶硼烷(pyridine borane)。

对于基本上均一的单聚合物IL-22RA缀合物的群体，还原性烷化反应条件是允许水溶性聚合物部分选择性地附着至IL-22RA的N端的条件。这些反应条件一般提供了赖氨酸氨基和N末端α氨基之间的pKa的差异。pH也影响所用的聚合物对蛋白的比例。一般地，如果pH更低，聚合物对蛋白的更大的过量是想要的，因为N端α基的反应性越小，就需要更多聚合物来达到最佳条件。如果pH更高，聚合物：IL-22RA不必更大，因为可获得更多的反应性基团。一般地，pH在3至9、或3至6的范围之内。可使用该方法制备包含IL-22RA的同型二聚体、异二聚体或多聚体可溶性受体缀合物。

另一个要考虑的因素是水溶性聚合物的分子量。一般地，聚合物的分子量越高，可附着至蛋白的聚合物分子的数目越少。对于PEG化反应，典型的分子量是大约2kDa至大约100kDa、大约5kDa至大约50kDa、或大约12kDa至大约25kDa。水溶性聚合物对IL-22RA的摩尔比一般地在1∶1至100∶1的范围之内。一般地，对于多PEG化，水溶性聚合物对IL-22RA的摩尔比是1∶1至20∶1，对于单PEG化是1∶1至5∶1。

用于产生包含多肽和水溶性聚合物部分的缀合物的一般方法在本领域是已知的。参见，例如，Karasiewicz等人，美国专利号5,382,657，Greenwald等人，美国专利号5,738,846，Nieforth等人，Clin.Pharmacol.Ther.59：636(1996)，Monkarsh等人，Anal.Biochem.247：434(1997))。可使用该方法制备包含IL-22RA的同型二聚体、异二聚体或多聚体可溶性受体缀合物。

本发明涉及包含肽或多肽例如此处描述的可溶性受体或抗体的组合物。此等组合物可进一步包含载体。载体可以是常规的有机或无机载体。载体的示例包括水、缓冲液、醇、丙二醇、聚乙二醇、麻油、玉米油等。

7.IL-22RA多肽的分离

可将本发明的多肽纯化至，相对于污染性大分子(特别是其他蛋白和核酸)，至少大约80％的纯度、至少大约90％的纯度、至少大约95％的纯度、或大于95％的纯度例如96％、97％、98％或大于99％的纯度，并且不含感染性因子和致热性因子。也可将本发明的多肽纯化至药物纯状态，该纯度超过99.9％的纯度。在某些制剂中，纯化的多肽基本上不含其他多肽，特别是动物来源的其他多肽。

可使用分级分离和/或常规的纯化方法获得从天然来源(例如，人组织来源)纯化的IL-22RA、合成的IL-22RA多肽和从重组宿主细胞纯化的重组IL-22RA多肽和融合IL-22RA多肽的制剂。一般地，可使用硫酸铵沉淀法或酸或离液剂提取法进行样品的分级分离。示例性纯化步骤可包括羟基磷灰石、大小排阻、FPLC和反相高效液相层析。合适的层析介质包括衍生化的葡聚糖、琼脂糖、纤维素、聚丙烯酰胺、特种硅土(specialty silicas)等。PEI、DEAE、QAE和Q衍生物是合适的。示例性层析介质包括用苯基、丁基或辛基衍生的介质，例如苯基-Sepharose FF(Pharmacia)、Toyopearl butyl 650(Toso Haas，Montgomeryville，PA)、辛基-Sepharose(Pharmacia)等；或聚丙烯酸树脂，例如Amberchrom CG 71(Toso Haas)等。合适的固体支持物包括玻璃小珠、基于二氧化硅的树脂、纤维素树脂、琼脂糖小珠、交联的琼脂糖小珠、聚苯乙烯小珠、交联的聚丙烯酰胺树脂等，所述支持物在其被使用的条件下是不溶性的。可用可使蛋白通过氨基、羧基、巯基、羟基和/或糖部分附着的反应性基团修饰这些支持物。

偶联化学试剂的示例包括溴化氰活化、N-羟基琥珀酰亚胺活化、环氧化物活化、巯基活化、酰肼活化和用于碳二亚胺偶联化学试剂的羧基和氨基衍生物。这些试剂和其他固体基质是本领域内熟知的和广泛使用的，并且可从提供商商购获得。用于多肽分离和纯化的特定方法的选择在常规技术范围之内并且可部分地通过选择的支持物的特性进行确定。参见，例如，Affinity Chromatography：Principles &Methods(Pharmacia LKB Biotechnology 1988)，和Doonan，ProteinPurification Protocols(The Humana Press 1996)。

本领域技术人员可设计IL-22RA分离和纯化上的另外的变化。例如，可使用如下所述获得的抗IL-22RA抗体通过免疫亲和纯化分离大量的蛋白。

也可通过利用特定性质分离本发明的多肽。例如，可使用固定化的金属离子吸附(IMAC)层析纯化富含组氨酸的蛋白，包括包含多组氨酸标签的蛋白。简而言之，首先用二价金属离子加载凝胶以形成螯合物(Sulkowski，Trends in Biochem.3：1(1985))。依赖于所用的金属离子，可将富含组氨酸的蛋白以不同的亲和力吸附至该基质，通过竞争性洗脱、降低pH、或使用强螯合剂洗脱所述蛋白。纯化的其他方法包括通过凝集素亲和层析和离子交换层析纯化糖基化蛋白(M.Deutscher，(ed.)，Meth.Enzymol.182：529(1990))。在本发明的其他实施方案中，可构建目的多肽和亲和标签(例如，麦芽糖-结合蛋白质，免疫球蛋白的结构域)的融合物以帮助纯化。此外，可使用IL-22RA细胞外结构域的配体-结合特性，通过例如使用亲和层析纯化例如包含IL-22RA的可溶性受体，在所述亲和层析中，将IL-22配体结合至柱子，使用标准层析方法结合和随后洗脱包含IL-22RA的受体。

也可通过上述的化学合成制备IL-22RA多肽或其片段。IL-22RA多肽可以是单体或多聚体、糖基化或非糖基化的、PEG化或非PEG化的、和可以包含或可以不包含起始甲硫氨酸残基。

8.针对IL-22RA蛋白的抗体的产生

可通过例如使用IL-22RA表达载体的产物或从天然来源分离的IL-22RA作为抗原来获得针对IL-22RA的抗体。特别有用的抗-IL-22RA抗体“特异性地结合”IL-22RA。如果抗体表现下列两种特性中的至少一种则该抗体被认为是特异性结合的：(1)抗体以阈值水平的结合活性结合IL-22RA，和(2)抗体和与IL-22RA关联的多肽不发生显著的交叉反应。

关于第1特性，如果抗体以10⁶M^-1或更大的、优选地10⁷M^-1或更大的、更优选地10⁸M^-1或更大的、最优选地10⁹M^-1或更大的结合亲和力(Ka)结合IL-22RA多肽、肽或表位则其是特异性地结合。本领域技术人员通过例如Scatchard分析法(Scatchard，Ann.NY Acad.Sci.51：660(1949))可容易地确定抗体的结合亲和力。关于第2特征，例如，如果通过使用标准的Western印迹分析法，抗体检测IL-22RA，但不检测目前已知的多肽，那么抗体不和关联多肽发生显著的交叉反应。已知的关联多肽的示例包括已知的细胞因子受体。

可使用具有抗原性IL-22RA表位的肽和多肽产生抗IL-22RA抗体。本发明的具有抗原性IL-22RA表位的肽和多肽包含SEQ ID NO：3或此处公开的另一种氨基酸序列中的至少9个、或15至大约30个氨基酸的序列。然而，包含本发明的氨基酸序列的更大部分的肽或多肽，包含30至50个氨基酸或任何长度(包括长达和包含本发明的多肽的整个氨基酸序列的长度)，也用于诱导结合IL-22RA的抗体产生。选择在水溶剂中提供充分溶解性的具有表位的肽的氨基酸序列(即，所述序列包含相对亲水的残基，同时一般避免疏水性残基)是想要的。此外，对于抗体生产，包含脯氨酸残基的氨基酸序列也是想要的。

作为说明示例，使用通过LASERGENE(DNASTAR；Madison，WI)的PROTEAN程序(版本3.14)进行的Jameson-Wolf方法，Jameson和Wolf，CABIOS 4：181，(1988)鉴定了IL-22RA中的潜在的抗原性位点。在该分析中使用缺省参数。

Jameson-Wolf法通过组合用于蛋白结构预测的6个主要子程序来预测潜在的抗原决定簇。简而言之，首先使用Hopp-Woods方法，Hopp等人，Proc.Nat′l Acad.Sci.USA 78：3824(1981)，鉴定代表最大局部亲水性区域的氨基酸序列(参数：平均7个残基)。在第2步骤中，使用Emini法，Emini等人，J.Virology 55：836(1985)计算表面或然率(surface probabilities)(参数：表面决定阈值(0.6)＝1)。第三，使用Karplus-Schultz法，Karplus和Schultz，Naturwissenschaften 72：212(1985)预测主链柔度(backbone chainflexibility)(参数：柔度阈值(0.2)＝1)。在分析的第4和第5步骤中，使用Chou-Fasman，Chou，“Prediction of Protein StructuralClasses from Amino Acid Composition，”in Prediction of ProteinStructure and the Principles of Protein Conformation，Fasman(ed.)，pages 549-586(Plenum Press 1990)，和Garnier-Robson，Garnier等人，J.Mol.Biol.120：97(1978)的方法对数据进行二级结构预测(Chou-Fasman参数：构象表＝64个蛋白；α区域阈值＝103；β区域阈值＝105；Garnier-Robson参数：α和β决定常数＝0)。在第6子程序中，使用柔度参数和亲水性/溶剂可接触性因子一起确定称为“抗原性指数”的表面等值(surface contour value)。最后，将峰加宽函数用于抗原性指数，该函数通过加上峰值的20、40、60或80％来加宽主要表面峰以补偿从表面区域相对于内部区域的移动所产生的额外的自由能。然而，不将该计算用于存在于螺旋区域的任何主峰，因为螺旋区域倾向于较低的柔性。

此分析表明随后的SEQ ID NO：3氨基酸序列将提供合适的抗原肽：可使用Hopp/Woods亲水性分布图确定在SEQ ID NO：3内最具抗原性潜力的区域(Hopp等人，Proc.Natl.Acad.Sc i.78：3824-3828，1981；Hopp，J.Immun.Meth.88：1-18，1986和Triquier等人，ProteinEngineering 11：153-169，1998)。所述分布图基于滑动6残基窗口。忽略埋藏的G、S和T残基和暴露的H、Y和W残基。此外，将例如使用DNASTAR Protean程序(DNASTAR，Inc.，Madison，WI)通过Jameson-Wolf作图预测的SEQ ID NO：3中的IL-22RA抗原表位用作优选的抗原表位，其可通过本领域技术人员来确定。这些抗原表位包括(1)SEQ ID NO：3的氨基酸残基1(脯氨酸)至氨基酸残基6(天冬氨酸)；(2)SEQ ID NO：3的氨基酸残基26(丝氨酸)至氨基酸残基32(脯氨酸)；(3)SEQ ID NO：3的氨基酸残基41(赖氨酸)至氨基酸残基47(天冬氨酸)；(4)SEQ ID NO：3的氨基酸残基49(缬氨酸)至氨基酸残基62(半胱氨酸)；(5)SEQ ID NO：3的氨基酸残基41(赖氨酸)至氨基酸残基62(半胱氨酸)；(6)SEQ ID NO：3的氨基酸残基84(丙氨酸)至氨基酸残基97(丝氨酸)；(7)SEQ ID NO：3的氨基酸残基103(苏氨酸)至氨基酸残基108(天冬氨酸)；和(8)SEQ IDNO：3的氨基酸残基130(精氨酸)至氨基酸残基135(组氨酸)；(9)SEQ ID NO：3的氨基酸残基164(甘氨酸)至氨基酸残基166(赖氨酸)；(10)SEQ ID NO：3的氨基酸残基175(酪氨酸)至氨基酸残基179(谷氨酸)；(11)SEQ ID NO：3的氨基酸残基193(赖氨酸)至氨基酸残基196(组氨酸)；(12)SEQ ID NO：3的氨基酸残基203(赖氨酸)至氨基酸残基209(苏氨酸)。本发明涉及使用抗原表位1至12中的任一表位肽产生抗IL-22RA抗体或将其用作筛选或鉴定本发明的中和单克隆抗体的工具。本发明还涉及包含1到10至少一个抗原肽多肽的多肽。本发明涉及使用此处描述的任何抗原肽或表位产生抗IL-22RA抗体以及鉴定和筛选这样的抗IL-22RA单克隆抗体，所述单克隆抗体是中和抗体，其可结合、阻断、抑制、减少、拮抗或中和IL-22和IL-20(单独地或一起地)的活性。

此外，合适的抗原也包括这样的IL-22RA多肽，包含上面公开IL-22RA细胞因子结合或细胞外结构域和其它I型或II型细胞因子细胞外结构域的联合体，例如那些可形成可溶性IL-22RA异二聚体或多聚体多肽等的多肽，例如可溶性IL-22RA/CRF2-4、IL-22RA/zcytor11、IL-22RA/zcytor7等类似物质。

可使用本领域技术人员熟知的方法制备抗重组IL-22RA蛋白或抗从天然来源分离的IL-22RA的多克隆抗体。参见，例如，Green等人，“Production of Polyclonal Antisera，”in ImmunochemicalProtocols(Manson，ed.)，pages 1-5(Humana Press 1992)，和Williams等人，“Expression of foreign proteins in E.coli usingplasmid vectors and purification of specific polyclonalantibodies，”in DNA Cloning 2：Expression Systems，第2版，Glover等人(eds.)，page 15(Oxford University Press 1995)。通过使用佐剂例如明矾(氢氧化铝)或弗氏完全或不完全佐剂可增加IL-22RA多肽的免疫原性。用于免疫的多肽也包括融合多肽，例如IL-22RA或其部分和免疫球蛋白多肽或麦芽糖结合蛋白的融合物。多肽免疫原可以是全长分子或其部分。如果多肽部分是“半抗原样的”，可将该部分有利地结合至或连接至用于免疫的大分子载体(例如钥孔血蓝蛋白(KLH)、牛血清白蛋白(BSA)或破伤风类毒素)。

尽管一般在动物例如马、牛、狗、鸡、大鼠、小鼠、兔、豚鼠、山羊或绵羊中生产多克隆抗体，但也可从类人灵长类动物的抗体衍生本发明的抗-IL-22RA抗体。可在例如Goldenberg等人，国际专利公开号WO 91/11465，和Losman等人，Int.J.Cancer 46：310(1990)中查找到用于在狒狒中产生诊断和治疗用途的抗体的一般技术。

可选择地，可产生单克隆抗IL-22RA抗体。可通过本领域技术人员已知的方法(参见，例如，Kohler等人，Nature 256：495(1975)，Coligan等人(eds.)，Current Protocols in Immunology，第1卷，pages 2.5.1-2.6.7(John Wiley & Sons 1991)[“Coligan”]，Picksley等人，“Production of monoclonal antibodies againstproteins expressed in E.coli，”in DNA Cloning 2：ExpressionSystems，第2版，Glover等人(eds.)，page 93(Oxford UniversityPress 1995))获得抗特定抗原的啮齿动物单克隆抗体。

简而言之，可这样获得单克隆抗体，用包含IL-22RA基因产物的组合物注射小鼠，通过取出血清样品以验证抗体产物的存在，取出脾脏以获得B淋巴细胞，将B淋巴细胞和骨髓瘤细胞融合以产生杂交瘤，克隆杂交瘤，选择产生抗所述抗原的抗体的阳性克隆，培养产生抗所述抗原的抗体的克隆，从杂交瘤培养物中分离抗体。

此外，可从人单克隆抗体产生本发明的抗IL-22RA抗体。从已通过基因工程改造，产生对抗原攻击起反应的特异性人抗体的转基因小鼠获得人单克隆抗体。在该技术中，将人重链和轻链基因座的元件导入来源于胚胎干细胞系的小鼠品系，所述小鼠品系包含内源重链和轻链基因座的靶向断裂。转基因小鼠可合成对于人抗原是特异性的人抗体，可使用所述小鼠产生分泌人抗体的杂交瘤。由例如，Green等人，Nature Genet.7：13(1994)，Lonberg等人，Nature 368：856(1994)，和Taylor等人，Int.Immun.6：579(1994)描述用于从转基因小鼠获得人抗体的方法。

可通过各种已良好建立的技术从杂交瘤培养物中分离和纯化单克隆抗体。这些分离技术包括使用A蛋白Sepharose的亲和层析、大小排阻层析和离子交换层析(参见，例如，Coligan at pages2.7.1-2.7.12和pages 2.9.1-2.9.3；Baines等人，″Purificationof Immunoglobulin G(IgG)，″in Methods in Molecular Biology，第10卷，pages 79-104(The Humana Press，Inc.1992))。

对于特定的用途，制备抗IL-22RA抗体的片段是想要的。可通过抗体的蛋白水解作用获得这些抗体片段。可通过常规的方法，用胃蛋白酶或木瓜蛋白酶降解完整的抗体来获得抗体片段。作为说明性示例，可通过使用胃蛋白酶酶促断裂抗体以提供称为F(ab′)₂的5S片段来产生抗体片段。可用巯基还原剂进一步断裂该片段，从而产生3.5S Fab′单价片段。任选地，可使用二硫链断裂产生的巯基的封闭基团进行该断裂反应。作为另一种选择，使用胃蛋白酶的酶促断裂直接产生2个单价Fab片段和Fc片段。由例如，Goldenberg，美国专利号4,331,647，Nisonoff等人，Arch Biochem.Biophys.89：230(1960)，Porter，Biochem.J.73：119(1959)，Edelman等人，in Methods inEnzymology第1卷，page 422(Academic Press 1967)，和Coligan atpages 2.8.1-2.8.10和2.10.-2.10.4描述这些方法。

也可使用断裂抗体的其他方法，例如形成单价轻-重链片段的重链的分离、片段的进一步断裂，或其他酶促、化学或遗传技术，只要所述片段结合由该完全抗体识别的抗原。

例如，Fv片段包含结合的V_H和V_L链。该结合可以是非共价的，如由Inbar等人，Proc.Nat′l Acad.Sci.USA 69：2659(1972)所描述的。可选择地，可通过分子间二硫键连接或通过化学试剂例如戊二醛(参见，例如，Sandhu，Crit.Rev.Biotech.12：437(1992))交联可变链。

Fv片段可包含通过肽连接体连接的V_H和V_L链。通过构建包含编码V_H和V_L结构域的结构基因(所述V_H和V_L结构域通过寡核苷酸连接)制备这些单链抗原结合蛋白(scFv)。将结构基因插入随后被导入宿主细胞例如大肠杆菌的表达载体。重组宿主细胞合成具有跨接2个V结构域的连接体肽的单个多肽链。由Whitlow等人，Methods：A Companionto Methods in Enzymology 2：97(1991)(也参见，Bird等人，Science242：423(1988)，Ladner等人，美国专利号4,946,778，Pack等人，Bio/Technology 11：1271(1993)，和Sandhu，同上)描述用于产生scFvs的方法。

作为说明性示例，可这样获得scFV，在体外将淋巴细胞暴露于IL-22RA多肽，选择噬菌体或相似的载体中的抗体展示文库(例如，通过使用固定的或标记的IL-22RA蛋白或肽)来获得scFV。可通过在噬菌体(噬菌体展示)或在细菌例如大肠杆菌上展示的随机肽文库来获得编码具有潜在的IL-22RA多肽结合结构域的多肽的基因。可通过许多方法例如通过随机诱变和随机多核苷酸合成来获得编码所述多肽的核苷酸序列。可使用这些随机肽展示文库选择和这样的已知的靶相互作用的肽，该靶可以是蛋白或多肽，例如配体或受体、生物大分子或合成的大分子、或有机或无机物。用于产生和筛选这些随机肽展示文库的技术在本领域是已知的(Ladner等人，美国专利号5,223,409，Ladner等人，美国专利号4,946,778，Ladner等人，美国专利号5,403,484，Ladner等人，美国专利号5,571,698，和Kay等人，Phage Display of Peptides and Proteins(Academic Press，Inc.1996))，可从例如CLONTECH Laboratories，Inc.(Palo Alto，CA)、Invitrogen Inc.(San Diego，CA)、New England Biolabs，Inc.(Beverly，MA)和Pharmacia LKB Biotechnology Inc.(Piscataway，NJ)商购获得用于筛选这些文库的随机肽展示文库和试剂盒。可使用此处公开的IL-22RA序列筛选随机肽展示文库以鉴定结合IL-22RA的蛋白。

抗体片段的另一种形式是编码单个互补决定区(CDR)的肽。可通过构建编码目的抗体的CDR的基因来获得CDR肽(“最小识别单位”)。通过例如使用聚合酶链式反应合成来自产生抗体的细胞的RNA的可变区来制备这些基因(参见，例如，Larrick等人，Methods：ACompanion to Methods in Enzymology 2：106(1991)，Courtenay-Luck，“Genetic Manipulation of Monoclonal Antibodies，”inMonoclonal Antibodies：Production，Engineering and ClinicalApplication，Ritter等人(eds.)，page 166(Cambridge UniversityPress 1995)，和Ward等人，“Genetic Manipulation and Expressionof Antibodies，”in Monoclonal Antibodies：Principles andApplications，Birch等人，(eds.)，page 137(Wiley-Liss，Inc.1995))。

可选择地，可从“人源化的”单克隆抗体产生抗IL-22RA抗体。通过将来自小鼠免疫球蛋白的重链和轻链可变区的小鼠互补决定区转移至人可变结构域来产生人源化的单克隆抗体。然后在鼠类对应物的构架区内用人抗体的特有的残基进行取代。使用来自人源化单克隆抗体的抗体组分避免了和鼠类恒定区的免疫原性关联的潜在问题。用于克隆鼠类免疫球蛋白可变结构域的一般方法描述于例如Orlandi等人，Proc.Nat′l Acad.Sci.USA 86：3833(1989)。由例如Jones等人，Nature 321：522(1986)，Carter等人，Proc.Nat′l Acad.Sci.USA89：4285(1992)，Sandhu，Crit.Rev.Biotech.12：437(1992)，Singer等人，J.Immun.150：2844(1993)，Sudhir(ed.)，AntibodyEngineefing Protocols(Humana Press，Inc.1995)，Kelley，“Engineering Therapeutic Antibodies，”in Protein Engineering：Principles and Practice，Cleland等人(eds.)，pages 399-434(John Wiley & Sons，Inc.1996)，和Queen等人，美国专利号5,693,762(1997)描述用于产生人源化单克隆抗体的技术。

此外，可使用本领域内和此处描述的方法PEG化本发明的抗IL-22RA抗体或抗体片段。

使用标准技术，用抗IL-22RA抗体或抗体片段免疫动物来制备多克隆抗独特型抗体。参见，例如，Green等人，“Production ofPolyclonal Antisera，”in Methods In Molecular Biology：Immunochemical Protocols，Manson(ed.)，pages 1-12(HumanaPress 1992)。也参见，Coligan at pages 2.4.1-2.4.7。可选择地，使用上述技术，用抗IL-22RA抗体或抗体片段作为免疫原来制备单克隆抗独特型抗体。作为另一种选择，可使用上述技术制备人源化抗独特型抗体或类人灵长类动物抗独特型抗体。由例如Irie，美国专利号5,208,146，Greene，等人，美国专利号5,637,677，和Varthakavi和Minocha，J.Gen.Virol.77：1875(1996)描述用于产生抗独特型抗体的方法。

可用可检测的标记物缀合抗IL-22RA抗体以形成抗IL-22RA免疫缀合物。合适的可检测的标记物包括，例如，放射性同位素、荧光标记物、化学发光标记物、酶标记物、生物发光标记物或胶体金。制备和检测这些可检测标记的免疫缀合物的方法对于本领域技术人员来说是熟知的，并在下面进行更详细的描述。

可检测的标记物可以是通过放射自显影法检测的放射性同位素。对于本发明的目的特别有用的同位素是³H、¹²⁵I、¹³¹I、³⁵S和¹⁴C。

也可用荧光化合物标记抗IL-22RA免疫缀合物。通过将免疫缀合物暴露于合适波长的光并检测所得的荧光来确定荧光标记的抗体的存在。荧光标记化合物包括异硫氰酸荧光素、罗丹明、藻红蛋白、藻蓝蛋白、别藻蓝蛋白、邻苯二醛和荧光胺。

可选择地，可通过将抗体组分偶联至化学发光化合物来可检测地标记抗IL-22RA免疫缀合物。通过检测化学反应过程产生的发光的存在来确定化学发光标记的免疫缀合物的存在。化学发光标记化合物的示例包括鲁米诺、4-氨基邻苯二甲酰肼、芳香族吖啶酯、咪唑、吖啶盐和草酸酯。

类似地，可使用生物发光化合物标记本发明的抗IL-22RA免疫缀合物。生物发光是在这样的生物系统中发现的化学发光类型，在所述生物系统中，催化蛋白增加了化学发光反应的效率。通过检测发光的存在来确定生物发光蛋白的存在。用于标记的生物发光化合物包括荧光素、萤光素酶和水母发光蛋白。

可选择地，可通过将抗IL-22RA抗体组分连接至酶来可检测地标记抗IL-22RA免疫缀合物。当在合适的底物存在的情况下温育抗IL-22RA抗体-酶缀合物时，酶部分和底物反应，产生可通过例如分光光度计、荧光计或可视方法检测的化学部分。可用于可检测地标记多特异性的免疫缀合物的酶的示例包括β-半乳糖苷酶、葡糖氧化酶、过氧化物酶和碱性磷酸酶。

本领域技术人员知道可根据本发明使用的其他合适的标记物。可使用本领域已知的标准技术来使标记物部分和抗IL-22RA抗体结合。由Kennedy等人，Clin.Chim.Acta 70：1(1976)，Schurs等人，Clin.Chim.Acta 81：1(1977)，Shih等人，Int′l J.Cancer 46：1101(1990)，Stein等人，Cancer Res.50：1330(1990)，和Coligan，同上描述该方面的典型方法。

此外，可使用已和抗生物素蛋白、链霉抗生物素和生物素缀合的抗IL-22RA抗体增加免疫化学检测的方便性和通用性(参见，例如，Wilchek等人(eds.)，“Avidin-Biotin Technology，”Methods InEnzymology，第184卷(Academic Press 1990)，和Bayer等人，“Immunochemical Applications of Avidin-Biotin Technology，”in Methods In Molecular Biology，第10卷，Manson(ed.)，pages149-162(The Humana Press，Inc.1992)。

用于进行免疫测定法的方法是建立良好的方法。参见，例如，Cook和Self，“Monoclonal Antibodies in Diagnostic Immunoassays，”in Monoclonal  Antibodies：Production，Engineering，andClinical Application，Ritter and Ladyman(eds.)，pages 180-208，(Cambridge University Press，1995)，Perry，“The Role ofMonoclonal Antibodies in the Advancement of ImmunoassayTechnology，”in Monoclonal Antibodies：Principles andApplications，Birch和Lennox(eds.)，pages 107-120(Wiley-Liss，Inc.1995)，和Diamandis，Immunoassay(Academic Press，Inc.1996)。

本发明也涉及用于进行用于测定IL-22RA基因表达的免疫学诊断测定法的试剂盒。这些试剂盒包含至少一个装有抗IL-22RA抗体或抗体片段的容器。试剂盒也可包含装有一种或多种能够指示IL-22RA抗体或抗体片段存在的试剂的第二容器。这些指示剂的示例包括可检测的标记物例如放射性标记物、荧光标记物、化学发光标记物、酶标记物、生物发光标记物、胶体金等。试剂盒也可以包含递送给用户的使用IL-22RA抗体或抗体片段检测IL-22RA蛋白的手段。例如，书面说明书可声明，可使用包装的抗体或抗体片段检测IL-22RA。可将书面材料直接用于容器，或可以包装书明书的形式提供书面材料。9.抗IL-22RA抗体拮抗IL-22RA结合IL-22或IL-20和IL-22两者的用途

用于产生或选择此处有用的抗体的可选择的技术包括在体外将淋巴细胞暴露于可溶性IL-22RA受体多肽或其片段(例如抗原表位)，并选择噬菌体或相似的载体中的抗体展示文库(例如，通过使用固定的或标记的可溶性IL-22RA受体多肽或其片段例如抗原表位进行筛选)。可通过筛选在噬菌体中展示(噬菌体展示)的或在细菌例如大肠杆菌中展示的随机肽文库来获得编码具有潜在的结合结构域的多肽的基因，所述多肽是例如可溶性IL-22RA受体多肽或其片段例如抗原表位。可通过许多方法例如通过随机诱变和随机多核苷酸合成法获得编码所述多肽的核苷酸序列。这些随机肽展示文库可用于筛选和已知的靶相互作用的肽，所述靶可以是蛋白或多肽，例如配体或受体、生物大分子或合成的大分子、或有机物或无机物。用于建立和筛选这些随机肽展示文库的技术在本领域是已知的(Ladner等人，美国专利号5,223,409；Ladner等人，美国专利号4,946,778；Ladner等人，美国专利号5,403,484和Ladner等人，美国专利号5,571,698)，可从例如Clontech(Palo Alto，CA)、Invitrogen Inc.(San Diego，CA)、New England Biolabs、Inc.(Beverly，MA)和Pharmacia LKBBiotechnology Inc.(Piscataway，NJ)商购获得用于筛选这些文库的随机肽展示文库和试剂盒。可使用可溶性IL-22RA受体多肽或其片段(例如此处公开的抗原表位多肽)筛选随机肽展示文库来鉴定结合包含IL-22RA的受体多肽的蛋白。和包含可溶性IL-22RA的受体多肽相互作用的这些“结合多肽”可用于标记细胞；用于通过亲和纯化分离同源多肽；可将其直接或间接地缀合至药物、毒素、放射性核素等。也可将这些结合多肽用于这样的分析方法，所述方法用于例如筛选表达文库和中和活性，例如用于结合、阻断、抑制、减少、拮抗或中和IL-22配体和受体之间的相互作用，或病毒对受体的结合。也可将结合多肽用于这样的诊断测定法，该诊断测定法用于确定可溶性包含IL-22RA的受体多肽的循环水平；用于检测或定量作为潜在的病状或疾病的标志物的可溶性或非可溶性包含IL-22RA的受体。这些结合多肽也可用作在体外和体内阻断或抑制可溶性或膜结合的IL-22RA单体受体或IL-22RA同型二聚体、异二聚体或多聚体多肽结合(例如对配体的结合)和信号转导的“拮抗剂”。此外，这些结合多肽用作抗IL-22RA单体受体或抗IL-22RA同型二聚体、异二聚体或多聚体多肽和用于抑制IL-22或IL-20和IL-22两者一起的活性以及受体活性或蛋白结合。针对本发明的天然受体复合物产生的抗体和IL-22RA-表位-结合抗体、和抗IL-22RA中和性单克隆抗体可以是优选的实施方案，因为其可更特异性地抗IL-22RA和可抑制IL-22或同时抑制IL-20和IL-22。此外，可分别在IL-20或IL-22和包含IL-22RA的可溶性受体存在的情况下，在IL-20或IL-22扩增、信号捕获、萤光素酶或结合测定法中以及在此处描述的其他生物学或生物化学测定法中检测本发明的抗体的拮抗和结合活性。

抗可溶性IL-22RA受体多肽的抗体(例如针对SEQ ID NO：3的抗体)或其片段例如抗原表位可用于在体内抑制IL-20、IL-22、或IL-20和IL-22两者一起的炎症效应，用于抵抗炎症和炎性疾病例如牛皮癣、异位性皮炎、炎性皮肤病、内毒素血症、关节炎、哮喘、炎性肠病(IBD)、结肠炎、牛皮癣性关节炎、类风湿性关节炎或其他IL-20和IL-22导致的炎性疾病；用于标记表达IL-22RA受体的细胞；用于通过亲和层析分离可溶性包含IL-22RA的受体多肽；用于确定可溶性包含IL-22RA的受体多肽的循环水平的诊断测定法；用于检测或定量作为潜在的病状或疾病的标志物的可溶性的包含IL-22RA的受体；用于使用FACS的分析方法；用于筛选表达文库；用于产生可用作IL-22或IL-20激动剂的抗独特型抗体；和用作在体外和体内结合、阻断、抑制、减少或拮抗IL-22RA受体功能或结合、阻断、抑制、减少或拮抗或中和IL-22和/或IL-20活性(单独地或一起地)的中和抗体或拮抗剂。合适的直接标签或标记物包括放射性核素、酶、底物、辅助因子、生物素、抑制剂、荧光标记物、化学发光标记物、磁颗粒等；间接标签或标记物可表征作为中间物的生物素-抗生物素蛋白或其他互补/反互补对的用途。此处的抗体也可直接或间接地缀合至药物、毒素、放射性核素等，这些缀合物用于体内诊断或治疗用途。此外，可在体外使用抗可溶性的包含IL-22RA的受体多肽或其片段的抗体检测变性的或非变性的包含IL-22RA的受体多肽或其片段，例如Western印迹法或本领域已知的其他测定法。

抗可溶性IL-22RA受体或可溶性IL-22RA同型二聚体、异二聚体或多聚体受体多肽的抗体用于标记表达对应的受体的细胞并测定其表达水平，用于亲和纯化，在诊断测定法中用于确定受体多肽的循环水平，用于使用荧光激活的细胞分选的分析方法。此外，二价抗体和抗同种型抗体可用作模拟IL-22RA配体，IL-22或IL-20的效应的激动剂。

也可将此处的抗体直接或间接地缀合至药物、毒素、放射性核素等，这些缀合物用于体内诊断或治疗用途。例如，可使用识别可溶性IL-22RA受体或可溶性IL-22RA同型二聚体、异二聚体或多聚体受体多肽的抗体或结合多肽鉴定或处理这样的组织或器官，所述组织或器官表达对应的反互补分子(即，包含IL-22RA的可溶性或膜结合受体)。更明确地，可将针对可溶性的包含IL-22RA的受体多肽的抗体或其生物活性片段或部分偶联至可检测的或细胞毒性分子和将其递送至具有表达包含IL-22RA的受体的组织或器官的哺乳动物，例如表达IL-22RA的癌。

合适的可检测的分子可直接或间接地附着至结合包含IL-22RA的受体多肽的多肽例如“结合多肽”(包括上述的结合肽)、抗体或其生物活性片段或部分。合适的可检测的分子包括放射性核素、酶、底物、辅助因子、抑制剂、荧光标记物、化学发光标记物、磁性颗粒等。合适的细胞毒性分子可直接或间接地附着至所述多肽或抗体，其包括细菌或植物毒素(例如，白喉毒素、假单胞菌(Pseudomonas)外毒素、篦麻蛋白、相思豆毒蛋白等)，以及治疗性放射性核素，例如碘-131、铼-188或钇-90(直接地附着至多肽或抗体，或通过例如螯合部分间接地附着)。也可将结合性多肽或抗体缀合至细胞毒性药物，例如阿霉素。为了间接附着可检测的或细胞毒性分子，可将可检测的或细胞毒性分子和互补/反互补对的成员缀合，而将另一个成员结合至结合多肽或抗体部分。对于这些目的，生物素/链霉抗生物素是示例性互补/反互补对。

在另一个实施方案中，可将结合性多肽-毒素融合蛋白或抗体-毒素融合蛋白用于被靶向的细胞或组织的抑制或切除(例如，治疗癌细胞或组织)。可选择地，如果结合性多肽具有多个功能结构域(即，激活结构域或配体结合结构域和靶向性结构域)，只包含靶向性结构域的融合蛋白可适合用于指导可检测的分子、细胞毒性分子或互补分子朝向目的细胞或组织类型。在当只包含单个结构域的融合蛋白包含互补分子的情况下，可将反互补分子缀合至可检测的或细胞毒性分子。因此这些结构域-互补分子融合蛋白代表了用于一般反互补-可检测的/细胞毒性分子缀合物的细胞/组织特异性递送的一般靶向性载体。

在另一个实施方案中，IL-22RA结合性多肽-细胞因子或抗体-细胞因子融合蛋白可用于在体内增强杀伤靶组织(例如，脾、胰、血液、淋巴、结肠和骨髓癌)，如果结合性多肽-细胞因子或抗IL-22RA受体抗体靶向过度增殖的细胞(一般参见，Hornick等人，Blood89：4437-47，1997)。所述融合蛋白可使细胞因子靶向想要的作用位点，从而提供了提高的细胞因子的局部浓度。合适的抗IL-22RA单体、同型二聚体、异二聚体或多聚体抗体靶向不想要的细胞或组织(即，肿瘤或白血病)，融合的细胞因子通过效应细胞介导提高的靶细胞裂解。例如，用于该目的合适的细胞因子包括白细胞介素2和粒细胞-巨噬细胞集落刺激因子(GM-CSF)。

可选择地，此处描述的结合IL-22RA受体的多肽或抗体融合蛋白可用于在体内通过直接刺激IL-22RA受体调控的细胞凋亡途径来增强杀伤靶组织，导致表达包含IL-22RA的受体的过度增殖的细胞的细胞死亡。

10.具有IL-22RA活性的多肽或针对IL-22RA的抗体的治疗性用途

可使用具有可溶性IL-22RA活性的氨基酸序列，通过结合IL-22RA配体IL-20和IL-22(单独地或一起地)，从而，阻断IL-22RA配体和内源IL-22RA受体的结合来调节免疫系统。也可使用IL-22RA拮抗剂，例如抗IL-22RA抗体，通过抑制IL-22RA配体和内源IL-22RA受体的结合来调节免疫系统。因此，本发明包括对这样的受治疗者使用具有IL-22RA活性的蛋白、多肽和肽(例如可溶性IL-22RA多肽、IL-22RA多肽片段、IL-22RA类似物(例如，抗IL-22RA抗同种型抗体)、和IL-22RA融合蛋白)，所述受治疗者缺乏足够量的该多肽，或产生过量的IL-22RA配体。也可使用IL-22RA拮抗剂(例如，抗IL-22RA抗体)治疗产生过量IL-22RA配体或IL-22RA的受治疗者。合适的受治疗者包括哺乳动物，例如人。例如，这些IL-22RA多肽和抗IL-22RA抗体用于结合、阻断、抑制、减少、拮抗或中和IL-20和IL-22(单独地或一起地)，用于治疗炎症和炎性疾病，所述病症是例如牛皮癣、特应性皮炎、炎性皮肤病、牛皮癣性关节炎、关节炎、内毒素血症、哮喘、炎性肠病(IBD)、结肠炎和此处公开的其他炎性病症。

另外，我们已经表明IL-22RA受体结合被称为T细胞诱导因子(IL-22)(SEQ ID NO：6；Dumoutier，L.等人，Proc.Nat′l.Acad.Sci.97：10144-10149，2000；mouse IL-22 sequence is shown inDumontier et al.，J.Immunol.164：1814-1819，2000)的配体。另外，共同拥有的zcytor11(IL-22RA)(US Patent No.5,965,704)和CRF2-4受体还结合IL-22成为异源二聚体(见，WIPO公开号WO00/24758；Dumontier et al.，J.Immunol.164：1814-1819，2000；Spencer，SD et al.，J.Exp.Med.187：571-578，1998；Gibbs，VCand Pennica Gene 186：97-101，1997(CRF2-4cDNA)；Xie，MH et al.，J.Biol.Chem.275：31335-31339，2000；and Kotenko，SV et al.，J.Biol.Chem.276：2725-2732，2001)。另外，IL-10β受体可以作为IL-22的受体参与其中，并被认为和CRF2-4(Dumoutier，L.etal.，Proc.Nat′l.Acad.Sci.97：10144-10149，2000；Liu Y et al，J Immunol.152；1821-1829，1994(IL-10R cDNA)是相同的。另外，我们还表明IL-22RA受体结合被称为IL-20的配体(SEQ ID NO：8；WIPO公开号WO 99/27103)。在优选的实施方案中，IL-22RA(SEQ ID NO：3)的可溶性受体形式是在体内结合、阻断、抑制、减少、拮抗或中和IL-22和IL-20的单体、同型二聚体、异二聚体或多聚体。结合于这些IL-22RA单体、同型二聚体、异二聚体或多聚体的抗体和结合性多肽也作为IL-22RA活性的拮抗剂以及作为IL-20和IL-22的拮抗剂(单独地或一起地)，如此处所描述的。

此外，我们在此已描述了在基于细胞的中和测定法中多克隆和单克隆中和抗IL-22抗体结合、阻断、抑制、减少、拮抗或中和IL-22和IL-20的活性。

已经表明在IL-9存在的情况下诱导IL-22，并有可能参与促进Th1-型免疫应答和炎症。IL-9刺激增殖、激活、分化和/或通过多种方法诱导免疫功能，并有可能参与哮喘、肺肥大细胞增生病和其它疾病，还激活STAT通路。IL-22或IL-9功能拮抗剂可以治疗这些疾病。本发明提供了这种新型的IL-22拮抗剂。

已经表明IL-22参与上调急性期反应物的产生，例如血清淀粉样蛋白A(SAA)、α1-抗胰凝乳蛋白酶和接联球蛋白，并且，在体内注射脂多糖(LPS)时IL-22表达增加，表明IL-22参与炎症应答(Dumoutier，L.et al.，Proc.Nat′l.Acad.Sci.97：10144-10149，2000)。急性期蛋白产物，例如SAA，被认为通过一种短期幸存机制使炎症有益；但是，维持急性期蛋白产物至更长时期会促成慢性炎症并对人体健康有害。这方面的综述，参考CM和Whitehead，AS，Eur.J.Biochem.265：501-523，1999，和Baumann H.和Gauldie，J.Immunology Today 15：74-80，1994。并且，急性期蛋白SAA与一些慢性炎性疾病的发病机理有关，与动脉粥样硬化、类风湿性关节炎有关，并且还是淀粉样变性病中的淀粉样A蛋白的前体(Uhlar，CM andWhitehead，supra.)。因此，IL-22是一种促炎症分子并诱导SAA的产生，拮抗剂将能用于治疗炎性疾病和其它IL-22诱导的急性期应答蛋白相关疾病。本方面提供了这些拮抗剂。例如，降低IL-22诱导的或IL-9诱导的炎症的方法，包括向带有炎症的哺乳动物施用足以降低炎症的量的包含可溶性IL-22RA受体的组合物。并且，抑制炎症哺乳动物炎症应答的方法可以包括：(1)确定血清淀粉样A蛋白的水平；(2)给予含有在可接受的药物载体中的此处所述的可溶性IL-22RA细胞因子受体多肽的组合物；(3)确定给药后血清淀粉样A蛋白的水平；(4)比较第(1)步和第(3)步的血清淀粉样A蛋白的水平，其中血清淀粉样A蛋白水平没有增加或下降预示着炎症反应被抑制。此处所示实验证据表明，IL-22拮抗剂(例如可溶性受体和抗体)在炎性疾病体内模型中确实减少了SAA水平，表明结合、阻断、抑制、减少、拮抗或中和IL-22具有抗炎效果。

证据表明IL-20及其受体与牛皮癣有关。这种多基因皮肤病的特征是，角质化细胞增殖增加，角质化细胞分化改变和免疫细胞向皮肤的浸润。IL-20与牛皮癣有关第一手证据是，转基因小鼠具有类似牛皮癣的异常，观察到过度角化和增厚的表皮。被认为和角质化缺陷有关张力丝数量减少是人牛皮癣的显著的征象。化学诱导和天然产生的小鼠增生皮肤中都发现了线粒体内包涵物。还不知道包涵物的起因以及它们对线粒体功能的影响(如果有的话)。IL-20转基因小鼠表现出许多人牛皮癣的特征。

并且，和正常皮肤相比人牛皮癣皮肤中IL-20受体mRNA(IL-20RA和IL-20RB mRNA)显著上调，进一步表明IL-20在牛皮癣中起一定作用。两个IL-20受体亚基在所有各处表皮的角质化细胞中表达，并在免疫和上皮细胞亚群中表达。我们认为增加活化的IL-20受体的表达可以改变上皮细胞、免疫细胞和角质化细胞之间的相互作用，导致角质化细胞增殖和分化的失调。另外，此处展示的小鼠敲除数据(其中IL-22RA受体被敲除)表明，IL-22RA对转基于动物皮肤中IL-20诱导的炎症效果是必须的。这些结果为如下方面提供了证据，有效敲除IL-22RA的活性，例如通过IL-22RA基因敲除或类似的本发明中的IL-22RA中和性单克隆抗体，能够类似的减少IL-20诱导的皮肤效果和IL-22诱导的皮肤效果，例如在IL-20诱导的牛皮癣、炎性肠病、结肠炎或IL-20诱导的其它炎性疾病和或IL-22诱导的炎性肠病、哮喘、牛皮癣性关节炎、结肠炎、炎性皮肤病和特应性皮炎。

并且，IL-20刺激人角质化细胞HaCaT细胞系的信号传导，暗示这种新型配体在皮肤中有直接活性。另外，已知IL-1β、EGF和TNF-α蛋白质在角质化细胞中有活性，并参与皮肤的增殖和促炎性信号传递，增强对IL-20的应答。在表达IL-20受体的HaCaT和BHK细胞中，IL-20通过STAT3进行信号传递。

如上述讨论和下面的例子所表明的，IL-20涉及牛皮癣的病理。本发明特别提供了一种方法，所述方法通过给予药剂结合、阻断、抑制、减少、拮抗或中和IL-20来治疗牛皮癣。IL-20拮抗剂既可以是结合IL-20的可溶性受体(可溶性IL-22RA)又可以是能结合IL-20或IL-20受体的抗体，例如抗IL-22RA抗体，所述抗体可以是单链抗体或抗体片段。这些拮抗剂将防止IL-20受体的激活。并且，因为IL-20和IL-22都以IL-22RA为共同的受体，拮抗剂例如可溶性IL-22RA或结合到IL-22RA受体的抗体、单链抗体或抗体片段能够被用于同时结合、阻断、抑制、减少、拮抗或中和IL-22或IL-20和IL-22这两者的活性。

牛皮癣是最常见的皮肤疾病之一，影响全世界人口的1-2％。牛皮癣是一种慢性炎性皮肤病，其特征是红斑、边界清楚的丘疹和圆形斑点，覆盖银白色鳞屑。牛皮癣的皮肤损伤是各种瘙痒。受伤区域常发展为牛皮癣病灶。另外，其它外界因素能够加重牛皮癣，包括感染、压力和医药，例如锂、β-阻滞剂和抗疟药。

最常见的牛皮癣种类被称为斑块型。斑块状牛皮癣患者具有稳定的、缓慢生长的斑块，这些斑块在很长时间内基本上不会发生变化。斑块状牛皮癣最普遍地出现在肘膝、臀裂和头皮上。具有对称的趋势。皮褶牛皮癣发生在对磨部(intertriginous)区域，包括腋窝、腹股沟、乳房下区和肚脐，也具有影响头皮、手掌和足底的趋势。个别的病灶是边界清楚的斑块，但是根据其位置有可能是潮湿的。斑块状牛皮癣通常发展缓慢，呈现一种无痛的过程。很少自然消退。

滴状牛皮癣(Eruptive psoriasis)在儿童和青年人中最常见。它在未患牛皮癣的人体或患有慢性斑块状牛皮癣的人体中急性发展。患者出现许多小红斑、鳞状丘疹，经常发生在上呼吸道β-溶血性链球菌感染之后。牛皮癣患者也会发展为脓泡病灶。主要位于手掌和足底，或者是全身的，并伴随发烧、不适、腹泻和关节痛。

大约一半的牛皮癣患者会影响到指甲，表现为孔蚀、指甲增厚或甲床角化过度。大约5-10％的牛皮癣患者伴随关节并发症，并通常发生在涉及到患者的指甲中。虽然一些患者会同时发生典型的类风湿性关节炎，但是许多患有关节疾病的患者属于下面5种和牛皮癣相关的类型中的一种：(1)疾病局限于单一或少数几个小关节中(70％的病例)；(2)血清阴性的风湿样关节炎样疾病；(3)涉及远端指(趾)间关节；(4)严重的毁坏型关节炎，发展为“残毁性关节炎“；和(5)疾病局限在脊柱。

可以给予结合、阻断、减少、拮抗或中和IL-22、IL-20、或IL-20和IL-22这两者的药剂来治疗牛皮癣。优选的拮抗剂是IL-20和IL-22的可溶性受体，例如IL-22RA(SEQ ID NO：3)或结合IL-22RA受体的抗体、抗体片段或单链抗体，例如本发明的中和抗体。这些拮抗剂能够单独给药或和其它已经建立的疗法联合给药，所述疗法例如润滑剂、角质层分离剂、局部用皮质甾类药物、局部用维生素D衍生物、蒽林、系统抗代谢药例如甲氨喋呤、补骨脂素-紫外线疗法(PUVA)、依曲替酯、异维甲酸、环孢霉素A和局部用维生素D3衍生系维生素D3(topical vitamin D3 derivative calcipotriol)。并且，这些拮抗剂能够通过皮下、静脉内或采用含有拮抗剂的乳剂或透皮贴剂透皮给药。如果皮下给药，拮抗剂可以注射到一个或多个牛皮癣斑块中。如果透皮给药，能够采用含有拮抗剂的乳剂、软膏、油膏剂直接对斑块给药。

可以给哮喘、支气管炎或纤维囊泡症或其它炎性肺疾病患者施用IL-20或IL-22的拮抗剂来治疗疾病。可采用任何合适的方法进行拮抗剂给药，包括静脉注射、皮下、支气管灌洗和使用含有拮抗剂的吸入剂。

对IL-22RA cDNA的mRNA在组织中的分布的分析表明，胎盘和脾脏中mRNA水平最高，并且IL-22RA结合配体(IL-22)涉及炎症应答的诱导，包括诱导急性期应答(Dumoutier，L.et al.，Proc.Nat′l.Acad.Sci.97：10144-10149，2000)。因此，本发明的个别实施例是直接使用可溶性IL-22RA和抗IL-22RA抗体作为拮抗剂用于炎症和免疫疾病或症状的治疗，例如牛皮癣、牛皮癣性关节炎、牛皮癣性关节炎、炎性皮肤症状、类风湿性关节炎、炎性肠病(IBD)、克罗恩病、憩室病、哮喘、胰腺炎、I型糖尿病、胰腺癌、胰腺炎、格雷夫斯病(Graves Disease)、结肠和肠癌、自身免疫性疾病、败血病、器官或骨髓移植能够；因内毒素血症导致的炎症、外伤、手术或感染；淀粉样变性病；脾大；移植物抗宿主病；和炎症抑制、免疫抑制、抑制造血、免疫或淋巴细胞、巨噬细胞、T细胞(包括Th1和Th2细胞)的增殖、抑制对病原体或抗原的免疫应答或其它需要抑制IL-22或IL-20细胞因子的例子。

此外，结合此处描述的IL-22RA多肽的抗体或结合性多肽和IL-22RA多肽自身可用于：

1)阻断、抑制、减少、拮抗或中和通过IL-20或IL-22受体的信号，用于治疗急性炎症、外伤导致的炎症、组织损伤、手术、败血病或感染和慢性炎性疾病，例如哮喘、炎性肠病(IBD)、慢性结肠炎、脾大、类风湿性关节炎、复发性急性炎症(例如肺结核)和治疗淀粉样变性病和动脉粥样硬化、卡斯尔曼(氏)病、哮喘和其它和诱导急性期应答相关的疾病。

2)阻断、抑制、减少、拮抗或中和通过IL-20或IL-22受体的信号，用于治疗自身免疫疾病，例如胰岛素依赖性糖尿病(IDDM)、多发性硬化症(MS)、全身性红斑狼疮(SLE)、重症肌无力、类风湿性关节炎和良性乳房疾病(IBD)，通过IL-22RA来防止或抑制免疫细胞中的信号(例如淋巴细胞、单核细胞、粒细胞)(Hughes C et al.，J.Immunol 153：3319-3325，1994)。可选择的抗体，例如包含IL-22RA受体的单克隆抗体(MAb)，也能用作拮抗剂来减少不需要的免疫细胞来治疗自身免疫疾病。可以采用拮抗MAb来治疗哮喘、过敏和其它特应性疾病，例如可溶性IL-22RA受体抑制免疫应答或减少不喜欢的细胞。用本发明的多肽和抗体阻断、抑制、减少或拮抗通过IL-22RA的信号，也可以有助于胰、肾、脑下垂体和神经细胞疾病的治疗。可用于IDDM、NIDDM、胰腺炎和胰腺癌的治疗。IL-22RA可以作为癌症MAb疗法的靶点，其中MAb的拮抗剂抑制癌症的生长并靶向免疫介导的杀伤(Holliger P，and Hoogenboom，H：Nature Biotech.16：1015-1016，1998)。可溶性IL-22RA的Mab还可以用于治疗肾病，例如肾小球硬化症、膜性神经病变、淀粉样变性病(也影响其它组织中的肾)、肾动脉硬化症、不同起源的肾小球肾炎、肾脏纤维增生疾病和伴随全身性红斑狼疮、胰岛素依赖性糖尿病、II型糖尿病(NIDDM)、肾肿瘤的肾功能失调和其它疾病。

3)干扰、增强、加大或启动通过IL-20或IL-22受体的信号，治疗自身免疫疾病，例如胰岛素依赖性糖尿病、MS、全身性红斑狼疮、重症肌无力、类风湿性关节炎和炎性肠病。抗IL-22RA中和和单克隆抗体可以向淋巴细胞或其它免疫细胞发信号进行分化、改变增殖或改变细胞因子的产生或细胞表面蛋白来改善自身免疫。特异性的，调节T辅助细胞应答到另一种细胞因子分泌模式可以改变自身免疫应答，改善疾病(Smith JA et al.，J.Immunol.160：4841-4849，1998)。相似的，拮抗抗可溶性IL-22RA，抗可溶性IL-22RA/CRF2-4异二聚体和多聚体单克隆抗体可以用于发信号、减少和改变参与哮喘、过敏和异位性疾病的免疫细胞。通过IL-22RA发信号还可用于胰脏、肾脏、脑下垂体和神经细胞疾病。可对治疗胰岛素依赖性糖尿病、非胰岛素依赖性糖尿病、胰腺炎和胰腺癌有益。IL-22RA可以作为MAb治疗胰腺癌的靶点，其中发信号的MAb抑制癌生长并且以免疫介导的杀伤为靶点(Tutt，AL et al.，J Immunol.161：3175-3185，1998)。相似的，可以用本发明的包含IL-22RA可溶性受体单克隆抗体治疗肾细胞癌。

在治疗上述的自身免疫疾病、异位性疾病、非胰岛素依赖性糖尿病、胰腺炎和肾功能失调中，此处所述可溶性IL-22RA多肽能用于结合、阻断、抑制、减少、拮抗或中和单独的或共同的IL-22或IL-20活性。可溶形式的IL-22RA可以用于促进由Th细胞介导的抗体应答和/或促进淋巴细胞或其它免疫细胞产生IL-4或其它细胞因子。

本发明的可溶性包含IL-22RA受体可用作IL-20或IL-22细胞因子的拮抗剂。这种拮抗效果能够通过直接中和或结合IL-20或IL-22来实现。除了用于拮抗，本发明的可溶性受体能够结合IL-22并作为IL-20或IL-22细胞因子的载体蛋白，用于运输配体到体内不同组织、器官和细胞。像这样，本发明的可溶性受体能被融合或偶联到分子、多肽或化学半部分上，引导可溶性受体-配体复合物到达特定位点，例如一个组织、特定免疫细胞或肿瘤。例如，在急性感染或某些癌症中，通过IL-22的活性诱导炎症和局部急性期应答蛋白可以给疾病治疗有益。因此，本发明的可溶性受体可以用作特异性的引导IL-20或IL-22活性。见Cosman，D.Cytokine 5：95-106，1993；andFernandez-Botran，R.Exp.Opin.Invest.Drugs 9：497-513，2000。

此外，本发明的可溶性受体能被用于稳定IL-22或IL-20，来增强生物利用度和治疗有效时间，和/或通过稳定配体减少降解或清除或通过让配体靶向到体内作用部位来增强配体的效果。例如天然产生的IL-6/可溶性IL-6R复合物稳定IL-6，并能通过gp130受体发信号。参见，Cosman，D.同上，和Fernandez-Botran，R.同上。此外，IL-22RA可以和关联配体(例如IL-22)联用形成配体/可溶性受体复合物。这些复合物可用于刺激来自呈递伴侣受体亚基例如pDIRS1(IL-20RB)或CRF2-4(IL-10RB)的细胞的应答。IL-22RA/配体复合物的细胞特异性可以和单独给予配体的细胞特异性不同。并且，复合物可以具有独特的药物代谢动力学特性，例如优秀的半衰期、剂量/应答和器官或组织特异性。IL-22RA/IL-22或IL-22RA/IL-20复合物因此可以具有激动剂活性，来增影响强免疫应答或刺激肾小球膜细胞或刺激肝细胞。可选择的，只有表达和复合物二聚化的参与信号转导的亚基的组织可受到和对IL6/IL6R复合物的应答相似的影响(Hirota H.等人，Proc.Nat′l.Acad.Sci.92：4862-4866，1995；Hirano，T.in Thomason，A.(Ed.)”The Cytokine Handbook”，第3版，p.208-209)。IL12和CNTF的可溶性受体/细胞因子复合物表现相似的活性。

并且，炎症是有机体抵抗侵入物质的一种保护性应答。炎症是一种级联事件，涉及许多细胞和体液性介质。一方面，抑制炎症应答能导致宿主免疫受损；但是，如果对其不加抑制，炎症能导致严重的并发症，包括慢性炎性疾病(例如牛皮癣、关节炎、类风湿性关节炎、多发性硬化症、炎性肠病等)、败血症性休克和多器官衰竭。重要的是，这些不同的疾病状态拥有共同的炎症介质。特征为炎症的疾病集合对人发病率和死亡率有巨大影响。因此，清楚，抗炎症蛋白，例如IL-22RA和抗IL-22RA抗体，可能拥有重要的针对大量人类和动物疾病的治疗潜力，从哮喘和过敏到自身免疫疾病和败血症性休克。

1.关节炎

关节炎，包括骨关节炎、类风湿性关节炎、损伤引起的关节炎关节等，是可从使用消炎蛋白例如本发明的IL-22RA多肽的治疗受益的常见炎性病状。例如，类风湿性关节炎(RA)是影响整个身体的全身性疾病，其是最普遍的关节炎形式中的一种。其特征在于关节滑膜的炎症，该炎症导致疼痛、强直、温热、发红和肿胀。炎症细胞释放可降解骨和软骨的酶。作为类风湿性关节炎的结果，发炎的关节衬里(jointlining)，滑膜，可侵入和破坏骨和软骨，导致关节损坏、严重疼痛和其他生理学效应。被影响的关节可丧失其形状和排列，导致疼痛和丧失活动能力。

类风湿性关节炎(RA)是免疫介导的疾病，其特征明确地在于导致重度残疾和增加的死亡率的炎症和随后的组织破坏。各种细胞因子局部地产生于患风湿症的关节。大量研究已证明IL-1和TNF-α，两种原型促炎细胞因子，在参与滑液炎症和渐进性关节损毁的机制中起着重要作用。事实上，在患有RA的患者中施用TNF-α和IL-1抑制剂已导致炎症的临床和生物学体征的显著提高和骨质侵蚀和软骨破坏的放射学体征的降低。然而，尽管存在这些鼓舞人心的结果，显著百分比的患者不对这些试剂起反应，暗示着其他介质也参与关节炎的病理生理学(Gabay，Expert.Opin.Biol.Ther.2(2)：135-149，2002)。这些介质中的一种可以是IL-20或IL-22，这样，结合或抑制IL-22或IL-20活性的分子，例如IL-22RA多肽、或抗IL-22RA抗体或结合伴侣，可用作在类风湿性关节炎和其他关节炎疾病中减少炎症的有价值的治疗剂。

存在本领域内已知的类风湿关节炎的几种动物模型。例如，在胶原诱导的关节炎(CIA)模型中，小鼠发展和人类类风湿性关节炎非常相似的慢性炎性关节炎。因为CIA和RA共有相似的免疫学和病理学特征，所以这使其成为筛选潜在的人消炎化合物的理想模型。CIA模型在小鼠中是个熟知的模型，其发生依赖于免疫应答和炎症应答。所述免疫应答包括对作为抗原提供的胶原起反应的B细胞和CD4+T细胞之间的相互作用，并导致抗胶原抗体的产生。炎症相是组织对炎症的介质的应答的结果，是这些抗体中的一些抗体和小鼠的天然胶原发生交叉反应并激活补体的级联反应的结果。使用CIA模型的有利方面是发病机理的基本机制是已知的。已鉴定了II型胶原上的相关T细胞和B细胞表位，已确定了和免疫介导的关节炎相关的免疫学参数(例如，延迟型过敏和抗胶原抗体)和炎症参数(例如，细胞因子、趋化因子和降解基质的酶)，因此其可用于在CIA模型中评价受试化合物的功效(Wooley，Curr.Opin.Rheum.3：407-20，1999；Williams等人，Immunol.89：9784-788，1992；Myers等人，Life Sci.61：1861-78，1997；和Wang等人，Immunol.92：8955-959，1995)。

给这些CIA模型小鼠施用可溶性的包含IL-22RA2的多肽(zcytor16)，例如zcytor16-Fc4或其他IL-22RA可溶性和融合蛋白，被用于评估可溶性IL-22RA2(作为用于减轻症状和改变疾病的病程的IL-22的拮抗剂)的用途。此外，结果显示IL-22被IL-22RA2抑制的结果可提供这样的概念的证据，所述概念是，其他IL-22拮抗剂，例如可溶性IL-22RA或针对其的抗体，也可用于改善疾病的症状和改变疾病的病程。因为IL-22RA2的配体IL-22诱导产生涉及类风湿性关节炎发病的SAA，并且表明在体内和体外IL-22RA2能够抑制IL-22和SAA的活性，系统或局部给予包含IL-22RA2多肽，例如zcytor16-Fc4或其它IL-22可溶性受体(例如IL-22RA；SEQ ID NO：3)和抗IL-22RA抗体和融合蛋白，有可能抑制RA中的炎症应答。注射10ugzcytor16-Fc(每周3次，连续4周)可显著减少疾病得分(爪评分、发炎率或发病率)。其它有潜力的治疗剂包括IL-22RA多肽、抗IL-22RA抗体或抗IL-22抗体或结合伴侣等。

一个小组已经发现，和对照小鼠相比抗小鼠IL-22抗体可以减少小鼠CIA-模型的症状，因此从概念上表明可溶性IL-22RA多肽和IL-22RA的中和抗体可以对人类疾病治疗有益。在对模型进行预防性引种或CIA诱导关节炎被诱导后给予单一小鼠-IL-22特异性大鼠单克隆抗体(P3/1)能减少动物的关节炎的症状(WIPO Publication02/068476；2002年9月9日发表)。因此，本发明的可溶性IL-22RA多肽和抗IL-22RA抗体，包括本发明的中和抗人IL-22RA抗体，能被用于中和IL-22和IL-20，治疗特定的人类疾病，例如牛皮癣、牛皮癣性关节炎、内毒素血症、炎性肠病、结肠炎和此处描述的其它炎症症状。

2.内毒素血症

内毒素血症是通常由传染因子例如细菌和其他传染性疾病因子、脓毒症、中毒性休克综合征造成的重症，或是遭受机会感染等的免疫受损患者中的重症。消炎蛋白例如本发明的IL-22RA多肽和抗体的治疗性用途可有助于预防和治疗人和动物中的内毒素血症。IL-22RA多肽、抗IL-22RA抗体、或抗IL-22抗体或结合伴侣，可用作在内毒素血症中减轻炎症和病理效应的有价值的治疗剂。

脂多糖(LPS)诱导的内毒素血症涉及许多在传染性疾病中产生病理效应的促炎介质的参与，啮齿类动物中的LPS诱导的内毒素血症是被广泛使用和接受的用于研究潜在的促炎因子或免疫调节剂的药理学效应的模型。革兰氏阴性细菌产生的LPS在脓毒性休克的发病机理中是主要的致病因子(Glausner等人，Lancet 338：732，1991)。事实上可通过给动物单次注射LPS实验式地诱导休克样状态。由对LPS起反应的细胞产生的分子可直接或间接地靶向病原体。尽管这些生物学应答保护宿主免受侵入性病原体，但其也可能产生有害方面。因此，作为重度革兰氏阴性细菌感染的结果发生的先天免疫的巨大刺激，导致细胞因子和其他分子的过量产生，导致致命综合症、脓毒性休克的发生，所述疾病的特征在于发烧、低血压、弥散性血管内凝血和多器官衰竭(Dumitru等人Cell 103：1071-1083，2000)。

LPS的这些毒效应主要和导致多炎症介质的释放的巨噬细胞活化相关。在这些介质中，如通过中和抗TNF抗体的施用(Beutler等人，Science 229：869，1985)预防LPS毒性所表明的，TNF似乎起着至关重要的作用。已很好地确定，给C57B1/6小鼠肺部注射入大肠杆菌LPS将在大约注射后2小时导致循环IL-6、TNF-α、IL-1和急性期蛋白(例如，SAA)的显著增加。LPS的毒性似乎由这些细胞因子介导，因为抗这些介质的被动免疫可导致降低的死亡率(Beutler等人，Science229：869，1985)。用于预防和/或治疗脓毒性休克的有效的免疫干预策略包括抗TNF mAb、IL-1受体拮抗剂、LIF、IL-10和G-CSF。

给这些LPS诱导的模型施用可溶性的包含IL-22RA2的多肽，例如Zcytor16-Fc4或其他IL-22RA可溶性或融合蛋白，可用于评价IL-22RA2改善LPS诱导的疾病的症状和改变其病程的用途。此外，显示IL-22被IL-22RA2抑制的结果可提供这样的概念的证据，所述概念是，其他IL-22拮抗剂，例如可溶性IL-22RA或针对其的抗体，也可用于在LPS诱导的模型中改善症状和改变疾病的病程。所述模型将显示通过LPS注射产生的IL-22的诱导和通过IL-22RA2多肽进行的疾病的有效治疗。因为LPS诱导可能促进IL-22，SAA或其它病理学促炎因子的产生，有可能促进内毒素血症的病理症状，因此可使用拮抗剂IL-22RA2多肽中和IL-22活性，SAA或其他促炎因子来减轻内毒素血症的症状，例如在内毒素性休克中看到的症状。其他潜在的治疗剂包括IL-22RA多肽、抗IL-22RA抗体或结合伴侣等。

3炎性肠病IBD

在美国大约有500,000人遭受可影响结肠或直肠(溃疡性结肠炎)或两者或小肠和大肠(克罗恩病)的炎性肠病(IBD)。这些疾病的发病机理不清楚，但其涉及受影响的组织的慢性炎症。IL-22RA多肽、抗IL-22RA抗体或抗IL-22抗体或结合伴侣可用作在IBD和相关疾病中减轻炎症和病理学效应的有价值的治疗剂。

溃疡性结肠炎(UC)是大肠(通常称为结肠)的炎性疾病，其特征在于结肠的粘膜或最内层衬里(innermost lining)的炎症和溃疡。该炎症经常使结肠排空，导致腹泻。症状包括粪便稀松和关联性腹部绞痛、发烧和体重减轻。尽管UC的确切原因不清楚，但最近的研究表明身体的天然防御系统抵御身体中被身体当作外来物的蛋白(“自身免疫反应”)。可能因为其和消化道内的细菌蛋白相似，这些蛋白可激起或刺激开始破坏结肠衬里的过程。当结肠的衬里被破坏时，溃疡形成释放粘液、脓和血液。疾病通常在直肠区域开始，最终可扩展至整个大肠。炎症的重复发作导致肠壁的加厚和具有瘢痕组织的直肠。结肠组织的死亡或脓毒症可伴随严重的疾病发生。溃疡性结肠炎的症状在严重度上不同，其发病可以是渐进的或是突然的。可通过许多因素包括呼吸道感染或应激引起发作。

尽管目前还没有治愈UC的方法，但治疗集中在抑制结肠衬里中的异常炎症过程。可获得包括皮质类固醇免疫抑制剂(例如，硫唑嘌呤、巯嘌呤和氨甲蝶呤)和氨基水杨酸的治疗法来治疗疾病。然而，长期使用免疫抑制剂例如皮质类固醇和硫唑嘌呤可导致严重的副作用，包括骨萎缩、白内障、感染以及肝脏和骨髓效应。在其中目前的治疗不成功的患者中，手术是种选择。手术包括切除完整的结肠和直肠。

存在可部分模拟慢性溃疡性结肠炎的几种动物模型。最广泛使用的模型是2，4，6-三硝基苯磺酸/乙醇(TNBS)诱导的结肠炎模型，其诱导结肠中的慢性炎症和溃疡。当通过直肠内滴注法将TNBS导入易感小鼠后，其在结肠粘膜中诱导T细胞介导的免疫应答，在该情况下，导致大片的粘膜炎症，其特征在于T细胞和巨噬细胞通过大肠的整个壁的密集渗透。此外，该组织病理学还伴随着渐进体重减轻(消瘦)、血性腹泻、直肠脱垂和大肠壁加厚(Neurath等人Intern.Rev. Immunol.19：51-62，2000)。

另一种结肠炎模型使用葡聚糖硫酸钠(DSS)，该葡聚糖硫酸钠诱导急性结肠炎，所述急性结肠炎通过血性腹泻、体重减轻、结肠缩短和伴有嗜中性粒细胞渗透的粘膜溃疡来表现。DSS诱导的结肠炎的组织学特征在于炎症细胞渗透入粘膜固有层(lamina propria)，淋巴样增生、灶性隐窝损伤(focal crypt damage)和上皮溃疡形成。据认为这些变化是由于DSS对上皮的毒害作用和粘膜固有层细胞的吞噬作用以及TNF-α和IFN-γ的产生而产生的。尽管其常用，但关于DSS和人疾病的关联性的机制的几个问题仍未解决。DSS被当作不依赖于T细胞的模型，因为在T细胞缺陷型动物例如SCID小鼠中观察到其效应。

给这些TNBS或DSS模型施用可溶性的包含IL-22RA2的多肽，例如zcytor16-Fc4或其他IL-22RA可溶性和融合蛋白，可用于评价可溶性IL-22RA改善胃肠疾病的症状和改变其病程的用途。此外，显示IL-22被IL-22RA2抑制的结果提供了这样的概念的证据，所述概念是，其他IL-22拮抗剂，例如IL-22RA或针对其的抗体，也可用于改善结肠炎/IBD模型中的症状和改变疾病的病程。我们通过RT-PCR技术观察到在DSS小鼠结肠组织中IL-22表达增高，和在肠内细胞系中IL-22和IL-1β的协同活性。这表明IL-22可能在结肠炎炎症应答中扮演一定角色，并且通过给予IL-22RA2多肽中和IL-22活性是一种有潜力的IBD疗法。其它有潜力的治疗剂包括IL-22RA多肽、抗IL-22RA抗体或抗IL-22抗体或结合伴侣等。

4.牛皮癣

牛皮癣是影响超过七百万美国人的慢性皮肤病。当新的皮肤细胞生长异常，导致发炎的、肿胀的和鳞状斑的皮肤(其中老皮肤没有足够快地脱落)时，牛皮癣发生。斑块状牛皮癣(plaque psoriasis)(最常见的形式)的特征在于上面覆盖银白色鳞屑的皮肤炎症斑(“损伤”)。牛皮癣可限制在少数斑中或影响中等至大面积的皮肤，最普遍地出现在头皮、膝盖、肘和躯干。尽管其是高度可见的，但牛皮癣不是接触性传染病。该病的发病机理涉及受影响的组织的慢性炎症。IL-22RA多肽、抗IL-22RA抗体或抗IL-22和抗IL-20抗体或结合伴侣可用作减轻牛皮癣、其他炎性皮肤病、皮肤和粘膜过敏以及相关疾病中的炎症和病理效应的有价值的治疗剂。

牛皮癣是T细胞介导的皮肤炎性病症，其可产生极大的不适。其是没有治愈方法和影响所有年龄的人的疾病。牛皮癣影响大约百分之二的欧洲和北美人口。尽管具有轻微牛皮癣的个体通常可用局部药剂控制其疾病，但世界范围内超过一百万患者需要紫外或全身性免疫抑制剂治疗。不幸的是，紫外照射的不方便性和危险性以及许多治疗法的毒性限制了其长期使用。此外，患者通常具有牛皮癣的复发，在一些情况下，在停止免疫抑制剂治疗后立刻出现反弹。

IL-20是一种新的IL-10同系物，表明能引起皮肤异常新生死亡，包括在IL-20转基因小鼠中异常的表皮分化(Blumberg H et al.，Cell104：9-19，2001)。牛皮癣皮肤中IL-20受体显著上调。因为IL-22和IL-20受体共享一个受体亚基(zcytor11)，并且IL-22转基因小鼠表现出相似的表型，表明IL-22有可能也参与炎症皮肤疾病，例如牛皮癣。皮下或局部给予IL-22RA多肽或抗IL-22RA抗体拮抗剂有可能减少炎症和症状。其它有潜力的治疗剂包括IL-22RA多肽、可溶性zcytor11/CRF2-4受体多肽或抗IL-22抗体或结合伴侣等。

此外，人牛皮癣病灶中表现IL-22和IL-20的过量表达，表明IL-22和IL-20一样也与人牛皮癣有关。此外，如此处所述，在转基因小鼠中过量表达IL-20或IL-22表现出表皮增厚和表现为免疫细胞参与的牛皮癣表型；并且向正常小鼠增加注射IL-22表现出表皮增厚和表现为免疫细胞参与的牛皮癣表型，此表型能被可溶性受体拮抗剂IL-22RA2消除(zcytor16；WIPO Publication No.WO 01/40467)。这些体内数据进一步表明促炎症IL-22与牛皮癣有关。像这样，IL-22和IL-20活性拮抗剂，例如IL-22RA可溶性受体及其相应抗体，包括本发明的抗人IL-22RA单克隆抗体和中和抗体，可用于治疗炎性疾病，尤其是作为IL-22和IL-20单独或两者共同的拮抗剂治疗牛皮癣。此外，IL-22活性拮抗剂，例如IL-22RA可溶性受体及其相应抗体，包括本发明的抗人IL-22RA单克隆抗体和中和抗体，可用于治疗其它炎性疾病，例如作为试剂结合、阻断、抑制、减少、拮抗或中和IL-22和IL-20，治疗特应性皮炎、炎性肠病、结肠炎、内毒素血症、关节炎、类风湿性关节炎和牛皮癣性关节炎成人呼吸系统疾病(ARD)、败血症性休克、多器官衰竭、炎性肺损伤例如哮喘或支气管炎、细菌性肺炎、牛皮癣、湿疹、特异反应的和接触性皮炎、炎性肠病例如溃疡性结肠炎和克罗恩病。

此外，本发明的抗IL-22RA抗体和IL-22RA可溶性受体能用于预防和治疗和此处所述的一些炎性疾病和癌症(例如化疗和恶病质)和感染性疾病相关的体重减轻。例如，严重体重减轻是败血病、多发性硬化症、RA的模型和肿瘤模型的一个关键标志。此外，体重减轻是许多人类疾病包括癌症、感染性疾病和炎性疾病的一个关键参数。此处所述注射IL-22A腺病毒的小鼠表现出体重减轻。可以在小鼠中注射此处所述的IL-22腺病毒来检测抗IL-22抗体和IL-22拮抗剂，例如本发明的可溶性IL-22RA受体及其抗体和zcytor16(IL-22RA2)受体预防和治疗体重减轻的能力。确定这样的IL-22拮抗剂的预防或治疗方案的方法在本领域技术人员中是已知的，并可以采用此处所述方法进行确定。

IL-22RA可溶性受体多肽及其抗体还可以用于检测IL-22或IL-20配体的循环水平的诊断系统中，还可以用在检测和急性期炎症应答相关的IL-22。在相关的实施例中，抗体或本发明的其它特异性结合IL-22RA可溶性受体的试剂能被用于检测循环中的受体多肽；反之，发明的IL-22RA可溶性受体自身可以用于检测血液循环中或局部作用的IL-22或IL-20多肽。病理学条件可以预示配体或受体多肽的升高或抑制水平，包括炎症或癌症。已知IL-22诱导相关急性期炎症应答。另外，检测急性期蛋白或核酸例如IL-20或IL-22被某些疾病状态(例如牛皮癣、类风湿性关节炎、结肠炎、炎性肠病)的慢性炎症状况所预示。检测这些状况可以帮助疾病诊断和帮助医生选择合适的疗法。

中和性抗IL-22或IL-20抗体的子宫内(In utero)给药可用于在过量表达IL-22的IL-22转基因幼崽(pup)或过量表达IL-20的IL-20转基因幼崽的疾病模型中，通过减少或消除皮肤表型来显示体内功效。在本领域存在使用拮抗剂例如中和单克隆抗体(mAb)进行子宫内治疗的先例。在一种情况下，B细胞的B-1亚型的产生明显地受到用对于B细胞特异性分子CD19是特异性的mAb治疗怀孕的雌性小鼠的影响(例如，Krop I.等人，Eur.J.Immunol.26(1)：238-42，1996)。Krop等人在怀孕后的第9天开始用500ug PBS中的大鼠抗小鼠CD19mAb(或大鼠同种型匹配的对照Ab)腹膜内定期注射怀孕小鼠，随后隔日注射直至生产。也在10天大小时用500ug这些抗体注射幼崽一次。在另一种情况下，Tanaka等人发现在使用抗IL-2受体β链的单克隆抗体的子宫内治疗中，完全消除了Thy-1+树突样表皮细胞的产生。I L-2受体的两个不同亚基，即α链(IL-2Rα)和β链(IL-2Rβ)，在整个胚胎胸腺个体发生过程中以几乎相互排斥的方式表达。通过施用抗IL-2R的中和mAb阻断IL-2Rβ(IL-2R的信号转导组分)，导致Thy-1+皮肤树突样表皮细胞的完全和选择性消失。任何其他T细胞亚型的发生都不受损害。这表明IL-2在胚胎Vγ5+细胞和其后代的发生中起着至关重要的作用(参见，Tanaka，T.等人，Int Immunol. 4(4)：487-9，1992)。此外，Schattemann GC等人使用子宫内系统显示PDGF-A是正常鼠类心血管发育所必需。几个证据显示血小板衍生的生长因子A链(PDGF-A)是正常胚胎心血管发育所必需的。将抗PDGF-A中和抗体导入小鼠子宫内蜕膜导致体内PDGF-A配体-受体相互作用选择性中断18-24小时，使得能够确定PDGF-A是否是心血管发育所必需的和需要其的时间(参见，Schattemann GC等人，Dev.Biol. 176(1)：133-42，1996)。这些结果，和本领域中描述的其他结果，提供了拮抗剂例如中和mAbs或可溶性受体可在子宫内引起强效应的证据。类似地，可以有数据显示，在分别过量表达IL-20和IL-22的IL-20和IL-22转基因幼崽疾病模型中在体内用单克隆抗体减少或消除皮肤表型，表明了中和IL-20或IL-22的功效。这些转基因小鼠出生时带有“光泽的“皮肤形态，至少部分是因为此处所述的表皮增厚。表达很低水平的转基因细胞因子的IL-20转基因幼崽能够恢复并生存喂养，但是IL-22转基因小鼠出生后很快死亡，通常在5天之内。

例如，IL-20中和抗体包括抗体，例如能结合IL-20抗原表位和中和IL-20活性的中和单克隆抗体。相应的，IL-20的拥有抗原表位的肽和多肽可用于增加结合此处所述的IL-20多肽的抗体，还能用于确定和筛选中和和可以结合、阻断、抑制、减少、拮抗或中和IL-20活性的抗IL-20单克隆抗体。本发明的这种中和单克隆抗体能结合IL-20抗原表位。将例如用DNASTAR Protean程序(DNASTAR，Inc.，Madison，WI)通过Jameson-Wolf做图预测的SEQ ID NO：8中的这种表位作为优选的抗原表位，其可通过本领域技术人员来确定。这些抗原表位包括：SEQ ID NO：8的氨基酸残基42(异亮氨酸)至氨基酸残基102(天冬氨酸)；SEQ ID NO：8的氨基酸残基42(异亮氨酸)至氨基酸残基60(异亮氨酸)；SEQ ID NO：8的氨基酸残基42(异亮氨酸)至氨基酸残基81(半胱氨酸)；SEQ ID NO：8的氨基酸残基42(异亮氨酸)至氨基酸残基96(赖氨酸)；SEQ ID NO：8的氨基酸残基42(异亮氨酸)至氨基酸残基102(天冬氨酸)；SEQ ID NO：8的氨基酸残基60(异亮氨酸)至氨基酸残基69(谷氨酸)；SEQ ID NO：8的氨基酸残基60(异亮氨酸)至氨基酸残基96(赖氨酸)；SEQ ID NO：8的氨基酸残基60(异亮氨酸)至氨基酸残基102(天冬氨酸)；SEQ IDNO：8的氨基酸残基69(谷氨酸)至氨基酸残基81(半胱氨酸)；SEQID NO：8的氨基酸残基69(谷氨酸)至氨基酸残基96(赖氨酸)；SEQID NO：8的氨基酸残基69(谷氨酸)至氨基酸残基102(天冬氨酸)；SEQ ID NO：8的氨基酸残基81(半胱氨酸)至氨基酸残基96(赖氨酸)；SEQ ID NO：8的氨基酸残基81(半胱氨酸)至氨基酸残基102(天冬氨酸)；SEQ ID NO：8的氨基酸残基96(赖氨酸)至氨基酸残基102(天冬氨酸)。

除了此处描述的其他疾病模型以外，可使用重症联合免疫缺陷(SCID)小鼠模型测量可溶性抗IL-22RA抗体对来源于人牛皮癣病灶的炎症组织的体内活性。已发展了几种小鼠模型，在所述模型中将人细胞移植入免疫缺陷小鼠(统称为异种移植物模型)；参见，例如，CattanAR，Douglas E，Leuk.Res. 18：513-22，1994和Flavell，DJ，Hematological Oncology 14：67-82，1996。作为牛皮癣的体内异种移植物模型，将人牛皮癣皮肤组织移植入SCID小鼠模型，并用合适的拮抗剂进行激发。此外，可使用本领域内的其他牛皮癣动物模型评价IL-20和IL-22拮抗剂，例如将人牛皮癣皮肤移植物移植入AGR129小鼠模型，并用合适的拮抗剂攻击(例如，参见，Boyman，0.等人，J.Exp. Med.Online publication #20031482，2004，此处引用作为参考)。结合、阻断、抑制、减少、拮抗或中和IL-22或IL-20和IL-22两者的活性的抗IL-22RA抗体是优选的拮抗剂，然而，可在该模型中可以使用抗IL-20和抗IL-22抗体(单独地或一起地)、可溶性IL-22RA以及其他IL-20和IL-22的拮抗剂。类似地，可在SCID模型中使用来源于人结肠炎、IBD、关节炎、或其他炎性损伤的组织或细胞来确定此处描述的IL-20和IL-22的拮抗剂的消炎性质。

可通过对具有人炎症组织(例如，牛皮癣损伤等)的SCID小鼠或此处描述的其他模型施用抗IL-22RA抗体或可溶性IL-22RA化合物来检验这样的疗法，该疗法经设计使用抗IL-22RA抗体或其衍生物、激动剂、缀合物或变体来消除、延迟或减轻炎症。使用本领域熟知的方法，以在一段时间内在受治疗的群体内增加的消炎效果来测量和通过统计学的方法评价治疗的功效。一些示例性方法包括，但不限于在牛皮癣模型中测量例如表皮厚度、上层真皮中的炎症细胞的数目和角化不全的程度。这些方法在本领域是已知的并且在此处得到描述。例如，参见，Zeigler，M.等人Lab Invest 81：1253，2001；Zollner，T.M.等人J.Clin.Invest.109：671，2002；Yamanaka，N.等人Microbio.l Immunol.45：507，2001；Raychaudhuri，S.P.等人Br. J.Dermatol.144：931，2001；Boehncke，W.H等人Arch.Dermatol. Res.291：104，1999；Boehncke，W.H等人.J.Invest.Dermatol. 116：596，2001；Nickoloff，B.J.等人Am.J.Pathol.146：580，1995；Boehncke，W.H等人J.Cutan.Pathol.24：1，1997；Sugai，J.，M.等人J.Dermatol.Sci.17：85，1998；和Villadsen L.S.等人J.Clin.Invest.112：1571，2003。也要使用熟知的方法例如流式细胞仪(或PCR)在一段时间内监控炎症以对存在于样品中的炎症或损伤细胞数目、IBD的评分(体重减轻、腹泻、直肠出血、结肠长度)、CIARA模型的爪疾病评分和炎症评分进行定量。例如，适合在该模型中检验的治疗策略包括使用抗IL-22RA抗体、其他IL-20和IL-22拮抗剂(单独地或一起地)、或相关缀合物或基于破坏抗IL-22RA抗体和其配体IL-20和IL-22的相互作用的拮抗剂的直接治疗，或基于细胞的疗法，其使用抗IL-22RA抗体或其衍生物、激动剂、缀合物或变体。

此外，牛皮癣是和增生性表皮角质细胞和浸润性单核细胞(包括CD4+记忆T细胞、嗜中性粒细胞和巨噬细胞)相关的慢性炎性皮肤病(Christophers，Int.Arch.Allergy Immunol.，110：199，1996)。目前认为，环境抗原在起始和促进该疾病的病理学中起着重要作用。然而，据认为，对自身抗原的耐受性的丧失介导了牛皮癣的病理学。据认为树突细胞和CD4⁺T细胞在介导导致病理学的免疫应答的抗原呈递和识别中起着重要作用。我们最近已经发展了基于CD4+CD45RB转移模型(Davenport等人，Internat.Immunopharmacol.，2：653-672)的牛皮癣模型。给小鼠施用抗IL-20、抗IL22或针对IL20R和/或IL22R的抗体，例如本发明的抗IL-22RA抗体或可溶性IL-22RA。抑制疾病评分(皮肤损伤、炎症细胞因子)表明了IL-20和IL-22的拮抗剂(例如抗IL-22RA抗体或IL-22RA可溶性受体或其它拮抗剂，例如针对IL20和/或IL-22的抗体或它们的受体)在牛皮癣中的功效。

特应性皮炎

在特应性皮炎(AD)患者样本中IL-20和IL-22都上调。AD是普通的慢性炎性疾病，其特征在于辅助T细胞亚型2(Th2)的过度活化的细胞因子。尽管不知道AD的确切病因，但其已涉及多个因素，包括极度活跃的Th2免疫应答、自身免疫性、感染、变应原和遗传倾向。疾病的关键特性包括干燥病(皮肤的干燥)、瘙痒症(皮肤的瘙痒)、结膜炎、炎性皮肤损伤、金黄色葡萄球菌(Staphylococcus aureus)感染、提高的血液嗜酸性粒细胞增多症、血清IgE和IgG1的提高、和伴随T细胞、肥大细胞、巨噬细胞和嗜酸性粒细胞浸润的慢性皮炎。已公认金黄色葡萄球菌的建群使AD恶化和使该皮肤病的慢性永生。

通常在患有哮喘和过敏性鼻炎的患者中发现AD，其通常是过敏性疾病的初始表现。西方国家中大约20％的人口遭受这些过敏性疾病，由于未知原因，发展中国的AD发病率正在上升。AD通常始于儿童时期，其通常可从青春期持续至成人期。目前对于AD的治疗包括局部施用皮质类固醇、口服环孢菌素A、非皮质类固醇免疫抑制剂例如他克莫司(以软膏形式存在的FK506)和干扰素-γ。尽管存在各种AD的治疗法，许多患者的症状并未改善，或其对药物治疗具有不利的反应，存在对其它更有效的治疗剂的研究的需要。本发明的可溶性IL-22RA多肽和抗IL-22RA抗体，包括本发明的中和抗人IL-22RA抗本，可用于中和IL-22和IL-20，治疗特定的人疾病例如特应性皮炎、炎性皮肤病和此处公开的其他炎性病症。

对于药物用途，配制用于根据常规方法肠胃外特别是静脉内或皮下递送的本发明的可溶性IL-22RA或抗IL-22RA抗体。通过例如使用微型泵(mini-pumps)或其他合适的技术进行推注、受控释放或通过在通常1至数小时的时间内的输注进行静脉内给药。一般地，药物制剂包含造血蛋白和药物可接受的载体例如盐水、缓冲盐水、5％的葡萄糖水溶液等。制剂还可包含一种或多种赋形剂、防腐剂、增溶剂、缓冲剂、白蛋白以防止蛋白在瓶子表面丢失，等等。当使用这样的组合治疗时，可将细胞因子组合在单一制剂中或以分开的制剂施用。配制的方法在本领域是已知的，公开于例如Remington′s PharmaceuticalSciences，Gennaro，ed.，Mack Publishing Co.，Easton PA，1990中，其在此引用作为参考。治疗剂量通常为每天0.1至100mg/kg患者体重、优选地每天0.5-20mg/kg的范围内，由临床医生根据已接受的标准，考虑要治疗的病症的性质和严重度、患者体质等确定确切的剂量。剂量的确定在本领域技术人员的水平之内。通常在化学疗法后或骨髓移植后在长达28天的一段时间内施用蛋白或施用至达到＞20,000/mm³、优选地＞50,000/mm³的血小板计数。更一般地，在一周或更短的时间内，通常在1至3天的时间内施用蛋白。一般地，本发明的可溶性IL-22RA或抗IL-22RA抗体的治疗有效量是这样的量，该量在淋巴样或骨髓祖细胞的增殖和/或分化上足以产生临床上显著的增加，该增加表现为成熟细胞(例如血小板或嗜中性粒细胞)的循环水平增加。因此持续治疗血小板病症直至达到至少20,000/mm³、优选地50,000/mm³的血小板计数。本发明的可溶性IL-22RA或抗IL-22RA抗体也可以和其他细胞因子例如IL-3、-6和-11、干细胞因子、促红细胞生成素、G-CSF和GM-CSF一起施用。在组合治疗的方案中，其他细胞因子的日剂量一般是：EPO，150U/kg；GM-CSF，5-15lg/kg；IL-3，1-5lg/kg；和G-CSF，1-25lg/kg。使用EPO的组合治疗，特别适合例如具有低EPO水平的贫血患者。

一般地，可溶性IL-22RA(或IL-22RA类似物或融合蛋白)或抗IL-22RA抗体的施用剂量视这些因素如患者的年龄、体重、身高、性别、总体医学状况和以前的医疗史的变化而变化。一般地，想要给接受者提供这样的剂量的可溶性IL-22RA或抗IL-22RA抗体，该剂量在从大约1pg/kg至10mg/kg(药剂量/患者体重)的范围之内，尽管也可依照情况施用更低或更高的剂量。

可通过局部导管输注或通过直接的损伤区注射经静脉内、动脉内、腹膜内、肌内、皮下、胸膜内、鞘内途径给受试者施用可溶性IL-22RA或抗IL-22RA抗体。当通过注射施用治疗性蛋白时，可通过连续输注或通过一次或多次推注进行施用。

给药的其他途径包括经口、经粘膜、经肺和经皮肤施用。经口给药适合聚酯微球体、玉米醇溶蛋白微球体、类蛋白微球体、聚氰基丙烯酸酯微球体和基于脂质的系统(参见，例如，DiBase和Morrel，“Oral Delivery of Microencapsulated Proteins，”in ProteinDelivery：Physical Systems，Sanders和Hendren(eds.)，pages255-288(Plenum Press 1997))。通过这样的胰岛素施用模式(参见，例如，Hinchcliffe和Illum，Adv.Drug Deliv.Rev.35：199(1999))举例说明鼻内给药的可行性。可制备包含IL-22RA的无水或液体颗粒，在干粉分配器、液体气雾发生器或喷雾器的帮助下将其吸入(例如.，Pettit and Gombotz，TIBTECH 16：343(1998)；Patton等人，Adv.Drug Deliv.Rev.35：235(1999))。通过AERX糖尿病治疗系统举例说明该方法，该系统是将雾化的胰岛素递送入肺的手工操纵的电子吸入器。研究已显示在低频超声的帮助下已将大如48,000kDa的蛋白以治疗性浓度递送穿过皮肤，这说明了透皮给药的可行性(Mitragotri等人，Science 269：850(1995))。使用电穿孔的透皮给药提供了施用具有IL-22RA结合活性的分子的另一种方法(Potts等人，Pharm.Biotechnol.10：213(1997))。

可根据已知的方法配制包含可溶性IL-22RA或抗IL-22RA抗体的药物组合物以制备药物用途的组合物，由此将治疗性蛋白和药物可接受载体混合在一起。如果物质的施用可被接受者患者耐受，则认为其是“药物可接受的载体”。无菌磷酸缓冲盐是药物可接受载体的一个示例。其他合适的载体对于本领域技术人员来说是熟知的。参见，例如，Gennaro(ed.)，Remington′s Pharmaceutical Sciences，第19版(Mack Publishing Company 1995)。

为达到治疗目的，以治疗有效量给患者施用可溶性IL-22RA或抗IL-22RA抗体分子和药物可接受的载体。如果施用量是生理学显著的，那么本发明的治疗分子和药物可接受的载体的组合被认为以“治疗有效量”施用。如果药剂的存在导致接受者患者的生理学上产生可检测的变化则其是生理学上显著的。例如，如果用于治疗炎症的药剂的存在减缓炎症应答那么其是生理学显著的。

可以液体剂型、气溶胶、或固体剂型提供包含可溶性IL-22RA(或IL-22RA类似物或融合蛋白)或中和抗IL-22RA抗体的药物组合物。以可注射的溶液和口服混悬剂来举例说明液体剂型。示例性固体剂型包括胶囊、片剂和控释剂型。后一种剂型通过微型渗透泵(miniosmoticpumps)和植入体举例说明(Bremer等人，Pharm.Biotechnol.10：239(1997)；Ranade，“Implants in Drug Delivery，”in Drug DeliverySystems，Ranade和Hollinger(eds.)，pages 95-123(CRC Press1995)；Bremer等人，“Protein Delivery with Infusion Pumps，”in Protein Delivery：Physical Systems，Sanders和Hendren(eds.)，pages 239-254(Plenum Press 1997)；Yewey等人，“Delivery ofProteins from a Controlled Release Injectable Implant，”inProtein Delivery：Physical Systems，Sanders和Hendren(eds.)，pages 93-117(Plenum Press 1997))。

脂质体提供了将治疗性多肽经静脉内、腹膜内、鞘内、肌内、皮下、或通过口服给药、吸入、或鼻内给药递送至受试者的一种方法。脂质体是由包围水性区室的一层或多层脂双层构成的微小囊泡(一般参见，Bakker-Woudenberg等人，Eur.J.Clin.Microbiol.Infect.Dis.12(Suppl.1)：S61(1993)，Kim，Drugs 46：618(1993)，和Ranade，“Site-Specific Drug Delivery Using Liposomes asCarriers，”in Drug Delivery Systems，Ranade和Hollinger(eds.)，pages 3-24(CRC Press 1995))。脂质体在组成上类似于细胞膜，因此，可安全地施用脂质体，其可被生物降解。依赖于制备的方法，脂质体可以是单层或多层的，脂质体可在大小为0.02μm至大于10μm的直径范围内变化。可将各种药剂封装入脂质体中：疏水性试剂被分配入双层而亲水性试剂被分配入内部水空间(参见，例如，Machy等人，Liposomes In Cell Biology And Pharmacology(John Libbey 1987)，和Ostro等人，American J.Hosp.Pharm.46：1576(1989))。此外，可能通过改变脂质体大小、双层的数目、脂质组成以及脂质体的电荷和表面特征来控制被封装的药剂的治疗利用度。

脂质体几乎可吸附至任何类型的细胞，然后慢慢地释放被封装的药物。可选择地，被吸收的脂质体可被吞噬细胞内吞。内吞后，脂质体内降解脂质体脂质，释放被封装的药物(Scherphof等人，Ann.N.Y.Acad.Sci.446：368(1985))。在经静脉内施用后，小质脂体(0.1至1.0μm)通常被主要位于肝脏和脾脏的网状内皮系统的细胞吸收，而大于3.0μm的脂质体则沉积在肺中。通过网状内皮系统的细胞进行的较小脂质体的该优先吸收已用于将化学治疗剂递送至巨噬细胞和递送至肝脏的肿瘤。

可通过几种方法包括使用大剂量的脂质体颗粒饱和或通过药理学方法选择性地使巨噬细胞失活来避开网状内皮系统(Claassen等人，Biochim.Biophys.Acta 802：428(1984))。此外，已显示将糖脂衍生的或聚乙二醇衍生的磷脂整合入脂质体膜导致网状内皮系统的吸收显著减少(Allen等人，Biochim.Biophys.Acta 1068：133(1991)；Allen等人，Biochim.Biophys.Acta 1150：9(1993))。

也可通过改变磷脂的组成或通过向脂质体中插入受体或配体来制备靶向特定细胞或器官的脂质体。例如，已使用用高含量的非离子表面活性剂制备的脂质体靶向肝脏(Hayakawa等人，Japanese Patent04-244，018；Kato等人，Biol.Pharm.Bull.16：960(1993))。通过在甲醇中混合大豆磷脂酰胆碱、α-生育酚和乙氧基化氢化蓖麻油(HCO-60)，在真空下浓缩该混合物，然后用水重构该混合物来制备这些制剂。也已显示二棕榈酰磷脂酰胆碱(DPPC)和从大豆产生的豆甾醇糖苷(sterylglucoside)混合物(SG)和胆固醇(Ch)的脂质体制剂靶向肝脏(Shimizu等人，Biol.Pharm.Bull.20：881(1997))。

可选择地，可将各种靶向性配体结合在脂质体的表面，所述配体是例如抗体、抗体片段、糖类、维生素和转运蛋白。例如，可用分枝型半乳糖脂质衍生物修饰脂质体以使其靶向无唾液酸糖蛋白(半乳糖)受体，该受体只在肝细胞的表面表达(Kato和Sugiyama，Crit.Rev.Ther.Drug Carrier Syst.14：287(1997)；Murahashi等人，Biol.Pharm.Bull.20：259(1997))。类似地，Wu等人，Hepatology 27：772(1998)，已显示用无唾液酸基胎球蛋白标记脂质体导致缩短的血浆半衰期和极大地增加了肝细胞对无唾液酸基胎球蛋白标记的脂质体的吸收。另一方面，预先注射无唾液酸基胎球蛋白可抑制包含分枝型半乳糖脂质衍生物的脂质体在肝中积累(Murahashi等人，Biol.Pharm.Bull.20：259(1997))。多乌头酸化的人血清白蛋白脂质体提供了用于将脂质体靶向肝细胞的另一种方法(Kamps等人，Proc.Nat′l Acad.Sci.USA 94：11681(1997))。此外，Geho等人美国专利号4,603,044，描述了导向肝细胞的脂质体囊泡递送系统，其具有对于和肝脏的特化的代谢细胞关联的肝胆管受体的特异性。

在组织寻靶的更普通的方法中，用对于靶细胞表达的配体是特异性的生物素化的抗体预标记该靶细胞(Harasym等人，Adv.Drug Deliv.Rev.32：99(1998))。在游离抗体的血浆清除之后，施用链霉抗生物素缀合的脂质体。在另一个方法中，将靶向性抗体直接附着至脂质体(Harasym等人，Adv.Drug Deliv.Rev.32：99(1998))。

可使用蛋白质微胶囊化的标准技术(参见例如，Anderson等人，Infect.Immun.31：1099(1981)，Anderson等人，Cancer Res.50：1853(1990)，和Cohen等人，Biochim.Biophys.Acta 1063：95(1991)，Alving等人“Preparation and Use of Liposomes inImmunological Studies，”in Liposome Technology，第2版，第III卷，Gregoriadis(ed.)，page 317(CRC Press 1993)，Wassef等人，Meth.Enzymol.149：124(1987))将多肽和抗体封装在脂质体中。如上面所指出的，治疗上有用的脂质体可包含各种组分。例如，脂质体可包含聚(乙二醇)的脂质衍生物(Allen等人，Biochim.Biophys.Acta 1150：9(1993))。

已设计了可维持治疗性蛋白的高系统水平的可降解的聚合物微球体。用可降解的聚合物例如聚(丙交酯共乙交酯)(PLG)、聚酐、聚(原酸酯)、非生物可降解的乙基乙酸乙烯酯聚合物制备微球体，其中将蛋白捕获入聚合物中(Gombotz和Pettit，Bioconjugate Chem.6：332(1995)；Ranade，“Role of Polymers in Drug Delivery，”in DrugDelivery Systems，Ranade和Hollinger(eds.)，pages 51-93(CRCPress 1995)；Roskos和Maskiewicz，“Degradable ControlledRelease Systems Useful for Protein Delivery，”in ProteinDelivery：Physical Systems，Sanders和Hendren(eds.)，pages45-92(Plenum Press 1997)；Bartus等人，Science 281：1161(1998)；Putney和Burke，Nature Biotechnology 16：153(1998)；Putney，Curr.Opin.Chem.Biol.2：548(1998))。聚乙二醇(PEG)包被的纳米球(nanospheres)也可提供用于治疗性蛋白的静脉内施用的载体(参见，例如，Gref等人，Pharm.Biotechnol.10：167(1997))。

本发明也涉及经化学修饰的具有结合IL-22RA的活性的多肽，例如IL-22RA单体、同型二聚体、异二聚体或多聚体可溶性受体、和IL-22RA拮抗剂，例如抗IL-22RA抗体或结合多肽、或中和抗IL-22RA抗体，所述多肽和上述的聚合物连接。

本领域技术人员可设计其他剂型，例如由Ansel和Popovich，Pharmaceutical Dosage Forms and Drug Delivery Systems，第5版(Lea & Febiger 1990)，Gennaro(ed.)，Remington′sPharmaceutical Sciences，第19版(Mack Publishing Company1995)，和Ranade和Hollinger，Drug Delivery Systems(CRC Press1996)所显示的。

作为说明性示例，可以包含这样的容器的试剂盒提供药物组合物，该容器装有具有IL-22RA的细胞外结构域的多肽，例如IL-22RA单体、同型二聚体、异二聚体或多聚体可溶性受体、或IL-22RA的拮抗剂(例如，结合IL-22RA多肽的抗体或抗体片段，或中和抗IL-22RA抗体)。可以用于单剂或多剂的可注射溶液的剂型提供治疗性多肽，或以在注射前进行重构的无菌粉末的形式提供。可选择地，这样的试剂盒可包含干粉分配器、液体气雾发生器或用于施用治疗性多肽的喷雾器。这样的试剂盒还可包含关于药物组合物的适应症和应用的书面资料。此外，这些资料可包括这样的声明，即在具有已知的对IL-22RA有过敏反应的患者中禁用IL-22RA组合物。

可以液体剂型、气溶胶或固体剂型提供这样的药物组合物，该药物组合物包含抗IL-22RA抗体或结合伴侣(或抗IL-22RA抗体片段、抗体融合物、人源化抗体等)、或IL-22RA可溶性受体。通过可注射的溶液、气溶胶、微滴(droplets)、拓扑(topological)溶液和口服悬混剂举例说明液体剂型。示例性固体剂型包括胶囊、片剂和控释剂型。通过微型渗透泵和植入体(Bremer等人，Pharm.Biotechnol.10：239(1997)；Ranade，“Implants in Drug Delivery”，in Drug DeliverySystems，Ranade和Hollinger(eds.)，pages 95-123(CRC Press1995)；Bremer等人，“Protein Delivery with Infusion Pumps，”in Protein Delivery：Physical Systems，Sanders和Hendren(eds.)，pages 239-254(Plenum Press 1997)；Yewey等人，“Delivery ofProteins from a Controlled Release Injectable Implant，”inProtein Delivery：Physical Systems，Sanders和Hendren(eds.)，pages 93-117(Plenum Press 1997))举例说明固体剂型。其他固体剂型包括乳脂、糊剂、其他局部应用的等。

脂质体提供了将治疗性多肽经静脉内、腹膜内、鞘内、肌内、皮下、或通过口服给药、吸入、或鼻内给药递送至受试者的一种方法。脂质体是由包围水性区室的一层或多层脂质双层构成的微小囊泡(一般参见，Bakker-Woudenberg等人，Eur.J.Clin.Microbiol.Infect.Dis.12(Suppl.1)：S61(1993)，Kim，Drug s 46：618(1993)，和Ranade，“Site-Specific Drug Delivery Using Liposomes asCarriers，”in Drug Delivery Systems，Ranade和Hollinger(eds.)，pages 3-24(CRC Press 1995))。脂质体在组成上类似于细胞膜，因此，可安全地施用脂质体，其可被生物降解。依赖于制备的方法，脂质体可以是单层或多层的，脂质体可在大小为0.02μm至大于10μm的直径范围内变化。可将各种药剂封装入脂质体中：疏水性试剂被分配入双层而亲水性试剂分被配入内部水空间(参见，例如，Machy等人，Liposomes In Cell Biology And Pharmacology(John Libbey 1987)，和Ostro等人，American J.Hosp.Pharm.46：1576(1989))。此外，可能通过改变脂质体大小、脂双层的数目、脂质组成以及脂质体的电荷和表面特征来控制被封装的药剂的治疗利用度。

脂质体几乎可吸附至任何类型的细胞，然后慢慢地释放被封装的药物。可选择地，被吸收的脂质体可被吞噬细胞内吞。内吞后，脂质体内降解脂质体脂质，释放被封装的药物(Scherphof等人，Ann.N.Y.Acad.Sci.446：368(1985))。在经静脉内给药后，小质脂体(0.1至1.0μm)通常被主要位于肝脏和脾脏的网状内皮系统的细胞吸收，而大于3.0μm的脂质体则沉积在肺中。通过网状内皮系统的细胞进行的较小脂质体的该优先吸收已用于将化学治疗剂递送至巨噬细胞和递送至肝脏的肿瘤。

可通过几种方法包括使用大剂量的脂质体颗粒饱和或通过药理学方法选择性地使巨噬细胞失活来避开网状内皮系统(Claassen等人，Biochim.Biophys.Acta 802：428(1984))。此外，已显示将糖脂衍生的或聚乙二醇衍生的磷脂整合入脂质体膜导致网状内皮系统的吸收显著减少(Allen等人，Biochim.Biophys.Acta 1068：133(1991)；Allen等人，Biochim.Biophys.Acta 1150：9(1993))。

也可通过改变磷脂的组成或通过向脂质体中插入受体或配体来制备靶向特定细胞或器官的脂质体。例如，已使用用高含量的非离子表面活性剂制备的脂质体靶向肝脏(Hayakawa等人，Japanese Patent04-244，018；Kato等人，Biol.Pharm.Bull.16：960(1993))。通过在甲醇中混合大豆磷脂酰胆碱、α-生育酚和乙氧基化氢化蓖麻油(HCO-60)，在真空下浓缩该混合物，然后用水重构该混合物来制备这些制剂。也已显示二棕榈酰磷脂酰胆碱(DPPC)和从大豆产生的豆甾醇糖苷混合物(SG)和胆固醇(Ch)的脂质体将制剂靶向肝脏(Shimizu等人，Biol.Pharm.Bull.20：881(1997))。

可选择地，可将各种靶向性配体结合在脂质体的表面，所述配体是例如抗体、抗体片段、糖类、维生素和转运蛋白。例如，可用分枝型半乳糖脂质衍生物修饰脂质体以使其靶向无唾液酸糖蛋白(半乳糖)受体，该受体只在肝细胞的表面表达(Kato和Sugiyama，Crit.Rev.Ther.Drug Carrier Syst.14：287(1997)；Murahashi等人，Biol.Pharm.Bull.20：259(1997))。类似地，Wu等人，Hepatology 27：772(1998)，已显示用无唾液酸基胎球蛋白标记脂质体导致缩短的血浆半衰期和极大地增加了肝细胞对无唾液酸基胎球蛋白标记的脂质体的吸收。另一方面，预先注射无唾液酸基胎球蛋白可抑制包含分枝型的半乳糖脂质衍生物的脂质体在肝中积累(Murahashi等人，Biol.Pharm.Bull.20：259(1997))。多乌头酸化的人血清白蛋白脂质体提供了用于将脂质体靶向肝细胞的另一种方法(Kamps等人，Proc.Nat′l Acad.Sci.USA 94：11681(1997))。此外，Geho等人美国专利号4,603,044，描述了指向肝细胞的脂质体小囊泡递送系统，其具有对于和特化肝代谢细胞结合的肝胆管受体的特异性。

在组织寻靶的更普通的方法中，用对于由靶细胞表达的配体是特异性的生物素化的抗体预标记该靶细胞(Harasym等人，Adv.DrugDeliv.Rev.32：99(1998))。在游离抗体的血浆清除之后，施用经链霉抗生物素缀合的脂质体。在另一个方法中，将靶向性抗体直接附着至脂质体(Harasym等人，Adv.Drug Deliv.Rev.32：99(1998))。

可使用蛋白质微胶囊化的标准技术(参见例如，Anderson等人，Infect.Immun.31：1099(1981)，Anderson等人，Cancer Res.50：1853(1990)，和Cohen等人，Biochim.Biophys.Acta 1063：95(1991)，Alving等人“Preparation and Use of Liposomes inImmunological Studies，”in Liposome Technology，第2版，第III卷，Gregoriadis(ed.)，page 317(CRC Press 1993)，Wassef等人，Meth.Enzymol.149：124(1987))将抗IL-22RA中和抗体和具有IL-22或IL-20结合活性的结合伴侣、或IL-22RA可溶性受体封装在脂质体中。如上面所指出的，治疗上有用的脂质体可包含各种组分。例如，脂质体可包含聚(乙二醇)的脂质衍生物(Allen等人，Biochim.Biophys.Acta 1150：9(1993))。

已设计了可维持治疗性蛋白的高系统水平的可降解的聚合物微球体。用可降解的聚合物例如聚(丙交酯共乙交酯)(PLG)、聚酐、聚(原酸酯)、非生物可降解的乙基乙酸乙烯酯聚合物制备微球体，其中蛋白被捕获入聚合物中(Gombotz和Pettit，Bioconjugate Chem.6：332(1995)；Ranade，“Role of Polymers in Drug Delivery，”in DrugDelivery Systems，Ranade和Hollinger(eds.)，pages 51-93(CRCPress 1995)；Roskos和Maskiewicz，“Degradable ControlledRelease Systems Useful for Protein Delivery，”in ProteinDelivery：Physical Systems，Sanders和Hendren(eds.)，pages45-92(Plenum Press 1997)；Bartus等人，Science 281：1161(1998)；Putney和Burke，Nature Biotechnology 16：153(1998)；Putney，Curr.Opin.Chem.Biol.2：548(1998))。聚乙二醇(PEG)包被的纳米球也可提供用于治疗性蛋白的静脉内给药的载体(参见，例如，Gref等人，Pharm.Biotechnol.10：167(1997))。

本发明也涉及经化学修饰的和上述聚合物连接的抗IL-22RA抗体或结合伴侣，例如抗IL-22RA抗体或IL-22RA可溶性受体。

本领域技术人员可设计其他剂型，例如由Ansel和Popovich，Pharmaceutical Dosage Forms and Drug Delivery Systems，第5版(Lea & Febiger 1990)，Gennaro(ed.)，Remington′sPharmaceutical Sciences，第19版(Mack Publishing Company1995)，和Ranade和Hollinger，Drug Delivery Systems(CRC Press1996)所显示的。

本发明也涉及抗IL-22抗体的组合物，以及使用和包含此处描述的抗体、肽或多肽的方法和治疗剂。这些组合物还可包含载体。所述载体可以是常规的有机或无机载体。载体的示例包括水、缓冲液、醇、丙二醇、聚乙二醇、麻油、玉米油等。

11.转基因小鼠的产生

在人牛皮癣病灶中显示IL-20和IL-22两者的过量表达，表明IL-20和IL-22两者与人牛皮癣有关。此外，如此处所述，在转基因小鼠中过量表达IL-20和IL-22表现出表皮增厚和免疫细胞参与特征的牛皮癣表型；并且给正常小鼠增加注射IL-22表现出表皮增厚和免疫细胞参与特征的牛皮癣表型，可以用可溶性受体拮抗剂zcytor16(IL-22RA2)去除此表型。这些体内数据进一步表明促炎症IL-22与牛皮癣有关。像这样，IL-22活性拮抗剂，例如本发明的抗IL-22RA中和和单克隆抗体，和可溶性IL-22RA受体，可用于治疗炎性疾病，尤其是作为IL-22和IL-20的拮抗剂治疗牛皮癣。此外，结合、阻断、抑制、减少、拮抗或中和IL-22或IL-20和IL-22两者的活性的试剂，例如本发明的抗人IL-22RA中和和单克隆抗体和可溶性IL-22RA受体，可用于治疗其它炎性疾病，例如作为IL-22或IL-20和IL-22两者的拮抗剂治疗特应性皮炎、炎性肠病、结肠炎、内毒素血症、关节炎、类风湿性关节炎和牛皮癣性关节炎成人呼吸系统疾病(ARD)、败血症性休克、多器官衰竭、炎性肺损伤例如哮喘或支气管炎、细菌性肺炎、牛皮癣、湿疹、特异反应的和接触性皮炎、炎性肠病例如溃疡性结肠炎和克罗恩病等。

一方面，本发明提供一种产生针对多肽的抗体的方法，所述多肽包括：用选自包括如下的组的多肽接种动物，包括：(a)包含SEQ IDNO：3的氨基酸残基1(脯氨酸)至6(天冬氨酸)的氨基酸序列的多肽；(b)包含SEQ ID NO：3的氨基酸残基26(丝氨酸)至32(脯氨酸)的氨基酸序列的多肽；(c)包含SEQ ID NO：3的氨基酸残基41(赖氨酸)至47(天冬氨酸)的氨基酸序列的多肽；(d)包含SEQ IDNO：2的氨基酸残基49(缬氨酸)至62(半胱氨酸)的氨基酸序列的多肽；(e)包含SEQ ID NO：3的氨基酸残基41(赖氨酸)至62(半胱氨酸)的氨基酸序列的多肽；(f)包含SEQ ID NO：3的氨基酸残基84(丙氨酸)至97(丝氨酸)的氨基酸序列的多肽；(g)包含SEQ IDNO：3的氨基酸残基103(苏氨酸)至108(天冬氨酸)的氨基酸序列的多肽；(h)包含SEQ ID NO：3的氨基酸残基130(精氨酸)至135(组氨酸)的氨基酸序列的多肽；(i)包含SEQ ID NO：3的氨基酸残基164(甘氨酸)至166(赖氨酸)的氨基酸序列的多肽；(j)包含SEQ ID NO：3的氨基酸残基175(酪氨酸)至179(谷氨酸)的氨基酸序列的多肽；(k)包含SEQ ID NO：3的氨基酸残基193(赖氨酸)至196(丙氨酸)的氨基酸序列的多肽；(l)包含SEQ ID NO：3的氨基酸残基203(赖氨酸)至209(苏氨酸)的氨基酸序列的多肽；(m)包含SEQ ID NO：3的氨基酸序列的多肽；(n)包含SEQ ID NO：4的氨基酸序列的多肽；并且其中多肽能够诱导动物产生免疫应答产生抗体；和从动物中分离抗体；和其中抗体特异性结合IL-22RA多肽(SEQ IDNO：2或SEQ ID NO：3)；和降低IL-20(SEQ ID NO：8)或IL-22(SEQID NO：6)的活性。在一个实施例中方法如上述所示，其中方法产生的抗体减少IL-20(SEQ ID NO：8)或IL-22(SEQ ID NO：6)的促炎症活性。在另一个实施例中方法如上述所示，其中方法产生的抗体中和IL-20(SEQ ID NO：8)或IL-22(SEQ ID NO：6)和IL-22RA(SEQ ID NO：2)的相互作用。在另一个实施例中方法如上述所示，其中抗体的中和可以通过体外一种基于细胞的中和检测方法表明IL-20(SEQ ID NO：8)或IL-22(SEQ ID NO：6)的中和来检测。在另一个实施例中方法如上述所示，其中方法产生的抗体减少IL-20(SEQ ID NO：8)和IL-22(SEQID NO：6)的促炎症活性。在另一个实施例中方法如上述所示，其中方法产生的抗体中和IL-20(SEQ ID NO：8)和IL-22(SEQ ID NO：6)两者和IL-22RA(SEQ ID NO：2)的相互作用。在另一个实施例中方法如上述所示，其中抗体的中和可以通过体外一种基于细胞的中和检测方法表明IL-20(SEQ ID NO：8)和IL-22(SEQ ID NO：6)两者的中和来检测。

在另一方面，本发明提供了此处所述方法产生的抗体，所述抗体结合SEQ ID NO：2或SEQ ID NO：3多肽。在一个实施例中抗体如上所述，其中抗体是(a)多克隆抗体，(b)鼠类单克隆抗体，(c)来源于(b)的人源化抗体，(d)抗体片段或(e)人单克隆抗体。在另一个实施例中抗体如上所述，其中抗体进一步包含放射性核素、酶、底物、辅助因子、荧光标记物、化学发光标记物、肽标签、磁性颗粒、药物或毒素。在另一个实施例中抗体如上所述，其中抗体还包含PEG化。在另一个实施例中抗体如上所述，其中抗体是(a)多克隆抗体，(b)鼠类单克隆抗体，(c)来源于(b)的人源化抗体，(d)抗体片段或(e)人单克隆抗体。在另一个实施例中抗体如上所述，其中抗体进一步包含放射性核素、酶、底物、辅助因子、荧光标记物、化学发光标记物、肽标签、磁性颗粒、药物或毒素。在另一个实施例中抗体如上所述，其中抗体还包含PEG化。

在另一方面，本发明提供了抗体或抗体片段，所述抗体或抗体片段结合包含SEQ ID NO：3中所示的氨基酸序列的多肽；并且减少IL-20(SEQ ID NO：8)或IL-22(SEQ ID NO：6)的促炎活性。在一个实施例中抗体或抗体片段如上所述，其中抗体或抗体片段减少IL-20(SEQ IDNO：8)和IL-22(SEQ ID NO：6)的促炎活性。在另一个实施例中抗体或抗体片段如上所述，其中抗体或抗体片段是a)多克隆抗体，(b)鼠类单克隆抗体，(c)来源于(b)的人源化抗体，(d)抗体片段或(e)人单克隆抗体。在另一个实施例中抗体或抗体片段如上所述，其中抗体进一步包含放射性核素、酶、底物、辅助因子、荧光标记物、化学发光标记物、肽标签、磁性颗粒、药物或毒素。在另一个实施例中抗体或抗体片段如上所述，其中抗体还包含PEG化。在另一个实施例中抗体或抗体片段如上所述，其中或抗体片段是a)多克隆抗体，(b)鼠类单克隆抗体，(c)来源于(b)的人源化抗体，(d)抗体片段或(e)人单克隆抗体。在另一个实施例中抗体或抗体片段如上所述，其中抗体进一步包含放射性核素、酶、底物、辅助因子、荧光标记物、化学发光标记物、肽标签、磁性颗粒、药物或毒素。在另一个实施例中抗体或抗体片段如上所述，其中抗体还包含PEG化。

在另一方面，本发明提供了减少或抑制IL-22诱导的或IL-20诱导的造血细胞和造血祖细胞增殖或分化的方法，包括和不用抗体培养的骨髓或外周血细胞相比用含有此处所述的足以减少骨髓或外周血细胞中的造血细胞增殖或分化的量的抗体的组合物培养骨髓或外周血细胞。在一个实施例中方法如上所述，其中造血细胞和造血祖细胞是淋巴细胞。在另一个实施例中方法如上所述，其中淋巴细胞是巨噬细胞或T细胞。

在另一方面，本发明提供了减少IL-22诱导的或IL-20诱导的炎症的方法，包括给患有炎症的哺乳动物施用此处所述的足以减轻炎症的量的抗体的组合物。

在另一方面，本发明提供了减少或抑制IL-22诱导的和IL-20诱导的造血细胞和造血祖细胞增殖或分化的方法，包括和不用抗体培养的骨髓或外周血细胞相比用含有此处所述的足以减少骨髓或外周血细胞中的造血细胞增殖或分化的量的抗体的组合物培养骨髓或外周血细胞。在一个实施例中方法如上所述，其中造血细胞和造血祖细胞是淋巴细胞。在另一个实施例中方法如上所述，其中淋巴细胞是巨噬细胞或T细胞。

在另一方面，本发明提供了减少IL-22诱导的和IL-20诱导的炎症的方法，包括给患有炎症的哺乳动物施用此处所述的足以减轻炎症的量的抗体的组合物。

在另一方面，本发明提供了减少或抑制IL-22诱导的和IL-20诱导的造血细胞和造血祖细胞增殖或分化的方法，包括和不用抗体或抗体片段培养的骨髓或外周血细胞相比用含有此处所述的足以减少骨髓或外周血细胞中的造血细胞增殖或分化的量的抗体或抗体片段的组合物培养骨髓或外周血细胞。在另一个实施例中方法如上所述，其中造血细胞和造血祖细胞是淋巴细胞。在另一个实施例中方法如上所述，其中淋巴细胞是巨噬细胞或T细胞。

在另一方面，本发明提供了减少IL-22诱导的和IL-20诱导的炎症的方法，包括给患有炎症的哺乳动物施用此处所述的足以减轻炎症的量的抗体或抗体片段的组合物。

在另一方面，本发明提供了减少或抑制IL-22诱导的和IL-20诱导的造血细胞和造血祖细胞增殖或分化的方法，包括和不用抗体或抗体片段培养的骨髓或外周血细胞相比用含有此处所述的足以减少骨髓或外周血细胞中的造血细胞增殖或分化的量的抗体或抗体片段的组合物培养骨髓或外周血细胞。在另一个实施例中方法如上所述，其中造血细胞和造血祖细胞是淋巴细胞。在另一个实施例中方法如上所述，其中淋巴细胞是巨噬细胞或T细胞。

在另一方面，本发明提供了减少IL-22诱导的和IL-20诱导的炎症的方法，包括给患有炎症的哺乳动物施用此处所述的足以减轻炎症的量的抗体或抗体片段的组合物。

在另一方面，本发明提供了抑制患有炎症的哺乳动物炎症应答的方法，包括

(1)确定血清淀粉样A蛋白的水平；

(2)以一种可接受的药物载体给予包含根据此处所述的抗体或抗体片段的抗体的组合物；

(3)给药后测定血清淀粉样A蛋白的水平；

(4)比较第(1)步和第(3)步的血清淀粉样A蛋白的水平，其中血清淀粉样A蛋白水平没有增加或下降预示着炎症反应被抑制。

在另一方面，本发明提供了治疗IL-22或IL-20在其中起作用的炎性疾病的哺乳动物的方法，包括给哺乳动物施用IL-22或IL-20的拮抗剂以减轻炎症，其中所述拮抗剂包括(i)特异性结合IL-22RA(SEQ ID NO：3)的多肽或多肽片段的抗体、抗体片段或结合多肽，或(ii)IL-22RA(SEQ ID NO：3)的多肽或多肽片段；和其中IL-22(SEQ ID NO：6)或IL-20(SEQ ID NO：8)的炎症活性减少。在一个实施例中方法如上所述，其中疾病是慢性炎性疾病。在另一个实施例中方法如上所述，其中疾病是慢性炎性疾病，包括炎性肠病、溃疡性结肠炎、克罗恩病、关节炎、特应性皮炎或牛皮癣。在另一个实施例中方法如上所述，其中疾病是急性炎性疾病。在另一个实施例中方法如上所述，其中疾病是急性炎性疾病，其包括内毒素血症、败血症、中毒性休克综合征或传染性疾病。在另一个实施例中方法如上所述，其中所述抗体、抗体片段或结合多肽还包含放射性核素、酶、底物、辅助因子、荧光标记物、化学发光标记物、肽标签、磁性颗粒、药物或毒素。

在另一方面，本发明提供了治疗IL-22和IL-20在其中起作用的炎性疾病的哺乳动物的方法，包括给哺乳动物施用IL-22和IL-20两者的拮抗剂以减轻炎症，其中所述拮抗剂包括(i)特异性结合IL-22RA(SEQ ID NO：3)的多肽或多肽片段的抗体、抗体片段或结合多肽，或(ii)IL-22RA(SEQ ID NO：3)的多肽或多肽片段；和其中IL-22(SEQ ID NO：6)和IL-20(SEQ ID NO：8)两者的炎症活性减少。在一个实施例中方法如上所述，其中疾病是慢性炎性疾病。在另一个实施例中方法如上所述，其中疾病是慢性炎性疾病，包括炎性肠病、溃疡性结肠炎、克罗恩病、关节炎、特应性皮炎或牛皮癣。在另一个实施例中方法如上所述，其中疾病是急性炎性疾病。在另一个实施例中方法如上所述，其中疾病是急性炎性疾病，其包括内毒素血症、败血症、中毒性休克综合征或传染性疾病。在另一个实施例中方法如上所述，其中所述抗体、抗体片段或结合多肽还包含放射性核素、酶、底物、辅助因子、荧光标记物、化学发光标记物、肽标签、磁性颗粒、药物或毒素。

在另一方面，本发明提供了一种抗体，包括特异性结合人IL-22RA(SEQ ID NO：3)抗原表位的单克隆抗体的抗体，所述抗原表位选自：

(a)由SEQ ID NO：3中氨基酸1(脯氨酸)至氨基酸6(天冬氨酸)氨基酸序列构成的表位；

(b)由SEQ ID NO：3中氨基酸26(丝氨酸)至氨基酸32(脯氨酸)氨基酸序列构成的表位；

(c)由SEQ ID NO：3中氨基酸41(赖氨酸)至氨基酸47(天冬氨酸)氨基酸序列的表位；

(d)由SEQ ID NO：2中氨基酸49(缬氨酸)至氨基酸62(半胱氨酸)氨基酸序列构成的表位；

(e)由SEQ ID NO：3中氨基酸41(赖氨酸)至氨基酸62(半胱氨酸)氨基酸序列构成的表位；

(f)由SEQ ID NO：3中氨基酸84(丙氨酸)至氨基酸97(丝氨酸)氨基酸序列构成的表位；

(g)由SEQ ID NO：3中氨基酸103(苏氨酸)至氨基酸108(天冬氨酸)氨基酸序列构成的表位；

(h)由SEQ ID NO：3中氨基酸130(精氨酸)至氨基酸135(组氨酸)氨基酸序列构成的表位；

(i)由SEQ ID NO：3中氨基酸164(甘氨酸)至氨基酸166(赖氨酸)氨基酸序列构成的表位；

(j)由SEQ ID NO：3中氨基酸175(酪氨酸)至氨基酸179(谷氨酸)氨基酸序列构成的表位；

(k)由SEQ ID NO：3中氨基酸193(赖氨酸)至氨基酸196(丙氨酸)氨基酸序列构成的表位；

(l)由SEQ ID NO：3中氨基酸203(赖氨酸)至氨基酸209(苏氨酸)氨基酸序列构成的表位；

和(m)由SEQ ID NO：3氨基酸序列构成的表位；

和(n)由SEQ ID NO：4中氨基酸序列构成的表位；

并且其中所述抗体减少或中和人IL-22(SEQ ID NO：6)或IL-20IL-20(SEQ ID NO：8)的活性。在一个实施例中抗体如上所述，其中抗体降低或中和人IL-22(SEQ ID NO：6)和IL-20(SEQ ID NO：8)的活性。在另一个实施例中抗体如上所述，其中抗体选自包括如下的组：(a)鼠类单克隆抗体，(b)来源于(a)的人源化抗体，(c)抗体片段，和(d)人单克隆抗体。在另一个实施例中抗体如上所述，其中抗体还包含PEG化。在另一个实施例中抗体如上所述，其中抗体选自包括如下的组：(a)鼠类单克隆抗体，(b)来源于(a)的人源化抗体，(c)抗体片段，和(d)人单克隆抗体。在另一个实施例中抗体如上所述，其中抗体还包含PEG化。

在另一方面，本发明提供了治疗伴随IL-22RA活性的病人的病理状态的方法，包括给予有效数量的此处所述的抗体，从而治疗所述的病理状态。在一个实施例中方法如上所述，其中所述病理状态是慢性炎性状态。在另一个实施例中方法如上所述，其中所述慢性炎性状态包括炎性肠、溃疡性结肠炎、克罗恩病、关节炎、特应性皮炎或牛皮癣。在另一个实施例中方法如上所述，其中所述病理状态是急性炎性状态。在另一个实施例中方法如上所述，其中所述急性炎性状态包括内毒素血症、败血病、中毒性休克综合征或传染性疾病。

在另一方面，本发明提供了治疗患有IL-22RA在其中起作用的炎性疾病的哺乳动物的方法，包括给哺乳动物施用IL-22RA的拮抗剂以减轻炎症，其中所述拮抗剂包含特异性结合IL-22RA(SEQ ID NO：3)多肽或多肽片段的抗体、抗体片段或结合多肽；并且其中炎症活性减少。在一个实施例中方法如上所述，其中所述疾病是慢性炎性疾病。在另一个实施例中方法如上所述，其中所述疾病是慢性炎性疾病，包括炎性肠病、溃疡性结肠炎、克罗恩病、关节炎、特应性皮炎或牛皮癣。在另一个实施例中方法如上所述，其中所述疾病是急性炎性疾病。在另一个实施例中方法如上所述，其中所述疾病是急性炎性疾病，包括内毒素血症、败血病、中毒性休克综合征或传染性疾病。在另一个实施例中方法如上所述，其中所述抗体、抗体片段或结合多肽还包含放射性核素、酶、底物、辅助因子、荧光标记物、化学发光标记物、肽标签、磁性颗粒、药物或毒素。在另一个实施例中方法如上所述，其中所述抗体、抗体片段或结合多肽还包含PEG化。

在另一方面，本发明提供了减少炎症的方法，包括给患有炎症的哺乳动物施用一定数量的此处所述的足以减少炎症的抗体组合物。

通过下面的非限定性实施例进一步说明本发明。

实施例1

从转染BHK 570细胞中纯化IL-22RA2-Fc4多肽

除非另外指出，所有的操作都是在4℃下进行的。下面的操作被用于纯化IL-22RA2多肽(从SEQ ID NO：13的氨基酸残基23至231的成熟可溶性受体多肽；多核苷酸显示于SEQ ID NO：12)，含有C末端融合人Fc4(SEQ ID NO：14)，命名为IL-22RA2-Fc4。采用0.2um灭菌滤器从转染IL-22RA2-Fc4的BHK 570细胞中过滤大约16,500ml条件培养基，然后不加蛋白酶抑制剂溶液到终浓度0.001mM亮肽酶素(Boerhinger-Mannheim，Indianapolis，IN)、0.001mM胃酶抑素(Boerhinger-Mannheim)和0.4mM Pefabloc(Boerhinger-Mannheim)。填充Poros蛋白A50柱子(柱床体积20ml，Applied Biosystems)并用400ml PBS(Gibco/BRL)清洗。将添加的条件培养基通过柱子，流速为15ml/minute，随后用800ml PBS(BRL/Gibco)清洗。用0.1M甘氨酸pH 3.0洗脱柱子中的IL-22RA2-Fc4，并且直接收集5ml洗脱液到0.5ml 2M Tris pH 7.8，调节洗脱馏分最终pH为7.4。

通过起始培养基和过柱培养基的还原SDS-PAGE凝胶蛋白质印法表征柱性能。蛋白质印法使用抗IgG HRP(Amer sham)抗体，该法表明起始培养基中有60,000Da的免疫反应性蛋白，而过柱培养基没有，表明完全捕获。用还原SDSPAGE凝胶表征蛋白A50洗脱组分。该凝胶表明3到11馏份中有浓缩的60,000Da的考马斯染料条带。3到11馏份合并。

采用30,000Da的Ultrafree Biomax离心浓缩器(15ml容积，Millipore)将蛋白A 50洗脱合并物从44ml浓缩到4ml。用350mlPBS(BRL/Gibco)清洗Sephacryl S-300凝胶滤柱(175ml柱床体积；Pharmacia)。采用1.5ml/min流速将浓缩的合并物注射到柱上，随后用225ml PBS(BRL/Gibco)清洗。收集2ml的洗脱峰。

用还原和非还原银染(Geno Technology)SDS PAGE凝胶表征洗脱馏份。还原银染SDS PAGE凝胶表明，在馏份14-31中有60,000Da的浓缩的染色带，而非还原银染SDS PAGE凝胶表明在14-31馏份中有160,000Da的浓缩的染色带。馏份1-13表现出许多不同大小的条带。馏份14-31合并，采用30,000Da Ultrafree Biomax离心浓缩器(15ml容积，Millipore)浓缩到22ml。这个浓缩物用0.2μm Acrodisc灭菌滤器过滤(Pall Corporation)。

用分析法测定BCA浓缩合并物的蛋白浓度(Pierce，Rockford，IL)，分装并根据我们的标准流程储存在-80℃中。合并馏分的浓度为1.50mg/ml。

实施例2

构建BaF3细胞表达CRF2-4受体(BaF3/CRF2-4细胞)和表达带有IL-22RA受体的CRF2-4受体的BaF3细胞(BaF3/CRF2-4/IL-22RA细胞)

用30μg CFR2-4表达载体按如下所述构建表达全长的CFR2-4受体的BaF3细胞。表达CFR2-4受体的BaF3细胞被命名为BaF3/CFR2-4。这些细胞被用作对照和进一步转染全长IL-22RA受体(美国专利5,965,704)并按如下所述用于构建筛选IL-22活性。

A.构建BaF3细胞表达CRF2-4受体

从Daudi细胞系cDNA文科中分离全长cDNA序列CRF2-4(GenbankAccession No.Z17227)，然后克隆到pZP7P表达载体。BaF3，来自鼠骨髓的白介素-3(IL-3)依赖性前-淋巴细胞系(Palacios和Steinmetz，Cell 41：727-734，1985；Mathey-Prevot等，Mol.Cell. Biol. 6：4133-4135，1986)维持在完全培养基(RPMI培养基，JRHBioscience Inc.，Lenexa，KS)上，补充有10％热失活的胎牛血清、2ng/ml鼠IL-3(mIL-3)(R & D，Minneapolis，MN)、2mML-glutaMax-1^TM(Gibco BRL)、1mM丙酮酸钠(Gibco BRL)及PSN抗生素(GIBCO BRL))。电穿孔前，按制造商的说明利用Qiagen Maxi Prep试剂盒(Qiagen)制备纯化CRF2-4/pZP7P。用于电穿孔的BaF3细胞在无血清RPMI培养基中洗涤一次，然后以10⁷细胞/ml的细胞密度重悬于无血清RPMI培养基中。将1ml重悬的BaF 3细胞与30μgCRF2-4/pZP7P质粒DNA混合，并转移到单独的可弃型电穿孔仓中(GIBCO BRL)。室温孵育15分钟后用电穿孔仪(CELL-PORATOR^TM；GIBCOBRL)对细胞给予两次连续电击(8001Fad/300V.；1180 1Fad/300V)。恢复5分钟后电穿孔细胞转移到到T-162细颈瓶中50ml完全培养基中并在培养箱中放置15-24小时(37℃，5％CO₂)。随后离心分离细胞并重悬于50ml含有2μg/ml嘌呤霉素的完全培养基中，来分离嘌呤霉素抗性细胞群。按下述方法检测转染的BaF3细胞(下文被称为BaF3/CRF2-4细胞)群的信号能力。另外，按下述方法对这些细胞进一步转染IL-22RA受体。

B.构建表达CRF2-4和IL-22RA受体的BaF3细胞

使用30μg IL-22RA表达载体，按上述方法构建表达全长IL-22RA受体的BaF3/CRF2-4细胞。恢复后，用200μg/mlzeocin和2μg/ml嘌呤霉素选择转染细胞。表达IL-22RA受体的BaF3/CRF2-4细胞被命名为BaF3/CRF2-4/IL-22RA细胞。按此处所述用这些细胞筛选IL-22活性和IL-22RA2拮抗剂活性。

实施例3

用BaF3/CRF2-4/IL-22RA细胞用Alamar蓝增殖检测法筛选IL-22拮抗剂

A.用BaF3/CRF2-4/IL-22RA细胞和Blue增殖检测法(BlueProliferation Assay)筛选IL-22活性

按如下所述用纯化的IL-22-CEE(实施例4)检测存在的增殖活性。按如下所述用纯化的IL-22RA2-Fc4(实施例1)拮抗此检测中的IL-22的增殖应答。

离心下来BaF3/CRF2-4/IL-22RA细胞并用添加10％热灭活的胎牛血清、2ng/ml小鼠IL-3(mIL-3)(R & D，Minneapolis，MN)、2mML-glutaMax-1^TM(Gibco BRL)、1mM丙酮酸钠(Gibco BRL)、PSN抗体(GIBCO BRL)但是不含有mIL-3(在下文中称为″无mIL-3培养基″)的完全培养基清洗(RPMI培养基(JRH Bioscience Inc.，Lenexa，KS))。细胞离心并清洗3次来确保去除mIL-3。然后用血细胞计数器对细胞计数。利用无mIL-3培养基，按每孔100μl体积5000个细胞接种到96-孔型的板中。

用无mIL-3培养基稀释为50、10、2、1、0.5、0.25、0.13、0.06ng/ml浓度的IL-22-CEE蛋白检测BaF3/CRF2-4/IL-22RA细胞的增殖。向所述BaF3/CRF2-4/IL-22RA细胞中添加100μl稀释的蛋白。总测定体积为200μl。测定板于37℃、5％CO₂中温育3天，此时以20μl/孔添加Alamar Blue(Accumed，Chicago，IL)。板再次于37℃、5％CO₂中温育24小时。Alamar Blue基于活细胞的数量给出荧光读数，因而对照着阴性对照直接测量细胞增殖。板再次于37℃、5％CO₂中温育24小时。在Fmax^TM板阅读器上(Molecular Devices Sunnyvale，CA)利用SoftMax^TMPro程序以544(激发)和590(发射)的波长对板进行读数。结果证实了BaF3/CRF2-4/IL-22RA细胞对IL-22-CEE具有剂量依赖的增殖应答。检测结果，在高端的50ng/ml应答大约是背景的15倍，低端的0.06ng/ml则下降到2倍。BaF3野生型细胞和BaF3/CRF2-4细胞对IL-22-CEE应答而不发生细胞增殖，表明IL-22特异性作用CRF2-4/IL-22RA异二聚体受体。为了确定IL-22RA2是否拮抗IL-22活性，采用了纯化的可溶性IL-22RA2/Fc4重复上述检测。当IL-22在10μg/ml水平下和IL-22RA2联用时，对所有浓度的IL-22的应答都下降到背景水平。存在的可溶性IL-22RA2消除IL-22的增殖效果表明它是一种潜在的IL-22配体拮抗剂。这个检测能被用于检测此处所述的IL-22活性的其它拮抗剂，例如抗IL-22RA抗体。

实施例4

从BHK 570纯化IL-22-CEE

除非另外指出，所有的操作都是在4℃下进行的。下面的操作用于纯化含有C末端谷氨酸谷氨酸(EE)标签(SEQ ID NO：15；或SEQID NO：16)的IL-22多肽。用ProFlux A30上的Amicon S10Y3螺旋式筒滤器浓缩表达IL-22-CEE的BHK细胞的条件培养基。向浓缩的条件培养基中加入蛋白酶抑制剂溶液到终浓度为2.5mM乙二胺四醋酸(EDTA，Sigma Chemical Co.St.Louis，MO)、0.003mM亮肽酶素(Boehringer-Mannheim，Indianapolis，IN)、0.001mM胃酶抑素(Boehringer-Mannheim)和0.4mM Pefabloc(Boehringer-Mannheim)。取样用于分析并将总体积冻存于-80℃直到开始进行纯化。用抗EE HRP连接抗体SDS-PAGE和蛋白质印记技术分析浓缩的条件培养基中的总靶蛋白浓度。

向Waters AP-5(5cm×10cm玻璃柱)中灌注大约100ml体积的抗EE G-Sepharose(按如下所述制备)。用pH 7.4的磷酸缓冲液(PBS)和BioCad Sprint(PerSeptive BioSystems，Framingham，MA)对柱进行流动填充和平衡。融化浓缩的条件培养基，用0.2微米灭菌滤器过滤，调节pH 7.4，然后上柱过夜，流速大约1ml/分钟。用10倍柱体积(CV)的磷酸盐缓冲液(PBS，pH 7.4)清洗柱子，然后用200ml含有0.5mg/ml EE肽(Anaspec，San Jose，CA)的PBS(pH6.0)洗柱子，流速5ml/分钟。所用的EE肽具有EYMPME(SEQ ID NO：15)氨基酸序列。用10CVs的PBS清洗柱子后用5CVs的0.2M甘氨酸pH 3.0洗脱。用2CVs的5X PBS将甘氨酸洗脱的柱子的pH调节到7.0，然后用PBS(pH 7.4)平衡。在全程的洗脱层析中收集5ml的洗脱馏份，检测280和215nM处的光吸收；流过和清洗下来的合并物也被储存并分析。用SDS-PAGE和银染和抗EE HRP连接抗体蛋白印记检测EE多肽洗脱峰馏份中的靶蛋白。合并所需的多肽洗脱馏份并采用10,000Dalton分子量筛截膜的离心浓缩器(Millipore，Bedford，MA)按照仪器生产商的说明书操作，从60ml浓缩到5.0ml。

为了从其它共同纯化出的蛋白中分离IL-22-CEE，浓缩的肽洗脱合并馏份在pH 8.0条件下用POROS HQ-50(强阴离子交换树脂，PerSeptive BioSystems，Framingham，MA)处理。灌装1.0×6.0cm的柱子并用BioCad Sprint流动填充。柱子带上抗衡离子电荷，然后用20mM Tris pH 8.0(Tris(羟甲基氨基甲烷))平衡。样品按1∶13稀释(减少PBS的离子强度)然后以5ml/分钟流速加到Poros HQ柱上。用10CVs的20mM TRIS pH 8.0清洗柱子，然后用40CV的梯度20mM Tris/1M氯化钠(NaCl)10ml/分钟速度洗脱。在整个层析过程收集1.5ml的洗脱馏份，在280和215nM处监测。用SDS-PAGE银染分析洗脱峰馏份。合并所需馏份并采用10,000 Dalton分子量筛截的膜的离心浓缩器(Millipor e，Bedford，MA)按照仪器厂商的说明书操作浓缩到1.5-2ml。

为了从游离的EE肽和其它任何污染的共同纯化出的蛋白中分离IL-22-CEE，用1.5×90cm的Sephadex S200(Pharmacia，Piscataway，NJ)柱子中的分子筛析色谱处理合并的浓缩馏份，该柱用PBS平衡并用BioCad Sprint以1.0ml/分钟的流速上样。在整个层析过程收集1.5ml的洗脱馏份并监测280和215nM处的光吸收。用SDS-PAGE银染表征峰馏份，只有最纯的馏份被合并。这个物质就是纯化的IL-22-CEE多肽。

最终将这个纯化的物质用4ml ActiClean Etox(Sterogene)柱处理来去除任何残留的内毒素。样品流过PBS平衡的重力柱4次，然后用单一的3ml体积的PBS清洗柱子，并和“清洁”的样品合并。然后将此物质进行0.2微米灭菌过滤并储存在-80℃中直到分装。

在蛋白印记的考马斯蓝和银染SDS-PAGE凝胶中IL-22-CEE多肽是一个主要的条带。用BCA(Pierce，Rockford，IL)分析测定纯化物中的蛋白浓度，并且蛋白被分装并根据标准操作储存到-80℃中。

为了制备抗EE Sepharose，用500ml Nalgene 0.45微米过滤器单位含有0.02％叠氮化纳的100ml PBS清洗100ml柱床体积的G蛋白Sepharose(Pharmacia，Piscataway，-NJ)三次。用6.0倍体积的200mM三乙醇胺pH 8.2(TEA，Sigma，St.Louis，MO)清洗凝胶，并加入等体积的含900mg抗体的EE抗体溶液。4℃下孵育过夜后，如上所述用5倍体积的200mM TEA清洗树脂去除未结合的抗体。在2倍体积的TEA中重悬树脂，转到合适的容器中，并将dimethylpimilimidate-2HCl(Pierce，Rockford，IL)溶于TEA，加入到终浓度为36mg/ml的蛋白G-Sepharose凝胶。凝胶在室温下摇动45分钟，并如上所述用滤器去除液体。用5倍体积的20mM乙醇胺200mM TEA室温下孵育10分钟封闭凝胶上的非特异性位点。随后用5倍体积的含有0.02％的叠氮化纳的PBS清洗凝胶并在4℃下储存在溶液中。

实施例5

IL-22多肽的体内效果

小鼠(雌性，C57BL/6N，年龄8周；Charles River Labs，Kingston，NY)分为3组。以前用标准方法制备了表达IL-22多肽(SEQ ID NO：6的腺病毒)。在第0天，亲本或IL-22腺病毒分别通过尾部静脉给予到第一(n＝8)和第二(n＝8)组，每个小鼠接受～0.1ml体积中的～1×10¹¹颗粒的剂量。第三组(n＝8)不接受治疗。在第12天，小鼠称重并抽血。对样品进行全血细胞计数(CBC)和血清化学分析。检测到IL-22腺病毒处理组的血液样品中的中性白细胞和血小板数量相对于亲本腺病毒处理组具有统计学显著性的升高，并且，IL-22腺病毒处理组相对于亲本腺病毒处理组的淋巴细胞和红细胞数量显著减少。另外，IL-22腺病毒处理小鼠体重下降，而亲本腺病毒处理小鼠体重增加。并且，第三天时血清IL-22水平增加，葡萄糖水平下降。总之，IL-22腺病毒处理小鼠表现的急性期应答也能被其它促炎性细胞因子例如TNF-α、IL-1β和gp130细胞因子引发。急性期应答是模式识别分子发起的一组直接的炎症应答。急性期蛋白提供了增强的针对微生物的保护作用，并且修改了炎症应答对细胞运输和介质释放产生影响。例如，SAA具有潜在的白细胞激活功能，包括诱导趋化性、增强白细胞粘附到上皮细胞，并增加吞噬。理解发起和改变急性期应答的强度和持续时间的因子是开发新的感染和炎症疾病疗法的重要步骤。

结果表明，IL-22影响造血作用，例如体内血细胞形成。像这样，IL-22可能具有生物活性影响不同的血液干细胞，因此导致增加或降低特定谱系的某些分化的血液细胞。例如，IL-22显得能减少淋巴细胞，这可能是因为抑制了增加淋巴细胞的定向先祖细胞的原因。IL-22还减少血红细胞，支持IL-22可能通过影响参与这些过程的血细胞从而在贫血、感染、炎症、和/或免疫疾病中具有一定作用的这种概念。IL-22的拮抗剂，例如抗体或其可溶性受体IL-22RA2有可能用作这些疾病的治疗药物。

此外，这些在小鼠中使用IL-22腺病毒的实验表明IL-22过量表达增加体内嗜中性粒细胞和血小板的水平。可以想像，还有其它因子(例如细胞因子和修饰基因)参与整个动物系统对IL-22的应答。然而，这些数据强烈的支持了IL-22参与造血的观点。因此，IL-22及其受体是合适的诊断和治疗多种疾病的试剂/靶点，所述疾病包括炎症、免疫疾病、感染、贫血、造血和其它癌症等。

实施例6

表达IL-22转基因小鼠

A.产生表达小鼠IL-22的转基因小鼠

采用标准方法制备含有淋巴特异性的EμLCK启动子的5′和3′侧翼顺序、小鼠IL-22(SEQ ID NO：10；SEQ ID NO：11显示的多肽)、大鼠胰岛素II内含子、IL-22cDNA和人生长素poly A序列的转基因载体中的DNA片段，并采用标准微注射流程微注射到灭菌的B6C3f1(Taconic，Germantown，NY)小鼠卵母细胞中。参见Hogan，B.et al.，Manipulating the Mouse Embryo.A Laboratory Manual，Cold SpringHarbor Laboratory Press，1994。

25只小鼠转基因了淋巴特异性的小鼠IL-22在154只幼崽中鉴定了EμLCK启动子。11只转基因幼崽在出生数小时内死亡，9只具有光泽表型的转基因幼崽在出生当天进行尸体剖检，2只成长到成年。一只成年鼠表达水平低。制备了尸体剖检幼崽的组织并按如下所述进行。

组织学检测。具有光泽表型的新生幼崽表现为和皮肤变硬有相关性，似乎它们脱水，导致适当护理减少。它们的行动总体上变得僵硬。

B.转基因小鼠基因型和表达分析

如上所述EμLck启动子驱动的小鼠IL-22转基因系，新生幼崽被观察到在第一天(出生日)有异常并被处死收集组织。所有幼崽被给予独特的耳朵标签数字，并且那些被命名为具有光泽皮肤表型的小鼠在处死时被记录。在12只幼崽中，6只被观察到有光泽皮肤表型，2只被指定为“严重”表型。严重表型的定义为带有很少可动性的小幼崽，其皮肤特别厚并且非常干。从每只幼崽的左侧收集皮肤，并冻在组织-Tek包埋介质中。

虽然没有收集表达数据，但是基因分型证实有光泽皮肤是转基因状态的良好指示物。用恒冷切片机将冻存皮肤块被切为7微米并染色来观察CD3、CD4、CD8、小鼠巨噬细胞、B细胞、CD80和MHC型II的存在。染色操作涉及让皮肤结合可购买的抗体、用过氧物酶标记二抗检测、和DAB色原体反应来使染色可见。

发现转基因动物的MHC II型和CD80更高，分别染色抗原递呈细胞和树状突细胞。和野生型动物相比，严重和非严重转基因细胞中检测到更多的巨噬细胞标志物，但是这些细胞的区别主要局限在高等真皮(high dermis)中。被划分为严重表型的动物所有这三种标志物的染色都最强，和野生型相比表现出细胞强度和数量的增加。这种变化有可能是因为IL-22在这些转基因创立幼崽中的不同表达水平所引起的。MHC型II阳性细胞位于较低等真皮，以一种松散开放簇的形式排列，而CD80阳性细胞主要在真皮下，或者在肌肉/脂肪层里面或就在其上面。这两种细胞群没有表现出重叠。在所有动物中其它所有的标志物染色相当。甲苯胺染色肥大细胞显示野生型和转基因动物轻微的没有区别。

C.显微镜评价转基因小鼠的组织：带有EuLck启动子的IL-22TG具有新生致死组织学

在出生日，来自于litters含有IL-22转基因的幼崽被人为施以无痛致死，整个尸体在10％缓冲福尔马林中浸泡固定。6只转基因和两只非转基因幼崽接受进一步诊断检查。6只转基因中的4只被记录在安乐死时有光泽皮肤。固定的组织被修剪为5个切片(头部的纵向切片和上、下胸廓的横切片和上、下腹部的横切片)。组织被包埋在石蜡中，常规处理，5um切开(Jung 2065 Supercut microtome，LeicaMicrosystems，Wetzlar，德国)并用H&E染色。委员会(ACVP)认证的兽医病理学家在光学显微镜(Nikon Eclipse E600，Nikon Inc.，Melville，NY)下评价染色的组织。

在显微镜检查中，转基因幼崽中的两只小鼠的表皮被观察到比其它6只小鼠(包括对照)厚。没有记录任何小鼠其它皮肤和其它组织的异常。用附加在显微镜上的40X物镜和CoolSnap数码相机(RoperScientific，Inc.，San Diego，CA)对胸和腹对应区域的皮肤的代表性区域进行了成像。用组织形态测定软件(Scion Image for Windows(NIH Image)，Scion Corp.，Frederick，MD，v.B4.0.2)确定了表皮厚度。结果列于下面的表5。

表5

基因型/表型	胸部皮肤的平均厚度(μm)	腹部皮肤的平均厚度(μm)
			非转基因/正常	5.2	5.4
转基因的/不光滑	5.0	6.7
			转基因的/光滑	8.2	7.4
转基因的/全部	7.1	7.1

小鼠数量不足以确定统计学显著性；但是转基因小鼠，尤其是有光泽皮肤的，和非皮肤光泽的转基因小鼠与非转基因对照小鼠相比具有表皮增厚的趋势。和非皮肤光泽转基因小鼠相比，皮肤有光泽的转基因小鼠有可能具有更高的IL-22表达水平；但是没有确定这些小鼠的表达水平。这些表明IL-22在牛皮癣、牛皮癣性关节炎或其它炎性皮肤症状或其它炎性疾病中扮演一定角色。

实施例7

IL-22多肽A的体内效果

A.IL-22腺病毒感染的小鼠表现出SAA诱导

小鼠(雌性，C57BL/6N，8周；Charles River Labs，Kingston，NY)被分为3组。以前采用标准方法制备了表达IL-22多肽(SEQ ID NO：6)的腺病毒。在第0天，亲本或IL-22腺病毒分别通过尾部静脉给予到第一(n＝8)和第二(n＝8)组，每个小鼠接受～0.1ml体积中的～1×10¹¹颗粒的剂量。第三组(n＝8)不接受治疗。在第12天，小鼠称重并抽血。在实验的第20天，小鼠被处死，称体重并记录，收集血液和组织用于分析。

对所有的血液样品进行全血细胞计数(CBC)和血清化学分析。在第12天和第20天，检测到IL-22腺病毒处理组的血液样品中的中性白细胞和血小板数量相对于亲本腺病毒处理组都具有统计学显著性的升高。并且，第12天时IL-22腺病毒处理组相对于亲本腺病毒处理组的淋巴细胞显著减少，但是第20天观察到相反效果。另外，IL-22腺病毒处理小鼠体重下降，而亲本腺病毒处理小鼠体重增加。和亲本腺病毒处理组相比，IL-22腺病毒处理组在两个时间里的血清样品葡萄糖显著减少。两个时间的血清清蛋白都显著减少。第20天时血液尿素氮水平显著降低。和亲本腺病毒处理组相比，IL-22腺病毒处理组在两个时间里的血清球蛋白水平都显著增加。显微镜观察，观察到的和IL-22相关的一个组织形态学改变是肾小管再生。虽然在小鼠中不常见，但是在这组动物中更多并且更严重。肾病的特征是多病灶区域皮质肾小管上皮细胞嗜碱粒细胞增多。

进行了一个新增的和上述一个实验设计相同的实验来验证结果并收集额外的样品。在这个实验中，每3天记录体重，给小鼠注射腺病毒后第3天收集血样品，在第10天(每组n＝4)和第20天(每组n＝4)处死小鼠收集血液和组织。又一次检测到IL-22腺病毒处理组相对于亲本腺病毒处理组血液样品中嗜中性粒细胞和血小板数量增加。第3天嗜中性粒细胞的效果明显，但是血小板数量直到第10天才出现显著差别。同样，在3和10天IL-22腺病毒处理组相对于亲本腺病毒处理组淋巴细胞数量显著减少，但是没有象以前的实验那样在第20天出现升高。再一次，给予IL-22腺病毒的小鼠在整个实验疗程期内降低了体重，同时对照病毒处理和未处理的小鼠的体重增加。血清化学参数与前面的实验结果一致。组织学检查发现的IL-22腺病毒处理和肾小管再生的相关性在此实验中也得到验证。这和新发现的给予IL-22的小鼠出现中度蛋白尿(第20天)是相一致的。

这个结果暗示IL-22影响造血作用，例如体内血细胞形成。像这样，IL-22有可能具有影响不同血液干细胞的生物学活性，因此导致特定的谱系的某些不同的血细胞出现增加或减少。例如，IL-22显得能减少淋巴细胞，这可能是由于抑制增加淋巴细胞的定向先祖细胞的原因，支持了如下观点：IL-22可能通过影响参与这些过程的血细胞在贫血、感染、炎症和/或免疫疾病中扮演一定角色。IL-22的拮抗剂，例如抗体或其可溶性受体IL-22RA2有可能用作这些疾病的治疗药物。

并且，在小鼠中使用IL-22腺病毒的这些实验暗示，IL-22过量表达增加体内的嗜中性粒细胞和血小板的水平。可以想像，还有其它因子(例如细胞因子和修饰基因)参与整个动物系统对IL-22的应答。然而，这些数据强烈的支持了IL-22参与造血的观点。因此，IL-22、抗IL-22抗体、IL-22RA可溶性受体(例如SEQ ID NO：3)和抗IL-22RA抗体是合适的诊断和治疗多种疾病的试剂/靶点，所述疾病包括炎症、免疫疾病、感染、贫血、造血和其它癌症等。

IL-22表达和体重减轻直接的相关性、急性期蛋白SAA的出现和通过减少血清葡萄糖、白蛋白和尿素氮证明的代谢干扰暗示IL-22是一种在某些炎症反应早期发挥作用的细胞因子。给予IL-22腺病毒的小鼠可以出现慢性炎症的状态，例如在IBD、溃疡性结肠炎、关节炎、牛皮癣、牛皮癣性关节炎、哮喘等中观察到的。使用IL-22的拮抗剂，例如抗IL-22抗体及其受体例如IL-22RA可溶性受体(例如SEQ IDNO：3)和抗IL-22RA抗体等有可能抑制某些有害的炎症过程。

B.IL-22是一种促炎性细胞因子：在Adeno-IL-22小鼠中的SAA的血清水平：

使用小鼠SAA免疫试剂盒和操作流程(Biosource International，California，USA)进行了一个ELISA来确定IL-22-Adeno小鼠中的SAA水平。稀释的标准品和未知样品和HRP-抗小鼠SAA一起铺到预先包被有抗小鼠SAA抗体的检测板中。板在37摄氏度下孵育1小时然后根据试剂盒说明书清洗。板在室温下用TMB显影15分钟并用2M H₂SO₄终止，用Spectromax 190(Molecular Devices，California，USA)读取450nm的光吸收值。用Softmax Pro(Molecular Devices，California，USA)和Excel(Microsoft Corp.，Washington，USA)分析结果数据。

和亲本腺病毒对照相比感染IL-22-腺病毒的小鼠的mSAA大量增加，超过10倍。

C.流式细胞计量分析IL-22腺病毒感染小鼠

为了分析腺病毒对体内IL-22表达的效果，我们在感染后第10天和第20天从IL-22-腺病毒感染的C57BL/6N小鼠中分离外周血、脾和骨髓。在加肝素的管中大约收集100μl血，然后用低渗溶解法去除红细胞(细胞在4.5ml dH₂O裂解～5秒，然后加1.5ml 3.6％NaCl)。脾在两张磨沙玻璃片间磨碎，释放的细胞通过Nytex膜(细胞筛网)并打散。通过用研钵压碎大腿骨获得骨髓并让细胞通过细胞筛网(Falcon)。细胞重新悬浮在FACS洗涤缓冲液(WB＝HBSS/1％BSA/10mM hepes)中，用台盼蓝计数，将每种类型的1×10⁶个活性细胞分装到5ml聚苯乙烯管中。细胞清洗并打散，然后在冰上和荧光标记的(FITC，PE，and CyChrome)识别多种细胞表面标志物的用于鉴定特定的免疫细胞亚群的单克隆抗体(PharMingen，San Diego，CA)按照夹心法孵育20分钟。这些标志物包括如下(列于我们检测的3组)。对于血液染色：CD3、Gr1和B220；对于脾染色：CD62L、CD44和CD3；CD21、CD23和B220；IgD、IgM和B220；CD11b、Gr1和CD8；对于骨髓染色：CD11b、Gr1、CD3；IgD、IgM和B220。用1.5ml WB清洗细胞并打散，然后重悬于0.4ml的WB中，并在FACScan上用CellQuest软件(Becton Dickinson，Mountain View，CA)分析。

我们发现，在第10天时IL-22-adeno处理小鼠的血液中的嗜中性粒细胞增加了4-13倍，在第20天增加了2-3倍。在第10天，这个区别导致了相伴随的血液中淋巴细胞和单核细胞的减少。在骨髓中，第10天我们发现B细胞总数下降了约1.5倍，发育成熟的再循环B细胞的比例增加，不成熟的B细胞的总数轻微下降。在第20天，这些区别许多都不明显，但是我们确实发现成熟的再循环B细胞轻微增加。在脾中，在两个检测日期中B细胞都总数轻微下降(1.5-2倍)，在第20天，边缘带B细胞(CD21+CD23-B220+)增加2倍，滤泡B细胞(CD21+CD23+B220+)下降2倍。边缘带B细胞被认为是病原体的一线防御，和更普通的滤泡B细胞相比它们对B细胞分裂素(例如LPS)更加敏感，并且当它们遇到相关抗原时会非常迅速的分化为分泌抗体细胞。IL-22可能或者增强滤泡B细胞转化为边缘带B细胞，或者选择性减少成熟度较小的滤泡细胞。在骨髓中发现B细胞数量的变化有可能表明前/促和/或未成熟B细胞分化增强，或者再循环B细胞从血液/脾流入，并且有可能是未成熟B细胞同时流出到外周血中。成熟BM B细胞的确切数量没有增加，因此IL-22不会增强它们的增殖。可选择的，IL-22可以阻断、减少或抑制未成熟B细胞的分化，因此增加成熟B细胞的相对表现。

D.在体内IL-22RA2-Fc4中和IL-22活性：SAA ELISA表明IL-22诱导的SAA表达被IL-22RA2-Fc4注射所抑制：

为了评价IL-22RA2是否能抑制IL-22对SAA的诱导，小鼠(雌性，C3H/HEJ，8周；Jackson Labs，Bar Harbor，ME)被分为5组，每组3只，IP注射显示于下面表6的蛋白：

表6

组号	IL-22	IL-22RA2
			组1：	-	-
组2：	-	100μg
			组3：	3μg	-
组4：	3μg	20μg
			组5：	3μg	100μg

在IL-22注射前15分钟注射IL-22RA2。两种蛋白注射都采用腹膜内途径。在每只小鼠处理前、处理后2和6小时都收集血液样品。每个样品制备血清用于检测SAA和IL-22。

按如上所述进行ELISA来确定接受IL-22、可溶性IL-22受体、此处所述IL-22RA2-Fc4处理的小鼠的SAA水平。和背景相比3μgIL-22结合浓度在20-100ug之间的IL-22RA2-Fc4处理的小鼠表现出IL-22单独诱导的SAA水平的下降，表明IL-22RA2抑制体内IL-22的SAA诱导活性。

实施例8

IL-22在炎性肠病小鼠模型中的表达

炎性肠病(IBD)是一种多因子病，分为溃疡性结肠炎(UC)和克罗恩病(CD)两种类型。UC局限于结肠，症状包括血性腹泻、体重减轻和腹痛。UC的显微镜特征包括加重的溃疡和结肠缩短。相反，克罗恩病还能影响肠的其它部分。症状包括腹泻(出血次数不象UC那么多)、低热和疼痛。显微镜特征包括纤维变性和带有狭窄、深度溃疡、脑裂和瘘的狭窄肠。

有一些动物模型可以模拟这些人类疾病。三种常用于药物筛选的结肠炎模型是2，4，6-三硝基苯磺酸(TNBS)诱导的大鼠模型、小鼠T细胞转移模型和葡聚糖硫酸钠或DSS诱导的小鼠模型。DSS模型是使用疾病活性指数得分系统(S.N.S.Murthy，Treatment of Dextran Sulfate Sodium-Induced Murine Colitis by Intracolonic Cyclosporin，Digestive Diseases and Sciences，Vol.38，No.9(September 1993)，pp.1722-1734)来自于Dr.S.Murthy的模型。

在本发明中，当通过饮用水中给小鼠喂DSS 6天时导致急性结肠炎。动物表现出体重减轻和出血腹泻，模拟UC患者的症状。DSS损伤的机制不很清除，但认为它能诱导一种非特异性炎症免疫应答并模拟环境对肠的影响。有可能产生对细胞有毒性的H₂S。另外，发生腔细菌群落的改变。在结肠中证明了激活的单核细胞、巨噬细胞和肥大细胞。所有三种动物模型的介质(Mediators)包括炎性前列腺素、白细胞三烯代谢产物和细胞因子。

A.方法

在来自于Charles River实验室的Swiss Webster雌性小鼠中用DSS摄食诱导结肠炎。实验开始时小鼠为10和11周。通过饮用水给予小鼠4％DSS 6天(处理小鼠)或仅给予正常饮用水(对照小鼠)。使用疾病活性指数临床得分(DAI)，DAI由包括粪便质量、潜血和体重减轻的综合检测组成。在DSS处理后1天开始每天获得每只小鼠的DAI。6天后，去除处理小鼠饮用水中的DSS。采用DAI临床得分监测所有小鼠直到在实验开始后第2、7或10天处死小鼠。在第2和7天，4只DSS处理小鼠和1只对照小鼠被处死。在第10天，4只DSS处理小鼠和2只对照小鼠被处死。对于所有处死小鼠都测量结肠长度。结肠切片在10％中性缓冲的福尔马林中固定用于组织学分析或冻存进行mRNA提取。

B.组织学得分和疾病活性指数(DAI)得分

按照参考文献1的方法获得组织学指数得分。通常病理学者对结肠切片的小囊得分(crypts cores)、增生上皮、小囊畸变(cryptdistortion)和炎症进行盲打分。

每天，每只小鼠按照基于体重减轻、粪便稠度和肠出血的临床得分进行分级。随着体重减轻、腹泻和出血增多给分增大。每只小鼠的每天得分是三种结果/观察的均值。

C.结果

第7天和第10天DSS处理小鼠的结肠长度比对照组短，但是结果可能不明显(没有用统计学程序检查)。临床DAI得分反映了DSS处理小鼠疾病症状升高，这和过去使用此模型的实验结果相似。在大约第4天和第5天时潜血最多，第6天和第7天稀粪更多。组织学结果表明在所有处死日期疾病得分和对照不同，尤其是第7天(峰值)和第10天。组织病理学筛选得分为：对照＝0.5，第2天DSS处理小鼠＝8.8，第7天DSS处理小鼠＝21，第10天DSS处理小鼠＝18。临床和组织病理学得分表明和非处理对照相比DSS处理小鼠具有显著的结肠疾病。冻存组织样品随后用于如下所述的mRNA测定。

D.用RT-PCR检测鼠类IBD结肠样品中IL-22RNA的组织表达

为了确定小鼠IL-22RNA(SEQ ID NO：10；SEQ ID NO：11)在炎性肠病模型中的相关表达，收集DSS处理小鼠的末端结肠并立即冻存到液氮中。在本实验中小鼠经DSS处理并在处理后第2、7和10天收集样品。也从正常未处理小鼠中收集样品。然后采用标准RNeasyMidiprep^TM试剂盒(Qiagen，Valencia，CA)按照生产商说明书从样品中分离RNA。

采用′带有Platinum Taq.的Superscript One-Step RT-PCR系统′(Life Technologies，Gaithersburg，MD)进行RT-PCR反应。每个25μl的反应包括下述：12.5μl of 2X反应缓冲液，0.5ul(20pmol/μl)ZC39，289(SEQ ID NO：17)，0.5μl(20pmol/ul)ZC39，290(SEQ ID NO：18)，0.4μl RT/Taq聚合酶混合物，10ul无RNase的水，1.0μl总RNA(100ng/μl)。扩增按如下进行：50°，30分钟，1个循环，随后94°，30秒；58°，30秒；72°，60秒，35个循环；用72°，7分钟的最终延长作为结束。用2％琼脂糖凝胶对8-10μl PCR反应产物进行标准琼脂糖凝胶电泳。目前预测的cDNA片段大小见下：在第2天的2个样品中出现了模糊条带。第7天3个样品中的2个产生了强条带，而第3个第7天的样品产生了非常强条带。第10天的3个样品产生了强条带。最终，两个“正常”对照样品没有产生任何条带。这些结果暗示，在结肠中的某些类型的炎性应答(包括那些和炎性肠病、溃疡性结肠炎和克罗恩病相关的)中IL-22上调。这些数据在下述表7中被总结，其中相对表达按下述打分：0＝没有条带，1＝模糊条带，2＝强条带，3＝非常强条带。

表7

组织	相对表达(0-3)
		正常的结肠	0
正常的结肠	0
		处理2天后	1
处理2天后	1
		处理7天后	3
处理7天后	2
		处理7天后	2
处理10天后	2
		处理10天后	2
处理10天后	2

实施例9

IL-22RA2降低小鼠胶原诱导关节炎(CIA)模型中的IL-6和SAA水平

A.小鼠胶原诱导的关节炎(CIA)模型

10周年老雌性DBA/1J小鼠(Jackson Labs)被分为3组，每组13只小鼠。在第21天，对动物进行皮下注射50-100μl 1mg/ml采用用弗氏完全佐剂(Chondrex制备，Redmond，WA)的小鸡II型胶原，并且3周后的第0天被注射100μl(25μg)来自大肠杆菌0111：B4的从低压冻干分装(Sigma，St.Louis，MO)被制备为250μg/ml的LPS。从第0天到第25天连续4周每周腹腔内注注射3次IL-22RA2。头两组的每只动物每次接受剂量为100或10μg的IL-22RA2，第3组接受对照载体PBS(Life Technologies，Rockville，MD)。动物在LPS注射后开始表现关节炎症状，多数动物在2-3周内发展出炎症。用测径器测量爪厚度来评价病变程度，并按如下详述对每只爪赋予临床得分(0-3)∶0＝正常，0.5＝足指发炎，1＝轻微足指发炎，2＝中度足指发炎，3＝严重指发炎。

监测疾病：

动物在第二次胶原注射后不久就能开始表现爪发炎征兆，并且一些动物甚至可以在第二次胶原注射前开始具有脚趾发炎征兆。多数动物在加强注射2-3周内发展出关节炎，但是一些可能需要更长时间。在这种模型中疾病发病率是有典型的95-100％，在使用40只动物的实验中典型的观察到0-2只无应答者(观察6周后确定)。当炎症开始，会发生常见的短暂的可变的低度爪或脚趾炎症。因此，直到发展出显著的、持续的爪肿大才认为动物建立疾病。

每天观察通过每个爪的定性临床得分来评价所有动物的爪的疾病状况。根据临床疾病状态每天每只动物有4个爪得分。为了确定临床得分，爪被认为有3个区域，脚趾、爪本身(手或足)和腕或踝关节。记录这些区域炎症的范围和严重程度，包括观察所有的脚趾出现的任何关节肿、指甲撕裂或发红，任何爪中的水肿或发红都被记录，并记录腱或骨出现的任何解剖界限丢失，并评价腕或踝出现的任何水肿或发红，并记录是否炎症范围扩展到最近的腿。首先根据严重综合印象，然后根据多少脚趾参与来给予爪得分1、2或3。下面显示了临床得分的等级。

临床得分：

0＝正常

0.5＝一个或多个脚趾参与，但是只有脚趾发炎

1＝爪(1区域)轻微炎症，并可以包括一个或多个脚趾

2＝爪中度炎症并且可以包括一些脚趾和/或腕/踝(2个区域)

3＝爪严重炎症，腕/踝，并且一些或所有脚趾(3个区域)

将建立的疾病用范围在2至2以上的爪的炎症定量得分进行限定，持续过夜(在一个爪上两天)。一旦建立的疾病出现，立即将该数据记录下来，并定为动物具有“建立的疾病”的第一天。

整个实验过程都收集血液来监测抗胶原抗体的血清水平。第21天处死小鼠，收集血液用于血清和CBC。对每只动物，一个感染的爪被收集在10％NBF中用于组织学，一个感染的爪冻于液氮并储存在-80℃用于mRNA分析。同样，在RNAlater中收集1/2的脾、1/2的胸腺、1/2肠系膜淋巴结、一个肝叶和左肾用于RNA分析。并且在10％NBF中收集1/2的脾、1/2的胸腺、1/2的肠系膜淋巴结、肝剩余部分和右肾用于组织学研究。收集的血清冻于-80℃用于免疫球蛋白和细胞因子检测。

对爪得分和检测数据进行分析时不同组之间没有出现统计学显著的差别，但是暗示一个接受IL-22RA2处理的组可能在爪炎症发作和恶化中出现延迟。在体重、CBC参数或抗胶原抗体水平中不同组没有出现统计学显著的差异。这些早期结果表明IL-22RA2对体重、红细胞或白细胞或抗体产生没有不利影响，但是可能能够减少炎症。对剂量、作用机制和效果的进一步的研究正在进行中(例如实施例10)。

B.小鼠CIA模型中的抗胶原ELISA数据

在胶原诱导关节炎(上述的实施例9A)小鼠模型中相对于LPS激发(第0天)的第0、7、14、21和28天收集血清样品。用ELISA筛选血清样品的抗胶原抗体滴度。和PBS对照组相比，IL-22RA2处理的100μg或10μg组的抗胶原抗体水平没有出现统计学显著的效果。下面描述了抗胶原ELISA方法和材料。

抗胶原ELISA使用的试剂是Maxisorp 96孔微量滴定板(NUNC，Rochester，NY)，鸡II型胶原(Chondrex，Redmond，WA)、SμperBlock(Pierce，Rockford，IL)、辣根过氧化物酶(HRP)交联的山羊抗小鼠IgG+A+M(H+L)(Zymed，South San Francisco，CA)和o-phenylenediamine dihydrochlor ide底物(Pierce，Rockford，IL)。所有检测使用的缓冲液是ELISA B稀释缓冲液(PBS+0.1％BSA+0.05％Tween(Sigma，St.Louis，MO))、ELISA C清洗缓冲液(PBS+0.05％Tween)和NovoD显影缓冲液(0.063M sodium citrate，0.037Mcitric acid)，H₂O₂(Sigma)和1N H₂SO₄(VWR，Tukwilla，WA)。

通过眼窝后(retro-orbital)放血收集大约100μL外周血进入血清分离管(Becton Dickinson)。通过离心(2-3min，16,000xg，4-6℃)收集血清并储存在-20℃直到分析使用。为了确定抗胶原Ig抗体水平，用10μg/mL小鸡type-II胶原(Chondrex，Redmond WA)包被NUNC板并在4℃孵育过夜。用ELISA C清洗板，用Super Block(Pierce，Rockford，IL)封闭(5分钟，室温)并用ELISA C清洗。稀释的血清样品(用ELISA B稀释5倍，从1∶5000到1∶625,000)以3次重复加入到ELISA板上，然后板在4℃孵育过夜。孵育后，用ELISAC清洗板，加入过氧化物酶交联的山羊抗小鼠Ig Fc(Zymed，在ELISAB 1∶2000)。孵育板(室温，90分钟)，再次用ELISA C清洗，然后用o-phenylenediamine dihydrochloride底物(10mL NovoD+1tablet OPD+10μL H₂O₂，Pierce)显影HRP活性。反应用1N H₂SO₄终止。在490nm用Spectra MAX 190检测相对1∶25,000稀释的血清样品的光学密度，并且用SoftMax Pro软件(Molecular DevicesCorporation，Palo Alto，CA)分析数据。

C.在小鼠CIA模型中分析IL-6和SAA

从CIA小鼠(上述实施例9A)中收获第0天施用25μg LPS 4小时后的血清样品。用购买自Biosource International(Camarillo，CA)的商业化ELISA试剂盒并按生产商说明书操作筛选样品中IL-6和血清淀粉样蛋白A(SAA)的浓度。

在施用100μg IL-22RA2、10μg IL-22RA2和PBS对照组小鼠中，IL-6水平分别为9651+/-1563pg/ml、10,865+/-1478pg/ml和15,006+/-2,099pg/ml。100μg剂量IL-22RA2组CIA小鼠IL-6浓度显著低于PBS对照小鼠，p＝0.351。用Fisher′s PLSD计算显著水平为5％得到了统计学显著性(ABACUS Concepts，INC，Berkeley，CA)。

另外，在施用100μg IL-22RA2、10μg IL-22RA2和PBS对照组小鼠中，SAA浓度分别为381+/-40μg/ml、348+/-37μg/ml和490+/-50μg/ml。10μg剂量IL-22RA2组CIA小鼠SAA浓度显著低于PBS对照小鼠，p＝0.257。用Fisher′s PLSD计算显著水平为5％得到了统计学显著性(ABACUS Concepts，INC，Berkeley，CA)。

实施例10

在小鼠CIA模型中抗IL-22RA mAbs或抗IL-22mAbs抑制疾病严重程度

胶原诱导的关节炎(CIA)模型是一个类风湿性关节炎小鼠模型，很大程度上反映了人类疾病(Moore，Methods Mol.Biol. 225：175-179，2003：Waksman，Scand.J.Immunol.，56：12-34，2002)。在尾下给予两次剂量的CFA乳化胶原对小鼠进行免疫。这导致爪肿大并在一段时间里继续增大，并且既能视觉打分又能用测径器测量。另外，血清抗凝胶抗体和疾病严重程度相关性很好。基于表明IL-20和IL-22诱导炎症的数据，对数组凝胶免疫的小鼠施用抗IL-22RA和抗IL-22的mAb，检测对疾病得分的效果。在自身免疫模型中施用抗IL-22RA mAb或抗IL-22mAb后爪得分和爪厚度下降，暗示IL-20和IL-22促进免疫应答的进行，并且阻断、抑制、减少、拮抗或中和它们的功能能抑制自身免疫疾病。抑制血清TNFa和抗胶原抗体也暗示了阻断IL-22RA有可能对治疗自身免疫疾病有益。

因此，为了确定抗IL-22RA mAb或抗IL-22mAb是否对自身免疫有效果，在类风湿性关节炎-凝胶诱导关节炎(CIA)小鼠模型中检测了它们。特别的，给DBA1J小鼠注射凝胶来诱导风湿样关节炎。第0天的接种是皮下注射含有弗氏完全佐剂(CFA)和II型凝胶(50-100μl，制备为2mg/ml凝胶)的匀浆。在近尾底处注射。在第21天给予第二次接种，唯一的区别是用不完全弗氏佐剂(IFA)代替CFA制备匀浆。每天检测爪得分和厚度。不同组小鼠在第二次凝胶注射后开始分别接受接受PBS、20-200ug对照同种型匹配单克隆抗体或20-200ug抗IL-22RA mAb或抗IL-22mAb的腹膜内注射，2X或3X/周，连续1-4周。每天监测小鼠直到第30天。第30天时处死小鼠，取血清用于抗凝胶抗体分析和血清细胞因子分析(TNF)。

给予抗IL-22RA或抗IL-22mAb对爪得分、爪厚度、血清TNFa和血清抗凝胶抗体的抑制暗示阻断型IL-22RA能够结合、阻断、减少、拮抗或中和IL-22，并在自身免疫模型中抑制正在进行的免疫应答，并可以抑制自身免疫疾病。

实施例11

在DSS小鼠模型中表达IL-22受体、IL-22RA

进行了定量RT-PCR来检测小鼠IL-22RA在DSS诱导的IBD(实施例8)小鼠结肠中的表达水平。从正常小鼠结肠和DSS处理小鼠2、7和10天末端结肠中提取RNA。用Applied Biosystems 7700 TaqMan仪器和操作流程进行RT-PCR。简而言之，根据Applied Biosystems的指导方针用“Primer Express”软件设计针对小鼠IL-22RA序列(ZC39776(SEQ ID NO：19)and ZC 39777(SEQ ID NO：20))的引物和FAM/TAMRA标记的TaqMan探针(ZC38752(SEQ ID NO：21))。每个反应加25ng RNA、PE/Applied Biosystems TaqMan EZ RT-PCR CoreReagents和上述引物和探针。按下述条件进行重复的RT-PCR反应：50℃2分钟，60℃30分钟，95℃5分钟，40个循环的94℃20秒和60℃1分钟。和已知数量的分子的标准曲线比较合成的小鼠IL-22RA RNA转录子的表达值，并且以每个反应中小鼠IL-22RA分子的绝对数来报告表达。初步数据暗示和正常小鼠结肠的表达水平相比，第7和10天的DSS诱导IBD小鼠结肠切片中小鼠IL-22RA表达轻微下调。

实施例12

在轻度内毒素血症模型中的IL-22和促炎性指示物：LPS诱导的内毒素血症小鼠模型

A.LPS诱导的内毒素血症小鼠模型：在LPS诱导的内毒素血症小鼠模型中测定促炎性细胞因子和体温

设计了一个体内实验来检测IL-22RA2(IL-22RA2)在小鼠轻度内毒素血症LPS模型中的效果。为了开始检测模型，我们检测了促炎性细胞因子和体温来收集模型的参考数据。

简要的，对6个月Balb/c(CRL)雌性小鼠进行腹膜内(IP)注射溶于灭菌PBS的25μg LPS(Sigma)。在第0，1，4，8，16，24，48和72小时的每个收集多组8只小鼠的血清样品。检测了血清样品中的炎性细胞因子水平。用购自Biosource International(Camarillo，CA)的市售ELISA试剂盒检测IL-1b、IL-6、TNFa、IL-10和血清淀粉样A蛋白(SAA)水平。

在注射LPS后1小时TNFa水平达到4000pg/ml的峰值，IL-10水平为341pg/ml。在注射LPS后4小时，IL-6、IL-1b和IL-10分别为6,100pg/ml、299pg/ml和229pg/ml。在注射LPS后4小时血清中SAA水平为0.405mg/ml。血清中SAA浓度持续增长，注射LPS后24小时达到3.9mg/ml，但是因为SAA和其它血清成分发生相互作用，用现在的ELISA试剂盒难以准确或可重复的检测出血清中大于1到2mg/ml的SAA水平。这些结果表明，在这个模型中确实产生除了IL-22(实施例11B)以外的促炎性细胞因子。因此建立下述标准作为轻度内毒素血症LPS模型的生物标志：施用LPS后1小时TNFa血清水平、施用LPS后4小时IL-6血清水平、施用LPS后4和8小时SAA血清水平。

在72小时的实验过程中对一独立组动物用外科手术移植遥测设备检测体温。注射LPS 30分钟后，小鼠体温剧烈下降了2℃，从37.07℃到34.98℃。

在注射LPS前30分钟注射100ug IL-22RA2-Fc融合蛋白在第4和8小时时间点显著减少大约50％的SAA诱导，而10ug IL-22RA2-Fc没有显著效果。TNF-α和IL-6水平没有显著改变。注射IL-22RA2-Fc在1小时时间点减少循环中的中性白细胞计数。这表明施用IL-22RA2-Fc能中和SAA诱导的IL-22活性。

B.在Alamar Blue增殖检测中用BaF3/CRF2-4/IL-22RA细胞检测LPS诱导的内毒素血症小鼠模型小鼠血清中的IL-22活性

离心下来BaF3/CRF2-4/IL-22RA细胞(如此处所述)并用PBS洗两次来保障去除mIL-3，然后离心第3次并重悬在不含mIL-3(以下称为“无mIL-3培养基”)完全培养基(RPMI 1640，10％FBS，1％GlutaMAX，1％Sodium Pyruvate)中。然后用血细胞计数器计数。用无mIL-3培养基以5000细胞/孔、100μl/孔，将细胞铺在96孔板上。

来自上面实施例11A所述实验的LPS诱导的内毒素血症小鼠的血清被板上的第一排无mIL-3培养基稀释到2％，然后按1∶2系列稀释到96孔板下面剩余的7排中，让每孔体积为100μl。然后加入到100μl细胞中，让最终血清浓度分别为1％、0.5％，0.25％、0.125％、0.063％、0.031％、0.016％和0.018％，总检测体积为200μl。检测板在37℃、5％CO₂培养4天，加入20μl/孔Alamar Blue(Accumed，Chicago，IL)。板再次孵育在37℃，5％CO₂中16小时。Alamar Blue基于活细胞的数量给出荧光读数，因而对照着阴性对照直接测量细胞增殖。在Wallac Victor 21420 Multilabel Counter(Wallac，Turku，Finland)上以530(激发)和590(发射)的波长对板进行读数。

结果显示，在第0、1、8、16小时时间点时没有高于背景水平的显著增殖。4小时时间点的血清样品显示高于背景4倍到超过10倍的增殖增加，表明在这些样品中存在IL-22。

C.LPS诱导的内毒素血症小鼠模型：实验检测IL-22RA2的效果

检测了IL-22RA2处理对小鼠腹膜内注射一次25μg LPS诱导的促炎性指示物的影响能力。分析了所有样品的SAA、IL-22和循环中性白细胞数量。分析了每组亚群的独特的细胞因子的水平(1小时样品筛选TNFα，4小时样品分析IL-6)。在下面表8中列出的时间点处死动物，收集全血和血清并分装用于分析。

按下面表8所示对72C57BL/6N雌性小鼠(CRL)进行腹膜内注射一次IL-22RA2。对照小鼠为C57BL/6N(CRL)。

30分钟后，它们接受另一次腹膜内注射100μl的25μg LPS(Sigma)来启动内毒素血症级联。按表8所示在相应的时间点处死每组的小鼠，收集50μl全血来检测循环嗜中性粒细胞的总数，并且剩余血液离心取血清并分装用于此处所述的各种检测。

表8

组	号	处理	LPS	处死时间	样品
						A	8	100μg IL-22RA2IP	25μg IPtx 30分钟后	1小时	用于CBC的血液、血清等分试样
B	8	10μg IL-22RA2 IP	25μg IPtx 30分钟后	1小时	用于CBC的血液、血清等分试样
						C	8	200μl PBS IP	25μg IPtx 30分钟后	1小时	用于CBC的血液、血清等分试样
D	8	100μg IL-22RA2IP	25μg IPtx 30分钟后	4小时	用于CBC的血液、血清等分试样
						E	8	10μg IL-22RA2 IP	25μg IPtx 30分钟后	4小时	用于CBC的血液、血清等分试样
F	8	200μl PBS IP	25μg IPtx 30分钟后	4小时	用于CBC的血液、血清等分试样
						G	8	100μg  IL-22RA2IP	25μg IPtx 30分钟后	8小时	用于CBC的血液、血清等分试样
H	8	10μg IL-22RA2 IP	25μg IPtx 30分钟后	8小时	用于CBC的血液、血清等分试样
						J	8	200μl PBS IP	25μg IPtx 30分钟后	8小时	用于CBC的血液、血清等分试样
K	5	对照	无	PreLPS	用于CBC的血液、血清等分试样

D.IL-22RA2-Fc4中和体内SAA诱导：SAA ELISA表明在LPS诱导的内毒素血症小鼠模型中LPS诱导的SAA表达被注射IL-22RA2-Fc4所抑制。

为了检测LPS诱导的内毒素血症小鼠模型中IL-22RA2是否能抑制SAA诱导，在注射LPS前30分钟给小鼠注射IL-22RA2，如上述实施例11C的表8所示。

使用小鼠SAA免疫测定试剂盒(BioSource International，California)按照生产商的指导进行了一个ELISA来确定第4和8小时的样品的SAA水平。在第4小时的时间点，相对于PBS注射小鼠，100μg或10μg IL-22RA2处理的小鼠表现出剂量依赖的统计学显著的SAA水平减少。在第8小时的时间点，相对于PBS注射小鼠，100μg处理的小鼠继续表现出统计学显著的SAA水平减少。这表明IL-22RA2能够抑制体内LPS对SAA的诱导。

实施例13

IL-22多肽在皮肤中的体内效果

A.IL-22诱导的棘皮症

小鼠(雌性，C 3H/HEJ，8周；Jacks on Labs，Bar Harbor，ME)被分为3组每组6只动物和1组4只动物。通过微渗透泵对一组小鼠恒量输注人BHK产生的IL-22，导致局部的并且稳定状态的血清浓度成比例达到泵中含IL-22浓度。Alzet微渗透泵(model 2002；Alzacorporation Palo Alto，CA)在无菌条件下填充IL-22蛋白(A601F，0.22mL)，泵内所述IL-22蛋白被磷酸盐缓冲生理盐水(pH 7.0)分别稀释为组1小鼠2mg/mL、组2小鼠0.2mg/mL、组3小鼠0.02mg/mL、组4小鼠0mg/mL(只有稀释剂)。通过背侧皮肤1cm切口将泵皮下移植到小鼠中，并且用无菌伤口闭合封闭皮肤。这些泵被设计为在14天里以0.5μl每小时的速度运输它们的内容物。采用这种额定注射速度，组1-4的剂量水平分别计算为24μg/天、2.4μg/天、0.24μg/天、0μg/天。

在14天的结束，处死小鼠并收集每只小鼠泵区域周围大约1cm平方的皮肤样品。皮肤固定于10％中性缓冲的福尔马林中。采用常规方法将福尔马林固定的皮肤样品被包埋到石蜡中，5um切片并用苏木精和伊红染色。采用盲方式由ACVP委员会认证的兽医病理学家对组织进行显微镜检测。记录组织学变化，并且使用下述得分系统以主观方式对棘皮症严重程度(例如表皮增厚)打分：0-正常，1-极微棘皮症，2-轻微棘皮症，3-中度棘皮症和4-严重棘皮症。另外，用CoolSnap数码相机(Roper Scientific，Inc.，San Diego，CA)对所选择组的皮肤成像，并用组织形态测定软件(Scion Image for Windows，v.4.02，Scion Corp.，Frederick，MD)测定表皮厚度。

以2.4和24μg/天剂量给予I L-22导致表皮增厚，由平均棘皮症得分(见s)所示，所述增厚始终比观察到的对照组皮肤大。另外，IL-22处理动物还出现单核细胞浸润进入表皮。在载体处理的对照中没有观察到这些浸润。

下面表9显示了表皮厚度的棘皮症得分和按组皮肤厚度测定(通常单位像素)，如下：

表9

                                  棘皮症       测量到

组号  n＝     泵                  平均值       的厚度

1     6       24μgIL-22/天       3.0          ND

2     6       2.4μgIL-22/天      2.4          67.5

3     6       0.24μgIL-22/天     2.2          ND

4     4       PBS输注             1.8          45.6

B.IL-22RA2对IL-22诱导的棘皮症的效果

小鼠(雌性，C3H/HEJ，8周；Jackson Labs，Bar Harbor，ME)被分为8组每组8只动物。通过微渗透泵恒量输注IL-22，如实施例12A所述。在无菌条件下给Alzet微渗透泵(model 2001；Alzacorporation Palo Alto，CA)填充IL-22蛋白(A#601F，0.22mL)，泵内所述IL-22蛋白被磷酸盐缓冲生理盐水(pH 7.0)分别稀释为组1-2小鼠0.22mg/mL、组3-4小鼠0.45mg/mL、组5-6小鼠0.9mg/mL、组7-8小鼠0mg/mL(只有稀释剂)。这些泵被设计为在14天里以0.5μl每小时的速度运输它们的内容物。采用这种额定注射速度，剂量水平分别计算为组1-2中为10μg/天、组3-4中为5μg/天、组5-6中为2.5μg/天、组7-8中为0μg/天。对于给定剂量水平的IL-22的每对组，其中一组腹膜内注射3次(第1、3和5天)0.1mg人IL-22RA2Fc蛋白(如此处所述)，另一组按相同方式注射载体(PBS).

在实验的第8天，处死小鼠并收集每只小鼠泵区域周围大约1cm平方的皮肤样品。皮肤固定于10％中性缓冲的福尔马林中。采用常规方法将福尔马林固定的皮肤样品被包埋到石蜡中，5um切片并用苏木精和伊红染色。采用盲方式由ACVP委员会认证的兽医病理学家对组织进行显微镜检测。此实验采用和上述实施例不同的方式打分。确定从基底层到颗粒层的表皮的层数。基于这个结果，按如下对切片打分：0-正常(2-3层)，1-轻微增厚(3-4层)，2-中度增厚(4-6层)和3-严重增厚(＞6层)。

以2.5、5、10μg/天的剂量给予IL-22导致表皮增厚(见表10)。另外，IL-22处理动物还出现单核细胞浸润进入表皮。在载体处理的对照中没有观察到这些浸润。共同给予100μg IL-22RA2(注射3次)减少了5μg IL-22/天处理小鼠的表皮增厚数量。

下面表10显示了按组表皮厚度的棘皮症得分，如下：

表10

组号	n＝	泵	注射	棘皮症平均值
					1	8	2.5μg IL-22/天	100μL载体(3次注射)	1.1
2	8	2.5μg IL-22/天	100μg IL-22RA2(3次注射)	0.8
					3	8	5μg IL-22/天	100μL载体(3次注射)	2.0
4	8	5μg IL-22/天	100μg IL-22RA2(3次注射)	0.6
					5	8	10μg IL-22/天	100μL载体(3次注射)	2.0
6	8	10μg IL-22/天	100μg IL-22RA2(3次注射)	1.9
					7	8	载体	100μL载体(3次注射)	0.0
8	8	载体	100μg IL-22RA2(3次注射)	0.0

在人类牛皮癣皮肤中还发现表皮增厚和免疫浸润。在皮下注射IL-22发现的皮肤表型进一步表明IL-22在牛皮癣发病中的潜在作用。IL-22RA2-Fc能中和IL-22诱导的皮肤表型的事实暗示，其它IL-22拮抗剂例如抗IL-22中和抗体或可溶性受体可能用于治疗牛皮癣和其它IL-22诱导的炎症疾病。

C.IL-22RA可溶性受体的效果和抗IL-22RA抗体对IL-22诱导的或IL-20诱导的棘皮症效果

使用皮下注射IL-22或IL-20蛋白引起的棘皮症的组织学终末点，用相似的方式评价了IL-22RA可溶性受体或IL-22RA的抗体抑制IL-22或IL-20体内活性的活性。在一个实施例中这个C3H/HEJ小鼠模型被皮下移植了微渗透泵，如上述实施例12(A)和12(B)所述。在接触IL-22或IL-20期间，小鼠被注射纯化的IL-22单克隆抗体或相似的注射载体作为对照。在注射IL-22期间的结束，将从泵区域取皮肤样品用于组织学分析。和IL-22RA2可溶性受体或IL-22拮抗剂相似，本发明的IL-22或IL-20拮抗剂、IL-22RA可溶性受体或抗IL-22RA抗体被期望表现出减少IL-22或IL-20表皮增厚和免疫细胞浸润，并因此能象IL-22或IL-20拮抗剂一样用于治疗牛皮癣和其它IL-22或IL-20引起的炎症疾病。

实施例14

在人牛皮癣皮肤样品RNA样品中IL-22上调：

获得了正常皮肤样品和牛皮癣患者皮肤。后者包括来自于稳定斑块型牛皮癣的涉及的皮肤和临近未涉及的皮肤。用常规方法从人牛皮癣皮肤样品中分离RNA。在Agilent 2100 Bioanalyzer(AgilentTechnologies，Waldbronn Germany)上检测RNA样品的完整性和质量。

定量RT-PCR的引物和探针

以前已述(参见Heid，CA.et al.，Genome Research 6：986-994，1996；Gibson，U.E.M.et al.，Genome Research 6：995-1001，1996；Sundaresan，S.et al.，Endocrinology 139：4756-4764，1998)用ABI PRISM 7700 Sequence Detection System(PE Applied Biosystems，Inc.，Foster City，CA)进行实时定量RT-PCR。该方法合并使用了含报告和淬灭荧光两种染料的基因特异性探针。当探针完整时，由于临近于淬灭染料，报告染料的发射为无效。在使用另外的基因特异性正向和反向引物进行PCR延伸期间，探针由xTth DNA聚合酶的5′至3′核酸酶活性切割，这使得报告染料自探针释放，导致荧光发射的增加。

用引物设计软件Primer Express^TM(PE Applied Biosystems，Foster City，CA)设计分析IL-22表达的实时定量RT-PCR中使用的引物和探针。设计人类IL-22引物跨越内含子-外显子接点，以消除基因组DNA的扩增。正向引物ZC42459(SEQ ID NO：22)和反向引物ZC42458(SEQ ID NO：23)以800nM的浓度用于PCR反应合成72bp的产物。相应的IL-22探针ZC42460(SEQ ID NO：24)在ZymoGenetics被合成并标记。IL-22探针在5′端用报告荧光染料(6-羧基-荧光素)(FAM)(PE Applied Biosystems)标记，而3′端用荧光淬灭染料(6-羧基-四甲基-罗丹明)(TAMRA)(PE Applied Biosystems)标记。

C.实时定量RT-PCR

利用TaqMan EZ RT-PCR Core Reagents试剂盒(PE AppliedBiosystems)通过分析总RNA样品确定IL-22mRNA的相对水平。制备Runoff IL-22转录子并用以产生用于定量的标准曲线。所述曲线包括IL-22全部信息的1e8到1e3总拷贝范围内的10倍系列稀释，其中各标准曲线点重复三份分析。类似的，皮肤的总RNA样品也被重复分析三次人IL-22转录子水平和hGUS水平作为内部参照。在25μl总体积下，每个RNA样品进行TaqMan EZ RT-PCR反应(PE AppliedBiosystems)，包含：在DEPC处理水(无DNA酶/核糖核酸酶)中的大约25ng总RNA；合适的引物(大约800nM ZC 42459(SEQ ID NO：22)和ZC 42458(SEQ ID NO：23))；合适的探针(大约100nM ZC 42460(SEQ ID NO：24))；1×TaqMan EZ缓冲液；3mM醋酸锰；d-CTP、d-ATP和d-GTP各300μM和600μM d-UTP；rTth DNA聚合酶(0.1U/μl)；AmpErase UNG(0.01U/μl)。PCR稳定循环条件如下：开始进行UNG处理步骤1个循环的50℃2分钟；接着是，逆转录(RT)步骤1个循环的60℃30分钟；接着是失活UNG步骤1个循环的95℃5分钟；接着是94℃20秒60℃1分钟的40个循环的扩展步骤。

用生产商PE Biosystems(User Bulletin #2：ABI Prism 7700Sequence Detection System，Relative Quantitation of GeneExpression，December 11，1997)所述的标准曲线方法确定IL-22RNA的相对水平。用hGUS测定来标准化IL-22水平。数据显示于下面的表11。

表11

皮肤样品	IL-22
		正常的	0
未涉及的	0
		涉及的	1149

在来自于正常病人或未涉及区域的皮肤样品中检测不到IL-22mRNA。相反，在牛皮癣患者涉及的皮肤中IL-22信息显著上调。这些数据支持IL-22和人类牛皮癣有强疾病相关性。

在人类牛皮癣病灶中显示过量表达IL-22，暗示IL-22和人类牛皮癣有关。另外，如此处所述，在转基因小鼠中过量表达IL-22表现出表皮增厚和显示涉及免疫细胞的牛皮癣表型，并且向正常小鼠增加注射IL-22表现出表皮增厚和显示涉及免疫细胞的牛皮癣表型并能被可溶性受体拮抗剂IL-22RA2消除。这些体内数据暗示促炎性IL-22和牛皮癣有关。象这样，IL-22活性的拮抗剂，例如本发明的抗人IL-22单克隆抗体和可溶性受体及其抗体可用于治疗炎性疾病，尤其是作为IL-22拮抗剂治疗牛皮癣。另外，IL-22活性的拮抗剂，例如本发明的抗人IL-22单克隆抗体和可溶性受体及其抗体可用于治疗其它炎性疾病，例如作为作为IL-22拮抗剂治疗特应性皮炎、炎性肠病、结肠炎、内毒素血症、关节炎、类风湿性关节炎和牛皮癣性关节炎成人呼吸道疾病(ARD)、败血症性休克、多器官衰竭、炎性肺损伤例如哮喘或支气管炎、细菌性肺炎、牛皮癣、湿疹、遗传性过敏的和接触性皮炎和炎性肠病例如溃疡性结肠炎和克罗恩病。

实施例15

在人特应性皮炎样品中IL-22上调

获得正常皮肤样品(n＝4)和特应性皮炎患者皮肤(n＝4)。用常规方法从人皮肤样品中分离RNA。在Agilent 2100 Bioanalyzer(Agilent Technologies，Waldbronn Germany)上检测RNA样品的完整性和质量。

定量RT-PCR的引物和探针

以前已述(参见Heid，C.A.et al.，Genome Research 6：986-994，1996；Gibson，U.E.M.et al.，Genome Research 6：995-1001，1996；Sundaresan，S.et al.，Endocrinology 139：4756-4764，1998)用ABI PRISM 7700 Sequence Detection System(PE Applied Biosystems，Inc.，Foster City，CA)进行实时定量RT-PCR。该方法合并使用了含报告和淬灭荧光两种染料的基因特异性探针。当探针完整时，由于临近于淬灭染料，报告染料的发射为无效。在使用另外的基因特异性正向和反向引物进行PCR延伸期间，探针由rTth DNA聚合酶的5′至3′核酸酶活性切割，这使得报告染料自探针释放，导致荧光发射的增加。

用引物设计软件Primer Express^TM(PE Applied Biosystems，Foster City，CA)设计分析IL-22表达的实时定量RT-PCR中使用的引物和探针。设计人类IL-22引物跨越内含子-外显子接点，以消除基因组DNA的扩增。正向引物ZC42459(SEQ ID NO：22)和反向引物ZC42458(SEQ ID NO：23)以800nM的浓度用于PCR反应合成72bp的产物。相应的IL-22探针ZC42460(SEQ ID NO：24)在ZymoGenetics被合成并标记。IL-22探针在5′端用报告荧光染料(6-羧基-荧光素)(FAM)(PE Applied Biosystems)标记，而3′端用荧光淬灭染料(6-羧基-四甲基-罗丹明)(TAMRA)(PE Applied Biosystems)标记。

C.实时定量RT-PCR

利用TaqMan EZ RT-PCR Core Reagent s试剂盒(PE AppliedBiosystems)通过分析总RNA样品确定IL-22mRNA的相对水平。制备Runoff IL-22转录子并用以产生用于定量的标准曲线。所述曲线包括IL-22全部信息的1e8到1e3总拷贝范围内的10倍系列稀释，其中各标准曲线点重复三份分析。类似的，皮肤的总RNA样品也被重复分析三次人IL-22转录子水平和hGUS水平作为内部参照。在25μl总体积下，每个RNA样品进行TaqMan EZ RT-PCR反应(PE AppliedBiosystems)，包含：在DEPC处理水(无DNA酶/核糖核酸酶)中的大约25ng总RNA；合适的引物(大约800nM ZC 42459(SEQ ID NO：22)和ZC 42458(SEQ ID NO：23))；合适的探针(大约100nM ZC 42460(SEQ ID NO：24))；1×TaqMan EZ缓冲液；3mM醋酸锰；d-CTP、d-ATP和d-GTP各300μM和600μM d-UTP；rTth DNA聚合酶(0.1U/μl)；AmpErase UNG(0.01U/μl)。PCR稳定循环条件如下：开始进行UNG处理步骤1个循环的50℃2分钟；接着是，逆转录(RT)步骤1个循环的60℃30分钟；接着是失活UNG步骤1个循环的95℃5分钟；接着是94℃20秒60℃1分钟的40个循环的扩展步骤。用生产商PE Biosystems(User Bulletin #2：ABI Prism 7700Sequence Detection System，Relative Quantitation of GeneExpression，December 11，1997)所述的标准曲线方法确定IL-22RNA的相对水平。用hGUS测定来标准化IL-22水平。

在来自于正常病人的皮肤样品中检测不到IL-22mRNA。相反，在3到4个特应性皮炎的皮肤样品中IL-22信息显著上调(大约400-2300拷贝)。这些数据支持IL-22和人类特应性皮炎有强疾病相关性。

在人类特应性皮炎皮肤中显示过量表达IL-22，暗示IL-22和人类特应性皮炎有关。另外，如此处所述，在转基因小鼠中过量表达IL-22表现出表皮增厚和显示涉及免疫细胞的特应性皮炎表型，并且向正常小鼠增加注射IL-22表现出表皮增厚和显示涉及免疫细胞的特应性皮炎表型并能被可溶性受体拮抗剂IL-22RA2消除。这些体内数据暗示促炎性IL-22和特应性皮炎有关。象这样，IL-22活性的拮抗剂，例如本发明的抗人IL-22单克隆抗体和可溶性受体及其抗体可用于治疗炎性疾病，尤其是作为IL-22拮抗剂治疗特应性皮炎。另外，IL-22活性的拮抗剂，例如本发明的抗人IL-22单克隆抗体和可溶性受体及其抗体可用于治疗其它炎性疾病，例如作为作为IL-22拮抗剂治疗特应性皮炎、炎性肠病、结肠炎、内毒素血症、关节炎、类风湿性关节炎和牛皮癣性关节炎成人呼吸道疾病(ARD)、败血症性休克、多器官衰竭、炎性肺损伤例如哮喘或支气管炎、细菌性肺炎、牛皮癣、湿疹、遗传性过敏的和接触性皮炎和炎性肠病例如溃疡性结肠炎和克罗恩病。

实施例16

人IL-22单克隆抗体

用纯化的BHK细胞(IL-22-BHK)制备的成熟重组人类IL-22多肽(SEQ ID NO：6的氨基酸残基22(丙氨酸)到167(异亮氨酸))免疫2只新英格兰白兔制备抗IL-22多克隆抗体。每只兔子给予初始腹膜内(ip)注射在弗氏完全佐剂中的200μg纯化蛋白，随后每三周腹膜内加强注射在不完全弗氏佐剂中的100μg肽。第2次增强注射(共3次注射)后的第7到10天，对动物放血并收集血清。随后每三周对动物进行增强和放血。

用CNBr-SEPHAROSE 4B蛋白柱(Pharmacia LKB)从免疫兔子血清中亲和纯化人类IL-22特异性多克隆抗体，所述蛋白柱利用每克CNBr-SEPHAROSE 10mg特异性抗原纯化的重组蛋白人类IL-22-BHK制备，随后用PBS 20×透析过夜。用500ng/ml纯化的重组蛋白人类IL-22-BHK作为抗体靶通过ELISA表征人类IL-22特异性抗体。兔抗人IL-22亲和纯化的抗体的检测下限(LLD)对其特异性纯化的重组抗原人类IL-22-BHK是280pg/ml。

在BaF3/CRF2-4/IL-22RA细胞(实施例2和实施例3)上进一步表征人类IL-22特异性多克隆抗体阻断纯化重组人类IL-22-BHK的细胞增殖活性(中和检测)的能力。超过人类IL-22特异性多克隆抗体50×molar足以抑制细胞增殖。

实施例17

抗人IL-22单克隆抗体

用纯化的BHK细胞(IL-22-BHK)制备的成熟重组人类IL-22多肽(SEQ ID NO：6的氨基酸残基22(丙氨酸)到167(异亮氨酸))通过免疫4只雌性Sprague-Dawley大鼠(Charles River Laboratories，Wilmington，MA)制备单克隆抗体。每只大鼠给予初始腹膜内(IP)注射在弗氏完全佐剂(Pierce，Rockford，IL)中的100μg纯化的人重组IL-22蛋白，随后每2周腹膜内加强注射在不完全弗氏佐剂中的50μg纯化的重组蛋白。第3次增强注射后的第7到10天，对动物放血并收集血清。

用500ng/ml生物素化的人类IL-22-BHK和500ng/ml生物素化的小鼠IL-22、生物素化的muIL-22-E.coli(R+D Systems，Minneapolis，MN)抗体靶通过ELISA表征人类IL-22特异性大鼠血清样品。3个大鼠血清样品以1∶1E5稀释滴定到特异性的抗体靶生物素化的人类IL-22-BHK并以1∶1E4稀释滴定到特异性的抗体靶生物素化的muIL-22-E.coli。

从2只高效价大鼠中收获脾细胞和淋巴结细胞，并使用PEG 1500在两个独立的融合操作(4∶1融合比例，脾细胞到骨髓瘤细胞，″Antibodies A Laboratory Manual，E.Harlow and D.Lane，ColdSpring Harbor Press)中融合到SP2/0(小鼠)骨髓瘤细胞中。融合后生长10天，使用生物素化的重组蛋白人类IL-22-BHK和生物素化的重组蛋白muIL-22-E.coli作为独立的抗体靶通过ELISA鉴定产生特异性抗体的杂交瘤群。在两个ELISA流程中都呈阳性的杂交瘤群进一步分析它们在BaF3/CRF2-4/IL-22RA细胞中(实施例2和实施例3)中阻断或减少纯化的重组muIL-22-E.coli的细胞增殖活性(中和检测)的能力。

只在唯一ELISA或ELISA和“中和检测”中得到阳性结果的杂交瘤群通过有限稀释克隆至少两次。

通过ELISA表征从组织培养基中纯化的单克隆抗体的定量确定小鼠和人类血清样品重组和天然人类IL-22的效果。选择的两个抗体的定量检测下限更低，在100％人类血清中大约为1ng/ml重组huIL-22-E.coli。在BaF3/CRF2-4/IL-22RA细胞(实施例2和实施例3)中通过ELISA表征从组织培养基中纯化的单克隆抗体的阻断或减少纯化的重组huIL-22-E.coli或muIL-22-E.coli的细胞增殖活性(中和性检测)的能力。用这种方式确定了6个“中和性”单克隆抗体。

上述表达人类IL-22中和性单克隆抗体的杂交瘤按照Budapest协议储存于美国典型培养物保藏中心(ATCC；Manassas VA)的专利存储处作为原始储存物，ATCC编号为：克隆266.16.1.4.4.1(ATCCPatent Deposit Designation PTA-5035)；克隆266.5.1.2.2.3(ATCCPatent Deposit Designation PTA-5033)；克隆267.17.1.1.4.1(ATCC Patent Deposit Designation PTA-5038)；克隆267.4.1.1.4.1(ATCC Patent Deposit Designation PTA-5037)；克隆266.12.6.1.3.2.1(ATCC Patent Deposit Designation PTA-5034)；克隆266.19.1.10.5.2(ATCC Patent Deposit Designation PTA-5036)；和克隆267.9.1.1.4.1(ATCC Patent Deposit DesignationPTA-5353)。

实施例18

抗IL-22RA单克隆抗体

用切割和纯化的重组融合蛋白muIL-22RA-Fc(SEQ ID NO：4)免疫4只Lewis大鼠(Rockland Immunochemicals，Gilbertsville，PA)制备单克隆抗体。每只大鼠给予初始腹膜内(IP)注射在弗氏完全佐剂(Pierce，Rockford，IL)中的100μg纯化的人重组融合蛋白，随后连续4周每2周腹膜内加强注射在不完全弗氏佐剂中的50μg纯化重组蛋白。头4周免疫后，连续4周每2周腹膜内加强注射在不完全弗氏佐剂中的50ug切割和纯化的重组蛋白和载体蛋白钉形贝血蓝蛋白(KLH，Pierce，Rockford，IL)。第4次增强注射后的第7到10天，对动物放血并收集血清。

用500ng/ml纯化的重组融合蛋白muIL-22RA-Fc作为抗体靶和一种不相关融合蛋白作为非特异性抗体靶，通过ELISA表征muIL-22RA特异性大鼠血清样品。

从1只高效价大鼠中收获脾细胞，并采用一种优化的PEG介导的融合操作(Rockland Immunochemicals)融合到SP2/0(小鼠)骨髓瘤细胞中。融合后生长12天，使用每种500ng/ml重组融合蛋白muIL-22RA-Fc-Bv作为独立的抗体靶和一种不相关融合蛋白作为非特异性抗体靶通过ELISA鉴定产生特异性抗体的杂交瘤群。在两个ELISA流程中都呈阳性的杂交瘤群进一步分析它们在BaF3/CRF2-4/IL-22RA细胞中(实施例2和实施例3)阻断或减少纯化的重组muIL-22-E.coli的细胞增殖活性(中和检测)的能力。

只在唯一ELISA或ELISA和“中和检测”中得到阳性结果的杂交瘤群通过有限稀释克隆至少两次。

只对特异性抗体靶呈阳性的杂交瘤群进一步分析它们在BaF3/CRF2-4/IL-22RA细胞中(实施例2和实施例3)阻断或减少纯化的重组muIL-22-E.coli的细胞增殖活性(中和检测)的能力，并通过FACS分析作为抗体靶结合BaF3/CRF2-4/IL-22RA细胞(实施例2和实施例3)的活性。

在ELISA检测中得到特异性阳性结果的和在FACS或“中和检测”中得到阳性结果的杂交瘤群通过有限稀释克隆至少两次。

表征组织培养基中纯化的单克隆抗体的阻断或减少BaF3/CRF2-4/IL-22RA细胞(实施例2和实施例3)的增殖能力，所述BaF3/CRF2-4/IL-22RA细胞培养于含有纯化的重组蛋白muIL-22-E.coli或huIL-22-BHK条件下。确定了14个“中和性”单克隆抗体并克隆了9个单克隆抗体。

上述表达人类IL-22RA中和单克隆抗体的杂交瘤按照Budapest协议储存于美国典型培养物保藏中心(ATCC；Manassas VA)的专利用保存处作为原始保藏，ATCC编号为：克隆R2.1.1G11.1(ATCC PatentDeposit Designation PTA-6035)；克隆R2.1.5F4.1(ATCC PatentDeposit Designation PTA-6024)；克隆R2.1.5H8.1(ATCC PatentDeposit Designation PTA-6025)；克隆R2.1.12G7.1(ATCC PatentDeposit Designation PTA-6036)；克隆R2.1.13C8.1(ATCC PatentDeposit Designation PTA-5037)；克隆R2.1.15E2.1(ATCC PatentDeposit Designation PAT-6038)；克隆R2.1.16C11.1(ATCC PatentDeposit Designation PTA-6039)；克隆R2.1.18C8.1(ATCC PatentDeposit Designation PTA-6040)；和克隆R2.1.21G8.2(ATCC PatentDeposit Designation PTA-6111)。

上述表达人类IL-22RA中和单克隆抗体的杂交瘤按照Budapest协议储存于美国典型培养物保藏中心(ATCC；Manassas VA)的专利存储处作为原始储存物，ATCC编号为：克隆280.46.3.4(ATCC PatentDeposit Designation PTA-6284)；克隆281.73.49.1.1(ATCC PatentDeposit Designation PTA-6285)；克隆283.4.1.2(ATCC PatentDeposit Designation PTA-6287)；克隆283.52.5.4(ATCC PatentDeposit Designation PTA-6311)；和克隆283.108.2.3(ATCC PatentDeposit Designation PTA-6286)。

实施例19

两个大鼠抗Ms-IL-22RA MAb的结合亲和力

山羊抗大鼠IgG-Fcγ特异性抗体(Jackson)被固定化在CM5Biacore芯片上。优化检测使每种mAb都结合到抗大鼠捕获表面上，然后一系列浓度的IL-22RA被注射通过mAb来检测聚合(Ka)和解离(Kd)。初步检测观察到融合蛋白和芯片捕获表面的非特异性结合。获得了一瓶含有凝血酶切割的Fc4标签的IL-22RA，随后用于检测显示没有背景效果。每次操作后，注射2次20mM HCl将表面再生回抗大鼠抗体。每个MAb都产生数据并用软件(BIAevaluation softwareversion 3.2，Pharmacia BIAcore，Uppsala，Sweden)评估抗IL-22RA抗体结合到IL-22RA蛋白的动力学，如下面表12所示：

表12

显示了每种抗IL-22RA MAB的平衡聚合(Ka)和解离(Kd)速率常数，因仪器限制数值下降。Chi2是指结合曲线和评价拟合曲线之间的余差的平方和。离0越近，数据置信度越高

如表12所示，两种抗IL-22RA MAb的结合强于IL-22RA蛋白，表明了IL-22RA的皮摩尔结合浓度。(凝血酶切割Fc4标签)基于Chi²值低，显示的数据具有良好的置信度，并表明和IL-22RA受体相比mAb克隆R2.1.5F4.1具有稍强的亲和力

实施例20

在体内在组织样品中IL-22蛋白表达的免疫组织化学分析

A.概述

用抗人类IL-22(抗-hIL-22)单克隆抗体(Mab 266.19.1.10.5.2)在下述组织样品中免疫组织化学(IHC)分析IL-22蛋白的表达和定位，所述组织为：Human multi-Normal Grid和Tumor Grid；人胰腺炎、肺和肾疾病样品；人牛皮癣皮肤样品；INS IL-22 TG(从大鼠胰岛素启动子表达)和WT小鼠胰腺；muIL-22-EuLCK TG和WT小鼠皮肤样品；和DSS(WT和IL-22 KO)小鼠结肠样品。另外，比较了抗hIL-22单克隆抗体MAB 266.19.1.10.5.2(实施例17)和多克隆抗体(兔抗hIL-22)(实施例16)的染色式样。

大鼠抗人IL-22单克隆抗体MAb 266.16.1.4.4.1和MAb266.19.1.10.5.2(实施例17)被检验，显示染色大部分的BHK/人IL-22(＞50％)，但是也有一些BHK/小鼠IL-22细胞(1-5％)，并且被用于研究IL-22在人类患者和动物模型样品中的组织分布和表达，并用于和多克隆兔抗体比较染色式样来确证结果。

B.材料和方法

来自于人或小鼠动物模型的福尔马林固定并用石蜡包埋的细胞和组织被切为5μm切片。细胞包括表达人或小鼠IL-22的和作为阳性、阴性对照的野生型的BHK细胞。人类组织包括含有50片不同的正常人类组织(例如脑、脑下垂体、肾上腺、胸部、肾、心脏、胃、小肠、大肠、胎肝、肝、皮肤、胰、肺、扁桃体、卵巢、睾丸、子宫、胎盘、甲状腺和脾)切片的多组织对照片(NormalGrid^TM；Biomeda，FosterCity，CA)；含有50片不同人类肿瘤(例如肺腺癌、肝腺癌、卵巢腺癌、淋巴瘤、黑素瘤、ewing肉瘤、上皮肉瘤、恶性纤维组织细胞瘤肉瘤、Rhabdo肉瘤、良性肿瘤、未分化肿瘤、间皮瘤、畸胎瘤和精原细胞瘤)切片的多组织对照片(TumorGrid^TM；Biomeda，Foster City，CA)；来自CHTN(Cooperation Human Tissue Network，Cleveland，Ohio)的肺癌；正常胰，患有慢性胰腺炎的胰，患有慢性血管周围性炎的肺，患有多病灶肾小球硬化症或膜增生性肾小球肾炎或来自于NDRI(National Disease Research Interchange，Philadelphia，PA)的硬化肾小球间质性纤维化的肾脏；和人类牛皮癣皮肤样品。小鼠组织包括来自于炎性肠病动物模型(此处所述的DSS模型，Swiss Webster雌性小鼠)的结肠和来自于用含载体或4％DSS的饮用水处理7天的IL-20 WT和KO结肠炎动物模型(DSS小鼠，野生型和IL-20(IL-20)敲除雌性小鼠)的结肠；和来自于转基因(TG)动物模型的皮肤样品，所述动物模型包括mIL-22-EuLCK TG和mIL-22-INS对照和TG动物。用苏木精和伊红(H&E)对每个块/片的一个切片染色，用于组织学检测，后续切片被免疫组织化学染色研究IL-22表达和定位。

为了免疫组织化学，细胞和组织切片被置于ChemMate^TM CapillaryGap Plus显微镜载玻片上(BioTek，Winooski，Vermont)，60℃烘箱干燥60分钟，并用标准条件脱蜡，二甲苯3×5分钟，100％ EtOH 4分钟，100％EtOH 3分钟，和95％EtOH 2分钟。组织切片，然后在37℃用胃蛋白酶(NeoMarkers Fremont CA)进行20分钟的酶诱导的表位恢复过程，随后根据生产商说明书(Zymed，South San Francisco，CA)进行抗生物素蛋白/生物素封闭步骤。染色中使用了TechMate 500^TMAutomated Immunostainer和带有亲和素-生物素化酶复合物检测系统(Ventana Biotek Systems，Tucson，AZ)的Immunoperoxidase(IP)免疫组织化学操作流程。TechMate 500^TM Automated Immunostainer采用了毛细管作用原理，并且IP操作流程采用了一种被称为“夹心法”技术的免疫染色。用5％正常山羊血清(Vector，Burlingame CA)PBS预封闭切片10分钟，随后用1×缓冲液1清洗和1×缓冲液清洗(Signet，Dedham MA)，随后用针对IL-22(MAB 266.19.1.10.5.2)(实施例17)的1∶800稀释的基本抗体(2.04mg/ml PAS纯化的)室温下孵育30分钟，随后用5×缓冲液清洗。基本抗体被稀释于TechMate500^TM抗体稀释缓冲液(Ventana)中。1∶200稀释的生物素化的山羊抗大鼠IgG(Vector)加5％正常山羊血清和2.5％脱脂奶粉溶于PBS作为二次结合抗体，室温结合25分钟，随后用1×缓冲液2和3清洗(Signet)。随后组织切片进行3×7分钟3％过氧化氢(HP)封闭(Ventana)，随后用3×缓冲液2和3清洗。用过氧化物DAB试剂盒(Ventana)进行免疫过氧化物酶标记，和亲和素-生物素化酶复合物(ABC)孵育30分钟，随后用5×缓冲液2和3清洗并用二氨基联苯(DAB)处理4×4分钟，随后用2×缓冲液2和3清洗和1×水清洗(Signet，Cat.No.2340)。随后组织用甲基绿(Dako，Cat.No.S1962)复染剂10分钟，随后用2×缓冲液2和3清洗并用3×水清洗。对照包括采用大鼠基本抗体同种型对照(Zymed)替换基本抗体的非免疫基本血清。

用Olympus BH-2显微镜观察免疫染色，用CoolSNAP HQ数码相机(Roper Scientific，Tucson，AZ)获取图片。

C.结果

阳性和阴性对照细胞系：MAB 266.19.1.10.5.2，一种抗hIL-22单克隆抗体，在人类表达IL-22的BHK细胞中(+++)和小鼠表达IL-22的BHK细胞中(+)都表现出阳性染色，并且野生型BHK细胞(-)没有染色。用大鼠同种型阴性对照代替基本抗体染色所有阳性和阴性BHK细胞系都表现为没有染色(-)，这表明抗体特异性针对IL-22配体。抗体对对人和小鼠IL-22有交叉免疫反应性。

人类组织：检测了人类多正常Grid和肿瘤Grid；胰、肺和肾疾病样品；和人类牛皮癣皮肤样品。这些人类组织包括：1).多组织对照片(NormalGrid^TM)上的脑、脑下垂体、肾上腺、胸部、肾、心脏、胃、小肠、大肠、胎肝、肝、皮肤、胰、肺、扁桃体、卵巢、睾丸、子宫、胎盘、甲状腺和脾/正常人类组织；2).多组织对照片(TumorGrid^TM)上的肺腺癌、肝腺癌、卵巢腺癌、淋巴瘤、黑素瘤、ewing肉瘤、上皮肉瘤、恶性纤维组织细胞瘤肉瘤、Rhabdo肉瘤、良性肿瘤、未分化肿瘤、间皮瘤、畸胎瘤和精原细胞瘤/人类异常组织/肿瘤；3).正常胰，患有慢性胰腺炎的胰，患有慢性血管周围性炎的肺，肺癌，患有多病灶肾小球硬化症的肾，患有膜增生性肾小球肾炎的肾，来自于CHTN和/或NDRI的患有硬化肾小球间质性纤维化的肾；4).

小鼠组织：检测了INS IL-22 TG和WT小鼠的胰腺。在INS IL-22TG胰腺中遍及小岛的分散的细胞对Mab MAB 266.19.1.10.5.2表现出强阳性染色(+++)，而WT胰腺显示为没有染色(-)。

多克隆和单克隆抗体的比较。抗IL-22多克隆抗体(实施例16)被显示为敏感的，而单克隆抗体MAB 266.19.1.10.5.2是特异性的。多克隆抗体在人类表达IL-22的BHK细胞中(+++)、在小鼠表达IL-22的BHK细胞中(+)、在不同人类和小鼠组织样品中(+)、在ENS mIL-22TG小鼠小岛中(+++)都显示阳性染色。转基因(和野生型相比)中有更多的小岛含有阳性染色。在转基因小岛中的染色通常遍布于小岛(+++)，而野生型小岛通常局限于小岛外围(+)。但是，这个抗体还在WT BHK阴性对照细胞中表现出非特异性染色(+)。MAB266.19.1.10.5.2在人类表达IL-22的BHK细胞中(+++)、在小鼠表达IL-22的BHK细胞中(+)、在INC mIL-22TG小鼠小岛中(+++)表现阳性染色。转基因小岛的染色通常遍布小岛(+++)，而野生型小岛显示负染色(-)。

实施例21

人牛皮癣样品中IL-20上调

A.RNA样品：获得了正常皮肤样品和来自于牛皮癣患者的皮肤。后者包括来自于牛皮癣的涉及的皮肤和临近未涉及的皮肤。用常规方法从人类皮肤样品中分离RNA。在Agilent 2100 Bioanalyzer(Agilent Technologies，Waldbronn Germany)上检测RNA样品的完整性和质量。

B.定量RT-PCR的引物和探针

以前已述(参见Heid，C.A.et al.，Genome Research 6：986-994，1996；Gibson，U.E.M.et al.，Genome Research 6：995-1001，1996；Sundaresan，S.et al.，Endocrinology 139：4756-4764，1998)用ABI PRISM 7700 Sequence Detection System(PE Applied Biosystems，Inc.，Foster City，CA)进行实时定量RT-PCR。该方法合并使用了含报告和淬灭荧光两种染料的基因特异性探针。当探针完整时，由于临近于淬灭染料，报告染料的发射为无效。在使用另外的基因特异性正向和反向引物进行PCR延伸期间，探针由rTth DNA聚合酶的5′至3′核酸酶活性切割，这使得报告染料自探针释放，导致荧光发射的增加。

用引物设计软件Primer Express^TM(PE Applied Biosystems，Foster City，CA)设计分析IL-20表达的实时定量RT-PCR中使用的引物和探针。正向引物ZC40541(SEQ ID NO：25)和反向引物ZC 40542(SEQ ID NO：26)以800nM的浓度用于PCR反应(下面)合成71bp的产物。用PE Applied Biosystems合成并标记相应的IL-20 TaqMan探针ZC 40544(SEQ ID NO：27)。IL-20探针在5′端用报告荧光染料(6-羧基-荧光素)(FAM)(PE Applied Biosystems)标记，而3′端用荧光淬灭染料(6-羧基-四甲基-罗丹明)(TAMRA)(PE AppliedBiosystems)标记。

C.实时定量RT-PCR

利用TaqMan EZ RT-PCR Core Reagents试剂盒(PE AppliedBiosystems)通过分析总RNA样品确定IL-20mRNA的相对水平。制备Runoff IL-20转录子并用以产生用于定量的标准曲线。所述曲线包括IL-20全部信息的1e8到1e3总拷贝范围内的10倍系列稀释，其中各标准曲线点重复三份分析。类似的，皮肤的总RNA样品也被重复分析三次人IL-20转录子水平和hGUS水平作为内部参照。在25μl总体积下，每个RNA样品进行TaqMan EZ RT-PCR反应(PE AppliedBiosystems)，包含：在DEPC处理水(无DNA酶/核糖核酸酶)中的大约25ng总RNA；合适的引物(大约800nM ZC40541(SEQ ID NO：25)和ZC40542(SEQ ID NO：26))；合适的探针(大约100nM ZC40544(SEQID NO：27))；1×TaqMan EZ缓冲液；3mM醋酸锰；d-CTP、d-ATP和d-GTP各300μM和600μM d-UTP；rTth DNA聚合酶(0.1U/μ1)；AmpErase UNG(0.01U/μl)。PCR稳定循环条件如下：开始进行UNG处理步骤1个循环的50℃2分钟；接着是，逆转录(RT)步骤1个循环的60℃30分钟；接着是失活UNG步骤1个循环的95℃5分钟；接着是94℃20秒60℃1分钟的40个循环的扩展步骤。

用生产商PE Biosystems(User Bulletin #2：ABI Prism 7700Sequence Detection System，Relative Quantitation of GeneExpression，December 11，1997)所述的标准曲线方法确定IL-20RNA的相对水平。用hGUS测定来标准化IL-20水平。数据显示于下面的表13。

表13

皮肤样品	IL-20
		正常的	2903
未涉及的	7233
		涉及的	27,695

虽然在来自于正常病人或未涉及区域的皮肤样品中可以检测到IL-20mRNA，但是在牛皮癣患者涉及皮肤中IL-20信息上调。在人类正常和疾病皮肤中表达IL-20的受体亚基，包括IL-20RA、IL-22RA(IL-22RA)和IL-20RB。这些数据支持IL-20和人类牛皮癣有强疾病相关性。

在人类牛皮癣病灶中显示过量表达IL-20，暗示IL-20和人类牛皮癣有关。另外，如此处所述，在转基因小鼠中过量表达IL-20表现出表皮增厚和显示涉及免疫细胞的牛皮癣表型。这些体内数据暗示IL-20和牛皮癣有关。象这样，IL-20活性的拮抗剂，例如本发明的抗人IL-22RA单克隆抗体和可溶性受体及其抗体和抗IL-20中和和单克隆抗体可用于治疗性的IL-20拮抗剂，治疗炎性疾病，例如牛皮癣和其它此处所述的适应症。

实施例22

在人特应性皮炎皮肤样品中IL-20上调

C.RNA样品：

获得了正常皮肤样品和来自于特应性皮炎患者的皮肤。用常规方法从人类皮肤样品中分离RNA。在Agilent 2100

D.定量RT-PCR的引物和探针

以前已述(参见Heid，C.A.et al.，Genome Research 6：986-994，1996；Gibson，U.E.M.et al.，Genome Research 6：995-1001，1996；Sundaresan，S.et al.，Endocrinology 139：4756-4764，1998)用ABI PRISM 7700 Sequence Detection System(PE Applied Biosystems，Inc.，Foster City，CA)进行实时定量RT-PCR。该方法合并使用了含报告和淬灭荧光两种染料的基因特异性探针。当探针完整时，由于临近于淬灭染料，报告染料的发射为无效。在使用另外的基因特异性正向和反向引物进行PCR延伸期间，探针由rTth DNA聚合酶的5′至3′核酸酶活性切割，这使得报告染料自探针释放，导致荧光发射的增加。

用引物设计软件Primer Express^TM(PE Applied Biosystems，Foster City，CA)设计分析IL-20表达的实时定量RT-PCR中使用的引物和探针。正向引物ZC40541(SEQ ID NO：25)和反向引物ZC 40542(SEQ ID NO：26)以800nM的浓度用于PCR反应(下面)合成71bp的产物。用PE Applied Biosystems合成并标记相应的IL-20TaqMan探针ZC 40544(SEQ ID NO：27)。IL-20探针在5′端用报告荧光染料(6-羧基-荧光素)(FAM)(PE Applied Biosystems)标记，而3′端用荧光淬灭染料(6-羧基-四甲基-罗丹明)(TAMRA)(PE AppliedBiosystems)标记。

C.实时定量RT-PCR

利用TaqMan EZ RT-PCR Core Reagents试剂盒(PE AppliedBiosystems)通过分析总RNA样品确定IL-20mRNA的相对水平。制备Runoff IL-22转录子并用以产生用于定量的标准曲线。所述曲线包括IL-20全部信息的1e8到1e3总拷贝范围内的10倍系列稀释，其中各标准曲线点重复三份分析。类似的，皮肤的总RNA样品也被重复分析三次人IL-20转录子水平和hGUS水平作为内部参照。在25μl总体积下，每个RNA样品进行TaqMan EZ RT-PCR反应(PE AppliedBiosystems)，包含：在DEPC处理水(无DNA酶/核糖核酸酶)中的大约25ng总RNA；合适的引物(大约800nM ZC40541(SEQ ID NO：25)和ZC40542(SEQ ID NO：26))；合适的探针(大约100nM ZC40544(SEQID NO：27))；1×TaqMan EZ缓冲液；3mM醋酸锰；d-CTP、d-ATP和d-GTP各300μM和600μM d-UTP；rTth DNA聚合酶(0.1U/μ1)；AmpErase UNG(0.01U/μl)。PCR稳定循环条件如下：开始进行UNG处理步骤1个循环的50℃2分钟；接着是，逆转录(RT)步骤1个循环的60℃30分钟；接着是失活UNG步骤1个循环的95℃5分钟；接着是94℃20秒60℃1分钟的40个循环的扩展步骤。

用生产商PE Biosystems(User Bulletin #2：ABI Prism 7700Sequence Detection System，Relative Quantitation of GeneExpression，December 11，1997)所述的标准曲线方法确定IL-20RNA的相对水平。用hGUS测定来标准化IL-20水平。

在皮肤样品中可检测到低水平的IL-20mRNA(大约800个拷贝)。相反，在特应性皮炎患者皮肤中IL-20信息上调(大约8600个拷贝)。在人类正常和疾病皮肤中表达IL-20的受体亚基，包括IL-20RA、IL-22RA和IL-20RB。这些数据支持IL-20和人类特应性皮炎有强疾病相关性。在人类特应性皮炎皮肤中显示过量表达IL-20，暗示IL-20和人类特应性皮炎有关。另外，如此处所述，在转基因小鼠中过量表达IL-20表现出表皮增厚和显示涉及免疫细胞的特应性皮炎表型。这些体内数据暗示IL-20和特应性皮炎有关。象这样，IL-20活性的拮抗剂，例如本发明的抗人IL-22RA单克隆抗体和可溶性受体及其抗体和抗IL-20中和和单克隆抗体可用于治疗性的IL-20拮抗剂，治疗炎性疾病，例如特应性皮炎和其它此处所述的适应症。

实施例23

IL-20导致IL-8上调

第二代的正常人类表皮新生角质化细胞(NHEK)(来自于Clonetics)被铺板到12孔组织培养板上并生长到接触汇合。从Clonetics购买KGM(角质化细胞生长培养基)。当细胞达到接触汇合时，用不含生长因子的KGM培养基＝KBM(角质化细胞基础培养基)清洗。在加入检测化合物之前对细胞进行血清饥饿72小时。用1I.U./mL凝血酶和25nM胰蛋白酶作为阳性对照。加入1mL培养基/孔。KBM本身作为阴性对照。

在KBM培养基中补充IL-20并加入不同浓度，第一个实验从2.5μg/ml减少到618ng/mL，第二个实验从2.5μg/mL减少到3ng/mL。

细胞在37℃，5％CO₂中孵育48小时。去除上清并在检测IL-8和GM-CSF水平前冻存于-80℃数天。用人类IL-8免疫测定试剂盒#D8050(RandD Systems，Inc.)和人类GM-CSF免疫测定试剂盒#HSGMO(RandDSystems，Inc.)按照生产商说明书确定细胞因子产生。

结果表明IL-8和GM-CSF的表达受IL-20诱导。

实施例24

炎性细胞因子通过IL-20上调

人角质化细胞细胞系HaCaT在37℃在T-75组织培养瓶中长满接触后再生长数天。此时去除正常生长培养基(DMEM+10％FBS)并替换为无血清培养基。随后细胞在37℃下培养2天。随后去除DMEM，在37℃下按如下条件每次处理4瓶细胞4小时：5ng/mL重组人类(rh)IL-1α，20ng/mL rh IL-1α，5ng/mL rh IL-1α+1μg/mL IL-20，1μg/mL IL-20或10ng/mL rh IL-10。

在细胞因子处理后，除去培养基，用硫氰酸胍溶液裂解细胞。氯化铯梯度下离心过夜从细胞裂解液中分离总RNA。在随后时间中，RNA沉淀物重悬于TE/SDS溶液中并用乙醇沉淀。随后用分光光度计定量RNA，随后按照Section V.B.of Clontech′s Atlas^TM cDNA表达微阵列使用手册(version PT 3140-1/PR9X390，published 11/5/99)用DNA酶处理。通过基于分光光度计读数的纯度计算和琼脂糖凝胶观察来验证RNA样品的质量。通过β肌动蛋白的PCR分析来排除RNA样品中的基因组污染。

按照Clontech的操作流程中的多聚A+富集、探针合成和Atlas^TM微阵列杂交进行操作(见上，增加Atlas^TM Pure Total RNA标记系统使用手册，PT3231-1/PR96157，6/22/99公布)。简要的，用抗生物素蛋白链菌素包被的磁珠(Clontech，Paolo Alto，CA)和磁性颗粒分离器从50mg总RNA中分离多聚A+RNA。随后通过RT-PCR用α³²P-dATP标记多聚A+RNA。在反应中使用了对Atlas^TM人类细胞因子/受体微阵列(目录号#7744-1)上的268个基因有特异性的ClontechCDS引物。用柱色谱分离标记的探针并在闪烁液中计数。

在68℃下用Clontech ExpressHyb plus 100mg/mL热变性鲑精DNA预杂交Atlas^TM微阵列至少30分钟，并不断搅动。随后用1.9×10⁶CPM/mL(总共1.14×10⁷CPM)杂交膜，68℃下过夜并不断搅动。在随后的时间中，68℃下用2X SSC、1％SDS洗膜30分钟×4次，加68℃ 0.1X SSC、0.5％SDS清洗30分钟×1次，随后进行最后一次的室温2X SSC清洗5分钟。随后将微阵列膜置于封口的Kodak塑料袋中并在室温下暴露于荧光成像屏过夜。转天，在荧光成像仪上扫描荧光屏并用Clontech的AtlasImage^TM1.0软件分析。

IL-20引起的上调基因：

1.IL-20引起肿瘤坏死因子(TNF)上调1.9-2.4倍。

2.IL-20引起胎盘生长因子1和2(PLGF)上调1.9-2.0倍。

3.IL-20引起凝固因子II受体上调2.0-2.5倍。

4.IL-20引起降钙素受体上调2.2-2.3倍。

5.IL-20引起TNF-可诱导的透明质酸结合蛋白TSG-6上调2.1-2.2倍。

6.IL-20引起血管内皮生长因子(VEGF)受体-1前体，酪氨酸蛋白激酶受体(FLT-1)(SFLT)上调2.1-2.7倍。

7.IL-20引起MRP-8(MIF相关的巨噬细胞中的钙结合蛋白)上调2.9-4.1倍。

8.IL-20引起MRP-14(MTF相关的巨噬细胞中的钙结合蛋白)上调3.0-3.8倍。

9.IL-20引起耻骨松弛激素H2上调3.14倍。

10.IL-20引起转化生长因子β(TGFβ)受体III 300kDa上调2.4-3.6倍。

IL-20+IL-1处理显示协同效果的基因：

1.单独IL-20处理引起成骨蛋白2a上调1.8倍，单独IL-1处理上调2.5倍，IL-20和IL-1共同处理上调8.2倍。

2.单独IL-20处理引起MRP-8上调2.9倍，单独IL-1处理上调10.7倍，IL-20和IL-1共同处理上调18.0倍。

3.单独IL-20处理引起红细胞分化蛋白(EDF)上调1.9倍，单独IL-1处理上调9.7倍，IL-20和IL-1共同处理上调19.0倍。

4.单独IL-20处理引起MRP-14(MTF相关的巨噬细胞中的钙结合蛋白)上调3.0倍，单独IL-1处理上调12.2倍，IL-20和IL-1共同处理上调20.3倍。

5.单独IL-20处理引起肝素结合的EGF样生长因子上调2.0倍，单独IL-1处理上调14倍，IL-20和IL-1共同处理上调25.0倍。

6.单独IL-20处理引起β-血小板球蛋白样蛋白上调1.5倍，单独IL-1处理上调15倍，IL-20和IL-1共同处理上调27倍。

7.单独IL-20处理引起脑源性神经营养因子(BDNF)上调1.7倍，单独IL-1处理上调25倍，IL-20和IL-1共同处理上调48倍。

8.单独IL-20处理引起单核细胞趋化活化因子MCAF上调1.3倍，单独IL-1处理上调32倍，IL-20和IL-1共同处理上56倍。

实施例25

IL-20的转基因表型

在转基因小鼠中使用不同启动子过量表达人类和鼠IL-20。最初在一个尝试中用肝特异性小鼠白蛋白启动子引导人类IL-20表达来实现循环水平的蛋白。随后的实验使用主要在表皮和其它复层扁平上皮中表达的角蛋白14(K14)启动子；广泛表达的小鼠金属硫蛋白-1启动子；在淋巴系表达的EμLCK启动子。所有4个例子得到相似结果，可能是因为这些启动子都提高IL-20的循环水平。

在所有例子中，表达IL-20转基因的转基因幼崽比非转基因同窝出生仔畜小，具有光泽形态，皮肤紧、皱，并在出生后头几天内死亡。幼崽胃中有奶表明它们能够哺乳。这些小鼠的四肢、尾部、鼻孔和嘴区域肿大，行动困难。另外，小鼠虚弱、缺乏可见的脂肪组织、耳和足指发育迟缓。在肝中表达水平低(小于100mRNA分子/细胞)足以造成新生致死和皮肤异常。没有可见表型的转基因小鼠或者不表达转基因、未表达到可检测水平，或者是嵌合体。

和非转基因同窝出生仔畜相比对IL-20转基因小鼠的皮肤进行组织学分析显示表皮增厚，过度角化和角质层紧密。偶尔观察到Serocellular crusts(疥癣)。对转基因小鼠皮肤进行电子显微镜(EM)分析显示有线粒体内脂内含物、斑状透明角质颗粒和相对很少的张力丝，和在人牛皮癣皮肤中和小鼠皮肤疾病模型中观察到的相似。此外，许多转基因小鼠有凋亡的胸腺淋巴细胞。组织病理学分析没有检测到其它异常。这些组织学和EM结果支持并扩展了观察到的总体皮肤改变。

实施例26

构建表达载体表达可溶性人IL-22RA-muFc

制备了人类IL-22RA可溶性受体-muFc融合物(表示为IL-22RA-C(mG2a))，含有融合到小鼠γ2a重链Fc区(mG2a)的IL-22RA的细胞外结构域。用两个单独的DNA片段和表达载体pZMP40通过同源重组方法构建了一个含有IL-22RA-C(mG2a)的表达质粒。用下述引物通过PCR扩增产生了IL-22RA(SEQ ID NO：1)和mG2a SEQ ID NO：39多核苷酸序列的片段，所述引物：(a)IL-22RA引物ZC45，593(SEQID NO：28)和ZC45，592(SEQ ID NO：29)；和(b)mG2a引物ZC45，591(SEQ ID NO：30)和ZC45,594(SEQ ID NO：31)。

第一个片段含有IL-22RA细胞外结构域编码区，是用IL-22RA多核苷酸(例如SEQ ID NO：1)作为模板制备的。第一个片段包括5′和部分pZMP40载体序列重叠区，IL-22RA区段和一个含有接头序列和部分mG2a序列的3′重叠区。PCR条件：1个循环，94℃，5分钟；35个循环，94℃，1分钟，随后55℃，2分钟，随后72℃，3分钟；1个循环，72℃，10分钟。

第二个片段包括带有接头序列和部分IL-22RA序列的5′重叠区，mG2a区段和一个含有部分pZMP40载体序列的3′重叠区。从一个小鼠Igγ2a重链cDNA克隆中产生小鼠y 2a重链Fc区(mG2a)(SEQ IDNO：39)。mG2a含有铰链、小鼠免疫球蛋白γ2a重链恒定区的CH₂和CH₃结构域。PCR条件：1个循环，94℃，5分钟；35个循环，94℃，1分钟，随后55℃，2分钟，随后72℃，3分钟；1个循环，72℃，10分钟。

PCR反应混合物进行1％琼脂糖凝胶电泳，用QIAquick^TM凝胶回收试剂盒(Qiagen)凝胶回收符合插入片段大小的一个条带。

采用三种方法将BglII切割的质粒pZMP40和PCR插入片段重组在一起。质粒pZMP40是这样的哺乳动物表达载体，其包含这样的表达盒、大肠杆菌复制起始位点、这样的哺乳动物选择标记表达单位和在酿酒酵母中进行选择和复制所必需的URA3和CEN-ARS序列，所述表达盒具有MPSV启动子、用于插入编码序列的多个限制位点和Fc9编码区，所述哺乳动物选择标记表达单位包含SV40启动子、增强子和复制起始位点、DHFR基因以及SV40终止子。通过在pZMP21(保藏于美国典型培养物保藏中心，10801 University Boulevard，Manassas，VA20110-2209，保藏号为PTA-5266)聚合接头处增加一些限制酶位点构建pZMP40。

将100μl感受态酵母(酿酒酵母)细胞和10μl插入物DNA以及100ng切开的pZMP40载体独立地组合，并将混合物转移至0.2cm电穿孔小杯中。使用设置为0.75kV(5kV/cm)、∞欧姆和25μF的电源(BioRad Laboratories，Hercules，CA)对酵母/DNA混合物进行电脉冲。向小杯中加入600μl的1.2M的山梨醇，以100μl和300μl的等分将酵母涂板在2块URA-D板上并在30℃下温育。大约72小时后，将来自单块板的Ura⁺酵母转化子重悬浮于1ml H₂O中，并短暂离心以沉淀酵母细胞。将细胞沉淀物重悬浮于0.5ml裂解缓冲液(2％ Triton X-100、1％SDS、100mM NaCl、10mM Tris、pH 8.0、1mM EDTA)。将500μl裂解混合物加至包含250μl用酸洗涤的玻璃珠和300μl酚-氯仿的Eppendorf管中，涡旋振荡3分钟，并以最大速度在Eppendorf离心机中离心5分钟。将300μl的水相转移至新管，并使用600μl乙醇(EtOH)和30μl 3M乙酸钠，然后以最大速度离心30分钟沉淀DNA。将管中溶液轻轻倒出，并用1mL 70％的乙醇洗涤沉淀。将管中溶液轻轻倒出，并将DNA沉淀物重悬浮于30μl TE中。

使用5μl酵母DNA制剂和50μl细胞进行电转感受态大肠杆菌宿主细胞(DH12S)的转化。在2.0kV、25μF和400欧姆下对细胞进行电脉冲。电穿孔后，加入1ml SOC(2％ Bacto^TM胰蛋白胨(Difco，Detroit，MI)、0.5％酵母提取物(Difco)、10mM NaCl、2.5mM KCl、10mM MgCl₂、10mM MgSO₄、20mM葡萄糖)，并随后以50μl和200μl的等分将细胞涂板在2块LB AMP板(LB肉汤(Lennox)，1.8％ Bacto^TM琼脂(Difco)，100mg/L氨苄青霉素)上。

对构建体的3种克隆的插入物实施序列分析，并对于每种构建体，选择包含正确序列的一种克隆。按照制造商的说明，使用可商购获得的试剂盒(QIAGEN Plasmid Mega Kit，Qiagen，Valencia，CA)分离大规模的质粒DNA。

实施例27

表达和纯化人可溶性IL-22RA-muFc多肽

在37℃下用200单位Pvu I分别降解3组200μg的IL-22RA-C(mG2a)构建体(实施例22)3小时，并随后用IPA沉淀，并在1.5mL微量离心管中离心。将上清液轻轻倒离沉淀物，并用1mL 70％的乙醇洗涤沉淀物，并将其在室温下温育5分钟。在微量离心机中以14,000RPM离心10分钟，并将上清液轻轻倒离沉淀物。然后在无菌环境中将沉淀物重悬浮于750μl的PF-CHO培养基，并将其在60℃下温育30分钟，并使其冷却至室温。大约5E6个APFDXB11细胞在三只管中的每一只管中被离心沉淀，并使用DNA介质溶液重悬浮所述细胞。将DNA/细胞混合物置于0.4cm小杯中，并使用下列参数(950μF、高电容、和300V)进行电穿孔。然后取出小杯中的内容物，混合，并用PF-CHO培养基稀释至25mL，并放入125mL摇瓶中。将瓶子在37℃、6％CO₂下置于振荡器上的培养箱中，在120RPM下进行振荡。经由蛋白质印迹法证实蛋白质表达。

对细胞系实施营养物选择，然后转入100nM氨甲蝶呤(MTX)中进行扩增，之后转入500nM MTX中，最后转1μM MTX中。分步扩增后为CD8细胞分选。通过采用稳定的1μM MTX扩增的库并用单克隆FITC抗CD8抗体(BDPharMingen，cat # 30324X)使用制造商推荐的浓度对大约5E6个细胞进行染色来完成CD8细胞分选。染色的细胞被加工处理并在FACS Vantage(BD)流式细胞仪上进行分选。收集最顶端的5％的细胞并使其过度生长。用蛋白印记验证表达，并且用后面的标准方法扩大细胞系并纯化蛋白。

实施例28

通过用huL22RA-mG2a免疫的小鼠血清中和huIL-22RA

A.基于细胞的中和检测检测IL-20和/或IL-22的抑制

用共转染IL-22RA和IL-22RB(pDIRS1)的依赖因子的前B细胞系BaF3(BAF/IL-22RA/IL-20RB细胞；实施例38)通过拮抗IL-22RA/IL-20RB受体上的IL-20检测抗IL-22RA抗体的中和潜力。相似的，用IL-22RA和IL-10RB(CRF2-4)共转染的BaF3(BAF/IL-22RA/CRF2-4细胞；实施例2)通过拮抗IL-22RA/IL10RB受体上的IL-22检测抗IL-22RA抗体的中和潜力。用如实施例3所述的Alamar蓝检测法检测在表达各自受体的细胞系中存在IL-20或IL-22时的增殖，和存在拮抗抗体时这种增殖的抑制。在这些细胞中增殖的抑制预示着在这个检测中的中和活性。

B.在基于细胞的中和检测中抗IL-22RA血清中和IL-20和IL-22

采用如实施例28A所述的检测法，来自于用huIL-22RA-muG2a(实施例30(A)(1))免疫的IL-22RA敲除小鼠的血清按一系列稀释1％、0.5％、0.25％、0.13％、0.06％、0.03％、0.02％，和0％加入。检测板在37℃、5％CO₂培养4天，随后加入20l/孔Alamar蓝(Accumed，Chicago，IL)。板再次在37℃、5％CO₂培养16小时。Alamar蓝基于活细胞的数量给出荧光读数，因而对照着阴性对照直接测量细胞增殖。在Wallac Victor 2 1420 Multilabel Counter(Wallac，Turku，Finland)上以530(激发)和590(发射)的波长对板进行读数。结果表明，来自所有7只免疫动物的血清能通过huIL-22RA中和huIL-22和huIL20的信号。例如，在1％浓度下，5只动物的血清(16517，16518，16519，16520，和16527)完全中和huIL-22诱导的增殖，在低浓度下增殖下降采用依赖剂量的方式。此外，在1％浓度下，其它两只动物的血清(16471和16701)抑制大约90％的huIL-22诱导的增殖，在低浓度下增殖下降采用依赖剂量的方式。相似的，在1％和0.5％浓度下，5只动物的血清(16517，16518，16519，16520，和16527)完全中和huIL-20诱导的增殖，在低浓度下增殖下降采用依赖剂量的方式。此外，在1％浓度下，动物16701的血清完全中和huIL-20诱导的增殖，在低浓度下增殖下降采用依赖剂量的方式。在1％浓度下，动物16471的血清抑制大约95％的huIL-20诱导的增殖，在低浓度下增殖下降采用依赖剂量的方式。因此，所有7只动物的血清都能通过huIL-22RA受体中和IL-20或IL-22诱导的增殖。这些结果进一步证明IL-22RA抗体在低浓度下确实能拮抗促炎性配体(IL-20和IL-22)的活性。

这些结果提供了另外的证据，即通过结合、阻断、抑制、减少、拮抗或中和IL-20或IL-22活性(单独或一起)有效阻断IL-22RA活性(例如通过本发明的IL-22RA中和单克隆抗体)能方便的减少体内IL-20和IL-22的效果(单独或一起)，并可以减少IL-20和/或IL-22诱导的炎症，例如在IL-20诱导的皮肤效果和IL-22诱导的皮肤效果中所见，例如牛皮癣、炎性肠病或其它IL-20和/或IL-22诱导的炎性疾病包括炎性肠病、关节炎、哮喘、牛皮癣性关节炎、结肠炎、炎性皮肤症状和特应性皮炎。

实施例29

产生P815/hIL-22RA细胞和免疫小鼠

A.产生P815/hIL-22RA细胞并注射到小鼠中产生抗hIL-22RA抗体

使用Fugene Reagent根据生产商的操作流程(Roche，Indianapolis，IN)用含有hIL-22RA cDNA序列(例如SEQ ID NO：1)和一个选择性嘌呤霉素抗性标记的质粒载体转染野生型P815细胞(ATCC编号TIB-64)。转染后细胞铺板进行嘌呤霉素选择48小时。通过有限稀释克隆嘌呤霉素抗性转染子，并用流式细胞计量使用生物素化的人类IL-22(huIL-22-生物素)筛选它们的hIL-22RA细胞表面表达水平。简要的，细胞在5ug/ml huIL-22-biotin下在冰上培养30分钟，然后清洗。随后用PE标记的抗生物素蛋白链菌素在1∶500下检测结合到细胞上的huIL-22-生物素。用Facscan流式细胞测定器和Cellquest软件(Becton Dickinson，San Jose，CA)分析细胞。

选择的P815/IL-22RA细胞克隆生长起来并且随后收集用于注射。收集细胞，PBS清洗3次，计数，1×10⁸细胞每毫升重悬细胞，用10,000rads照射。随后细胞悬液转入1ml注射器，通过腹腔途径注射进入DBA/2小鼠。3周后按相同方式对小鼠取血，筛选血清结合hIL-22RA转染细胞系。简要地，血清用Facs缓冲液(HBSS，2％BSA，.02％NaN₃)稀释为1∶100，随后和过表达hIL-22RA的Fc-阻断的293人类肾细胞一起培养。用1∶200稀释的荧光-交联的山羊抗小鼠IgG(SouthernBiotech，Birmingham，AL)检测抗IL-22RA抗体结合细胞。如前所述分析细胞。再次对小鼠增强3次，如所述筛选血清。根据血清结合hIL-22RA转染子的水平选择两只小鼠用于杂交瘤融合，采用本领域的标准方法来产生单克隆抗体(实施例25)。

还用上述方法产生表达IL-22RA受体异二聚体的P815细胞，所述异二聚体例如IL-22RA/CRF2-4(P815/IL-22RA/CRF2-4细胞)、IL-22RA/pDIRS1(P815/IL-22RA/pDIRS1细胞)或IL-22RA/CRF2-4/pDIRS1(P815/IL-22RA/CRF2-4/pDIRS1细胞)，例如免疫小鼠来产生针对IL-22RA和包含IL-22RA的异二聚体受体的单克隆抗体。

实施例30

产生小鼠抗人IL-22RA(IL-22RA)mAbs

A.免疫产生抗IL-22RA抗体：

(1)使用可溶性IL-22RA-muFc

按照2周的时间表，通过腹膜内注射与Ribi佐剂(Sigma)1∶1(v∶v)混合的25-50ug可溶性人IL-22RA-muFc蛋白(实施例23)来免疫6至12周大的IL-22RA敲除的小鼠(实施例26)。第3次免疫后7至10天，经由眶后放血获取血样，收集血清并在中和测定(例如此处所述)中评估其抑制IL-22或IL-20与IL-22两者与IL-22RA结合的能力，并在FACS染色测定中评估其染色IL-22RA转染293细胞相对于染色未转染293细胞的能力。继续免疫小鼠并获取血样，并如上所述进行评估直至中和滴定度达到平台。此时，对具有最高中和滴定度的小鼠静脉内注射溶于PBS中的25-50ug可溶性IL-22RA-Fc蛋白质。3天后，收集来自这些小鼠的脾脏和淋巴结并用于产生杂交瘤，例如通过使用本领域已知的标准方法(例如，参见Kearney，J.F.等人J Immunol. 123：1548-50，1979；和Lane，R.D.J Immunol Methods 81：223-8.1985)经由小鼠骨髓瘤(P3-X63-Ag8.653.3.12.11)细胞或本领域其他合适的细胞系产生杂交瘤。

(2)使用表达IL-22RA受体的P815转染子

通过腹膜内注射1×10⁵活的、转染的P815细胞，例如P815/IL-22RA细胞、P815/IL-22RA/CRF2-4、P815/IL-22RA/pDIRS1或P815/IL-22RA/CRF2-4/pDIRS1细胞(实施例24)免疫6到10周大的雌性DBA/2小鼠(例如0.5ml细胞密度为2×10⁵细胞/ml)。注射前，细胞维持在指数生长期。为了注射，收集细胞，用PBS清洗3次，随后重悬于PBS中，密度为2×10⁵细胞/ml。在这个模型中，小鼠在2-3周内发展出腹水肿瘤，并在4-6周发展到死亡，除非产生对包埋的转染的靶标抗原的免疫应答。没有明显腹部肿大(预示腹水)的3周小鼠，重新按上述以2-3间隔免疫。第2次免疫后7至10天，经由眶后放血获取血样，收集血清并在中和测定(例如此处所述)中评估其抑制IL-22或IL-20与IL-22两者与IL-22RA结合的能力，并在FACS染色测定中评估其染色IL-22RA转染293细胞相对于染色未转染293细胞的能力。继续免疫小鼠并获取血样，并如上所述进行评估直至中和滴定度达到平台。此时，对具有最高中和滴定度的小鼠腹膜内注射1×10⁵活的、转染的P815细胞。4天后，收集来自这些小鼠的脾脏和淋巴结并用于产生杂交瘤，例如通过使用本领域已知的标准方法(例如，参见Kearney，J.F.等人如前；和Lane，R.D.如前)经由小鼠骨髓瘤(P3-X63-Ag8.653.3.12.11)细胞或本领域其他合适的细胞系产生杂交瘤。

上述用活的、转染的P815细胞的免疫计划的一个替代方法包括每2-3周腹膜内注射1-5×10⁶被照射的、转染的细胞。在这个方法中，没有动物发展并死于腹水。更改为，大致如上所述在第2次免疫后开始监测动物血清中针对IL-22RA的中和免疫应答并放血。一旦中和滴度达到最大水平，对最高滴度的小鼠给予预融合，腹膜内注射5×10⁶被照射的细胞，并且4天后收集这些小鼠的脾脏和淋巴结并用于产生杂交瘤，例如通过使用本领域已知的标准方法(例如，参见Kearney，J.F.等人如前；和Lane，R.D.如前)经由小鼠骨髓瘤(P3-X63-Ag8.653.3.12.11)细胞或本领域其他合适的细胞系产生杂交瘤。

B.在杂交瘤融合物中筛选结合IL-22RA并抑制IL-22结合IL-22RA的抗体

在融合后8至10天对杂交瘤上清液进行2种不同的初步筛选。对于第1种测定，通过ELISA使用HRP缀合的山羊抗小鼠κ链和抗λ轻链第二步骤试剂以鉴别结合的小鼠抗体，来检测上清液中的抗体结合板结合的可溶性IL-22RA-muFc蛋白的能力。为了证实IL-22RA-muFc蛋白的IL-22RA部分的特异性，用融合到相同小鼠Fc区域(mG2a)的无关蛋白评估在初始测定中的阳性上清液。这些上清液中结合IL-22RA-muFc但不结合包含无关的muFc的融合蛋白的抗体被视为对IL-22RA特异。对于第2种测定，通过ELISA评估所有杂交瘤上清液中的抗体抑制生物素化的人IL-22与板结合的IL-22RA-muFc结合的能力。

随后分别测试包含特异性结合IL-22RA的抗体的所有上清液抑制IL-20或IL-22与IL-22RA/IL-20RB和IL-22RA/CRF2-4转染的Baf3细胞结合的能力，无论所述上清液在ELISA测定中是否抑制IL-22与IL-22RA的结合。随后通过FACS分析评估在IL-22抑制检测或IL-20和IL-22共同抑制检测中为中和阳性的所有上清液使IL-22RA转染的Baf3细胞染色相对于未转染的细胞染色的能力。设计这个分析以确认IL-22与IL-22RA/CRF2-4结合或IL-20与IL-22RA/IL-20RB结合的抑制的确是由于特异性结合IL-22RA受体的抗体造成的。此外，因为用抗IgG第二步骤试剂进行FACS分析，所以特异性的FACS阳性结果表明中和抗体可能属于IgG类。通过这些方法，鉴别出标准(master)孔，它分别结合在板结合ELISA中的IL-22RA、在基于ELISA的抑制测定中抑制IL-22与IL-22RA的结合、阻断IL-20和IL-22与IL-22RA/IL-20RB和IL-22RA/CRF2-4转染的Baf3细胞(实施例28)的相互作用，并且对于使用抗小鼠IgG第二步骤试剂进行的IL-22RA/IL-20RB和IL-22RA/CRF2-4转染的Baf3细胞染色是强阳性的。

D.克隆产生抗IL-22RA特异性抗体的杂交瘤

通过标准的低密度稀释(少于1细胞/孔)法克隆产生特异性抗IL-22RA mAb的杂交瘤细胞，所述抗体交叉中和IL-20和IL-22与适当转染的BaF3细胞的结合。在涂板后大约5至7天，通过对板结合的人IL-22RA-muFc进行ELISA，随后通过对如上所述的包含无关的含muFc的融合蛋白进行ELISA重新检验阳性孔来筛选克隆。通过重复中和测定以及FACS分析进一步确认选择的克隆的特异性抗体活性，所述克隆的上清液结合IL-22RA-muFc而不结合包含无关muFc的融合蛋白。将所有选择的IL-22RA抗体阳性的克隆最少克隆2次以帮助确保克隆形成能力并且评估抗体生产的稳定性。如所述的进行进一步的克隆循环和筛选，直至优选地至少95％的所得到的克隆对于中和抗IL-22RA抗体的产生呈阳性。

E.由抗IL-22RA mAb识别的分子的生物化学特征

通过标准的免疫沉淀法，随后进行SDS-PAGE分析或蛋白质印记法，(两者都采用来自经IL-22RA转染的相对于未转染的Baf3细胞的可溶性膜制剂)，进行这样的生物化学确认，即由假定的抗IL-22RA mAb识别的靶分子IL-22RA的确是IL-22RA。此外，表达IL-22RA的未转染细胞系的可溶性膜制剂用于显示mAb识别天然的受体链以及转染的受体链。可选择地，检测mAb特异性免疫沉淀或蛋白质印迹杂交可溶性IL-22RA-muFc蛋白质的能力。

实施例31

用来自于注射转染huL22RA的P815细胞的小鼠的血清中和huL22RA

使用实施例28所述的基于细胞的中和测定，以1％、0.5％、0.25％、0.13％、0.06％、0.03％、0.02％和0％的系列稀释加入来自注射了用huIL-22RA转染的活的P815细胞(实施例30.A.2)的小鼠的血清。测定板在37℃，5％CO₂下温育4天，在第4天加入20μl/孔的Alamar Blue(Accumed，Chicago，IL)。板再次在37℃，5％CO₂下温育16小时。结果显示，4只动物的血清能通过huIL-22RA中和huIL-22和huIL20的信号。

在1％浓度下，6只动物(7125，7127，7128，7118，7124和7117)的血清中和50％到80％的huIL-22诱导的增殖，在低浓度下组织抑制下降呈现剂量依赖形式。另外，在1％浓度下，4只动物(7125，7127，7118，和7117)的血清中和40％到70％的huIL-20诱导的增殖，在低浓度下组织抑制下降呈现剂量依赖形式。这些结果进一步表明IL-22RA的抗体在低浓度下确实能拮抗促炎性配体IL-20和IL-22的活性。

这些结果提供了另外的证据，即通过结合、阻断、抑制、减少、拮抗或中和IL-20或IL-22活性(单独或一起)有效阻断IL-22RA活性，例如通过本发明的IL-22RA中和单克隆抗体，能方便的减少体内IL-20和IL-22的效果(单独或一起)，并可以减少IL-20和/或IL-22诱导的炎症，例如在IL-20诱导的皮肤效果和IL-22诱导的皮肤效果中所见，例如牛皮癣、炎性肠病或其它IL-20和/或IL-22诱导的炎性疾病包括炎性肠病、关节炎、哮喘、牛皮癣性关节炎、结肠炎、炎性皮肤症状和特应性皮炎。

实施例32

IL-22RA敲除小鼠的表型

A.产生带有遗传修饰的小鼠

1.产生表达鼠IL-20带有新生光泽的转基因小鼠

a).构建从K14启动子表达鼠IL-20

为了研究IL-20在体内的生物功能，进行了转基因构建，其中鼠IL-20由人K14启动子(也参见实施例21)驱动.设计寡核苷酸产生含有一致的Kozak序列和鼠IL-20编码区的PCR片段。这些寡核苷酸被设计有5′端的FseI位点和3′端的AscI位点，来辅助克隆进入标准的含有人角质化细胞和表皮细胞特异性启动子的转基因载体pRSK14。

PCR反应采用大约200ng鼠IL-20模板(SEQ ID NO：33)和设计为扩增全长IL-20(SEQ ID NO：34)的寡核苷酸。PCR反应条件由本领域已知的方法确定。PCR产物用琼脂糖凝胶电泳分离并用QiaQuick^TM(Qiagen)凝胶回收试剂盒纯化。用FseI和AscI(Boerhinger-Mannheim)消化分离的、大小正确的DNA片段。设计为在转基因小鼠角质化细胞和上皮细胞中表达所需基因的pRSK14质粒含有一个表达盒，两侧有大约3Kb的人类角蛋白特异性K14启动子。

根据生产商的指导将大约1微升连接反应液被电转进入DH10BElectroMax^TM感受态细胞(GIBCO BRL，Gaithersburg，MD)并铺板到含有100μg/ml氨苄西林的LB平板上，培养过夜。挑选克隆并生长在含有100μg/ml氨苄西林的LB培养基中。从挑选出的克隆小量制备DNA并用FseI和AscI联合的限制性消化来筛选鼠IL-20插入片段，随后进行琼脂糖凝胶电泳。用测序分析来验证构建有正确cDNA插入片段的TG。大量制备正确的pRSK14鼠IL-20。

b)产生并表征K14 IL-20转基因小鼠。

从含有角蛋白特异性K14启动子5′和3′侧翼序列、鼠IL-20(SEQID NO：33；SEQ ID NO：34所示多肽)、Gormon内含子、IL-20cDNA和人生长激素多聚A信号序列的转基因(TG)载体中分离大约4Kb长度的NotI片段。将其显微注射到受精的B6C3f1(Taconic，Germantown，NY)小鼠卵母细胞。显微注射和产生转基因小鼠如Hogan，B.et al.Manipulating the Mouse Embryo，2^nd ed.，Cold Spring HarborLaboratory Press，NY，1994所述。

用特异性针对转基因人类生长激素多聚A信号部分PCR引物通过TaqMan^TMRT-PCR反应对TG RNA表达进行定量。

所有表达IL-20的TG构建体表现出高的致死率，并且出生的TG幼崽典型的表现出“有光泽”表型。具有光泽表型的新生幼崽表现为和皮肤变硬有相关性，似乎它们脱水，导致适当护理减少。它们的行动总体上变得僵硬。组织病理学上，有光泽幼崽具有增厚的表皮，并且角蛋白层紧密。这些有光泽建立幼崽多数在头5天内死亡，生存的和断奶的幼崽总体上不表达转基因(通过转录子分析)，或者它们是嵌合体(通过转基因低后代传递)。

建立了由K14启动子驱动的表达鼠IL-20的一个系。皮肤和胸腺中表达水平低，并且所有新生动物出生时带有光泽表型。总体上这个系拥有20％的TG后代，表明50-60％的转基因幼崽在子宫内死亡(在半合子交配中50％后代应为TG)。

2.产生带有去除IL-22RA表达的小鼠；IL-22RA敲除小鼠

a).产生小鼠IL-22RA的敲除(KO)构建体

为了进一步研究IL-22RA的体内生物功能，构建了一个小鼠敲除(KO)株来去除IL-22RA的表达。首先，用小鼠IL-22RA cDNA探针筛选小鼠129/SvJ基因组BAC文库。确定含有IL-22RA基因组基因座的克隆并表征。小鼠IL-22RA多核苷酸显示于SEQ ID NO：41，多肽显示于SEQ ID NO：42。

为了产生敲除构建体去除IL-22RA，用ET克隆技术(Zhang et al.1998.A new logic for DNA engineering using recombination inE.coli.Nat.Genet.Vol.20：123-8)生产一个敲除载体。简要的，KO载体含有IL-22RA基因的一个1.8kb 5′臂(短臂)，一个IRES-LacZ/MClneo选择性标志，和一个10kb 3′臂(长臂)。在KO载体中，IL-22RA基因组序列的外显子2、3和4和内含子2和3被IRES-LacZ/MClneo的选择标志替换，因此通过在ES细胞中同源重组产生了大约4.4Kb的缺失体。

用限制性酶Pme I线性化KO载体后，将其电穿孔进入129/SvJ ES细胞。按Robertson，E.J.et al.Teratocarcinomas and Embryonic Stem Cells：A Practical Approach，2^nd ed.，IRL Press Limited，Oxford，1987所述进行同源重组的选择和重组ES克隆的鉴定。

b).去除IL-22RA表达的小鼠的建立和分析

扩大阳性ES克隆，其中IL-22RA基因组基因座2-4外显子和2-3内含子缺失。它们被注射进入C57B1/6j小鼠的胚泡。注射的胚泡短暂的再次扩大后，它们被引入到假妊娠代孕母亲体内来产生嵌合体。突变的IL-22-RA的胚泡注射、嵌合体育种和后续的种系传递按照Robertson，E.J.et al.Teratocarcinomas and Embryonic Stem Cells：A Practical Approach.2^nd ed.，IRL Press Limited，Oxford，1987所述进行。

用PCR基因分型策略来鉴定KO突变小鼠。在多重PCR反应中使用3个PCR引物ZC22901(SEQ ID NO：35)、ZC45039((SEQ ID NO：36)、ZC38573(SEQ ID NO：37)来检测野生型等位基因和突变等位基因。野生型(WT)等位基因产生一个长度为229bp的DNA片段，突变等位基因产生一个长度为371bp的DNA片段。

配对的半合子小鼠生产正常几率的纯合子(HOM)、杂合子(Het)和野生型(WT)后代，和一个正常的性别比例。通过PhysioScreen(收集体重、组织重量、全血计数(CBC)、临床化学、总体观察和组织病理学)检查小鼠显示，HOM、Het和WT动物之间没有明显的区别。

B.IL-22RA对IL-22诱导的SAA是必须的：SAA ELISA显示在IL-22RA敲除小鼠中缺乏IL-22诱导的SAA表达

为了评价IL-22RA对注射IL-22的小鼠的SAA诱导是否是必须的，IL-22RA KO小鼠被注射5ug IL-22并在6小时后放血。

用小鼠SAA免疫检测试剂盒(BioSource International，California)按照生产商指导进行Elisa来确定血清样品中的SAA水平，血清按1∶1000稀释。5只WT小鼠中的4只对IL-22注射产生应答，显示SAA水平升高，而5只HOM IL-22RA KO小鼠中的4只显示基础水平SAA。检测的两只Het IL-22RA KO小鼠都显示SAA水平升高，但是比WT小鼠升高的SAA水平低。这表明IL-22RA对IL-22诱导SAA是必须的。

这些结果为如下提供了证据，有效阻断IL-22RA的活性，例如通过IL-22RA基因敲除或相似的通过本发明的IL-22RA中和单克隆抗体能相似的减少IL-22诱导的炎症，例如在牛皮癣、炎性肠病、结肠炎、内毒素血症或其它IL-22诱导的炎性疾病。

C.IL-22RA对IL-22诱导的表皮增厚是必须的：通过皮下植入的渗透微泵给予IL-22纯蛋白不含引起IL-22R KO小鼠表皮增厚。

为了评价IL-22RA对IL-22诱导的表皮增厚是否是必须的，对IL-22RA HOM和WT KO小鼠通过渗透微泵皮下施用IL-22。泵以18.4μL每天的速度运输IL-22共7天。4只HOM和6只WT IL-22RA KO小鼠接受了IL-22蛋白，而3只HOM和1只WT小鼠接受了PBS。

在BaF3增殖检测中对IL-22处理小鼠的血清样品进行检测来验证IL-22的存在。转染IL-22RA和CRF2-4的BaF3细胞增殖时需要IL-22或小鼠IL3。离心下来这些细胞并用不含mIL-3(RPMI培养基(JRHBioscience Inc.，Lenexa，KS)，补充10％热灭活胎牛血清、2mML-glutaMax-1^TM(Gibco BRL)、1mM丙酮酸钠(Gibco BRL)和PSN抗生素(GIBCO BRL)(以下被称为“无mIL-3培养基”))的完全培养基清洗。离心细胞并清洗3次来确保去除mIL-3。随后用血细胞计数器对细胞计数并5000细胞每孔铺板于96孔板，用无mIL-3培养基确定终体积为200ul每孔。孔中小鼠血清为1％、0.5％、0.25％或0.125％。这个检测板在37℃、5％CO₂中培养3天，第3天加入Alamar Blue(Accumed，Chicago，IL)20μl/孔。板再次在37℃，5％CO₂下温育24小时。Alamar Blue基于活细胞的数量给出荧光读数，因而对照着阴性对照直接测量细胞增殖。板再次于37℃、5％CO₂中温育24小时。在Wallac Victor 2 1420 Multilabel Counter(Wallac，Turku，Finland)上以530(激发)和590(发射)的波长对板进行读数。结果显示，注射PBS动物没有IL-22活性，而1只Het动物中的1只、而4只HOM动物中的2只和6只WT动物中的3只具有可检测的IL-22活性。这种血清诱导的增殖被1ug/ml IL-22BP所阻断，证明它是IL-22特异性的。

IL-22处理的和未处理的IL-22RA HOM和Het敲除(KO)小鼠和WT对照小鼠的皮肤样品被浸入固定在10％缓冲的福尔马林中。组织被修剪并包埋到石蜡中，常规处理，以5μm切片(Jung 2065 Supercutmicrotome，Leica Microsystems，Wetzlar，Germany)并用H&E染色。采用盲的方式委员会(ACVP)认证的兽医病理学家在光学显微镜(Nikon Eclipse E600，Nikon Inc.，Melville，NY)下评价染色的组织。

每个皮肤样品都被评价，采用0(无)到4(严重)评分等级评价皮下组织中泵植入部位周围组织的炎症的严重程度，采用0(无)到3(弥散)评分等级评价表皮增厚程度(棘皮症)，并且对表皮最厚部位的上皮层数进行计数。在施用PBS的HOM小鼠和WT小鼠中没有发现区别。这两组的结果合并为一个PBS组。确定了每个处理组的平均和标准偏差并显示于下面的表14。

表14

处理	PBS对照	HOM KO：IL-22	WT：IL-22
				小鼠数量	4	4	6
表皮厚度	3.5±1.0	3.2±0.5	5.9±2.3
				棘皮的范围	0.5±1.0	0.2±0.5	1.9±1.3
炎症	1.5±1.0	1.2±1.0	2.0±1.0

结果显示，IL-22处理的WT小鼠具有增加表皮厚度和棘皮症的范围，对IL-22RA HOM小鼠施用IL-22后表皮厚度和棘皮症较小。

这些结果为如下提供了证据，即有效阻断IL-22RA活性，例如通过IL-22RA基因敲除或相似的通过本发明的IL-22RA中和单克隆抗体能相似的减少IL-22诱导的皮肤效果，例如在牛皮癣、炎性肠病、结肠炎、内毒素血症或其它IL-22诱导的炎性疾病。

D.IL-22RA对IL-20诱导的新生幼崽皮肤光泽是必须的：用IL-22RA KO小鼠异系交配表达鼠IL-20的转基因小鼠产生的转基因幼崽没有光泽

为了评价IL-22RA对IL-20诱导的新生TG幼崽皮肤光泽是否是必须的，K14muIL-20转基因被交叉到IL-22RA KO种系，并且观察新生动物的光泽表型。

69只幼崽按孟德尔基因型比例出生。Het KO背景上的所有的TG都是光泽的，而非TG都是没有光泽的，HOM KO背景的TG也都是没有光泽的。

用表达IL-20RA和IL-20RB的BaF3细胞进行Alamar蓝增殖检测来评价小鼠血清中是否存在IL-20。这些细胞将对IL-20或小鼠IL3产生增殖应答。过程和C部分相同。检测结果显示，所有的TG小鼠具有相当的IL-20活性，并且在C57BL/6N背景上和IL-20TG相同的水平。缺乏任何光泽新生表现都表明光泽新生表型依赖于IL-22RA的存在。

在产后第3天，IL-22RA KO背景上含有K14 muIL-20 TG的来自于litters的幼崽被人为处死，整个尸体浸泡固定在10％缓冲的福尔马林中。修剪固定的组织成为胸和腹部的横切片，包埋到石蜡中，常规操作，以5um(Jung 2065 Supercut microtome，Leica Microsystems，Wetzlar，Germany)切片并用H&E染色。采用盲的方式委员会(ACVP)认证的兽医病理学家在光学显微镜(Nikon Eclipse E600，Nikon Inc.，Melville，NY)下评价染色的组织。记录组织异常和前胸背侧的表皮层数。

来自于3只HOM IL-22RA KO背景的IL-20TG小鼠(IL-20TG/IL-22RA KO HOM)和3只IL-22RRA HOM KO背景的非TG小鼠(non-TG/IL-22RA KO HOM)的组织进行显微镜检测并发现没有异常。来自于2只Het IL-22RA KO背景的IL-20TG小鼠(IL-20TG/IL-22RAKO Het)的组织也被检测。所有动物的表皮层数相近。但是，和其它动物相比2只IL-20TG/IL-22RA KO Het小鼠的表皮是高嗜曙红性的(hypereosinophilic)，并且显示颗粒层丢失颗粒性。所有小鼠的皮肤和其它组织没有其它异常。

这些结果为如下提供了证据，即有效阻断IL-22RA活性，例如通过IL-22RA基因敲除或相似的通过本发明的IL-22RA中和单克隆抗体能相似的减少IL-20诱导的皮肤效果和IL-22诱导的皮肤效果，例如在牛皮癣、炎性肠病、结肠炎或IL-20和/IL-22诱导的炎性疾病，包括炎性肠病、关节炎、哮喘、牛皮癣性关节炎、结肠炎、炎性皮肤症状和特应性皮炎。

实施例33

IL-22RA敲除小鼠的组织形态测定成像分析

已经建立k14 IL-20m转基因(TG)小鼠系，并且该TG幼崽展示出光滑表型。通过k14启动子表达该转基因，所述启动子指导在皮肤中向角蛋白产生细胞的表达。还建立了IL-22RA敲除(KO)小鼠系，而且在未经过操作处理的小鼠中未观察到明显的变化。两个品系的小鼠交叉交配并且汇集幼崽，所述幼崽具有下述四种不同的表型：(1)(1)TG/-HOM：在背景中表达k14IL-20m转基因，不表达IL-22RA；(2)TG/-Het：在背景中表达k14 IL-20m转基因，表达来自IL-22RA基因的一个拷贝的一些IL-22RA；(3)WT/HOM：在背景中表达k14IL-20m转基因，不表达IL-22RA；和(4)WT/Het：在背景中不表达k14IL-20m转基因，表达来自IL-22RA基因的一个拷贝的一些IL-22RA。在第3天(在出生后接近48小时)时检测34只幼崽的这些不同的表型(表15)：

表15

TG＝转基因；WT＝野生型；HOM＝纯合的；Het＝杂合的；n＝幼崽的个数

将每只小鼠全身横向切出三种切片(胸廓部分，近尾部分和腹部)并且弃头。组织样本厚4.0-5.0mm，固定在10％中性缓冲的福尔马林中，包埋到石蜡块中并且用苏木素和伊红(H&E)染色，用于常规的组织学检测和组织形态学成像分析。选择来自每种组织样本的脊背区域的表皮用于组织形态学成像分析，在该分析中使用Olympus BH-2显微镜，摄像机(Dage-MTI，Michigan City，DSf)和BioQuant True Colorwindows 98软件(R&M Biometrics，Inc.Nashville，TN 37209)，并设定成如下的设置：放大倍数10X，Z关，设定为0；配置：长(Dm)；测定：流程和附加模式。来自每个皮肤样品的表皮厚度(Om)和角质层厚度或者角质化层的厚度分别测定10次，在各测定相差0.1mm，在每个10x显微镜视野下观测，通过Excel计算获得平均值、SD和SEM。所有的切片都在随机和盲测定下进行。在测定后，切片不再盲处理，与处理组相匹配的结果以及处理组的最后结果分类如下：1.胸廓部分、尾部和腹部的平均表皮厚度(Dm)，然后再分小类为(a)胸廓部分的平均表皮厚度；(b)尾部的平均表皮厚度和(c)腹部的平均表皮厚度。2.胸廓部分、尾部和腹部的平均角质层厚度(Dm)，然后再分小类为(a)胸廓部分的平均角质层厚度；(b)尾部的平均角质层厚度和(c)腹部的平均角质层厚度。3.胸廓部分、尾部和腹部的平均表皮厚度加角质层厚度。使用GraphPad InStat软件(GraphPad Software，Inc.，San Diego，CA 92121)分析最终的数据。采用单向方差分析法(ANOVA)检查组1到组4间平均值差异的统计学显著性。采用Tukey-Kramer多向比较检测法确定两组间的平均值的统计学差异(*P＜0.05；**P＜0.01；***P＜0.001；****P＜0.0001)。认为P＜0.05是显著的。

(1)组织形态学结果

(a)分别相对于不表达IL-22RA的IL-20转基因幼崽(TG/-HOM，P＝0.001***)和同窝出生的对照幼崽(WT/HOM，P＝0.001***和WT/Het，P＝0.001***)，在缺少一个拷贝的IL-22RA基因的IL-20转基因幼崽(TG/-Het)中，胸廓部分、尾部和腹部的平均表皮厚度(μm)的表皮厚度增加显著(表16)。TG/-Het幼崽表现出的非角质化表皮的厚度增加可能是由于角质细胞增生。这种增加可能涉及所有三种非角质化层(基底细胞，棘细胞和颗粒细胞)，不过影响棘细胞层最多。TG/-Het幼崽的表皮在厚度上增加大约25％，而且棘变得很突出。反之，TG/-HOM幼崽的表皮比对照稍厚(WT/HOM和WT/Het)，并且统计学显示二组无显著性差异(P＞0.05)。还比较了胸廓部分、尾部分和腹部的表皮厚度。腹部的正常表皮的厚度厚于尾部的，尾部的厚于胸廓部分的(表16).

表16

结果表示为平均值±SEM.N＝所测定的切片的个数。

来自TG/-Het幼崽皮肤的扁平鳞状上皮表现出连同上皮细胞(角质细胞)的厚度一起增加的趋势。不过，与TG/-HOM，WT/HOM和WT/Het(P＝0.1565，表17)相比，没有统计学差异。看来这是组织学人工操作造成的，例如：切片到切片的易变性，表皮的自身结构，或者对于胸廓部分的薄皮肤没有这样的影响。注意：组织学流程或者腹腔部分的组织切片可能不符合用来获得统计学显著性的组织形态学分析的资格。

表17

结果表示为平均值±SEM。N＝所测定的切片的个数。

分别与TG/-HOM(P＜0.05*)，WT/HOM(P＜0.001***)，和WT/Het(P＜0.01*)相比，具有一个拷贝的IL-22RA基因(Het)的IL-20(TG/-)表现出增加的表皮厚度的平均值(表18)。统计学表明在该组中是极其显著的(P＜0.0001****)。TG/-Het表皮比WT/Het增加大约29％。缺乏IL-22RA(HOM)的IL-20(TG/-)幼崽的表型部分与缺少一个拷贝的IL-22RA基因的幼崽(Het)相似，所述的幼崽具有与同窝出生幼崽对照(WT/HOM和WT/Het)相比厚的表皮。不过，这表明与对照组相比没有统计学差异(P＞0.05)。TG/-HOM表皮与WT/HOM相比增加大约14％。与IL-20TG/-幼崽不同，IL-22RA受体缺陷幼崽(WT/HOM和WT/Het)表现出相对薄的表皮厚度。值得注意的是，在尾部的表皮厚度的组织形态学结果与在腹腔部分，尾部和腹部(表15)的平均表皮厚度一致，这表明尾部的组织学操作和组织切片对于组织学形态成像分析是合格的。

表18

结果表示为平均值±SEM。N＝所测定的切片的个数。

除了TG/-HOM表现出与同窝出生幼崽对照无差异(WT/HOM和WT/Het，P＞0.05)。腹部平均表皮厚度(表19)的结果与尾部的厚度结果相似(表18)，此处在组织切片方面有一些变化，而且还缺少两片切片，也就是在TG/-HOM组没有覆盖背部区域的表皮。

表19

结果表示为平均值±SEM。N＝所测定的切片的个数。

(b)胸廓部分，尾部和腹部角质层的平均厚度(μm)。

尽管IL-20转基因的幼崽(TG/-)表皮厚度增加，其在背景中不表达IL-22RA(HOM)或者表达一个拷贝的基因(Het)，不过与同窝出生幼崽对照(WT/HOM和WT/Het)相比，在TG/-HOM和TG/-Het皮肤中观测到角质层或者角质化层厚度的显著降低，并且统计学显示组间具有极显著差异(P＜0.0001****，表20)。TG/-Het幼崽表现出大约36％，50％和49％的表皮表明的角质素的减少量，其分别相对于TG/-HOM(P＜0.01**)，WT/HOM(P＜0.001***)和WT/Het(P＜0.001***)。TG/-HOM幼崽在角质层厚度上，与它的对照相比表现出大约22％的显著降低(WT/HOM，P＜0.05*)，相对于WT/Het仅降低17％，这表现为没有统计学差异(P＞0.05)。对照幼崽的角质层厚度，WT/HOM和WT/Het大致相同。显然，尾部的角质层比腹部的厚，并且腹部的比胸廓部分厚。

表20

结果表示为平均值±SEM。N＝所测定的切片的个数。

胸廓部分角质层的平均厚度(表21)和胸廓部分，尾部和腹部的相似(表20)，不过角质层的显著降低仅出现在TG/-Het，其分别相对于TG/-HOM(P＜0.05*)和相对于WT/HOM(P＜0.01**)。平均值的标准差和标准误差很高，可能是由于切片少、缺少皮肤样本、表皮的天然结构或者对胸廓部分没有什么影响的缘故。注意：组织操或者胸廓部分的组织切片可能对于获得合格的结果的组织形态学分析而言是不合格的。

表21

结果表示为平均值±SEM。N＝所测定的切片的个数。

尾部角质层的平均厚度的结果(表22)与胸廓部分，尾部和腹部相似，不过有3个例外：(1)TG/-HOM相对TG/-Het，和TG/-HOM相对WT/HOM表现出没有统计学差异(P＞0.05)；(2)TG/-HOM相对WT/He t表现出显著性差异(P＜0.01**)；(3)WT/Het的角质层显著厚，这可能是在组织操作过程中的人工操作的后果，例如：当将其放置在低渗溶液或者留在水池中太长时间会导致角质的肿胀和增大。

表22

结果表示为平均值±SEM。N＝所测定的切片的个数。

只有TG/-HOM相对WT/HOM，和TG/-Het相对WT/HOM分别表现出统计学的显著性差异，P＜0.05*和P＜0.001***(表23)。与同窝出生幼崽对照(WT/HOM和WT/Het)相比，TG/-幼崽展示出腹部角质层厚度的降低。    表23

结果表示为平均值±SEM.N＝所测定的切片的个数

(c)胸廓部分，尾部和腹部的表皮加角质层的平均厚度(μm)

与同窝出生幼崽对照(WT/HOM和WT/Het)相比，TG/-Het幼崽展示了显著增加的表皮厚度和显著降低的角质层厚度，并且TG/-HOM幼崽中产生了相似的结果，不过具有微小的影响(表24)。

表24

结果表示为平均值.N＝幼崽的个数

(d)通过IL-20RA和IL-22RA两者的IL-20的信号转导

表皮是层叠的，持续更新的上皮依赖于细胞间的增殖、分化和死亡的平衡来达到自稳。在正常的表皮中，分裂活跃的基底层提供了终末分化的角质细胞，所述的角质细胞向外移行并且最终作为脱落的鳞片从皮肤表面脱落。角质素和角质化层位于角质层。尽管已知很多种蛋白质在维持表皮自稳方面发挥功能，不过对于这些事件的分子协调知之甚少。IL-20是新型的受体相互作用蛋白质，并且它通过表达在于角质细胞的增殖有关的皮肤层的IL-20RA或者IL-22RA受体(IL-22RA)进行信号转导。

IL-20转基因的幼崽展示了异常的厚度和有光泽的皮肤表型。IL-22RAm(HOM)缺陷小表现出对IL-22处理的无应答，与此相对，带有IL-22RA基因的野生型小鼠用IL-22处理表现出表皮厚度的显著增加(P＜0.001***，参见在IL-22RAm KO/IL-22组织学形态成像分析中的结果，PDD 59.2)。为了研究IL-22RA的缺失是否影响在K14IL-20m TG幼崽(异位地表达IL-20的转基因小鼠，曾与IL-22RA纯合的(HOM)或者IL-22RA杂合的(Het)缺陷型交配)观察到的光滑表型。表皮厚度的定量成像分析先在很少的来自该研究的幼崽的尾部进行(即，19个幼崽，每只幼崽一个切片，共有19张切片)，不过由于所研究的动物的数量有限以及各组间的差异导致所获得结果没有统计学显著性。本研究的目的是组织学性定量更多从相同的研究中的动物的胸廓部分，尾部和腹部的皮肤样品(即，34各幼崽，每只3个切片，共102张切片)以研究IL-20的生物学功能并且获得可靠的定量结果。为了进行有效的成像分析，我们确保石蜡块中的皮肤的位置与所测定的来自幼崽的所有个体和组中的各个相同的位点的皮肤样品一致。

进行了两种类型的测定：(1)对于在每个脊背部的每个皮肤样品的表皮厚度，在每个10X显微镜视野下测定10次，以调查IL-20在接到角质细胞增殖和分化中的作用；(2)用相同的方式测定角质化层或者角质层的厚度，以建立在IL-20TG幼崽中的光滑皮肤的外表与该结果的联系。

表皮厚度的组织学形态成像分析表明TG/-Het幼崽(在背景中表达k14 IL-20m转基因，表达一些来自一个拷贝的IL-22RA基因)展示变厚的表皮，TG/-HOM幼崽(在背景中表达k14 IL-20m转基因，不表达IL-22RA)没有显著变化。相对于缺少两个拷贝的IL-22RA基因的IL-20转基因的幼崽(TG/-HOM，P＝0.001***)、同窝出生幼崽对照(WT/HOM，P＝0.001***和WT/Het，P＝0.001***)，在缺乏一个拷贝的IL-22RA基因(TG/-Het)的IL-20转基因的幼崽中表皮厚度的增加显著。TG/-Het幼崽表现出非角质化的表皮厚度的增加主要是由于棘细胞层的角质细胞增生。TG/-Het幼崽的表皮在厚度上增加大约25％，与此相对，与对照(WT/HOM和WT/Het)相比，TG/-HOM幼崽的表皮仅仅稍微增厚，增加大约4-5％，统计学表明在TG/-HOM和它的对照WT/HOM间无显著性差异(P＞0.05)。

角质层的组织形态学结果表明：不论是否在TG/-Het幼崽中观察导表皮的增厚，都观察到与对照同窝出生的幼崽(WT/HOM和WT/Het)相比，TG/-HOM和TG/-Het皮肤角质素的显著降低或者角质层增厚。而且统计学显示各组间具有显著差异(P＜0.0001****)。相对于TG/-HOM(P＜0.01**)，WT/HOM(P＜0.001***)和WT/Het(P＜0.001***)，TG/-Het幼崽分别表现出大约36％，50％和49％的表皮中的角质素的减少量。TG/-HOM幼崽与它的对照相比，表现出大约22％的角质层厚度的显著减少(WT/HOM，P＜0.05*)，并且相对于WT/Het仅仅减少17％(P＞0.05)。对照幼崽的角质层厚度，也就是WT/HOM和WT/Het中的厚度大致相同。在TG/-HOM和TG/-Het幼崽中的平均角质层厚度的降低对应于在sac中发现的粗糙，在sac中IL-20(TG)/IL-22RA(Het)幼崽的粗糙水平表现为光滑度的降低(例如具有少的角质素)，被称为有光泽，同时IL-20(TG)/TJL-22RA(HOM)幼崽不光滑(例如，具有更多角质素)。

组织学上，TG/-的幼崽的角质层的角质素表现出比WT的幼崽更为紧密。总之，增厚的表皮与增生的角质细胞有关，而且在IL-20转基因幼崽角质薄层可以解释为什么它们展示出光滑的皮肤的表型。在用一个拷贝的IL-22RA基因(Het)靶向敲除的IL-20转基因幼崽中观测到了角质层细胞的增生的增加和终末分化被扰乱。皮肤展示出角质层的增生以及不能充分分化，缺乏角蛋白或者角质层。

两个拷贝的IL-22RA基因(HOM)破坏的IL-20转基因幼崽展示出与TG/-Het皮肤相似的表型，不过表现出的是少而微小的效果(图12-15)。可见IL-22RA(HOM)的缺失在K14 IL-20mTG幼崽中观测到的光滑表型具有一部分效果，并且IL-22RA(Het)的缺失对该光滑表型具有微小或者无效果。换而言之，IL-20作为新型的受体相互作用蛋白质，其通过IL-20RA或者IL-22RA受体(IL-22RA)进行信号转导，IL-20的信号转导有可能通过一个拷贝的IL-22RA基因(Het)的不充分表达而被阻抑，或者通过两个拷贝的IL-22RA基因(HOM)的不充分表达所部分地阻抑。

这些结果提供了有效阻断IL-22RA活性的证据，例如，经过IL-22RA基因敲除或者类似地经过对本发明的IL-22RA的单克隆抗体的中和，将能够相似地减少IL-20所诱导的皮肤效果以及IL-22所诱导的皮肤效果，例如在由IL-20和/或IL-22所诱导的牛皮癣、IBD、结肠炎或者其他炎症性疾病中的皮肤效果。

实施例34

IL-22对IL-22RA敲除小鼠的影响

通过植入带有导管的或单独的微泵皮下给予IL-22或PBS处理36只小鼠，包括23只IL-22RA KO(HOM)和13只对照(WT)(表25)。

表25

获得长1.5-2.5cm厚4.0-5.0mm的每只动物的泵部位的皮肤样品，用于常规组织学检测和组织形态测定成像分析。所有的组织样品被固定于10％中性缓冲的福尔马林中并包埋到石蜡块中。来自于每只动物每个皮肤样品的6段切片(5um厚度和相邻切片间隔10um，表皮覆盖整个表面)被苏木精和伊红(H&E)染色。用Olympus BH-2显微镜、一个摄影机(Dage-MTI，Michigan City，IN)和BioQuant TrueColor windows 98软件(R&M Biometrics，Inc.Nashville，TN 37209)进行皮肤样品的组织形态测定成像分析，设置如下：参数：放大10×，Z off set 0；阵列：长度(um)；检测：手工和附加模式。检测5次表皮的厚度(um)，每次10×显微视野，从每个皮肤切片中心0.4cm共获取4个场(例如，一个10×显微视野＝0.1cm和4个10×显微视野＝0.4cm)。每个动物共有6个切片被检测，用Excel软件计算平均值、SD和SEM。所有切片都采用盲方式随机检测。检测后，切片非盲化，将结果和处理组匹配。处理组的最后的结果按如下归类：1.HOM和WT雄性和雌性小鼠的表皮厚度。2.HOM和WT雄性小鼠的表皮厚度。用GraphPad InStat软件(GraphPad Software，Inc.，San Diego，CA92121)分析结果数据。应用单向方差分析(ANOVA)来检测组1到组4的平均值差别的统计学显著性。应用Tukey-Kramer多重比较检测和Unpaired-T检验来分析两组间平均值的显著性。观察P＜0.05被认为显著。

III.组织形态测定结果

(1)HOM和WT雄性和雌性小鼠的表皮厚度(μm)

和WT/PBS对照相比IL-22处理的WT小鼠(WT/IL-22)皮肤表皮厚度显著增加(P＝0.0001)。和HOM/PBS对照相比IL-22(HOM/IL-22)处理的IL-22RAm KO小鼠皮肤显示表皮厚度平均值增加，但是两组区别没有统计学限制性(P＞0.05)。和WT小鼠相比IL-22RA KO小鼠表皮厚度减少(HOM/IL-22vs.WT/IL-22：P＜0.001)(表26)。

表26

结果表示为平均值±SEM。N＝动物数量

(2)HOM和WT雄性小鼠的表皮厚度(um)

WT/PBS雄性小鼠对照相比，IL-22(WT/IL-22)处理的WT雄性小鼠皮肤表皮厚度大约增长2倍(P＝0.0001)，但是和HOM/PBS雄性对照相比，IL-22(HOM/IL-22)处理的IL-22RAm KO雄性小鼠表皮仅显示轻微增加(P＞0.05)。令人注目的，当和WT雄性小鼠对照相比时，IL-22RAm KO小鼠表皮厚度显示显著的减少(例如HOM/PBS比上WT/PBS：P＜0.05；HOM/IL-22比上WT/IL-22：P＜0.001)(表27)。

表27

结果表示为平均值±SEM。

(3)表皮厚度(HOM和WT小鼠的(um)，雄性vs.雌性)

发现雌性小鼠的表皮比雄性小鼠厚(例如，HOM/IL-22/雄性vs.HOM/IL-22/雌性：P＜0.01；WT/IL-22/雄性vs.WT/IL-22/雌性：P＜0.05)(表28)

表28

结果代表平均值±SEM。

(4)HOM小鼠表皮厚度(μm)，IL-22泵vs.IL-22带导管泵

发现带有IL-22泵和导管的IL-22RAm KO(HOM)小鼠的表皮显著厚于仅有泵的IL-22RAm KO(HOM)小鼠(不成对-T检验P＜0.0001)(表29)

表29

结果表示为平均值±SEM。

M：雄性；F：雌性；N：小鼠总数

IV.讨论：

总之，此实验的目的是表征IL-22处理的IL-22RAm KO小鼠和WT小鼠的皮肤的表皮效果，并将这些发现和临床效果关联。进行定量成像分析来确定H&E染色皮肤切片的表皮厚度。对每只动物的皮肤样品进行120次组织形态测定(例如20次/每个切片×每只小鼠6部分切片＝120次检测)，并用Excel软件计算平均表皮厚度。组织形态测定实验显示，IL-22导致表皮厚度显著增加，尤其是在带有IL-22RA受体的WT小鼠中(P＜0.0001 ANOVA，被认为极端显著)，并且显示在不带有IL-22RA受体的IL-22RAm KO(HOM)小鼠中效果较小或只有一点效果(P＞0.05)。和PBS处理相比，IL-22处理的WT小鼠中表皮厚度增加大约43％(例如WT/PBS，P＜0.001)，但是和对照相比IL-22处理的IL-22RAm KO(HOM)小鼠的表皮厚度仅显示26％的增加(HOM/PBS，P＞0.05)。当和WT小鼠相比时IL-22RAm KO小鼠显示更厚的表皮(P＜0.001)。总之，IL-22对小鼠皮肤的生物效果暗示，这种因子有可能参与调控表皮生长和增殖。

实施例35

抗人IL-20单克隆抗体的药物代谢动力学(克隆#262.7.1.3.2.4)

提供3×3mL分装的检测的单克隆抗体抗人IL-20mAb(克隆#262.7.1.3.2.4)，浓度为1.08mg/mL(用280nM紫外吸收确定)并储存于-80℃直到使用。载体为1×PBS(50mM NaPO4，109mM NaCl)，pH 7.3。使用前室温融化mAb，分装1和2分别用于100μg IV和SC给药组。分装3的一半用1×PBS按1∶2稀释，用于50μg SC给药组，另一半用1×PBS按1∶10稀释用于10μg SC给药组。从Charles River Labs获得雌性SCID小鼠(n＝96)。到达时检查动物的健康并分组饲养(每个笼子3只动物)。实验开始时小鼠12周大，平均体重22g。

A.给药流程

雌性SCID小鼠(n＝24/剂量组)随机分配到4个剂量组(见表30)。组1通过通过尾静脉IV注射给予大约93μL抗huIL-20mAb，组2、3和4通过颈背(scruff)SC注射给予大约93μL mAb。

B.样品收集

在收集血液前，小鼠被氟烷或异氟烷全麻。在除了第168小时时间点(通过眼放血收集，同一只动物在第504小时时间点时通过心脏刺收集血液)以外的所有时间点里通过心脏刺(cardiac stick)收集血液样品。血液被收集到血清分离管中，凝结15分钟。随后样品离心3分钟14,000rpm。离心后，按125-150uL分装到标记的eppendorf管中并立即储存于-80℃，直到分析(表30)

表30

组号	剂量(ROA)	动物	PK时间点
				1	100μg(IV)	3只小鼠/时间点*	0.25，1，4，8，24，72，168，336和504小时
2	100μg(SC)	3只小鼠/时间点*	0.25，1，4，8，24，72，168，336和504小时
				3	50μg(SC)	3只小鼠/时间点*	0.25，1，4，8，24，72，168，336和504小时
4	10μg(SC)	3只小鼠/时间点*	0.25，1，4，8，24，72，168，336和504小时

*在第168小时时间点和第504小时时间点使用相同动物

C.用ELISA定量血清中抗huIL-20mAb浓度

在药物代谢动力学实验中，开发并验证了一种酶联免疫吸附测定法(ELISA)来分析给药抗IL-20mAb 267.7.1.3.2.4的小鼠的血清样品。这个分析方法利用了可购买的二抗和TMB比色法检测的优点。对用于标准曲线的稀释法进行了修改来提高标准曲线线性部分的精确度。可以使用采用2倍稀释的100ng/mL到0.231ng/mL范围的标准曲线来定量小鼠血清样品。QC样品在10％ SCID小鼠血清中被稀释到1∶100，1∶1000和1∶10000，并用标准曲线计算回去。

D.药物代谢动力学分析

血清浓度vs.时间数据被下载到WinNonlin Professional 4.0软件(Pharsight，Inc.；Cary，NC)进行药物代谢动力学分析。根据每个时间点的平均数据采用无房室分析法确定药物代谢动力学参数。

E.结果

100μg IV和100、50和10μg SC给药后平均血清抗人IL-20mAb浓度显示于表31。

表31

时间(小时)	100μg IVConc(μg/mL)	10μg SCConc(μg/mL)	50μg SCConc(μg/mL)	100μg SCConc(μg/mL)
					0.25	196(12)	LTR	0.101(0.065)	0.481(0.485)
1	154(18)	0.356(0.146)	1.61(0.52)	3.48(1.72)
					4	118(20)	2.42(0.53)	10.4(3.4)	19.7(4.7)
8	112(20)	3.41(0.30)	18.9(3.6)	40.2(6.4)
					24	103(13)	4.95(0.05)	26.3(0.7)	50.1(6.2)
72	101(16)	4.27(0.79)	21.0(3.4)	43.4(2.7)
					168	45.6(15.4)	2.92(0.53)	19.6(2.7)	37.6(3.4)
336	36.4(16.6)	3.60(0.31)	23.5(3.5)	34.4(5.8)
					504	28.8(3.8)	2.74(0.39)	20.5(3.6)	25.7(2.1)

LTR：小于值得报告的

IV给药后，mAb浓度vs.时间谱(profile)显示双指数下降。SC给药后，mAb表现出缓慢的吸收期，伴随有限吸收率清除。基于每个时间点的平均数据的血清药物代谢动力学参数见表32：

表32

ND：因为缺乏浓度vs.时间谱的末端清除期的数据无法检测

IV给药后，mAb显示非常慢的清除(Cl＝0.002mL/hr)和长的清除半衰期(t_1/2，λ_z≈21天)。mAb显示稳定状态的分布容量(V_ss＝1.3mL)，小于小鼠的血容量(≈1.7mL)，暗示mAb没有大量分布到血管腔隙之外。回算的最大浓度(C₀)高于基于注射剂量和小鼠血容量的预期。这和小V_ss一起暗示了mAb可能很大程度上被限制在血液的血清部分。

SC给药后，C_max值根据剂量线性增加。在100μg SC剂量下，mAb的t_1/2，λ_z大约为25天并清除，并且表观分布容积和IV给药相近。生物利用度为86％。在两个低剂量SC中，因为缺乏可检测的终端清除期，多数药物动力学参数不能被估计，纵使样品被504小时取得。SC给药后mAb的吸收显示达到稳定状态，在整个实验过程中被清除。

实施例36

在CD4⁺CD45RB^hi(CD25^-)结肠炎和牛皮癣模型中IL-20和IL-22的拮抗剂

A.摘要

转移CD4+CD45RBhi或CD4+CD25-T细胞到同系基因型SCID小鼠导致结肠炎。共转移调控T细胞(CD4+CD25+或CD4+CD45RB¹⁰)抑制这种结肠炎。转移CD4+CD25-T细胞到小鼠后，如果小鼠被增加注射葡萄球菌肠毒素B(SEB)，小鼠不仅发展出结肠炎，还发展出牛皮癣。从细胞转移并且监测到结肠炎和牛皮癣症状后0-21天给予针对IL-22RA、IL-20、IL-22、IL20R和/或IL-22R的抗体或可溶性IL-22RA受体。牛皮癣得分或结肠炎(组织学)的抑制表明，IL-21可以抑制这些自身免疫疾病。

B.实验设计

从B10.D2小鼠中分离脾和腹股沟淋巴结。形成单细胞悬液并计数。使用Miltenyi Bead系统通过阳性选择分选出CD25+细胞。细胞按1∶100稀释用CD25-PE(BD Pharmingen)染色，并孵育15分钟。清洗掉过量抗体并将细胞和10ul抗PE珠/10⁶细胞孵育20分钟。细胞用PBS清洗并通过LS柱(Miltenyi Biotech)。通过柱(CD25-)的细胞被保存用于进一步的分析。加入CD4富集鸡尾酒(Stem Celltechnologies)(1∶100)到这些CD25-中并孵育15分钟。细胞用PBS清洗。加入1∶10稀释的抗生物素四聚体到细胞中，15分钟，随后加入磁性胶体(60u l/10⁶细胞)，15分钟(所有都来自于Stem CellTechnologies)。细胞通过负选择柱(0.5″，Stem cell Technologies)。通过柱的细胞是CD4+CD25-细胞。用流式细胞计量技术分析纯度。0.4×10⁶细胞被i.v注射到天然CB-17 SCID小鼠中，总体积200μl。转天(第1天)，小鼠被i.p注射10Dg SEB。从第2-5周跟踪牛皮癣和结肠炎的症状。按如下标准对小鼠牛皮癣疾病打分：0-没有损伤，1-颈部轻微损伤，2-颈部和背部严重损伤(躯干)，3-小鼠颈部、背部和腹部非常严重的损伤。还测量耳朵厚度来测定疾病严重程度。从第1-30天，不同组小鼠按不同给药安排(3X/周或2X/周)被i.p.注射的PBS、100Dg对照抗体或10-100Dg针对IL-22RA、IL-20、IL-22、IL-20R或IL-22R的抗体或可溶性IL-22RA。

C.结果和结论

在抗体处理的小鼠中牛皮癣和结肠炎症状的抑制表明，抑制IL-20和/或IL-22的功能能抑制这种牛皮癣和结肠炎模型的自身免疫症状。

实施例37

SCID-hu移植牛皮癣模型中IL-20和IL-22拮抗剂

人牛皮癣皮肤移植到SCID小鼠能在数周内维持临床、光学显微镜和免疫组化的牛皮癣特征。这个模型提供了一个系统，用于评价试图恢复损伤组织到正常表型的疗法。一旦人类皮肤被成功移植，针对IL-22RA、IL-20、IL-22、IL-20R和/或L-22R或可溶性IL-20或IL-22受体的抗体就可施用数周，并分析表皮厚度来评价这些拮抗剂对牛皮癣的效果。

B.实验设计

从健康成人志愿者和牛皮癣受损皮肤中获取含有全部表皮和几mm真皮的全厚度6-mm的钻取活组织切片。从每个供体获得4到6个活组织切片。从每个供体获得的一个钻取活组织切片被移植到受体SCID小鼠(CB-17，Taconic)的背面。动物维持在无病原体环境中。在成功移植(移植后2-3周)后开始按照如下进行治疗：一个活组织切片用作阴性对照(PBS或同种型mAb)，一个活组织切片用作阳性对照(Cyclosporin A)，2-3个活组织切片用抗人IL-22RA、抗人IL-20、抗人IL-22mAb或IL-20或IL-22的可溶性受体处理(腹腔内注射，按照M-W-F计划表每周3次，连续2-4周)。

C.定量分析：

在整个实验过程中进行有规则的临床观察和评价，并记录。以盲的方式按有鳞屑、硬化、红斑对牛皮癣损伤的严重程度进行评价。用3分量表对参数记分：0＝完全缺乏表皮参与；1＝轻微参与；2＝中度参与；3＝严重参与。在给药期终点，所有动物被处死并收集组织，用于组织学和免疫组化分析。(1)部分组织固定于10％福尔马林中并用苏木精和伊红染色。用NIH成像软件检测表皮区域，作为每单位长度表皮厚度的改变的公式。对每个移植物的多个区域进行定量来提供高n值和平均表皮区域。(2)上真皮中每个高倍视野中炎性单核细胞的数量(0.103×0.135mm)；(3)角化不全的等级被归为0到3级，其中0是没有角化不全，1是角化不全小于切片三分之一，2是角化不全大于切片三分之一，但是小于三分之二，3是角化不全大于切片三分之二。(4)组织剩余部分将被染色Ki67(增殖的角质化细胞的标志)，来评估每毫米长度切片中Ki67循环角质化细胞的数量。通过表皮厚度来检测减少的牛皮癣严重程度，表明中和IL-20和IL-22的功能在这种牛皮癣模型中能是有效的。为了定量减少的牛皮癣严重程度，我们测定了表皮厚度，上真皮炎症细胞的数量，Ki67循环角质化细胞的数量和角化不全的等级。和对照小鼠相比，处理组所有4个参数都显著减少，表明IL-20、IL-22拮抗剂具有潜在的治疗用途。

实施例38

用BaF3/IL-22RA/IL-20RB细胞用Alamar蓝增殖检测筛选IL-20拮抗剂活性

依赖因子的前B细胞系BaF3被共转染IL-22RA和IL-22RB(参见，实施例3的方法)，并用不同浓度的IL-20处理。用alamar蓝测定法(如实施例3所述)检测增殖。在期望的细胞因子浓度下，IL-20以剂量依赖方式刺激增殖。表明IL-20在期望的细胞因子浓度下结合和激活异二聚体的IL-22RA/IL-20RB受体包括未转染的BaF3在内的阴性对照不增殖。

为了确定抗IL-22RA抗体是否能拮抗IL-20活性，使用抗IL-22RA抗体作为IL-20活性拮抗剂进行如上所述的检测。当IL-20和这种拮抗剂结合时，对IL-20的应答被减少到背景水平。拮抗剂的存在能消除或减少IL-20的增殖效果表明，它是一种IL-20配体拮抗剂。这个检测能用于检测如此所述的其它IL-20活性拮抗剂，例如拮抗剂多肽，包括可溶性IL-22RA受体。

实施例39

通过抗huL22RA单克隆抗体中和IL-20和IL-22活性

使用如实施例28所述的基于细胞的中和检测，加入纯化的小鼠抗huIL-22RA单克隆抗体(实施例30(D))作为系列稀释，例如10ug/ml、5ug/ml、2.5ug/ml、1.25ug/ml、625ng/ml、313ng/ml、156ng/ml和78ng/ml。检测板在37℃，5％CO₂中孵育4天，第4天时加入AlamarBlue(Accumed，Chicago，IL)201/孔。板再次孵育在37℃，5％CO₂中16小时。结果显示，纯化的抗huIL-22RA单克隆抗体能通过huIL-22RA中和huIL-22和huIL-20的信号。在10ug/ml浓度下，抗体完全中和huIL-22或huIL-20诱导的增殖，在较低浓度下对增殖的抑制以剂量依赖的方式下降。在上述浓度下检测一种同种型匹配的阴性对照小鼠mAb，对任一细胞因子的增殖都没有抑制作用。这些结果进一步表明，IL-22RA的单克隆抗体在低浓度下确实能拮抗促炎性配体、IL-20和IL-22的活性。

这些结果提供了另外的证据，即有效阻断IL-22RA的活性(例如通过本发明的IL-22RA中和单克隆抗体)能方便的阻断、抑制、减少、拮抗或中和IL-20和IL-22的体内效果(单独或一起)，并有可能减少IL-20和/或IL-22诱导的炎症，例如在IL-20诱导的皮肤效果和IL-22诱导的皮肤效果中所见，例如牛皮癣、炎性肠病或其它IL-20和/或IL-22诱导的炎性疾病包括炎性肠病、关节炎、哮喘、牛皮癣性关节炎、结肠炎、炎性皮肤症状和特应性皮炎。

实施例40

用中和的抗IL-22RA单克隆抗体处理怀孕的IL-20和IL-22转基因小鼠

为了检测大鼠抗小鼠IL-22RA单克隆抗体(mAb)在体内的中和活性，怀孕的IL-20转基因(TG)和IL-22Tg小鼠被腹膜内注射抗小鼠IL-22RA mAb。随后评价新生幼崽存在或不存在“有光泽”皮肤表型，通常用所述表型表征这些种系的小鼠。

特别的，雄性IL-20Tg(用keratin-14产生)或IL-22Tg(使用胰岛素启动子)小鼠和动情期的C57BL/6N雌性小鼠繁殖育种，随后的时间里通过存在阴道塞来鉴定育种的雌性。每只怀孕雌鼠被留出到独立的笼子中，并且每天监测。考虑到对Tg和非Tg幼崽进行统计学显著性分析，每个处理组至少包括4只怀孕雌鼠。基于以前对这些Tg小鼠的经验，每窝大约有6到8只幼崽，其中2到3只是Tg+。

小鼠育种后的7到9天(胚龄7-9；e7-9)，雌鼠被腹膜内注射溶于200-250ul的PBS中的250-500ug大鼠抗小鼠IL-22RA mAb(大鼠IgG2a同种型)。使用短针头浅注射角度来避免直接注射到子宫。采用此法对怀孕雌鼠进行一周3天注射(周1、周3和周5)，连续2周(直到生产)，来成功进入发育中的胚胎。对照组(每组不少于4只怀孕雌鼠)包括如下：同种型对照大鼠IgG2a mAb，抗人/小鼠IL-22mAb(大鼠IgG1同种型)，和一个同种型对照大鼠IgG1 mAb。作为鼠IL-20中和的对照，怀孕雌鼠被注射能结合并中和人和鼠IL-20的可溶性IL-20R-Fc4融合蛋白，或者被注射一种Fc4对照蛋白。

从出生后第1天到第2天，近距离监测幼崽的皮肤光泽表型。在第2天，处死幼崽收集部分尾用于分离DNA来检测每只幼崽的基因型(Tg或非Tg)。收集皮肤样品用于组织学分析，来评价幼崽是否表现增厚的表皮细胞层，通常用所述增厚的表皮细胞层表征这些Tg小鼠。还收集幼崽的躯干血液(出生1天后从眼取血)，通过ELISA对每只小鼠血清中的抗IL-22RA mAb的水平进行定量。因为这些mAbs是IL-20和/或IL-22的潜在的体内抑制剂，Tg幼崽拥有正常的皮肤(例如没有皮肤增厚或“有光泽”表型)。

实施例41

在器官培养牛皮癣模型中IL-20和IL-22拮抗剂

人牛皮癣斑点皮肤能在器官培养中维持，并且在缺乏外源生长因子时受损皮肤的异常组织学特征被保留。能给予针对IL-22RA，IL-20，IL-22，IL20R和/或IL-22R的抗体或可溶性IL-20或IL-22受体，牛皮癣受损皮肤的组织学特征能被改善。

B.实验设计

从健康成人志愿者和牛皮癣受损皮肤中获取含有全部表皮和几mm真皮的全厚度2-mm的钻取活组织切片。钻取活组织切片后立即浸入包括角质化细胞基础培养基(KBM)(Clonetics Inc，Walkersville，MD)的培养基中。培养基补充加入CaCl₂使Ca²⁺终浓度达到1.4mM(Varaniet al，1993，1994)。随后，活组织切片在含有200ul补Ca2+的KBM的96孔板中培养，进行或不进行额外的针对IL-20，IL-22，IL-22RA的抗体或IL-20或IL-22的可溶性受体的处理。在37℃95％空气和5％CO₂中培养8天。

C.定量分析：

在培养期结束时，组织被固定于10％缓冲的福尔马林中，用苏木精和伊红染色后进行组织学检测。接触抗体或可溶性受体的牛皮癣组织的形态更接近正常组织，包括如下观察：最初紊乱的、不规则形状的基底上皮细胞发展为恢复极性的更加圆柱状的形态；表皮突退化，在更少区域内表皮细胞伸展到真皮空间；上表皮层综合退化更少。器官培养模型提供了一个快速灵敏的方法，确定某种化合物是否具有潜在的作为抗过度增殖试剂的能力。在存在IL-20、IL-22拮抗剂的情况下，异常的组织学形态被改善，暗示了这种试剂在治疗牛皮癣中的效果。

实施例42

定位结合中和mAbs R2.1.5F4.1和R2.1.15E2.1的mIL22RA(zCytoR11m)区域

A.小鼠IL-22RA上的中和单克隆抗体结合的表位

下述实验的目的是确定对受体活性或对拮抗剂或中和抗体结合重要的小鼠IL-22RA可溶性受体蛋白(SEQ ID NO：62)的一个区域或多个区域的氨基酸序列。以前用凝血酶切割去除Fc的小鼠IL-22RA-Fc蛋白和溴化氰(CNBr)孵育，切除C末端到达序列中的蛋氨酸残基。CNBr产生的肽是片段化的，用带有中和活性的单克隆抗体克隆R2.1.5F4.1和克隆R2.1.15E2.1通过ELISA检测片段的结合活性，通过蛋白印记分析反应性。

用CNBr切割，有可能从非还原的全长mIL-22RA产生如下的肽(表33)。在非还原条件下，半胱氨酸形成二硫键，会导致肽1形成内部交联和肽3与肽5之间形成交联。粗体字形的残基有可能参与配体结合，对应于在SEQ ID NO：2或SEQ ID NO：3中有可能参与配体结合的人IL-22RA残基，如实施例42B所述。特别的，SEQ ID NO：48对应于SEQ ID NO：42的氨基酸残基16(组氨酸)到83(蛋氨酸)；SEQ ID NO：49对应于SEQ ID NO：42的氨基酸残基84(谷氨酸)到109(蛋氨酸)；SEQ ID NO：50对应于SEQ ID NO：42的氨基酸残基110(苏氨酸)到137(蛋氨酸)，SEQ ID NO：51对应于SEQ ID NO：42的氨基酸残基138(亮氨酸)到177(蛋氨酸)，SEQ ID NO：52对应于SEQ ID NO：42的氨基酸残基的163(组氨酸)到208(脯氨酸)或SEQ ID NO：62的氨基酸残基163(组氨酸)到212(精氨酸)。

表33

1.CNBr切割和分离肽片段

50μg的mIL22RA低压冻干并重新溶解到180μL甲酸(70％)中。加入1μL溶解于乙腈的5M CNBr。混合样品并在室温在黑暗中反应18小时。采用分析型Zorbax SB 300-C8柱对150μL反应混合物进行反向高效液相色谱分离。采用起始为25％乙腈(0.085％TFA)和75％水(0.1％TFA)结束为95％乙腈(0.085％TFA)和5％水(0.1％TFA)的梯度分离峰。紫外检测显示3个主要峰和2个小峰，收集。每个分离组分都被分为两部分；一部分进行ELISA，另一部分被低压冻干并重新溶解到150μL磷酸盐缓冲液(PBS)中。对PBS组分进行紫外分析证实回收了所有的从分析柱收集的峰。PBS组分用于蛋白印记分析。

2.ELISA

用HPLC缓冲液(90％乙腈，10％H₂O，0.09％三氟醋酸)将含有来自于用CNBr切割的IL-22RA的肽序列的HPLC组分稀释到估计相等的浓度。样品转到96孔微量滴定板上的4个孔中，100DL/孔，室温下在通风橱中干燥过夜。用ELISA C缓冲液(PBS，0.05％吐温20)清洗板，随后用ELISA B缓冲液(PBS，0.1％BSA，0.05％吐温20)封闭37℃2小时。IL22RA的两个单克隆抗体(mAb)(克隆R2.1.5F4.1和克隆R2.1.15E2.1)被ELISA B稀释到2Dg/mL。将每种mAb加入到每个肽序列样品中，100DL/孔，板在37℃孵育60分钟。清洗板来去除为结合的抗体，二抗(山羊抗大鼠IgG交联辣根过氧化物酶(Jackson))被ELISA B缓冲液稀释到1Dg/mL并加入到所有的孔中，100DL/孔。板在37℃孵育1小时。用ELISA C缓冲液清洗孔，随后和TMB 1 Component HRP Microwell Substrate(BioFx)一起孵育5分钟。加入450nm TMB Microwell(BioFx)的Stop Reagent来终止反应，在Dynatech ELISA板读出器(Molecular Devices)上以450nm光吸收读取板数据。

结果表明mAb R2.1.5F4.1和mIL22RA CNBr反应的HPLC组分#4发生反应，并且在蛋白印记实验中也产生了一个条带。

3.蛋白印记

含有来自于用CNBr切割的IL22RA的肽序列的HPLC组分被室温下低压冻干过夜，并重新溶解于PBS。随后样品和非还原性样品缓冲液(Invitrogen)混合并煮沸10分钟。上样到4-12％Bis-Tris凝胶(Invitrogen)上，并1x MES-SDS Running Buffer(Invitrogen)进行SDS-PAGE电泳，并且在20％甲醇转移缓冲液下转移到硝化纤维(0.2Dm；Bio-Rad)上，所有操作在室温下进行。可以在室温下干燥过夜滤膜。室温下，用含10％脱脂奶粉的缓冲液A(50mM Tris，pH 7.4，5mM EDTA，0.05％I gepa l CA-630，150mM NaCl，0.25％明胶)封闭滤膜30分钟。IL22RA的一个单克隆抗体(mAb)(克隆R2.1.5F4.1)被含有2.5％脱脂奶粉的缓冲液A稀释为2Dg/mL。印记在这种基本抗体下室温孵育1小时。孵育后，用缓冲液A清洗印记3次，并和含有2.5％脱脂奶粉的缓冲液A按1∶5000稀释的二抗(山羊抗大鼠IgG交联辣根过氧化物酶；Jackson，Inc)一起在室温下孵育1小时。随后清洗印记，和化学发光底物显影(Lumi-Light Western BlottingSubstra te；Roche)，并用荧光成像仪(Mannheim Boehringer Lumi-Imager)曝光。

采用30分钟曝光，4号和5号级分在非还原性凝胶中显示非常强的条带，3号级分显示一个模糊条带。4号级分还在ELISA检测中呈阳性。

活性组分4号级分的N端测序

在从分析型反向柱收集的5个CNBr肽片段中，4号级分在ELISA显示活性并在蛋白印记分析中也是阳性。为了确定有活性的4号级分中的肽，采用已知方法对样品进行Edman降解。鉴定出活性组分的3个N端，和肽2(SEQ ID NO：49)、肽3(SEQ ID NO：50)和肽5(SEQID NO：52)相符。这些结果表明抗体结合到肽2(SEQ ID NO：49)、肽3(SEQ ID NO：50)和肽5(SEQ ID NO：52)上。

表34

Edman降解	N-末端序列	肽鉴定
			获自4号级分的第一序列CNBr产生的mIL22RA序列	HLEGK QREYE FLGLTPDTEFHLEGK QREYE FLGLTPDTEF LGSIT ILTPILSKES APYVC RVKTLPLVPR(SEQ ID NO：53)	CNBr肽5(SEQ ID NO：52)
获自4号级分的第二序列CNBr产生的mIL22RA序列	ETRNH TEFYY AKVTAVSAGGETRNH TEFYY AKVTAVSAGG PPVTK M(SEQ ID NO：54)	CNBr肽2(SEQ ID NO：49)
			获自4号级分的第三序列CNBr产生的mIL22RA序列	TDRFS XLQHT XIXPXDXXXITDRFS SLQHT TIKPPDVTCI PKVRS IQM(SEQID NO：55)	CNBr肽3(SEQ ID NO：50)

讨论

从CNBr切割的mIL22RA肽的混合物中分离了5个组分，其中只有组分#4在ELISA中有活性并在蛋白印记中呈阳性。Edman降解鉴定出3个N端，和4号级分中的CNBr肽2(SEQ ID NO：49)、肽3(SEQ IDNO：50)和肽5(SEQ ID NO：52)相符。在这些部位中，6个残基有可能参与配体结合。这些残基是SEQ ID NO：42的Y93、R112K210和E211，同样也和SEQ ID NO：62中残基Y78、R97、K195和E196相符；SEQ ID NO：42中的残基Y60和F164也参与配体结合。

B.中和单克隆抗体结合的人IL-22RA的表位。

下述实验的目的是确定对受体活性或拮抗或中和抗体结合重要的人IL-22RA蛋白(SEQ ID NO：2)细胞外结构域中的一个区域或多个区域的氨基酸序列。通过和溴化氰(CNBr)或本领域已知的能切割人类蛋白为确定片段的其它试剂孵育，从C端切割人可溶性受体IL-22RA蛋白(例如，包括SEQ ID NO：3，例如凝血酶切割以去除Fc的IL-22RA-Fc)到序列中的蛋氨酸残基。CNBr产生的肽是片段化的，用带有中和活性的单克隆抗体通过ELISA检测结果片段的结合活性，通过蛋白印记分析反应性。

预测4个半胱氨酸形成二硫键，连接方式为SEQ ID NO：2的半胱氨酸71-半胱氨酸79和半胱氨酸204-半胱氨酸217。用CNBr切割，有可能从非还原的全长IL-22RA产生如下的肽：肽6(SEQ ID NO：56)、肽7(SEQ ID NO：57)；肽8(SEQ ID NO：58)；肽9(SEQ ID NO：59)；肽10(SEQ ID NO：60)；和肽11(SEQ ID NO：61)(表35)。半胱氨酸形成二硫键，导致肽7(SEQ ID NO：57)和肽10(SEQ ID NO：60)之间可能的连接。特定的，SEQ ID NO：56与SEQ ID NO：3的氨基酸残基1(脯氨酸)到92(蛋氨酸)相符；SEQ ID NO：57与SEQ ID NO：3的氨基酸残基93(苏氨酸)到120(蛋氨酸)相符；SEQ ID NO：58与SEQID NO：3的氨基酸残基121(异亮氨酸)到160(蛋氨酸)相符；SEQ IDNO：59与SEQ ID NO：3的氨基酸残基161(组氨酸)到185(蛋氨酸)相符；SEQ ID NO：60与SEQ ID NO：3的氨基酸残基186(异亮氨酸)到199(蛋氨酸)相符；SEQ ID NO：61与SEQ ID NO：3的氨基酸残基200(半胱氨酸)到211(苏氨酸)相符。

表35

肽编号	从	至	序列
				CNBr肽6	1	92	Pro Glu Asp Pro Ser Asp Leu Leu Gln His ValLys Phe Gln Ser Ser Asn Phe Glu Asn Ile LeuThr Trp Asp Ser Gly Pro Glu Gly Thr Pro AspThrVal Tyr Ser Ile Glu Tyr Lys Thr Tyr Gly GluArg Asp Trp Val Ala Lys Lys Gly Cys Gln ArgIle Thr Arg Lys Ser Cys Asn Leu Thr Val GluThr Gly Asn Leu Thr Glu Leu Tyr Tyr Ala ArgVal Thr Ala Val Ser Ala Gly Gly Arg Ser AlaThr Lys Met(SEQ ID NO：56)
CNBr肽7	93	120	Thr Asp Arg Phe Ser Ser Leu Gln His Thr ThrLeu Lys Pro Pro Asp Val Thr Cys Ile Ser Lys ValArg Ser Ile Gln Met(SEQ ID NO：57)
				CNBr肽8	121	160	Ile Val His Pro Thr Pro Thr Pro Ile Arg Ala GlyAsp Gly His Arg Leu Thr Leu Glu Asp Ile PheHis Asp Leu Phe Tyr His Leu Glu Leu Gln ValAsn Arg Thr Tyr Gln Met(SEQ ID NO：58)
CNBr肽9	161	185	His Leu Gly Gly Lys Gln Arg Glu Tyr Glu PhePhe Gly Leu Thr Pro Asp Thr Glu Phe Leu GlyThr Ile Met(SEQ ID NO：59)
				CNBr肽10	186	199	Ile Cys Val Pro Thr Trp Ala Lys Glu Ser Ala ProTyr Met(SEQ ID NO：60)
CNBr肽11	200	211	Cys Arg Val Lys Thr Leu Pro Asp Arg Thr TrpThr(SEQ ID NO：61)

4.CNBr切割和分离肽片段，蛋白印记和ELISA和N末端测序

大约50μg人IL22RA低压冻干并重新溶解，片段化，收集并用蛋白印记和ELISA分析(如实施例42A所述)，来鉴定含有抗IL-22RA单克隆抗体的并且如ELISA和蛋白印记所示能结合IL-22RA的片段。从分析型反向柱收集的CNBr肽片段，随后用ELISA检测活性，并用蛋白印记验证。对于阳性片段，采用已知的方法通过Edman降解来鉴定肽。

讨论

小鼠CNBr 5号肽级分(SEQ ID NO：52)和人CNBr肽9号和10号(SEQ ID NO：59和SED ID NO：60)相符；小鼠CNBr肽2号(SEQ ID NO：49)和人CNBr肽6号(SEQ ID NO：56)相符；小鼠CNBr肽3号(SEQ IDNO：50)和人CNBr肽7号(SEQ ID NO：57)相符。在从CNBr切割的人IL-22RA肽混合物中分离的片段中，在可能的区域中6个残基有可能参与配体结合：对配体-受体结合重要的SEQ ID NO：2的残基(和SEQ IDNO：3的相对应残基)包括SEQ ID NO：2中的酪氨酸-60和苯丙氨酸-164、酪氨酸-93、精氨酸-112、赖氨酸-210和谷氨酸-211和(和SEQID NO：3的相对应残基)。另外，对指导配体-受体结合重要的SEQ IDNO：2的基本残基(和SEQ ID NO：3的相对应残基)包括SEQ ID NO：2的酪氨酸-60和苯丙氨酸-164，(和SEQ ID NO：3的相对应残基)，残基酪氨酸-93、精氨酸-112、赖氨酸-210和谷氨酸-211 of SEQ ID NO：2和(和SEQ ID NO：3的相对应残基)。

根据上述内容，要认识到，尽管此处已描述了用于说明目的的本发明的特定实施方案，但其可产生各种变化而不背离本发明的精神和范围。因此，本发明除了受所附的权利要求限定外不受其他限定。

序列表

<110>ZymoGenetics公司等

<120>抗IL-22RA抗体和结合伴侣及其用于炎症的方法

<130>04-14PC

<150>

<151>

<150>

<151>

<160>62

<170>FastSEQ for Windows Version 4.0

<210>1

<211>2831

<212>DNA

<213>智人(Homo sapiens)

<220>

<221>CDS

<222>(34)...(1755)

<400>1

tagaggccaa gggagggctc tgtgccagcc ccg atg agg acg ctg ctg acc atc  54

                                       Met Arg Thr Leu Leu Thr Ile

                                        1                5

ttg act gtg gga tcc ctg gct gct cac gcc cct gag gac ccc tcg gat    102

Leu Thr Val Gly Ser Leu Ala Ala His Ala Pro Glu Asp Pro Ser Asp

         10                  15                    20

ctg ctc cag cac gtg aaa ttc cag tcc agc aac ttt gaa aac atc ctg    150

Leu Leu Gln His Val Lys Phe Gln Ser Ser Asn Phe Glu Asn Ile Leu

     25                   30                   35

acg tgg gac agc ggg cca gag ggc acc cca gac acg gtc tac agc atc    198

Thr Trp Asp Ser Gly Pro Glu Gly Thr Pro Asp Thr Val Tyr Ser Ile

 40                   45                   50                   55

gag tat aag acg tac gga gag agg gac tgg gtg gca aag aag ggc tgt    246

Glu Tyr Lys Thr Tyr Gly Glu Arg Asp Trp Val Ala Lys Lys Gly Cys

                  60                   65                   70

cag cgg atc acc cgg aag tcc tgc aac ctg acg gtg gag acg ggc aac    294

Gln Arg Ile Thr Arg Lys Ser Cys Asn Leu Thr Val Glu Thr Gly Asn

              75                   80                  85

ctc acg gag ctc tac tat gcc agg gtc acc gct gtc agt gcg gga ggc    342

Leu Thr Glu Leu Tyr Tyr Ala Arg Val Thr Ala Val Ser Ala Gly Gly

         90                   95                   100

cgg tca gcc acc aag atg act gac agg ttc agc tct ctg cag cac act    390

Arg Ser Ala Thr Lys Met Thr Asp Arg Phe Ser Ser Leu Gln His Thr

    105                  110                  115

acc ctc aag cca cct gat gtg acc tgt atc tcc aaa gtg aga tcg att    438

Thr Leu Lys Pro Pro Asp Val Thr Cys Ile Ser Lys Val Arg Ser Ile

120                  125                  130                  135

cag atg att gtt cat cct acc ccc acg cca atc cgt gca ggc gat ggc    486

Gln Met Ile Val His Pro Thr Pro Thr Pro Ile Arg Ala Gly Asp Gly

                 140                  145                  150

cac cgg cta acc ctg gaa gac atc ttc cat gac ctg ttc tac cac tta    534

His Arg Leu Thr Leu Glu Asp Ile Phe His Asp Leu Phe Tyr His Leu

            155                  160                  165

gag ctc cag gtc aac cgc acc tac caa atg cac ctt gga ggg aag cag    582

Glu Leu Gln Val Asn Arg Thr Tyr Gln Met His Leu Gly Gly Lys Gln

        170                  175                  180

aga gaa tat gag ttc ttc ggc ctg acc cct gac aca gag ttc ctt ggc    630

Arg Glu Tyr Glu Phe Phe Gly Leu Thr Pro Asp Thr Glu Phe Leu Gly

    185                  190                  195

acc atc atg att tgc gtt ccc acc tgg gcc aag gag agt gcc ccc tac    678

Thr Ile Met Ile Cys Val Pro Thr Trp Ala Lys Glu Ser Ala Pro Tyr

200                  205                  210                  215

atg tgc cga gtg aag aca ctg cca gac cgg aca tgg acc tac tcc ttc    726

Met Cys Arg Val Lys Thr Leu Pro Asp Arg Thr Trp Thr Tyr Ser Phe

                 220                  225                  230

tcc gga gcc ttc ctg ttc tcc atg ggc ttc ctc gtc gca gta ctc tgc    774

Ser Gly Ala Phe Leu Phe Ser Met Gly Phe Leu Val Ala Val Leu Cys

            235                  240                  245

tac ctg agc tac aga tat gtc acc aag ccg cct gca cct ccc aac tcc    822

Tyr Leu Ser Tyr Arg Tyr Val Thr Lys Pro Pro Ala Pro Pro Asn Ser

        250                  255                  260

ctg aac gtc cag cga gtc ctg act ttc cag ccg ctg cgc ttc atc cag    870

Leu Asn Val Gln Arg Val Leu Thr Phe Gln Pro Leu Arg Phe Ile Gln

    265                  270                  275

gag cac gtc ctg atc cct gtc ttt gac ctc agc ggc ccc agc agt ctg     918

Glu His Val Leu Ile Pro Val Phe Asp Leu Ser Gly Pro Ser Ser Leu

280                  285                  290                  295

gcc cag cct gtc cag tac tcc cag atc agg gtg tct gga ccc agg gag     966

Ala Gln Pro Val Gln Tyr Ser Gln Ile Arg Val Ser Gly Pro Arg Glu

                 300                  305                  310

ccc gca gga gct cca cag cgg cat agc ctg tcc gag atc acc tac tta    1014

Pro Ala Gly Ala Pro Gln Arg His Ser Leu Ser Glu Ile Thr Tyr Leu

            315                  320                  325

ggg cag cca gac atc tcc atc ctc cag ccc tcc aac gtg cca cct ccc    1062

Gly Gln Pro Asp Ile Ser Ile Leu Gln Pro Ser Asn Val Pro Pro Pro

        330                  335                  340

cag atc ctc tcc cca ctg tcc tat gcc cca aac gct gcc cct gag gtc    1110

Gln Ile Leu Ser Pro Leu Ser Tyr Ala Pro Asn Ala Ala Pro Glu Val

    345                  350                  355

ggg ccc cca tcc tat gca cct cag gtg acc ccc gaa gct caa ttc cca    1158

Gly Pro Pro Ser Tyr Ala Pro Gln Val Thr Pro Glu Ala Gln Phe Pro

360                  365                  370                  375

ttc tac gcc cca cag gcc atc tct aag gtc cag cct tcc tcc tat gcc    1206

Phe Tyr Ala Pro Gln Ala Ile Ser Lys Val Gln Pro Ser Ser Tyr Ala

                 380                  385                  390

cct caa gcc act ccg gac agc tgg cct ccc tcc tat ggg gta tgc atg    1254

Pro Gln Ala Thr Pro Asp Ser Trp Pro Pro Ser Tyr Gly Val Cys Met

            395                  400                  405

gaa ggt tct ggc aaa gac tcc ccc act ggg aca ctt tct agt cct aaa    1302

Glu Gly Ser Gly Lys Asp Ser Pro Thr Gly Thr Leu Ser Ser Pro Lys

        410                  415                  420

cac ctt agg cct aaa ggt cag ctt cag aaa gag cca cca gct gga agc    1350

His Leu Arg Pro Lys Gly Gln Leu Gln Lys Glu Pro Pro Ala Gly Ser

    425                  430                  435

tgc atg tta ggt ggc ctt tct ctg cag gag gtg acc tcc ttg gct atg    1398

Cys Met Leu Gly Gly Leu Ser Leu Gln Glu Val Thr Ser Leu Ala Met

440                  445                  450                  455

gag gaa tcc caa gaa gca aaa tca ttg cac cag ccc ctg ggg att tgc    1446

Glu Glu Ser Gln Glu Ala Lys Ser Leu His Gln Pro Leu Gly Ile Cys

                460                  465                  470

aca gac aga aca tct gac cca aat gtg cta cac agt ggg gag gaa ggg    1494

Thr Asp Arg Thr Ser Asp Pro Asn Val Leu His Ser Gly Glu Glu Gly

            475                  480                  485

aca cca cag tac cta aag ggc cag ctc ccc ctc ctc tcc tca gtc cag    1542

Thr Pro Gln Tyr Leu Lys Gly Gln Leu Pro Leu Leu Ser Ser Val Gln

        490                  495                  500

atc gag ggc cac ccc atg tcc ctc cct ttg caa cct cct tcc ggt cca    1590

Ile Glu Gly His Pro Met Ser Leu Pro Leu Gln Pro Pro Ser Gly Pro

    505                  510                  515

tgt tcc ccc tcg gac caa ggt cca agt ccc tgg ggc ctg ctg gag tcc    1638

Cys Ser Pro Ser Asp Gln Gly Pro Ser Pro Trp Gly Leu Leu Glu Ser

520                  525                  530                  535

ctt gtg tgt ccc aag gat gaa gcc aag agc cca gcc cct gag acc tca    1686

Leu Val Cys Pro Lys Asp Glu Ala Lys Ser Pro Ala Pro Glu Thr Ser

                540                  545                  550

gac ctg gag cag ccc aca gaa ctg gat tct ctt ttc aga ggc ctg gcc  1734

Asp Leu Glu Gln Pro Thr Glu Leu Asp Ser Leu Phe Arg Gly Leu Ala

            555                  560                  565

ctg act gtg cag tgg gag tcc tgaggggaat gggaaaggct tggtgcttcc     1785

Leu Thr Val Gln Trp Glu Ser

        570

tccctgtccc tacccagtgt cacatccttg gctgtcaatc ccatgcctgc ccatgccaca 1845

cactctgcga tctggcctca gacgggtgcc cttgagagaa gcagagggag tggcatgcag 1905

ggcccctgcc atgggtgcgc tcctcaccgg aacaaagcag catgataagg actgcagcgg 1965

gggagctctg gggagcagct tgtgtagaca agcgcgtgct cgctgagccc tgcaaggcag 2025

aaatgacagt gcaaggagga aatgcaggga aactcccgag gtccagagcc ccacctccta 2085

acaccatgga ttcaaagtgc tcagggaatt tgcctctcct tgccccattc ctggccagtt 2145

tcacaatcta gctcgacaga gcatgaggcc cctgcctctt ctgtcattgt tcaaaggtgg 2205

gaagagagcc tggaaaagaa ccaggcctgg aaaagaacca gaaggaggct gggcagaacc 2265

agaacaacct gcacttctgc caaggccagg gccagcagga cggcaggact ctagggaggg 2325

gtgtggcctg cagctcattc ccagccaggg caactgcctg acgttgcacg atttcagctt 2385

cattcctctg atagaacaaa gcgaaatgca ggtccaccag ggagggagac acacaagcct 2445

tttctgcagg caggagtttc agaccctatc ctgagaatgg ggtttgaaag gaaggtgagg 2505

gctgtggccc ctggacgggt acaataacac actgtactga tgtcacaact ttgcaagctc 2565

tgccttgggt tcagcccatc tgggctcaaa ttccagcctc accactcaca agctgtgtga 2625

cttcaaacaa atgaaatcag tgcccagaac ctcggtttcc tcatctgtaa tgtggggatc 2685

ataacaccta cctcatggag ttgtggtgaa gatgaaatga agtcatgtct ttaaagtgct 2745

taatagtgcc tggtacatgg gcagtgccca ataaacggta gctatttaaa aaaaaaaaaa 2805

aaaaaaaaaa atagcggccg cctcga                                      2831

<210>2

<211>574

<212>PRT

<213>智人

<400>2

Met Arg Thr Leu Leu Thr Ile Leu Thr Val Gly Ser Leu Ala Ala His

 1                5                   10                   15

Ala Pro Glu Asp Pro Ser Asp Leu Leu Gln His Val Lys Phe Gln Ser

            20                   25                   30

Ser Asn Phe Glu Asn Ile Leu Thr Trp Asp Ser Gly Pro Glu Gly Thr

        35                   40                   45

Pro Asp Thr Val Tyr Ser Ile Glu Tyr Lys Thr Tyr Gly Glu Arg Asp

    50                   55                   60

Trp Val Ala Lys Lys Gly Cys Gln Arg Ile Thr Arg Lys Ser Cys Asn

65                   70                   75                   80

Leu Thr Val Glu Thr Gly Asn Leu Thr Glu Leu Tyr Tyr Ala Arg Val

                 85                   90                   95

Thr Ala Val Ser Ala Gly Gly Arg Ser Ala Thr Lys Met Thr Asp Arg

            100                  105                  110

Phe Ser Ser Leu Gln His Thr Thr Leu Lys Pro Pro Asp Val Thr Cys

        115                  120                  125

Ile Ser Lys Val Arg Ser Ile Gln Met Ile Val His Pro Thr Pro Thr

    130                  135                  140

Pro Ile Arg Ala Gly Asp Gly His Arg Leu Thr Leu Glu Asp Ile Phe

145                  150                  155                  160

His Asp Leu Phe Tyr His Leu Glu Leu Gln Val Asn Arg Thr Tyr Gln

                 165                  170                  175

Met His Leu Gly Gly Lys Gln Arg Glu Tyr Glu Phe Phe Gly Leu Thr

            180                  185                  190

Pro Asp Thr Glu Phe Leu Gly Thr Ile Met Ile Cys Val Pro Thr Trp

        195                  200                  205

Ala Lys Glu Ser Ala Pro Tyr Met Cys Arg Val Lys Thr Leu Pro Asp

    210                  215                  220

Arg Thr Trp Thr Tyr Ser Phe Ser Gly Ala Phe Leu Phe Ser Met Gly

225                  230                  235                  240

Phe Leu Val Ala Val Leu Cys Tyr Leu Ser Tyr Arg Tyr Val Thr Lys

                245                  250                  255

Pro Pro Ala Pro Pro Asn Ser Leu Asn Val Gln Arg Val Leu Thr Phe

            260                  265                  270

Gln Pro Leu Arg Phe Ile Gln Glu His Val Leu Ile Pro Val Phe Asp

        275                  280                  285

Leu Ser Gly Pro Ser Ser Leu Ala Gln Pro Val Gln Tyr Ser Gln Ile

    290                  295                  300

Arg Val Ser Gly Pro Arg Glu Pro Ala Gly Ala Pro Gln Arg His Ser

305                  310                  315                  320

Leu Ser Glu Ile Thr Tyr Leu Gly Gln Pro Asp Ile Ser Ile Leu Gln

                325                  330                  335

Pro Ser Asn Val Pro Pro Pro Gln Ile Leu Ser Pro Leu Ser Tyr Ala

            340                  345                  350

Pro Asn Ala Ala Pro Glu Val Gly Pro Pro Ser Tyr Ala Pro Gln Val

        355                  360                  365

Thr Pro Glu Ala Gln Phe Pro Phe Tyr Ala Pro Gln Ala Ile Ser Lys

    370                  375                  380

Val Gln Pro Ser Ser Tyr Ala Pro Gln Ala Thr Pro Asp Ser Trp Pro

385                  390                  395                  400

Pro Ser Tyr Gly Val Cys Met Glu Gly Ser Gly Lys Asp Ser Pro Thr

                405                  410                  415

Gly Thr Leu Ser Ser Pro Lys His Leu Arg Pro Lys Gly Gln Leu Gln

            420                  425                  430

Lys Glu Pro Pro Ala Gly Ser Cys Met Leu Gly Gly Leu Ser Leu Gln

        435                  440                  445

Glu Val Thr Ser Leu Ala Met Glu Glu Ser Gln Glu Ala Lys Ser Leu

    450                  455                  460

His Gln Pro Leu Gly Ile Cys Thr Asp Arg Thr Ser Asp Pro Asn Val

465                  470                  475                  480

Leu His Ser Gly Glu Glu Gly Thr Pro Gln Tyr Leu Lys Gly Gln Leu

                485                  490                  495

Pro Leu Leu Ser Ser Val Gln Ile Glu Gly His Pro Met Ser Leu Pro

            500                  505                  510

Leu Gln Pro Pro Ser Gly Pro Cys Ser Pro Ser Asp Gln Gly Pro Ser

        515                  520                  525

Pro Trp Gly Leu Leu Glu Ser Leu Val Cys Pro Lys Asp Glu Ala Lys

    530                  535                  540

Ser Pro Ala Pro Glu Thr Ser Asp Leu Glu Gln Pro Thr Glu Leu Asp

545                  550                  555                  560

Ser Leu Phe Arg Gly Leu Ala Leu Thr Val Gln Trp Glu Ser

                565                  570

<210>3

<211>211

<212>PRT

<213>智人

<400>3

Pro Glu Asp Pro Ser Asp Leu Leu Gln His Val Lys Phe Gln Ser Ser

 1                5                   10                   15

Asn Phe Glu Asn Ile Leu Thr Trp Asp Ser Gly Pro Glu Gly Thr Pro

            20                   25                    30

Asp Thr Val Tyr Ser Ile Glu Tyr Lys Thr Tyr Gly Glu Arg Asp Trp

        35                   40                   45

Val Ala Lys Lys Gly Cys Gln Arg Ile Thr Arg Lys Ser Cys Asn Leu

    50                   55                   60

Thr Val Glu Thr Gly Asn Leu Thr Glu Leu Tyr Tyr Ala Arg Val Thr

65                   70                   75                   80

Ala Val Ser Ala Gly Gly Arg Ser Ala Thr Lys Met Thr Asp Arg Phe

                 85                   90                   95

Ser Ser Leu Gln His Thr Thr Leu Lys Pro Pro Asp Val Thr Cys Ile

            100                  105                  110

Ser Lys Val Arg Ser Ile Gln Met Ile Val His Pro Thr Pro Thr Pro

        115                  120                  125

Ile Arg Ala Gly Asp Gly His Arg Leu Thr Leu Glu Asp Ile Phe His

    130                  135                  140

Asp Leu Phe Tyr His Leu Glu Leu Gln Val Asn Arg Thr Tyr Gln Met

145                  150                  155                  160

His Leu Gly Gly Lys Gln Arg Glu Tyr Glu Phe Phe Gly Leu Thr Pro

                 165                  170                  175

Asp Thr Glu Phe Leu Gly Thr Ile Met Ile Cys Val Pro Thr Trp Ala

            180                  185                  190

Lys Glu Ser Ala Pro Tyr Met Cys Arg Val Lys Thr Leu Pro Asp Arg

        195                  200                  205

Thr Trp Thr

    210

<210>4

<211>541

<212>PRT

<213>人工序列

<220>

<223>可溶性IL-22RA-Fc融合多肽

<400>4

Pro Glu Asp Pro Ser Asp Leu Leu Gln His Val Lys Phe Gln Ser Ser

 1                5                   10                   15

Asn Phe Glu Asn Ile Leu Thr Trp Asp Ser Gly Pro Glu Gly Thr Pro

            20                   25                   30

Asp Thr Val Tyr Ser Ile Glu Tyr Lys Thr Tyr Gly Glu Arg Asp Trp

        35                   40                   45

Val Ala Lys Lys Gly Cys Gln Arg Ile Thr Arg Lys Ser Cys Asn Leu

    50                   55                   60

Thr Val Glu Thr Gly Asn Leu Thr Glu Leu Tyr Tyr Ala Arg Val Thr

65                   70                   75                   80

Ala Val Ser Ala Gly Gly Arg Ser Ala Thr Lys Met Thr Asp Arg Phe

                 85                   90                   95

Ser Ser Leu Gln His Thr Thr Leu Lys Pro Pro Asp Val Thr Cys Ile

            100                  105                  110

Ser Lys Val Arg Ser Ile Gln Met Ile Val His Pro Thr Pro Thr Pro

        l15                  120                  125

Ile Arg Ala Gly Asp Gly His Arg Leu Thr Leu Glu Asp Ile Phe His

    130                  135                  140

Asp Leu Phe Tyr His Leu Glu Leu Gln Val Asn Arg Thr Tyr Gln Met

145                  150                  155                  160

His Leu Gly Gly Lys Gln Arg Glu Tyr Glu Phe Phe Gly Leu Thr Pro

                165                  170                  175

Asp Thr Glu Phe Leu Gly Thr Ile Met Ile Cys Val Pro Thr Trp Ala

            180                  185                  190

Lys Glu Ser Ala Pro Tyr Met Cys Arg Val Lys Thr Leu Pro Asp Arg

        195                  200                  205

Thr Trp Thr Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser Val Phe Pro Leu Ala Pro

    210                  215                  220

Ser Ser Lys Ser Thr Ser Gly Gly Thr Ala Ala Leu Gly Cys Leu Val

225                  230                  235                  240

Lys Asp Tyr Phe Pro Glu Pro Val Thr Val Ser Trp Asn Ser Gly Ala

                245                  250                  255

Leu Thr Ser Gly Val His Thr Phe Pro Ala Val Leu Gln Ser Ser Gly

            260                  265                  270

Leu Tyr Ser Leu Ser Ser Val Val Thr Val Pro Ser Ser Ser Leu Gly

        275                  280                  285

Thr Gln Thr Tyr Ile Cys Asn Val Asn His Lys Pro Ser Asn Thr Lys

    290                  295                  300

Val Asp Lys Lys Val Glu Pro Lys Ser Cys Asp Lys Thr His Thr Cys

305                  310                  315                  320

Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu Leu Leu Gly Gly Pro Ser Val Phe Leu

                325                  330                  335

Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu

            340                  345                  350

Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser His Glu Asp Pro Glu Val Lys

        355                  360                  365

Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys Thr Lys

    370                  375                  380

Pro Arg Glu Glu Gln Tyr Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser Val Leu

385                  390                  395                  400

Thr Val Leu His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys

                405                  410                  415

Val Ser Asn Lys Ala Leu Pro Ala Pro Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys

            420                  425                  430

Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser

        435                  440                  445

Arg Asp Glu Leu Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu Thr Cys Leu Val Lys

    450                  455                  460

Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln

465                  470                  475                  480

Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly

                 485                  490                  495

Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Lys Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln

            500                  505                   510

Gln Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu Ala Leu His Ash

        515                  520                  525

His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro Gly Lys

    530                  535                  540

<210>5

<211>1116

<212>DNA

<213>智人

<220>

<221>CDS

<222>(21)...(557)

<400>5

tcgagttaga attgtctgca atg gcc gcc ctg cag aaa tct gtg agc tct ttc    53

                        Met Ala Ala Leu Gln Lys Ser Val Ser Ser Phe

                         1                5                    10

ctt atg ggg acc ctg gcc acc agc tgc ctc ctt ctc ttg gcc ctc ttg     101

Leu Met Gly Thr Leu Ala Thr Ser Cys Leu Leu Leu Leu Ala Leu Leu

             15                   20                   25

gta cag gga gga gca gct gcg ccc atc agc tcc cac tgc agg ctt gac    149

Val Gln Gly Gly Ala Ala Ala Pro Ile Ser Ser His Cys Arg Leu Asp

         30                   35                   40

aag tcc aac ttc cag cag ccc tat atc acc aac cgc acc ttc atg ctg    197

Lys Ser Asn Phe Gln Gln Pro Tyr Ile Thr Asn Arg Thr Phe Met Leu

     45                   50                   55

gct aag gag gct agc ttg gct gat aac aac aca gac gtt cgt ctc att    245

Ala Lys Glu Ala Ser Leu Ala Asp Asn Asn Thr Asp Val Arg Leu Ile

 60                   65                   70                   75

ggg gag aaa ctg ttc cac gga gtc agt atg agt gag cgc tgc tat ctg    293

Gly Glu Lys Leu Phe His Gly Val Ser Met Ser Glu Arg Cys Tyr Leu

                  80                   85                   90

atg aag cag gtg ctg aac ttc acc ctt gaa gaa gtg ctg ttc cct caa    341

Met Lys Gln Val Leu Asn Phe Thr Leu Glu Glu Val Leu Phe Pro Gln

             95                  100                  105

tct gat agg ttc cag cct tat atg cag gag gtg gtg ccc ttc ctg gcc    389

Ser Asp Arg Phe Gln Pro Tyr Met Gln Glu Val Val Pro Phe Leu Ala

        110                  115                  120

agg ctc agc aac agg cta agc aca tgt cat att gaa ggt gat gac ctg    437

Arg Leu Ser Asn Arg Leu Ser Thr Cys His Ile Glu Gly Asp Asp Leu

    125                  130                  135

cat atc cag agg aat gtg caa aag ctg aag gac aca gtg aaa aag ctt    485

His Ile Gln Arg Asn Val Gln Lys Leu Lys Asp Thr Val Lys Lys Leu

140                  145                  150                  155

gga gag agt gga gag atc aaa gca att gga gaa ctg gat ttg ctg ttt    533

Gly Glu Ser Gly Glu Ile Lys Ala Ile Gly Glu Leu Asp Leu Leu Phe

                 160                  165                  170

atg tct ctg aga aat gcc tgc att tgaccagagc aaagctgaaa aatgaataac   587

Met Ser Leu Arg Asn Ala Cys Ile

             175

taaccccctt tccctgctag aaataacaat tagatgcccc aaagcgattt tttttaacca  647

aaaggaagat gggaagccaa actccatcat gatgggtgga ttccaaatga acccctgcgt  707

tagttacaaa ggaaaccaat gccacttttg tttataagac cagaaggtag actttctaag  767

catagatatt tattgataac atttcattgt aactggtgtt ctatacacag aaaacaattt  827

attttttaaa taattgtctt tttccataaa aaagattact ttccattcct ttaggggaaa  887

aaacccctaa atagcttcat gtttccataa tcagtacttt atatttataa atgtatttat  947

tattattata agactgcatt ttatttatat cattttatta atatggattt atttatagaa 1007

acatcattcg atattgctac ttgagtgtaa ggctaatatt gatatttatg acaataatta 1067

tagagctata acatgtttat ttgacctcaa taaacacttg gatatccta             1116

<210>6

<211>179

<212>PRT

<213>智人

<400>6

Met Ala Ala Leu Gln Lys Ser Val Ser Ser Phe Leu Met Gly Thr Leu

 1                5                   10                   15

Ala Thr Ser Cys Leu Leu Leu Leu Ala Leu Leu Val Gln Gly Gly Ala

            20                   25                    30

Ala Ala Pro Ile Ser Ser His Cys Arg Leu Asp Lys Ser Asn Phe Gln

        35                   40                   45

Gln Pro Tyr Ile Thr Asn Arg Thr Phe Met Leu Ala Lys Glu Ala Ser

    50                   55                   60

Leu Ala Asp Asn Asn Thr Asp Val Arg Leu Ile Gly Glu Lys Leu Phe

65                   70                   75                   80

His Gly Val Ser Met Ser Glu Arg Cys Tyr Leu Met Lys Gln Val Leu

                 85                   90                   95

Asn Phe Thr Leu Glu Glu Val Leu Phe Pro Gln Ser Asp Arg Phe Gln

            100                  105                  110

Pro Tyr Met Gln Glu Val Val Pro Phe Leu Ala Arg Leu Ser Asn Arg

        115                  120                  125

Leu Ser Thr Cys His Ile Glu Gly Asp Asp Leu His Ile Gln Arg Asn

    130                  135                  140

Val Gln Lys Leu Lys Asp Thr Val Lys Lys Leu Gly Glu Ser Gly Glu

145                  150                  155                  160

Ile Lys Ala Ile Gly Glu Leu Asp Leu Leu Phe Met Ser Leu Arg Asn

                165                  170                  175

Ala Cys Ile

<210>7

<211>926

<212>DNA

<213>智人

<220>

<221>CDS

<222>(45)...(575)

<221>变体

<222>(188)...(188)

<223>在188位核苷酸可以是C或者G

<400>7

ctttgaattc ctagctcctg tggtctccag atttcaggcc taag atg aaa gcc tct    56

                                                   Met Lys Ala Ser

                                                    1

agt ctt gcc ttc agc ctt ctc tct gct gcg ttt tat ctc cta tgg act    104

Ser Leu Ala Phe Ser Leu Leu Ser Ala Ala Phe Tyr Leu Leu Trp Thr

 5                    10                   15                  20

cct tcc act gga ctg aag aca ctc aat ttg gga agc tgt gtg atc gcc    152

Pro Ser Thr Gly Leu Lys Thr Leu Asn Leu Gly Ser Cys Val Ile Ala

                 25                    30                   35

aca aac ctt cag gaa ata cga aat gga ttt tct gas ata cgg ggc agt    200

Thr Asn Leu Gln Glu Ile Arg Asn Gly Phe Ser Xaa Ile Arg Gly Ser

             40                   45                   50

gtg caa gcc aaa gat gga aac att gac atc aga atc tta agg agg act    248

Val Gln Ala Lys Asp Gly Asn Ile Asp Ile Arg Ile Leu Arg Arg Thr

         55                   60                   65

gag tct ttg caa gac aca aag cct gcg aat cga tgc tgc ctc ctg cgc    296

Glu Ser Leu Gln Asp Thr Lys Pro Ala Asn Arg Cys Cys Leu Leu Arg

     70                   75                   80

cat ttg cta aga ctc tat ctg gac agg gta ttt aaa aac tac cag acc    344

His Leu Leu Arg Leu Tyr Leu Asp Arg Val Phe Lys Asn Tyr Gln Thr

 85                   90                   95                  100

cct gac cat tat act ctc cgg aag atc agc agc ctc gcc aat tcc ttt    392

Pro Asp His Tyr Thr Leu Arg Lys Ile Ser Ser Leu Ala Asn Ser Phe

                 105                  110                  115

ctt acc atc aag aag gac ctc cgg ctc tgt cat gcc cac atg aca tgc    440

Leu Thr Ile Lys Lys Asp Leu Arg Leu Cys His Ala His Met Thr Cys

            120                  125                  130

cat tgt ggg gag gaa gca atg aag aaa tac agc cag att ctg agt cac    488

His Cys Gly Glu Glu Ala Met Lys Lys Tyr Ser Gln Ile Leu Ser His

        135                  140                  145

ttt gaa aag ctg gaa cct cag gca gca gtt gtg aag gct ttg ggg gaa    536

Phe Glu Lys Leu Glu Pro Gln Ala Ala Val Val Lys Ala Leu Gly Glu

    150                  155                  160

cta gac att ctt ctg caa tgg atg gag gag aca gaa tag gaggaaagtg     585

Leu Asp Ile Leu Leu Gln Trp Met Glu Glu Thr Glu  *

165                  170                  175

atgctgctgc taagaatatt cgaggtcaag agctccagtc ttcaatacct gcagaggagg  645

catgacccca aaccaccatc tctttactgt actagtcttg tgctggtcac agtgtatctt  705

atttatgcat tacttgcttc cttgcatgat tgtctttatg catccccaat cttaattgag  765

accatacttg tataagattt ttgtaatatc tttctgctat tggatatatt tattagttaa  825

tatatttatt tattttttgc tattaatgta tttaattttt tacttgggca tgaaacttta  885

aaaaaaattc acaagattat atttataacc tgactagagc a                      926

<210>8

<211>176

<212>PRT

<213>智人

<220>

<221>变体

<222>(48)...(48)

<223>第48位氨基酸可以是D(Asp)或者E(Glu)

<221>变体

<222>48

<223>Xaa＝任何氨基酸

<400>8

Met Lys Ala Ser Ser Leu Ala Phe Ser Leu Leu Ser Ala Ala Phe Tyr

 1                5                   10                   15

Leu Leu Trp Thr Pro Ser Thr Gly Leu Lys Thr Leu Asn Leu Gly Ser

             20                  25                    30

Cys Val Ile Ala Thr Asn Leu Gln Glu Ile Arg Asn Gly Phe Ser Xaa

        35                   40                   45

Ile Arg Gly Ser Val Gln Ala Lys Asp Gly Asn Ile Asp Ile Arg Ile

    50                   55                   60

Leu Arg Arg Thr Glu Ser Leu Gln Asp Thr Lys Pro Ala Asn Arg Cys

65                   70                   75                   80

Cys Leu Leu Arg His Leu Leu Arg Leu Tyr Leu Asp Arg Val Phe Lys

                 85                   90                   95

Asn Tyr Gln Thr Pro Asp His Tyr Thr Leu Arg Lys Ile Ser Ser Leu

            100                  105                  110

Ala Asn Ser Phe Leu Thr Ile Lys Lys Asp Leu Arg Leu Cys His Ala

        115                  120                  125

His Met Thr Cys His Cys Gly Glu Glu Ala Met Lys Lys Tyr Ser Gln

    130                  135                  140

Ile Leu Ser His Phe Glu Lys Leu Glu Pro Gln Ala Ala Val Val Lys

145                  150                  155                  160

Ala Leu Gly Glu Leu Asp Ile Leu Leu Gln Trp Met Glu Glu Thr Glu

                 165                  170                  175

<210>9

<211>16

<212>PRT

<213>人工序列

<220>

<223>肽连接子

<400>9

Gly Gly Ser Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser

 1                5                  10                    15

<210>10

<211>1050

<212>DNA

<213>小鼠(Mus musculus)

<220>

<221>CDS

<222>(5)...(589)

<400>10

aaca ggc tct cct ctc act tat caa ctt ttg aca ctt gtg cga tcg gtg    49

     Gly Ser Pro Leu Thr Tyr Gln Leu Leu Thr Leu Val Arg Ser Val

      1                5                    10                  15

atg gct gtc ctg cag aaa tct atg agt ttt tcc ctt atg ggg act ttg     97

Met Ala Val Leu Gln Lys Ser Met Ser Phe Ser Leu Met Gly Thr Leu

                  20                   25                   30

gcc gcc agc tgc ctg ctt ctc att gcc ctg tgg gcc cag gag gca aat    145

Ala Ala Ser Cys Leu Leu Leu Ile Ala Leu Trp Ala Gln Glu Ala Asn

             35                    40                   45

gcg ctg ccc atc aac acc cgg tgc aag ctt gag gtg tcc aac ttc cag    193

Ala Leu Pro Ile Asn Thr Arg Cys Lys Leu Glu Val Ser Asn Phe Gln

         50                   55                   60

cag ccg tac atc gtc aac cgc acc ttt atg ctg gcc aag gag gcc agc    241

Gln Pro Tyr Ile Val Asn Arg Thr Phe Met Leu Ala Lys Glu Ala Ser

     65                   70                   75

ctt gca gat aac aac aca gac gtc cgg ctc atc ggg gag aaa ctg ttc    289

Leu Ala Asp Asn Asn Thr Asp Val Arg Leu Ile Gly Glu Lys Leu Phe

 80                   85                   90                  95

cga gga gtc agt gct aag gat cag tgc tac ctg atg aag cag gtg ctc    337

Arg Gly Val Ser Ala Lys Asp Gln Cys Tyr Leu Met Lys Gln Val Leu

                 100                  105                  110

aac ttc acc ctg gaa gac att ctg ctc ccc cag tca gac agg ttc cgg    385

Asn Phe Thr Leu Glu Asp Ile Leu Leu Pro Gln Ser Asp Arg Phe Arg

            115                  120                  125

ccc tac atg cag gag gtg gtg cct ttc ctg acc aaa ctc agc aat cag    433

Pro Tyr Met Gln Glu Val Val Pro Phe Leu Thr Lys Leu Ser Asn Gln

        130                  135                  140

ctc agc tcc tgt cac atc agt ggt gac gac cag aac atc cag aag aat    481

Leu Ser Ser Cys His Ile Ser Gly Asp Asp Gln Asn Ile Gln Lys Asn

    145                  150                  155

gtc aga agg ctg aag gag aca gtg aaa aag ctt gga gag agc gga gag    529

Val Arg Arg Leu Lys Glu Thr Val Lys Lys Leu Gly Glu Ser Gly Glu

160                  165                  170                  175

atc aaa gcg atc ggg gaa ctg gac ctg ctg ttt atg tct ctg aga aat    577

Ile Lys Ala Ile Gly Glu Leu Asp Leu Leu Phe Met Ser Leu Arg Asn

                 180                  185                  190

gct tgc gtc tga gcgagaagaa gctagaaaac gaagaactgc tccttcctgc        629

Ala Cys Val  *

cttctaaaaa gaacaataag atccctgaat ggactttttt actaaaggaa agtgagaagc  689

taacgtccac catcattaga agatttcaca tgaaacctgg ctcagttgaa agagaaaata  749

gtgtcaagtt gtccatgaga ccagaggtag acttgataac cacaaagatt cattgacaat  809

attttattgt cattgataat gcaacagaaa aagtatgtac tttaaaaaat tgtttgaaag  869

gaggttacct ctcattcctc tagaagaaaa gcctatgtaa cttcatttcc ataaccaata  929

ctttatatat gtaagtttat ttattataag tatacatttt atttatgtca gtttattaat  989

atggatttat ttatagaaaa attatctgat gttgatattt gagtataaag caaataatat 1049

t

1050

<210>11

<211>194

<212>PRT

<213>小鼠

<400>11

Gly Ser Pro Leu Thr Tyr Gln Leu Leu Thr Leu Val Arg Ser Val Met

 1                5                   10                   15

Ala Val Leu Gln Lys Ser Met Ser Phe Ser Leu Met Gly Thr Leu Ala

            20                   25                   30

Ala Ser Cys Leu Leu Leu Ile Ala Leu Trp Ala Gln Glu Ala Asn Ala

        35                   40                   45

Leu Pro Ile Asn Thr Arg Cys Lys Leu Glu Val Ser Asn Phe Gln Gln

    50                   55                   60

Pro Tyr Ile Val Asn Arg Thr Phe Met Leu Ala Lys Glu Ala Ser Leu

65                   70                   75                   80

Ala Asp Asn Asn Thr Asp Val Arg Leu Ile Gly Glu Lys Leu Phe Arg

                 85                   90                   95

Gly Val Ser Ala Lys Asp Gln Cys Tyr Leu Met Lys Gln Val Leu Asn

            100                  105                  110

Phe Thr Leu Glu Asp Ile Leu Leu Pro Gln Ser Asp Arg Phe Arg Pro

        115                  120                  125

Tyr Met Gln Glu Val Val Pro Phe Leu Thr Lys Leu Ser Asn Gln Leu

    130                  135                  140

Ser Ser Cys His Ile Ser Gly Asp Asp Gln Asn Ile Gln Lys Asn Val

145                  150                  155                  160

Arg Arg Leu Lys Glu Thr Val Lys Lys Leu Gly Glu Ser Gly Glu Ile

                165                  170                  175

Lys Ala Ile Gly Glu Leu Asp Leu Leu Phe Met Ser Leu Arg Asn Ala

            180                  185                  190

Cys Val

<210>12

<211>2149

<212>DNA

<213>智人

<220>

<221>CDS

<222>(1)...(693)

<400>12

atg atg cct aaa cat tgc ttt cta ggc ttc ctc atc agt ttc ttc ctt     48

Met Met Pro Lys His Cys Phe Leu Gly Phe Leu Ile Ser Phe Phe Leu

 1                5                    10                   15

act ggt gta gca gga act cag tca acg cat gag tct ctg aag cct cag     96

Thr Gly Val Ala Gly Thr Gln Ser Thr His Glu Ser Leu Lys Pro Gln

             20                   25                   30

agg gta caa ttt cag tcc cga aat ttt cac aac att ttg caa tgg cag    144

Arg Val Gln Phe Gln Ser Arg Asn Phe His Asn Ile Leu Gln Trp Gln

         35                   40                   45

cct ggg agg gca ctt act ggc aac agc agt gtc tat ttt gtg cag tac    192

Pro Gly Arg Ala Leu Thr Gly Asn Ser Ser Val Tyr Phe Val Gln Tyr

     50                   55                   60

aaa ata tat gga cag aga caa tgg aaa aat aaa gaa gac tgt tgg ggt    240

Lys Ile Tyr Gly Gln Arg Gln Trp Lys Ash Lys Glu Asp Cys Trp Gly

 65                   70                   75                  80

act caa gaa ctc tct tgt gac ctt acc agt gaa acc tca gac ata cag    288

Thr Gln Glu Leu Ser Cys Asp Leu Thr Ser Glu Thr Ser Asp Ile Gln

                  85                   90                   95

gaa cct tat tac ggg agg gtg agg gcg gcc tcg gct ggg agc tac tca    336

Glu Pro Tyr Tyr Gly Arg Val Arg Ala Ala Ser Ala Gly Ser Tyr Ser

            100                  105                  110

gaa tgg agc atg acg ccg cgg ttc act ccc tgg tgg gaa aca aaa ata    384

Glu Trp Ser Met Thr Pro Arg Phe Thr Pro Trp Trp Glu Thr Lys Ile

        115                  120                  125

gat cct cca gtc atg aat ata acc caa gtc aat ggc tct ttg ttg gta    432

Asp Pro Pro Val Met Asn Ile Thr Gln Val Asn Gly Ser Leu Leu Val

    130                  135                  140

att ctc cat gct cca aat tta cca tat aga tac caa aag gaa aaa aat    480

Ile Leu His Ala Pro Asn Leu Pro Tyr Arg Tyr Gln Lys Glu Lys Asn

145                  150                  155                  160

gta tct ata gaa gat tac tat gaa cta cta tac cga gtt ttt ata att    528

Val Ser Ile Glu Asp Tyr Tyr Glu Leu Leu Tyr Arg Val Phe Ile Ile

                 165                  170                  175

aac aat tca cta gaa aag gag caa aag gtt tat gaa ggg gct cac aga    576

Asn Asn Ser Leu Glu Lys Glu Gln Lys Val Tyr Glu Gly Ala His Arg

            180                  185                  190

gcg gtt gaa att gaa gct cta aca cca cac tcc agc tac tgt gta gtg    624

Ala Val Glu Ile Glu Ala Leu Thr Pro His Ser Ser Tyr Cys Val Val

        195                  200                  205

gct gaa ata tat cag ccc atg tta gac aga aga agt cag aga agt gaa    672

Ala Glu Ile Tyr Gln Pro Met Leu Asp Arg Arg Ser Gln Arg Ser Glu

    210                  215                  220

gag aga tgt gtg gaa att cca tgacttgtgg aatttggcat tcagcaatgt       723

Glu Arg Cys Val Glu Ile Pro

225                  230

ggaaattcta aagctccctg agaacaggat gactcgtgtt tgaaggatct tatttaaaat  783

tgtttttgta ttttcttaaa gcaatattca ctgttacacc ttggggactt ctttgtttat  843

ccattctttt atcctttata tttcatttta aactatattt gaacgacatt ccccccgaaa  903

aattgaaatg taaagatgag gcagagaata aagtgttcta tgaaattcag aactttattt  963

ctgaatgtaa catccctaat aacaaccttc attcttctaa tacagcaaaa taaaaattta 1023

acaaccaagg aatagtattt aagaaaatgt tgaaataatt tttttaaaat agcattacag 1083

actgaggcgg tcctgaagca atggtttttc actctcttat tgagccaatt aaattgacat 1143

tgctttgaca atttaaaact tctataaagg tgaatatttt tcatacattt ctattttata 1203

tgaatatact ttttatatat ttattattat taaatatttc tacttaatga atcaaaattt 1263

tgttttaaag tctactttat gtaaataaga acaggttttg gggaaaaaaa tcttatgatt 1323

tctggattga tatctgaatt aaaactatca acaacaagga agtctactct gtacaattgt 1383

ccctcattta aaagatatat taagcttttc ttttctgttt gtttttgttt tgtttagttt 1443

ttaatcctgt cttagaagaa cttatcttta ttctcaaaat taaatgtaat ttttttagtg 1503

acaaagaaga aaggaaacct cattactcaa tccttctggc caagagtgtc ttgcttgtgg 1563

cgccttcctc atctctatat aggaggatcc catgaatgat ggtttattgg gaactgctgg 1623

ggtcgacccc atacagagaa ctcagcttga agctggaagc acacagtggg tagcaggaga 1683

aggaccggtg ttggtaggtg cctacagaga ctatagagct agacaaagcc ctccaaactg 1743

gcccctcctg ctcactgcct ctcctgagta gaaatctggt gacctaaggc tcagtgcggt 1803

caacagaaag ctgccttctt cacttgaggc taagtcttca tatatgttta aggttgtctt 1863

tctagtgagg agatacatat cagagaacat ttgtacaatt ccccatgaaa attgctccaa 1923

agttgataac aatatagtcg gtgcttctag ttatatgcaa gtactcagtg ataaatggat 1983

taaaaaatat tcagaaatgt attggggggt ggaggagaat aagaggcaga gcaagagcta 2043

gagaattggt ttccttgctt ccctgtatgc tcagaaaaca ttgatttgag catagacgca 2103

gagactgaaa aaaaaaaaat gctcgagcgg ccgccatatc cttggt                2149

<210>13

<211>231

<212>PRT

<213>智人

<400>13

Met Met Pro Lys His Cys Phe Leu Gly Phe Leu Ile Ser Phe Phe Leu

 1                5                   10                   15

Thr Gly Val Ala Gly Thr Gln Ser Thr His Glu Ser Leu Lys Pro Gln

            20                   25                   30

Arg Val Gln Phe Gln Ser Arg Asn Phe His Asn Ile Leu Gln Trp Gln

        35                   40                   45

Pro Gly Arg Ala Leu Thr Gly Asn Ser Ser Val Tyr Phe Val Gln Tyr

    50                   55                   60

Lys Ile Tyr Gly Gln Arg Gln Trp Lys Asn Lys Glu Asp Cys Trp Gly

65                   70                   75                   80

Thr Gln Glu Leu Ser Cys Asp Leu Thr Ser Glu Thr Ser Asp Ile Gln

                85                   90                   95

Glu Pro Tyr Tyr Gly Arg Val Arg Ala Ala Ser Ala Gly Ser Tyr Ser

            100                  105                  110

Glu Trp Ser Met Thr Pro Arg Phe Thr Pro Trp Trp Glu Thr Lys Ile

        115                  120                  125

Asp Pro Pro Val Met Asn Ile Thr Gln Val Asn Gly Ser Leu Leu Val

    130                  135                  140

Ile Leu His Ala Pro Asn Leu Pro Tyr Arg Tyr Gln Lys Glu Lys Asn

145                  150                  155                  160

Val Ser Ile Glu Asp Tyr Tyr Glu Leu Leu Tyr Arg Val Phe Ile Ile

                165                  170                  175

Asn Asn Ser Leu Glu Lys Glu Gln Lys Val Tyr Glu Gly Ala His Arg

            180                  185                  190

Ala Val Glu lle Glu Ala Leu Thr Pro His Ser Ser Tyr Cys Val Val

        195                  200                  205

Ala Glu Ile Tyr Gln Pro Met Leu Asp Arg Arg Ser Gln Arg Ser Glu

    210                  215                  220

Glu Arg Cys Val Glu Ile Pro

225                  230

<210>14

<211>699

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>C-末端的Fc4 tag

<400>14

gagcccagat cttcagacaa aactcacaca tgcccaccgt gcccagcacc tgaagccgag     60

ggggcaccgt cagtcttcct cttcccccca aaacccaagg acaccctcat gatctcccgg    120

acccctgagg tcacatgcgt ggtggtggac gtgagccacg aagaccctga ggtcaagttc    180

aactggtacg tggacggcgt ggaggtgcat aatgccaaga caaagccgcg ggaggagcag    240

tacaacagca cgtaccgtgt ggtcagcgtc ctcaccgtcc tgcaccagga ctggctgaat    300

ggcaaggagt acaagtgcaa ggtctccaac aaagccctcc catcctccat cgagaaaacc    360

atctccaaag ccaaagggca gccccgagaa ccacaggtgt acaccctgcc cccatcccgg    420

gatgagctga ccaagaacca ggtcagcctg acctgcctgg tcaaaggctt ctatcccagc    480

gacatcgccg tggagtggga gagcaatggg cagccggaga acaactacaa gaccacgcct    540

cccgtgctgg actccgacgg ctccttcttc ctctacagca agctcaccgt ggacaagagc    600

aggtggcagc aggggaacgt cttctcatgc tccgtgatgc atgaggctct gcacaaccac    660

tacacgcaga agagcctctc cctgtctccg ggtaaataa                           699

<210>15

<211>6

<212>PRT

<213>人工序列

<220>

<223>Glu-Glu(CEE)肽Tag

<400>15

Glu Tyr Met Pro Met Glu

 1                5

<210>16

<211>10

<212>PRT

<213>人工序列

<220>

<223>带有间隔子的Glu-Glu(CEE)肽Tag

<400>16

Gly Ser Gly Gly Glu Tyr Met Pro Met Glu

 1                5                   10

<210>17

<211>20

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>寡核苷酸引物，ZC39289

<400>17

tccgaggagt                                               caatgctaag

20

<210>18

<211>20

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>寡核苷酸引物，ZC39290

<400>18

tccaagcttt                                           ttcactgtct

20

<210>19

<211>16

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>寡核苷酸引物，ZC39776

<400>19

gggcccgcta                                           gcacct

16

<210>20

<211>16

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>寡核苷酸引物，ZC39777

<400>20

gggtgatccg                                           ctggca

16

<210>21

<211>36

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>IL-20FAM/TAMRA标记的TaqMan探针，ZC38752

<400>21

ccagccactt tctctctccg tatttcttat attcca    36

<210>22

<211>16

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>正向引物，ZC42459

<400>22

tggccaggct                                           cagcaa

16

<210>23

<211>21

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>反向引物，ZC42458

<400>23

gcacattcct ctggatatgc a                     21

<210>24

<211>31

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>IL-22TaqMan探针，ZC42460

<400>24

aggctaagca catgtcatat tgaaggtgat g    31

<210>25

<211>21

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>正向引物，ZC40541

<400>25

tcgccaattc ctttcttacc a               21

<210>26

<211>20

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>反向引物，ZC40542

<400>26

cccacaatgg                                           catgtcatgt

20

<210>27

<211>25

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>IL-20TaqMan？探针，ZC40544

<400>27

agaaggacct ccggctctgt catgc                                       25

<210>28

<211>57

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>寡核苷酸引物，ZC45，593

<400>28

caggaaatcc atgccgagtt gagacgcttc cgtagacacg cccctgagga cccctcg    57

<210>29

<211>63

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>寡核苷酸引物，ZC45，592

<400>29

tctgggctca ccgcttccag acccgcttcc agacccgctt cctgtccggt ctggcagtgt 60

ctt                                                                 63

<210>30

<211>63

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>寡核苷酸引物，ZC45，591

<400>30

gaccggacag gaagcgggtc tggaagcggg tctggaagcg gtgagcccag aggccccaca 60

atc                                                               63

<210>31

<211>57

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>寡核苷酸引物，ZC45，594

<400>31

agagctgttt taaggcgcgc ctctagatta tttttattta cccggagtcc gggagaa    57

<210>32

<211>531

<212>DNA

<213>小鼠

<220>

<221>CDS

<222>(1)...(531)

<400>32

atg aaa ggc ttt ggt ctt gcc ttt gga ctg ttc tcc gct gtg ggt ttt  48

Met Lys Gly Phe Gly Leu Ala Phe Gly Leu Phe Ser Ala Val Gly Phe

 1                5                    10                   15

ctt ctc tgg act cct tta act ggg ctc aag acc ctc cat ttg gga agc     96

Leu Leu Trp Thr Pro Leu Thr Gly Leu Lys Thr Leu His Leu Gly Ser

              20                   25                   30

tgt gtg att act gca aac cta cag gca ata caa aag gaa ttt tct gag    144

Cys Val Ile Thr Ala Asn Leu Gln Ala Ile Gln Lys Glu Phe Ser Glu

         35                   40                   45

att cgg gat agt gtg caa gct gaa gat aca aat att gac atc aga att    192

Ile Arg Asp Ser Val Gln Ala Glu Asp Thr Asn Ile Asp Ile Arg Ile

     50                   55                   60

tta agg acg act gag tct ttg aaa gac ata aag tct ttg gat agg tgc    240

Leu Arg Thr Thr Glu Ser Leu Lys Asp Ile Lys Ser Leu Asp Arg Cys

 65                   70                   75                   80

tgc ttc ctt cgt cat cta gtg aga ttc tat ctg gac agg gta ttc aaa    288

Cys Phe Leu Arg His Leu Val Arg Phe Tyr Leu Asp Arg Val Phe Lys

                  85                   90                   95

gtc tac cag acc cct gac cac cat acc ctg aga aag atc agc agc ctc    336

Val Tyr Gln Thr Pro Asp His His Thr Leu Arg Lys Ile Ser Ser Leu

             100                  105                  110

gcc aac tcc ttt ctt atc atc aag aag gac ctc tca gtc tgt cat tct    384

Ala Asn Ser Phe Leu Ile Ile Lys Lys Asp Leu Ser Val Cys His Ser

        115                  120                  125

cac atg gca tgt cat tgt ggg gaa gaa gca atg gag aaa tac aac caa    432

His Met Ala Cys His Cys Gly Glu Glu Ala Met Glu Lys Tyr Asn Gln

    130                  135                  140

att ctg agt cac ttc ata gag ttg gaa ctt cag gca gcg gtg gta aag    480

Ile Leu Ser His Phe Ile Glu Leu Glu Leu Gln Ala Ala Val Val Lys

145                  150                  155                  160

gct ttg gga gaa cta ggc att ctt ctg aga tgg atg gag gag atg cta    528

Ala Leu Gly Glu Leu Gly Ile Leu Leu Arg Trp Met Glu Glu Met Leu

                 165                  170                  175

tag                                                                53l

 *

<210>33

<21l>176

<212>PRT

<213>小鼠

<400>33

Met Lys Gly Phe Gly Leu Ala Phe Gly Leu Phe Ser Ala Val Gly Phe

 1                 5                  10                   15

Leu Leu Trp Thr Pro Leu Thr Gly Leu Lys Thr Leu His Leu Gly Ser

            20                   25                   30

Cys Val Ile Thr Ala Asn Leu Gln Ala Ile Gln Lys Glu Phe Ser Glu

        35                   40                   45

Ile Arg Asp Ser Val Gln Ala Glu Asp Thr Asn Ile Asp Ile Arg Ile

    50                   55                   60

Leu Arg Thr Thr Glu Ser Leu Lys Asp Ile Lys Ser Leu Asp Arg Cys

65                   70                   75                   80

Cys Phe Leu Arg His Leu Val Arg Phe Tyr Leu Asp Arg Val Phe Lys

                 85                   90                   95

Val Tyr Gln Thr Pro Asp His His Thr Leu Arg Lys Ile Ser Ser Leu

            100                   105                  110

Ala Asn Ser Phe Leu Ile Ile Lys Lys Asp Leu Ser Val Cys His Ser

        115                  120                  125

His Met Ala Cys His Cys Gly Glu Glu Ala Met Glu Lys Tyr Asn Gln

    130                  135                  140

Ile Leu Ser His Phe Ile Glu Leu Glu Leu Gln Ala Ala Val Val Lys

145                  150                  155                  160

Ala Leu Gly Glu Leu Gly Ile Leu Leu Arg Trp Met Glu Glu Met Leu

                165                  170                   175

<210>34

<211>21

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>寡核苷酸引物，ZC22901

<400>34

catcaaaccg cctgatgtga c    21

<210>35

<211>21

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>寡核苷酸引物，ZC45039

<400>35

attaggcttg ggagggaatg g    21

<210>36

<211>23

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>寡核苷酸引物，ZC38573

<400>36

tggcgatgcc tgcttgccga ata    23

<210>37

<211>22

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>寡核苷酸引物，ZC25223

<400>37

gtcttcctca catctgttat cg     22

<210>38

<211>24

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>寡核苷酸引物，ZC40128

<400>38

ggcttgaact ttgagaaagg cagt   24

<210>39

<211>1473

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>IL-22RA的细胞外结构域，其带有tPA前导肽并且融合于鼠λ2α重链Fc区域

     (mG2a)

<221>CDS

<222>(1)...(1473)

<400>39

atg gat gca atg aag aga ggg ctc tgc tgt gtg ctg ctg ctg tgt ggc   48

Met Asp Ala Met Lys Arg Gly Leu Cys Cys Val Leu Leu Leu Cys Gly

 1                5                    10                   15

gcc gtc ttc gtt tcg ctc agc cag gaa atc cat gcc gag ttg aga cgc   96

Ala Val Phe Val Ser Leu Ser Gln Glu Ile His Ala Glu Leu Arg Arg

             20                   25                   30

ttc cgt aga cac gcc cct gag gac ccc tcg gat ctg ctc cag cac gtg  144

Phe Arg Arg His Ala Pro Glu Asp Pro Ser Asp Leu Leu Gln His Val

         35                   40                   45

aaa ttc cag tcc agc aac ttt gaa aac atc ctg acg tgg gac agc ggg  192

Lys Phe Gln Ser Ser Asn Phe Glu Asn Ile Leu Thr Trp Asp Ser Gly

     50                   55                   60

cca gag ggc acc cca gac acg gtc tac agc atc gag tat aag acg tac  240

Pro Glu Gly Thr Pro Asp Thr Val Tyr Ser Ile Glu Tyr Lys Thr Tyr

 65                   70                   75                   80

gga gag agg gac tgg gtg gca aag aag ggc tgt cag cgg atc acc cgg  288

Gly Glu Arg Asp Trp Val Ala Lys Lys Gly Cys Gln Arg Ile Thr Arg

                  85                   90                   95

aag tcc tgc aac ctg acg gtg gag acg ggc aac ctc acg gag ctc tac  336

Lys Ser Cys Asn Leu Thr Val Glu Thr Gly Asn Leu Thr Glu Leu Tyr

            100                  105                  110

tat gcc agg gtc acc gct gtc agt gcg gga ggc cgg tca gcc acc aag    384

Tyr Ala Arg Val Thr Ala Val Ser Ala Gly Gly Arg Ser Ala Thr Lys

        115                  120                  125

atg act gac agg ttc agc tct ctg cag cac act acc ctc aag cca cct    432

Met Thr Asp Arg Phe Ser Ser Leu Gln His Thr Thr Leu Lys Pro Pro

    130                  135                  140

gat gtg acc tgt atc tcc aaa gtg aga tcg att cag atg att gtt cat    480

Asp Val Thr Cys Ile Ser Lys Val Arg Ser Ile Gln Met Ile Val His

145                  150                  155                  160

cct acc ccc acg cca atc cgt gca ggc gat ggc cac cgg cta acc ctg    528

Pro Thr Pro Thr Pro Ile Arg Ala Gly Asp Gly His Arg Leu Thr Leu

                165                  170                  175

gaa gac atc ttc cat gac ctg ttc tac cac tta gag ctc cag gtc aac    576

Glu Asp Ile Phe His Asp Leu Phe Tyr His Leu Glu Leu Gln Val Asn

            180                  185                  190

cgc acc tac caa atg cac ctt gga ggg aag cag aga gaa tat gag ttc    624

Arg Thr Tyr Gln Met His Leu Gly Gly Lys Gln Arg Glu Tyr Glu Phe

        195                  200                  205

ttc ggc ctg acc cct gac aca gag ttc ctt ggc acc atc atg att tgc    672

Phe Gly Leu Thr Pro Asp Thr Glu Phe Leu Gly Thr Ile Met Ile Cys

    210                  215                  220

gtt ccc acc tgg gcc aag gag agt gcc ccc tac atg tgc cga gtg aag    720

Val Pro Thr Trp Ala Lys Glu Ser Ala Pro Tyr Met Cys Arg Val Lys

225                  230                  235                  240

aca ctg cca gac cgg aca gga agc ggg tct gga agc ggg tct gga agc    768

Thr Leu Pro Asp Arg Thr Gly Ser Gly Ser Gly Ser Gly Ser Gly Ser

                 245                  250                  255

ggt gag ccc aga ggc ccc aca atc aag ccc tgt cct cca tgc aaa tgc    816

Gly Glu Pro Arg Gly Pro Thr Ile Lys Pro Cys Pro Pro Cys Lys Cys

             260                 265                   270

cca gca cct aac ctc ttg ggt gga cca tcc gtc ttc atc ttc cct cca    864

Pro Ala Pro Asn Leu Leu Gly Gly Pro Ser Val Phe Ile Phe Pro Pro

        275                  280                  285

aag atc aag gat gta ctc atg atc tcc ctg agc ccc ata gtc aca tgt    912

Lys Ile Lys Asp Val Leu Met Ile Ser Leu Ser Pro Ile Val Thr Cys

    290                  295                  300

gtg gtg gtg gat gtg agc gag gat gac cca gat gtc cag atc agc tgg    960

Val Val Val Asp Val Ser Glu Asp Asp Pro Asp Val Gln Ile Ser Trp

305                  310                  315                  320

ttt gtg aac aac gtg gaa gta cac aca gct cag aca caa acc cat aga   1008

Phe Val Asn Asn Val Glu Val His Thr Ala Gln Thr Gln Thr His Arg

                325                  330                  335

gag gat tac aac agt act ctc cgg gtg gtc agt gcc ctc ccc atc cag   1056

Glu Asp Tyr Asn Ser Thr Leu Arg Val Val Ser Ala Leu Pro Ile Gln

            340                  345                  350

cac cag gac tgg atg agt ggc aag gag ttc aaa tgc aag gtc aac aac   1104

His Gln Asp Trp Met Ser Gly Lys Glu Phe Lys Cys Lys Val Asn Asn

        355                  360                  365

aaa gac ctc cca gcg ccc atc gag aga acc atc tca aaa ccc aaa ggg   1152

Lys Asp Leu Pro Ala Pro Ile Glu Arg Thr Ile Ser Lys Pro Lys Gly

    370                  375                  380

tca gta aga gct cca cag gta tat gtc ttg cct cca cca gaa gaa gag  1200

Ser Val Arg Ala Pro Gln Val Tyr Val Leu Pro Pro Pro Glu Glu Glu

385                  390                  395                  400

atg act aag aaa cag gtc act ctg acc tgc atg gtc aca gac ttc atg  1248

Met Thr Lys Lys Gln Val Thr Leu Thr Cys Met Val Thr Asp Phe Met

                 405                  410                  415

cct gaa gac att tac gtg gag tgg acc aac aac ggg aaa aca gag cta  1296

Pro Glu Asp Ile Tyr Val Glu Trp Thr Asn Asn Gly Lys Thr Glu Leu

             420                  425                  430

aac tac aag aac act gaa cca gtc ctg gac tct gat ggt tot tac ttc  1344

Asn Tyr Lys Asn Thr Glu Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Tyr Phe

        435                  440                  445

atg tac agc aag ctg aga gtg gaa aag aag aac tgg gtg gaa aga aat  1392

Met Tyr Ser Lys Leu Arg Val Glu Lys Lys Asn Trp Val Glu Arg Asn

    450                  455                  460

agc tac tcc tgt tca gtg gtc cac gag ggt ctg cac aat cac cac acg  1440

Ser Tyr Ser Cys Ser Val Val His Glu Gly Leu His Asn His His Thr

465                  470                  475                  480

act aag agc ttc tcc cgg act ccg ggt aaa taa                      1473

Thr Lys Ser Phe Ser Arg Thr Pro Gly Lys  *

                 485                  490

<210>40

<21l>490

<212>PRT

<213>人工序列

<220>

<223>IL-22RA的细胞外结构域，其带有tPA前导肽并且融合于鼠λ2α重链Fc区域

     (mG2a)

<400>40

Met Asp Ala Met Lys Arg Gly Leu Cys Cys Val Leu Leu Leu Cys Gly

 1                5                   10                   15

Ala Val Phe Val Ser Leu Ser Gln Glu Ile His Ala Glu Leu Arg Arg

            20                    25                   30

Phe Arg Arg His Ala Pro Glu Asp Pro Ser Asp Leu Leu Gln His Val

        35                   40                   45

Lys Phe Gln Ser Ser Asn Phe Glu Asn Ile Leu Thr Trp Asp Ser Gly

    50                   55                   60

Pro Glu Gly Thr Pro Asp Thr Val Tyr Ser Ile Glu Tyr Lys Thr Tyr

65                   70                   75                   80

Gly Glu Arg Asp Trp Val Ala Lys Lys Gly Cys Gln Arg Ile Thr Arg

                85                    90                   95

Lys Ser Cys Asn Leu Thr Val Glu Thr Gly Asn Leu Thr Glu Leu Tyr

            100                  105                  110

Tyr Ala Arg Val Thr Ala Val Ser Ala Gly Gly Arg Ser Ala Thr Lys

        115                  120                  125

Met Thr Asp Arg Phe Ser Ser Leu Gln His Thr Thr Leu Lys Pro Pro

    130                  135                  140

Asp Val Thr Cys Ile Ser Lys Val Arg Ser Ile Gln Met Ile Val His

145                  150                  155                  160

Pro Thr Pro Thr Pro Ile Arg Ala Gly Asp Gly His Arg Leu Thr Leu

                 165                  170                  175

Glu Asp Ile Phe His Asp Leu Phe Tyr His Leu Glu Leu Gln Val Asn

            180                  185                  190

Arg Thr Tyr Gln Met His Leu Gly Gly Lys Gln Arg Glu Tyr Glu Phe

        195                  200                  205

Phe Gly Leu Thr Pro Asp Thr Glu Phe Leu Gly Thr Ile Met Ile Cys

    210                  215                  220

Val Pro Thr Trp Ala Lys Glu Ser Ala Pro Tyr Met Cys Arg Val Lys

225                  230                  235                  240

Thr Leu Pro Asp Arg Thr Gly Ser Gly Ser Gly Ser Gly Ser Gly Ser

                 245                  250                  255

Gly Glu Pro Arg Gly Pro Thr Ile Lys Pro Cys Pro Pro Cys Lys Cys

             260                  265                  270

Pro Ala Pro Asn Leu Leu Gly Gly Pro Ser Val Phe Ile Phe Pro Pro

        275                  280                  285

Lys Ile Lys Asp Val Leu Met Ile Ser Leu Ser Pro Ile Val Thr Cys

    290                  295                  300

Val Val Val Asp Val Ser Glu Asp Asp Pro Asp Val Gln Ile Ser Trp

305                  310                  315                  320

Phe Val Asn Asn Val Glu Val His Thr Ala Gln Thr Gln Thr His Arg

                 325                  330                  335

Glu Asp Tyr Asn Ser Thr Leu Arg Val Val Ser Ala Leu Pro Ile Gln

            340                  345                  350

His Gln Asp Trp Met Ser Gly Lys Glu Phe Lys Cys Lys Val Asn Asn

        355                  360                  365

Lys Asp Leu Pro Ala Pro Ile Glu Arg Thr Ile Ser Lys Pro Lys Gly

    370                  375                  380

Ser Val Arg Ala Pro Gln Val Tyr Val Leu Pro Pro Pro Glu Glu Glu

385                  390                  395                  400

Met Thr Lys Lys Gln Val Thr Leu Thr Cys Met Val Thr Asp Phe Met

                 405                  410                  415

Pro Glu Asp Ile Tyr Val Glu Trp Thr Asn Asn Gly Lys Thr Glu Leu

            420                  425                   430

Asn Tyr Lys Asn Thr Glu Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Tyr Phe

        435                  440                  445

Met Tyr Ser Lys Leu Arg Val Glu Lys Lys Asn Trp Val Glu Arg Asn

    450                  455                  460

Ser Tyr Ser Cys Ser Val Val His Glu Gly Leu His Asn His His Thr

465                  470                  475                  480

Thr Lys Ser Phe Ser Arg Thr Pro Gly Lys

                485                  490

<210>41

<211>1834

<212>DNA

<213>小鼠

<220>

<221>CDS

<222>(43)...(1788)

<400>41

ttggtccaga gccgaggccc gaaggggccc tggagggacc ca atg aag aca cta      54

                                                 Met Lys Thr Leu

                                                  1

ctg acc atc ctg acg gtg gga tcc ctg gcc gct cac acc act gtg gac    102

Leu Thr Ile Leu Thr Val Gly Ser Leu Ala Ala His Thr Thr Val Asp

 5                    10                   15                   20

aca tcc ggt ctc ctt caa cac gtg aaa ttc cag tcc agc aac ttt gag    150

Thr Ser Gly Leu Leu Gln His Val Lys Phe Gln Ser Ser Asn Phe Glu

                  25                   30                   35

aac atc ttg acg tgg gat ggt ggg ccc gct agc acc tct gac acc gtc    198

Asn Ile Leu Thr Trp Asp Gly Gly Pro Ala Ser Thr Ser Asp Thr Val

              40                   45                  50

tac agt gtg gaa tat aag aaa tac gga gag aga aag tgg ctg gcc aag    246

Tyr Ser Val Glu Tyr Lys Lys Tyr Gly Glu Arg Lys Trp Leu Ala Lys

         55                   60                   65

gcg ggc tgc cag cgg atc acc cag aag ttc tgc aac ctg act atg gag    294

Ala Gly Cys Gln Arg Ile Thr Gln Lys Phe Cys Asn Leu Thr Met Glu

     70                   75                   80

acc cgc aac cac act gag ttt tac tac gcc aag gtc acg gca gtc agc    342

Thr Arg Asn His Thr Glu Phe Tyr Tyr Ala Lys Val Thr Ala Val Ser

 85                   90                   95                  100

gca gga ggc cca cca gtc aca aag atg act gat cgt ttc agc tcg ctg    390

Ala Gly Gly Pro Pro Val Thr Lys Met Thr Asp Arg Phe Ser Ser Leu

                 105                  110                  115

cag cac act acc atc aaa ccg cct gat gtg acc tgt atc ccc aaa gtg    438

Gln His Thr Thr Ile Lys Pro Pro Asp Val Thr Cys Ile Pro Lys Val

            120                  125                   130

agg tcc att cag atg ctg gtc cac ccc aca ctc aca ccg gtc ctc tcg    486

Arg Ser Ile Gln Met Leu Val His Pro Thr Leu Thr Pro Val Leu Ser

        135                  140                  145

gaa gat ggc cac cag cta acc ctg gag gag att ttc cat gac ctg ttc    534

Glu Asp Gly His Gln Leu Thr Leu Glu Glu Ile Phe His Asp Leu Phe

    150                  155                  160

tac cgc tta gag ctc cac gtc aac cac acc tac cag atg cac ctt gaa    582

Tyr Arg Leu Glu Leu His Val Asn His Thr Tyr Gln Met His Leu Glu

165                  170                  175                  180

ggc aaa cag aga gaa tac gag ttc ctt ggc ctg act ccc gac aca gag    630

Gly Lys Gln Arg Glu Tyr Glu Phe Leu Gly Leu Thr Pro Asp Thr Glu

                185                  190                  195

ttc ctc ggc tcc atc aca att ttg act ccg ata ttg tcc aag gaa agt    678

Phe Leu Gly Ser Ile Thr Ile Leu Thr Pro Ile Leu Ser Lys Glu Ser

            200                   205                  210

gcc ccc tac gtg tgc cga gtg aag acg ctg ccc gat cgg acg tgg gcc    726

Ala Pro Tyr Val Cys Arg Val Lys Thr Leu Pro Asp Arg Thr Trp Ala

        215                  220                  225

tac tcc ttc tcg ggc gcc gtg ctc ttt tcc atg ggt ttc ctc gtc ggc    774

Tyr Ser Phe Ser Gly Ala Val Leu Phe Ser Met Gly Phe Leu Val Gly

    230                  235                  240

ttg ctc tgt tat ctg ggc tac aaa tac atc acc aag cca cct gta cct    822

Leu Leu Cys Tyr Leu Gly Tyr Lys Tyr Ile Thr Lys Pro Pro Val Pro

245                  250                  255                  260

cct aac tcc ctg aac gtc caa cgt gtc ctg acc ttt caa ccc cta cgc    870

Pro Asn Ser Leu Asn Val Gln Arg Val Leu Thr Phe Gln Pro Leu Arg

                265                  270                   275

ttc atc caa gaa cac gta ctg atc cct gtc ttg gac ctc agt ggc ccc    918

Phe Ile Gln Glu His Val Leu Ile Pro Val Leu Asp Leu Ser Gly Pro

            280                  285                  290

agc agt ctg cct cag ccc atc cag tac tcc caa gtg gtg gtg tct ggg    966

Ser Ser Leu Pro Gln Pro Ile Gln Tyr Ser Gln Val Val Val Ser Gly

        295                  300                  305

ccc agg gag cct cct gga gct gtg tgg cgg cag agc ctg tct gac ctc   1014

Pro Arg Glu Pro Pro Gly Ala Val Trp Arg Gln Ser Leu Ser Asp Leu

    310                  315                  320

acc tac gta ggg cag tca gat gtc tcc atc ctg caa cct acc aac gtg   1062

Thr Tyr Val Gly Gln Ser Asp Val Ser Ile Leu Gln Pro Thr Asn Val

325                  330                  335                  340

cca gct cag cag aca ctg tcc cca cca tcc tac gct ccg aag gct gtc   1110

Pro Ala Gln Gln Thr Leu Ser Pro Pro Ser Tyr Ala Pro Lys Ala Val

                 345                  350                  355

cct gag gtc cag ccc cct tcc tat gcg cct cag gta gcc tcg gat gcc    1158

Pro Glu Val Gln Pro Pro Ser Tyr Ala Pro Gln Val Ala Ser Asp Ala

            360                  365                  370

aaa gct ctg ttc tac tca cca caa cag ggg atg aag acc agg cct gcc    1206

Lys Ala Leu Phe Tyr Ser Pro Gln Gln Gly Met Lys Thr Arg Pro Ala

        375                  380                  385

acc tat gac ccg cag gac att ctg gac agc tgc cct gct tct tat gct    1254

Thr Tyr Asp Pro Gln Asp Ile Leu Asp Ser Cys Pro Ala Ser Tyr Ala

    390                  395                  400

gtg tgt gtg gaa gac tct ggc aaa gac tct acc cca ggc atc ctc tcc    1302

Val Cys Val Glu Asp Ser Gly Lys Asp Ser Thr Pro Gly Ile Leu Ser

405                  410                  415                  420

act ccc aaa tac ctc aag aca aaa ggt cag ctc cag gaa gac aca ctt    1350

Thr Pro Lys Tyr Leu Lys Thr Lys Gly Gln Leu Gln Glu Asp Thr Leu

                425                  430                   435

gtt aga agc tgt ctc cca ggg gac ctt tct cta cag aaa gtc acc tcc    1398

Val Arg Ser Cys Leu Pro Gly Asp Leu Ser Leu Gln Lys Val Thr Ser

            440                  445                   450

tta ggt gaa ggg gag aca cag aga cca aaa tca ctc ccc tca cct ctg    1446

Leu Gly Glu Gly Glu Thr Gln Arg Pro Lys Ser Leu Pro Ser Pro Leu

        455                  460                  465

gga ttt tgc aca gac aga gga cct gac ctt cac aca ctg cgc agt gag    1494

Gly Phe Cys Thr Asp Arg Gly Pro Asp Leu His Thr Leu Arg Ser Glu

    470                  475                  480

gaa cca gag aca cca cgg tac ctg aag ggg gcg ctg tct ctc ctg tcc    1542

Glu Pro Glu Thr Pro Arg Tyr Leu Lys Gly Ala Leu Ser Leu Leu Ser

485                  490                  495                  500

tct gtg cag atc gag ggc cac cct gtc tcc ctc cct ttg cac gtc cat    1590

Ser Val Gln Ile Glu Gly His Pro Val Ser Leu Pro Leu His Val His

                 505                  510                  515

tct gtc tca tgt tcc ccc tca gac gag gga cca agt ccc tgg ggc ctg    1638

Ser Val Ser Cys Ser Pro Ser Asp Glu Gly Pro Ser Pro Trp Gly Leu

            520                  525                   530

ctg gac tcc ctt gtg tgt cca aag gat gag ggt ccc gcg gtt gag act    1686

Leu Asp Ser Leu Val Cys Pro Lys Asp Glu Gly Pro Ala Val Glu Thr

        535                  540                  545

gag gcc atg tgc ccc agt gct gca gcc tct gag ctg gag cag tcc aca    1734

Glu Ala Met Cys Pro Ser Ala Ala Ala Ser Glu Leu Glu Gln Ser Thr

    550                  555                  560

gaa ctg gac tct ctt ttc aaa ggc ttg gcc ctg act gtg cag tgg gaa    1782

Glu Leu Asp Ser Leu Phe Lys Gly Leu Ala Leu Thr Val Gln Trp Glu

565                  570                  575                  580

tcc tga agggagatcg gagcaagcag gcctaagttt cctcccgccc  caccta        1834

Ser  *

<210>42

<211>581

<212>PRT

<213>小鼠

<400>42

Met Lys Thr Leu Leu Thr Ile Leu Thr Val Gly Ser Leu Ala Ala His

 1                5                   10                   15

Thr Thr Val Asp Thr Ser Gly Leu Leu Gln His Val Lys Phe Gln Ser

             20                  25                    30

Ser Asn Phe Glu Asn Ile Leu Thr Trp Asp Gly Gly Pro Ala Ser Thr

         35                  40                   45

Ser Asp Thr Val Tyr Ser Val Glu Tyr Lys Lys Tyr Gly Glu Arg Lys

    50                   55                   60

Trp Leu Ala Lys Ala Gly Cys Gln Arg Ile Thr Gln Lys Phe Cys Asn

65                   70                   75                   80

Leu Thr Met Glu Thr Arg Asn His Thr Glu Phe Tyr Tyr Ala Lys Val

                85                   90                    95

Thr Ala Val Ser Ala Gly Gly Pro Pro Val Thr Lys Met Thr Asp Arg

             100                  105                  110

Phe Ser Ser Leu Gln His Thr Thr Ile Lys Pro Pro Asp Val Thr Cys

        115                  120                  125

Ile Pro Lys Val Arg Ser Ile Gln Met Leu Val His Pro Thr Leu Thr

    130                  135                  140

Pro Val Leu Ser Glu Asp Gly His Gln Leu Thr Leu Glu Glu Ile Phe

145                  150                  155                  160

His Asp Leu Phe Tyr Arg Leu Glu Leu His Val Asn His Thr Tyr Gln

                 165                  170                  175

Met His Leu Glu Gly Lys Gln Arg Glu Tyr Glu Phe Leu Gly Leu Thr

            180                  185                   190

Pro Asp Thr Glu Phe Leu Gly Ser Ile Thr Ile Leu Thr Pro Ile Leu

        195                  200                  205

Ser Lys Glu Ser Ala Pro Tyr Val Cys Arg Val Lys Thr Leu Pro Asp

    210                  215                  220

Arg Thr Trp Ala Tyr Ser Phe Ser Gly Ala Val Leu Phe Ser Met Gly

225                  230                  235                  240

Phe Leu Val Gly Leu Leu Cys Tyr Leu Gly Tyr Lys Tyr Ile Thr Lys

                245                   250                  255

Pro Pro Val Pro Pro Asn Ser Leu Asn Val Gln Arg Val Leu Thr Phe

            260                  265                  270

Gln Pro Leu Arg Phe Ile Gln Glu His Val Leu Ile Pro Val Leu Asp

        275                  280                  285

Leu Ser Gly Pro Ser Ser Leu Pro Gln Pro Ile Gln Tyr Ser Gln Val

    290                  295                  300

Val Val Ser Gly Pro Arg Glu Pro Pro Gly Ala Val Trp Arg Gln Ser

305                  310                  315                  320

Leu Ser Asp Leu Thr Tyr Val Gly Gln Ser Asp Val Ser Ile Leu Gln

                325                   330                  335

Pro Thr Asn Val Pro Ala Gln Gln Thr Leu Ser Pro Pro Ser Tyr Ala

            340                   345                  350

Pro Lys Ala Val Pro Glu Val Gln Pro Pro Ser Tyr Ala Pro Gln Val

        355                  360                  365

Ala Ser Asp Ala Lys Ala Leu Phe Tyr Ser Pro Gln Gln Gly Met Lys

    370                  375                  380

Thr Arg Pro Ala Thr Tyr Asp Pro Gln Asp Ile Leu Asp Ser Cys Pro

385                  390                  395                  400

Ala Ser Tyr Ala Val Cys Val Glu Asp Ser Gly Lys Asp Ser Thr Pro

                405                  410                   415

Gly Ile Leu Ser Thr Pro Lys Tyr Leu Lys Thr Lys Gly Gln Leu Gln

            420                  425                   430

Glu Asp Thr Leu Val Arg Ser Cys Leu Pro Gly Asp Leu Ser Leu Gln

        435                  440                  445

Lys Val Thr Ser Leu Gly Glu Gly Glu Thr Gln Arg Pro Lys Ser Leu

    450                  455                  460

Pro Ser Pro Leu Gly Phe Cys Thr Asp Arg Gly Pro Asp Leu His Thr

465                  470                  475                  480

Leu Arg Ser Glu Glu Pro Glu Thr Pro Arg Tyr Leu Lys Gly Ala Leu

                 485                  490                  495

Ser Leu Leu Ser Ser Val Gln Ile Glu Gly His Pro Val Ser Leu Pro

            500                  505                  510

Leu His Val His Ser Val Ser Cys Ser Pro Ser Asp Glu Gly Pro Ser

        515                  520                  525

Pro Trp Gly Leu Leu Asp Ser Leu Val Cys Pro Lys Asp Glu Gly Pro

    530                  535                  540

Ala Val Glu Thr Glu Ala Met Cys Pro Ser Ala Ala Ala Ser Glu Leu

545                  550                  555                  560

Glu Gln Ser Thr Glu Leu Asp Ser Leu Phe Lys Gly Leu Ala Leu Thr

                565                  570                  575

Val Gln Trp Glu Ser

            580

<210>43

<211>660

<212>DNA

<213>智人

<220>

<221>CDS

<222>(1)...(660)

<400>43

atg gcg tgg agt ctt ggg agc tgg ctg ggt ggc tgc ctg ctg gtg tca   48

Met Ala Trp Ser Leu Gly Ser Trp Leu Gly Gly Cys Leu Leu Val Ser

 1                5                    10                   15

gca ttg gga atg gta cca cct ccc gaa aat gtc aga atg aat tct gtt   96

Ala Leu Gly Met Val Pro Pro Pro Glu Asn Val Arg Met Asn Ser Val

             20                   25                    30

aat ttc aag aac att cta cag tgg gag tca cct gct ttt gcc aaa ggg  144

Asn Phe Lys Asn Ile Leu Gln Trp Glu Ser Pro Ala Phe Ala Lys Gly

         35                   40                   45

aac ctg act ttc aca gct cag tac cta agt tat agg ata ttc caa gat  192

Asn Leu Thr Phe Thr Ala Gln Tyr Leu Ser Tyr Arg Ile Phe Gln Asp

     50                   55                   60

aaa tgc atg aatact acc  ttg acg gaa tgt gat ttc tca agt ctt tcc    240

Lys Cys Met Asn Thr Thr Leu Thr Glu Cys Asp Phe Ser Ser Leu Ser

 65                   70                   75                   80

aag tat ggt gac cac acc ttg aga gtc agg gct gaa ttt gca gat gag    288

Lys Tyr Gly Asp His Thr Leu Arg Val Arg Ala Glu Phe Ala Asp Glu

                  85                   90                   95

cat tca gac tgg gta aac atc acc ttc tgt cct gtg gat gac acc att    336

His Ser Asp Trp Val Asn Ile Thr Phe Cys Pro Val Asp Asp Thr Ile

            100                  105                   110

att gga ccc cct gga atg caa gta gaa gta ctt gat gat tct tta cat    384

Ile Gly Pro Pro Gly Met Gln Val Glu Val Leu Asp Asp Ser Leu His

        115                  120                  125

atg cgt ttc tta gcc cct aaa att gag aat gaa tac gaa act tgg act    432

Met Arg Phe Leu Ala Pro Lys Ile Glu Asn Glu Tyr Glu Thr Trp Thr

    130                  135                  140

atg aag aat gtg tat aac tca tgg act tat aat gtg caa tac tgg aaa    480

Met Lys Asn Val Tyr Asn Ser Trp Thr Tyr Asn Val Gln Tyr Trp Lys

145                  150                  155                  160

aac ggt act gat gaa aag ttt caa att act ccc cag tat gac ttt gag    528

Asn Gly Thr Asp Glu Lys Phe Gln Ile Thr Pro Gln Tyr Asp Phe Glu

                165                  170                  175

gtc ctc aga aac ctg gag cca tgg aca act tat tgt gtt caa gtt cga    576

Val Leu Arg Asn Leu Glu Pro Trp Thr Thr Tyr Cys Val Gln Val Arg

            180                  185                  190

ggg ttt ctt cct gat cgg aac aaa gct ggg gaa tgg agt gag cct gtc    624

Gly Phe Leu Pro Asp Arg Asn Lys Ala Gly Glu Trp Ser Glu Pro Val

        195                  200                  205

tgt gag caa aca acc cat gac gaa acg gtc ccc tcc                    660

Cys Glu Gln Thr Thr His Asp Glu Thr Val Pro Ser

    210                  215                  220

<210>44

<211>220

<212>PRT

<213>智人

<400>44

Met Ala Trp Ser Leu Gly Ser Trp Leu Gly Gly Cys Leu Leu Val Ser

 1                5                   10                   15

Ala Leu Gly Met Val Pro Pro Pro Glu Asn Val Arg Met Asn Ser Val

            20                   25                   30

Asn Phe Lys Asn Ile Leu Gln Trp Glu Ser Pro Ala Phe Ala Lys Gly

        35                   40                   45

Asn Leu Thr Phe Thr Ala Gln Tyr Leu Ser Tyr Arg Ile Phe Gln Asp

    50                   55                   60

Lys Cys Met Asn Thr Thr Leu Thr Glu Cys Asp Phe Ser Ser Leu Ser

65                   70                   75                   80

Lys Tyr Gly Asp His Thr Leu Arg Val Arg Ala Glu Phe Ala Asp Glu

                 85                   90                   95

His Ser Asp Trp Val Asn Ile Thr Phe Cys Pro Val Asp Asp Thr Ile

            100                  105                  110

Ile GIy Pro Pro Gly Met Gln Val Glu Val Leu Asp Asp Ser Leu His

        115                  120                  125

Met Arg Phe Leu Ala Pro Lys Ile Glu Asn Glu Tyr Glu Thr Trp Thr

    130                  135                  140

Met Lys Asn Val Tyr Asn Ser Trp Thr Tyr Asn Val Gln Tyr Trp Lys

145                  150                  155                  160

Asn Gly Thr Asp Glu Lys Phe Gln Ile Thr Pro Gln Tyr Asp Phe Glu

                 165                  170                  175

Val Leu Arg Asn Leu Glu Pro Trp Thr Thr Tyr Cys Val Gln Val Arg

             180                  185                  190

Gly Phe Leu Pro Asp Arg Asn Lys Ala Gly Glu Trp Ser Glu Pro Val

        195                  200                  205

Cys Glu Gln Thr Thr His Asp Glu Thr Val Pro Ser

    210                  215                  220

<210>45

<211>199

<212>PRT

<213>智人

<400>45

Met Val Pro Pro Pro Glu Asn Val Arg Met Asn Ser Val Asn Phe Lys

 1                5                   10                   15

Asn Ile Leu Gln Trp Glu Ser Pro Ala Phe Ala Lys Gly Asn Leu Thr

            20                   25                   30

Phe Thr Ala Gln Tyr Leu Ser Tyr Arg Ile Phe Gln Asp Lys Cys Met

        35                   40                   45

Asn Thr Thr Leu Thr Glu Cys Asp Phe Ser Ser Leu Ser Lys Tyr Gly

    50                   55                   60

Asp His Thr Leu Arg Val Arg Ala Glu Phe Ala Asp Glu His Ser Asp

65                   70                   75                   80

Trp Val Asn Ile Thr Phe Cys Pro Val Asp Asp Thr Ile Ile Gly Pro

                 85                   90                   95

Pro Gly Met Gln Val Glu Val Leu Ala Asp Ser Leu His Met Arg Phe

            100                  105                  110

Leu Ala Pro Lys Ile Glu Asn Glu Tyr Glu Thr Trp Thr Met Lys Asn

        115                  120                  125

Val Tyr Asn Ser Trp Thr Tyr Asn Val Gln Tyr Trp Lys Asn Gly Thr

    130                  135                  140

Asp Glu Lys Phe Gln Ile Thr Pro Gln Tyr Asp Phe Glu Val Leu Arg

145                  150                  155                  160

Asn Leu Glu Pro Trp Thr Thr Tyr Cys Val Gln Val Arg Gly Phe Leu

                 165                  170                  175

Pro Asp Arg Asn Lys Ala Gly Glu Trp Ser Glu Pro Val Cys Glu Gln

            180                  185                   190

Thr Thr His Asp Glu Thr Val

        195

<210>46

<211>211

<212>PRT

<213>智人

<400>46

Ser Asp Ala His Gly Thr Glu Leu Pro Ser Pro Pro Ser Val Trp Phe

 1                5                   10                   15

Glu Ala Glu Phe Phe His His Ile Leu His Trp Thr Pro Ile Pro Asn

             20                  25                   30

Gln Ser Glu Ser Thr Cys Tyr Glu Val Ala Leu Leu Arg Tyr Gly Ile

        35                   40                   45

Glu Ser Trp Asn Ser Ile Ser Asn Cys Ser Gln Thr Leu Ser Tyr Asp

    50                   55                   60

Leu Thr Ala Val Thr Leu Asp Leu Tyr His Ser Asn Gly Tyr Arg Ala

65                   70                   75                   80

Arg Val Arg Ala Val Asp Gly Ser Arg His Ser Asn Trp Thr Val Thr

                 85                   90                   95

Asn Thr Arg Phe Ser Val Asp Glu Val Thr Leu Thr Val Gly Ser Val

            100                  105                  110

Asn Leu Glu Ile His Asn Gly Phe Ile Leu Gly Lys Ile Gln Leu Pro

        115                  120                  125

Arg Pro Lys Met Ala Pro Ala Asn Asp Thr Tyr Glu Ser Ile Phe Ser

    130                  135                  140

His Phe Arg Glu Tyr Glu Ile Ala Ile Arg Lys Val Pro Gly Asn Phe

145                  150                  155                  160

Thr Phe Thr His Lys Lys Val Lys His Glu Asn Phe Ser Leu Leu Thr

                165                  170                  175

Ser Gly Glu Val Gly Glu Phe Cys Val Gln Val Lys Pro Ser Val Ala

            180                  185                  190

Ser Arg Ser Asn Lys Gly Met Trp Ser Lys Glu Glu Cys Ile Ser Leu

        195                  200                  205

Thr Arg Gln

    210

<210>47

<211>201

<212>PRT

<213>智人

<400>47

Asp Glu Val Ala Ile Leu Pro Ala Pro Gln Asn Leu Ser Val Leu Ser

 1                5                   10                   15

Thr Asn Met Lys His Leu Leu Met Trp Ser Pro Val Ile Ala Pro Gly

             20                   25                   30

Glu Thr Val Tyr Tyr Ser Val Glu Tyr Gln Gly Glu Tyr Glu Ser Leu

        35                   40                   45

Tyr Thr Ser His Ile Trp Ile Pro Ser Ser Trp Cys Ser Leu Thr Glu

    50                   55                   60

Gly Pro Glu Cys Asp Val Thr Asp Asp Ile Thr Ala Thr Val Pro Tyr

65                   70                   75                   80

Asn Leu Arg Val Arg Ala Thr Leu Gly Ser Gln Thr Ser Ala Trp Ser

                85                   90                   95

Ile Leu Lys His Pro Phe Asn Arg Asn Ser Thr Ile Leu Thr Arg Pro

            100                  105                  110

Gly Met Glu Ile Thr Lys Asp Gly Phe His Leu Val Ile Glu Leu Glu

        115                  120                  125

Asp Leu Gly Pro Gln Phe Glu Phe Leu Val Ala Tyr Trp Arg Arg Glu

    130                  135                  140

Pro Gly Ala Glu Glu His Val Lys Met Val Arg Ser Gly Gly Ile Pro

145                  150                  155                  160

Val His Leu Glu Thr Met Glu Pro Gly Ala Ala Tyr Cys Val Lys Ala

                165                  170                  175

Gln Thr Phe Val Lys Ala Ile Gly Arg Tyr Ser Ala Phe Ser Gln Thr

            180                  185                  190

Glu Cys Val Glu Val Gln Gly Glu Ala

        195                  200

<210>48

<211>68

<212>PRT

<213>小鼠

<400>48

His Thr Thr Val Asp Thr Ser Gly Leu Leu Gln His Val Lys Phe Gln

 1                5                   10                   15

Ser Ser Asn Phe Glu Asn Ile Leu Thr Trp Asp Gly Gly Pro Ala Ser

            20                   25                   30

Thr Ser Asp Thr Val Tyr Ser Val Glu Tyr Lys Lys Tyr Gly Glu Arg

        35                   40                   45

Lys Trp Leu Ala Lys Ala Gly Cys Gln Arg Ile Thr Gln Lys Phe Cys

    50                   55                   60

Asn Leu Thr Met

65

<210>49

<211>26

<212>PRT

<213>小鼠

<400>49

Glu Thr Arg Asn His Thr Glu Phe Tyr Tyr Ala Lys Val Thr Ala Val

 1                5                   10                   15

Ser Ala Gly Gly Pro Pro Val Thr Lys Met

            20                   25

<210>50

<211>28

<212>PRT

<213>小鼠

<400>50

Thr Asp Arg Phe Ser Ser Leu Gln His Thr Thr Ile Lys Pro Pro Asp

 1                5                   10                   15

Val Thr Cys Ile Pro Lys Val Arg Ser Ile Gln Met

            20                   25

<210>51

<211>40

<212>PRT

<213>小鼠

<400>51

Leu Val His Pro Thr Leu Thr Pro Val Leu Ser Glu Asp Gly His Gln

 1                5                   10                   15

Leu Thr Leu Glu Glu Ile Phe His Asp Leu Phe Tyr Arg Leu Glu Leu

            20                   25                   30

His Val Asn His Thr Tyr Gln Met

        35                   40

<210>52

<211>50

<212>PRT

<213>小鼠

<400>52

His Leu Glu Gly Lys Gln Arg Glu Tyr Glu Phe Leu Gly Leu Thr Pro

 1                5                   10                   15

Asp Thr Glu Phe Leu Gly Ser Ile Thr Ile Leu Thr Pro Ile Leu Ser

            20                   25                   30

Lys Glu Ser Ala Pro Tyr Val Cys Arg Val Lys Thr Leu Pro Leu Val

        35                   40                   45

Pro Arg

    50

<210>53

<211>70

<212>PRT

<213>小鼠

<400>53

His Leu Glu Gly Lys Gln Arg Glu Tyr Glu Phe Leu Gly Leu Thr Pro

 1                5                   10                   15

Asp Thr Glu Phe His Leu Glu Gly Lys Gln Arg Glu Tyr Glu Phe Leu

            20                   25                   30

Gly Leu Thr Pro Asp Thr Glu Phe Leu Gly Ser Ile Thr Ile Leu Thr

        35                   40                   45

Pro Ile Leu Ser Lys Glu Ser Ala Pro Tyr Val Cys Arg Val Lys Thr

    50                   55                   60

Leu Pro Leu Val Pro Arg

65                   70

<210>54

<211>46

<212>PRT

<213>小鼠

<400>54

Glu Thr Arg Asn His Thr Glu Phe Tyr Tyr Ala Lys Val Thr Ala Val

 1                5                   10                   15

Ser Ala Gly Gly Glu Thr Arg Asn His Thr Glu Phe Tyr Tyr Ala Lys

            20                   25                   30

Val Thr Ala Val Ser Ala Gly Gly Pro Pro Val Thr Lys Met

        35                   40                   45

<210>55

<211>48

<212>PRT

<213>小鼠

<220>

<221>变体

<222>6，11，13，

<223>Xaa＝任一氨基酸

<400>55

Thr Asp Arg Phe Ser Xaa Leu Gln His Thr Xaa Ile Xaa Pro Xaa Asp

 1                5                   10                   15

Xaa Xaa Xaa Ile Thr Asp Arg Phe Ser Ser Leu Gln His Thr Thr Ile

            20                   25                   30

Lys Pro Pro Asp Val Thr Cys Ile Pro Lys Val Arg Ser Ile Gln Met

        35                   40                   45

<210>56

<211>92

<212>PRT

<213>智人

<400>56

Pro Glu Asp Pro Ser Asp Leu Leu Gln His Val Lys Phe Gln Ser Ser

 1                5                   10                   15

Asn Phe Glu Asn Ile Leu Thr Trp Asp Ser Gly Pro Glu Gly Thr Pro

            20                   25                   30

Asp Thr Val Tyr Ser Ile Glu Tyr Lys Thr Tyr Gly Glu Arg Asp Trp

        35                   40                   45

Val Ala Lys Lys Gly Cys Gln Arg Ile Thr Arg Lys Ser Cys Asn Leu

    50                   55                   60

Thr Val Glu Thr Gly Asn Leu Thr Glu Leu Tyr Tyr Ala Arg Val Thr

65                   70                   75                   80

Ala Val Ser Ala Gly Gly Arg Ser Ala Thr Lys Met

                85                   90

<210>57

<211>28

<212>PRT

<213>智人

<400>57

Thr Asp Arg Phe Ser Ser Leu Gln His Thr Thr Leu Lys Pro Pro Asp

 1                5                   10                   15

Val Thr Cys Ile Ser Lys Val Arg Ser Ile Gln Met

            20                   25

<210>58

<211>40

<212>PRT

<213>智人

<400>58

Ile Val His Pro Thr Pro Thr Pro Ile Arg Ala Gly Asp Gly His Arg

 1                5                   10                   15

Leu Thr Leu Glu Asp Ile Phe His Asp Leu Phe Tyr His Leu Glu Leu

            20                   25                   30

Gln Val Asn Arg Thr Tyr Gln Met

        35                   40

<210>59

<211>25

<212>PRT

<213>智人

<400>59

His Leu Gly Gly Lys Gln Arg Glu Tyr Glu Phe Phe Gly Leu Thr Pro

 1                5                   10                   15

Asp Thr Glu Phe Leu Gly Thr Ile Met

            20                   25

<210>60

<211>14

<212>PRT

<213>智人

<400>60

Ile Cys Val Pro Thr Trp Ala Lys Glu Ser Ala Pro Tyr Met

 1                5                   10

<210>61

<211>12

<212>PRT

<213>智人

<400>61

Cys Arg Val Lys Thr Leu Pro Asp Arg Thr Trp Thr

 1                5                   10

<210>62

<211>212

<212>PRT

<213>人工序列

<220>

<223>鼠类IL-22RA可溶性受体在C末端带有切割位点(Leu Val Pro Arg)

<400>62

His Thr Thr Val Asp Thr Ser Gly Leu Leu Gln His Val Lys Phe Gln

 1                5                   10                   15

Ser Ser Asn Phe Glu Asn Ile Leu Thr Trp Asp Gly Gly Pro Ala Ser

            20                   25                   30

Thr Ser Asp Thr Val Tyr Ser Val Glu Tyr Lys Lys Tyr Gly Glu Arg

        35                   40                   45

Lys Trp Leu Ala Lys Ala Gly Cys Gln Arg Ile Thr Gln Lys Phe Cys

    50                   55                   60

Asn Leu Thr Met Glu Thr Arg Asn His Thr Glu Phe Tyr Tyr Ala Lys

65                   70                   75                   80

Val Thr Ala Val Ser Ala Gly Gly Pro Pro Val Thr Lys Met Thr Asp

                85                   90                   95

Arg Phe Ser Ser Leu Gln His Thr Thr Ile Lys Pro Pro Asp Val Thr

            100                  105                  110

Cys Ile Pro Lys Val Arg Ser Ile Gln Met Leu Val His Pro Thr Leu

        115                  120                  125

Thr Pro Val Leu Ser Glu Asp Gly His Gln Leu Thr Leu Glu Glu Ile

    130                  135                  140

Phe His Asp Leu Phe Tyr Arg Leu Glu Leu His Val Asn His Thr Tyr

145                  150                  155                  160

Gln Met His Leu Glu Gly Lys Gln Arg Glu Tyr Glu Phe Leu Gly Leu

                165                  170                  175

Thr Pro Asp Thr Glu Phe Leu Gly Ser Ile Thr Ile Leu Thr Pro Ile

            180                  185                  190

Leu Ser Lys Glu Ser Ala Pro Tyr Val Cys Arg Val Lys Thr Leu Pro

        195                  200                  205

Leu Val Pro Arg

    210

Claims (73)

1.产生针对多肽的抗体的方法，包括：

用选自下述的多肽接种动物：

(a)由SEQ ID NO：3中的氨基酸1(脯氨酸)至氨基酸6(天冬氨酸)氨基酸序列构成的多肽；

(b)由SEQ ID NO：3中的氨基酸26(丝氨酸)至氨基酸32(脯氨酸)氨基酸序列构成的多肽；

(c)由SEQ ID NO：3中的氨基酸41(赖氨酸)至氨基酸47(天冬氨酸)氨基酸序列构成的多肽；

(d)由SEQ ID NO：2中的氨基酸49(缬氨酸)至氨基酸62(半胱氨酸)氨基酸序列构成的多肽；

(e)由SEQ ID NO：3中的氨基酸41(赖氨酸)至氨基酸62(半胱氨酸)氨基酸序列构成的多肽；

(f)由SEQ ID NO：3中的氨基酸84(丙氨酸)至氨基酸97(丝氨酸)氨基酸序列构成的多肽；

(g)由SEQ ID NO：3中的氨基酸103(苏氨酸)至氨基酸108(天冬氨酸)氨基酸序列构成的多肽；

(h)由SEQ ID NO：3中的氨基酸130(精氨酸)至氨基酸135(组氨酸)氨基酸序列构成的多肽；

(i)由SEQ ID NO：3中的氨基酸164(甘氨酸)至氨基酸166(赖氨酸)氨基酸序列构成的多肽；

(j)由SEQ ID NO：3中的氨基酸175(酪氨酸)至氨基酸179(谷氨酸)氨基酸序列构成的多肽；

(k)由SEQ ID NO：3中的氨基酸193(赖氨酸)至氨基酸196(丙氨酸)氨基酸序列构成的多肽；

(l)由SEQ ID NO：3中的氨基酸203(赖氨酸)至氨基酸209(苏氨酸)氨基酸序列构成的多肽；

(m)由SEQ ID NO：3中的氨基酸序列构成的多肽；和

(n)由SEQ ID NO：4中的氨基酸序列构成的多肽；和

其中所述多肽激发动物产生免疫应答以产生抗体；和

从动物中分离抗体；和

其中所述抗体特异性地结合IL-22RA多肽(SEQ ID NO：2或SEQ IDNO：3)；和降低IL-20(SEQ ID NO：8)或IL-22(SEQ ID NO：6)的活性。

2.根据权利要求1的方法，其中通过所述方法产生的抗体降低IL-20(SEQ ID NO：8)或IL-22(SEQ ID NO：6)的促炎症活性。

3.权利要求1的方法，其中通过所述方法产生的抗体中和IL-20(SEQ ID NO：8)或IL-22(SEQ ID NO：6)与IL-22RA(SEQ ID NO：2)的相互作用。

4.权利要求3的方法，其中，通过在体外基于细胞的中和测验中表现出IL-20(SEQ ID NO：8)或IL-22(SEQ ID NO：6)的中和来测定所述抗体的中和作用。

5.权利要求1的方法，其中，通过所述方法产生的抗体降低IL-20(SEQ ID NO：8)和IL-22(SEQ ID NO：6)两者的促炎症活性。

6.权利要求1的方法，其中通过所述方法产生的抗体中和IL-20(SEQ ID NO：8)和IL-22(SEQ ID NO：6)两者与IL-22RA(SEQ IDNO：2)的相互作用。

7.权利要求3的方法，其中，通过在体外基于细胞的中和测验中表现出IL-20(SEQ ID NO：8)和IL-22(SEQ ID NO：6)两者的中和来测定所述抗体的中和作用。

8.权利要求1的方法产生的抗体，该抗体结合SEQ ID NO：2或SEQ TD NO：3的多肽。

9.权利要求2的抗体，其中所述抗体是：(a)多克隆抗体、(b)鼠类单克隆抗体、(c)来源于(b)的人源化抗体、(d)抗体片段或(e)人单克隆抗体。

10.权利要求2的抗体，其中所述抗体还包含放射性核素、酶、底物、辅助因子、荧光标记物、化学发光标记物、肽标签、磁性颗粒或毒素。

11.权利要求9的抗体，其中所述抗体还包含PEG化。

12.权利要求5的抗体，其中所述抗体是：(a)多克隆抗体、(b)鼠类单克隆抗体、(c)来源于(b)的人源化抗体、(d)抗体片段或(e)人单克隆抗体。

13.权利要求5的抗体，其中所述抗体还包含放射性核素、酶、底物、辅助因子、荧光标记物、化学发光标记物、肽标签、磁性颗粒、药物或毒素。

14.权利要求12的抗体，其中所述抗体还包含PEG化。

15.结合多肽的抗体或抗体片段，其结合的包含SEQ ID NO：3中所示的氨基酸残基序列的多肽；并且，降低IL-20(SEQ ID NO：8)或IL-22(SEQ ID NO：6)的促炎症活性。

16.根据权利要求15的抗体或抗体片段，其中所述抗体或抗体片段降低IL-20(SEQ ID NO：8)和IL-22(SEQ ID NO：6)两者的促炎症活性。

17.根据权利要求15的抗体或抗体片段，其中所述抗体或抗体片段是：(a)多克隆抗体，(b)鼠类单克隆抗体，(c)来源于(b)的人源化抗体，(d)抗体片段或(e)人单克隆抗体。

18.根据权利要求15的抗体或抗体片段，其中所述抗体或抗体片段还包含放射性核素、酶、底物、辅助因子、荧光标记物、化学发光标记物、肽标签、磁性颗粒、药物或毒素。

19.根据权利要求17的抗体，其中所述抗体还包含PEG化。

20.根据权利要求16的抗体或抗体片段，其中所述抗体或抗体片段是：(a)多克隆抗体，(b)鼠类单克隆抗体，(c)来源于(b)的人源化抗体，(d)抗体片段或(e)人单克隆抗体。

21.根据权利要求16的抗体或抗体片段，其中所述抗体或抗体片段还包含放射性核素、酶、底物、辅助因子、荧光标记物、化学发光标记物、肽标签、磁性颗粒、药物或毒素。

22.根据权利要求20的抗体，其中所述抗体还包含PEG化。

23.降低或抑制IL-22诱导的或IL-20诱导的造血细胞和造血祖细胞增殖或分化的方法，包括：用含有与不用抗体培养的骨髓或外周血细胞相比，足以降低骨髓或外周血细胞中的造血细胞增殖或分化的量的根据权利要求3的抗体的组合物培养骨髓或外周血细胞。

24.权利要求23的方法，其中造血细胞和造血祖细胞是淋巴样细胞。

25.权利要求24的方法，其中淋巴样细胞是巨噬细胞或T细胞。

26.降低IL-22诱导的或IL-20诱导的炎症的方法，其中包括给患有炎症的哺乳动物施用足以减轻炎症的量的权利要求3的抗体的组合物。

27.降低或抑制IL-22诱导的和IL-20诱导的造血细胞和造血祖细胞增殖或分化的方法，包括：用含有与不用抗体培养的骨髓或外周血细胞相比，足以降低骨髓或外周血细胞中的造血细胞增殖或分化的量的根据权利要求5的抗体的组合物培养骨髓或外周血细胞。

28.权利要求27的方法，其中造血细胞和造血祖细胞是淋巴样细胞。

29.权利要求28的方法，其中淋巴样细胞是巨噬细胞或T细胞。

30.降低或抑制IL-22诱导的和IL-20诱导的炎症的方法，其中包括给患有炎症的哺乳动物施用足以减轻炎症的量的权利要求5的抗体的组合物。

31.降低或抑制IL-22诱导的和IL-20诱导的造血细胞和造血祖细胞增殖或分化的方法，包括：用含有与不用抗体或抗体片段培养的骨髓或外周血细胞相比，足以降低骨髓或外周血细胞中的造血细胞增殖或分化的量的根据权利要求15的抗体或抗体片段的组合物培养骨髓或外周血细胞。

32.权利要求31的方法，其中造血细胞和造血祖细胞是淋巴样细胞。

33.权利要求32的方法，其中淋巴样细胞是巨噬细胞或T细胞。

34.降低或抑制IL-22诱导的和IL-20诱导的炎症的方法，其中包括给患有炎症的哺乳动物施用足以减轻炎症的量的权利要求15的抗体或抗体片段的组合物。

35.降低或抑制IL-22诱导的和IL-20诱导的造血细胞和造血祖细胞增殖或分化的方法，包括：用含有与不用抗体培养的骨髓或外周血细胞相比，足以降低骨髓或外周血细胞中的造血细胞增殖或分化的量的根据权利要求16的抗体或抗体片段的组合物培养骨髓或外周血细胞。

36.权利要求35的方法，其中造血细胞和造血祖细胞是淋巴样细胞。

37.权利要求36的方法，其中淋巴样细胞是巨噬细胞或T细胞。

38.降低或抑制IL-22诱导的和IL-20诱导的炎症的方法，其中包括给患有炎症的哺乳动物施用足以减轻炎症的量的权利要求16的抗体或抗体片段的组合物。

39.抑制患有炎症的哺乳动物的炎症应答的方法，包括：

(1)测定血清淀粉样A蛋白的水平；

(2)给予包含在可接受的药物载体中的根据权利要求3的抗体的组合物；

(3)给药后测定血清淀粉样A蛋白的水平；

(4)比较第(1)步和第(3)步的血清淀粉样A蛋白的水平，其中血清淀粉样A蛋白水平没有增加或下降预示着炎症应答被抑制。

40.抑制患有炎症的哺乳动物的炎症应答的方法，包括：

(1)测定血清淀粉样A蛋白的水平；

(2)给予包含在可接受的药物载体中的根据权利要求5的抗体的组合物；

(3)给药后测定血清淀粉样A蛋白的水平；

(4)比较第(1)步和第(3)步的血清淀粉样A蛋白的水平，其中血清淀粉样A蛋白水平没有增加或下降预示着炎症应答被抑制。

41.抑制患有炎症的哺乳动物的炎症应答的方法，包括：

(1)测定血清淀粉样A蛋白的水平；

(2)给予包含在可接受的药物载体中的根据权利要求15的抗体的组合物；

(3)给药后测定血清淀粉样A蛋白的水平；

(4)比较第(1)步和第(3)步的血清淀粉样A蛋白的水平，其中血清淀粉样A蛋白水平没有增加或下降预示着炎症应答被抑制。

42.抑制患有炎症的哺乳动物的炎症应答的方法，包括：

(1)测定血清淀粉样A蛋白的水平；

(2)给予包含在可接受的药物载体中的根据权利要求16的抗体的组合物；

(3)给药后测定血清淀粉样A蛋白的水平；

(4)比较第(1)步和第(3)步的血清淀粉样A蛋白的水平，其中血清淀粉样A蛋白水平没有增加或下降预示着炎症应答被抑制。

43.治疗患有IL-22或IL-20在其中起作用的炎性疾病的哺乳动物的方法，其包括：

给哺乳动物施用IL-22或IL-20的拮抗剂以减轻炎症，其中所述拮抗剂包含：(i)特异性结合IL-22RA(SEQ ID NO：3)的多肽或多肽片段的抗体、抗体片段或结合多肽，或(ii)IL-22RA(SEQ ID NO：3)的多肽或多肽片段；和其中IL-22(SEQ ID NO：6)或IL-20(SEQ ID NO：8)的炎症活性被降低。

44.权利要求43的方法，其中所述疾病是慢性炎性疾病。

45.权利要求44的方法，其中所述疾病是慢性炎性疾病，包括炎性肠病、溃疡性结肠炎、克罗恩病、关节炎、特应性皮炎或牛皮癣。

46.权利要求43的方法，其中所述疾病是急性炎性疾病。

47.权利要求46的方法，其中所述疾病是急性炎性疾病，其包括内毒素血症、败血症、中毒性休克综合征或传染性疾病。

48.权利要求43的方法，其中所述抗体、抗体片段或结合多肽还包含放射性核素、酶、底物、辅助因子、荧光标记物、化学发光标记物、肽标签、磁性颗粒、药物或毒素。

49.治疗患有IL-22和IL-20两者在其中起作用的炎性疾病的哺乳动物的方法，其包括：

给哺乳动物施用IL-22和IL-20两者的拮抗剂以减轻炎症，其中所述拮抗剂包含(i)特异性结合IL-22RA(SEQ ID NO：3)的多肽或多肽片段的抗体、抗体片段或结合多肽，或(ii)IL-22RA(SEQ ID NO：3)的多肽或多肽片段；和

其中IL-22(SEQ ID NO：6)和IL-20(SEQ ID NO：8)两者的炎症活性被降低。

50.权利要求49的方法，其中所述疾病是慢性炎性疾病。

51.权利要求50的方法，其中所述疾病是慢性炎性疾病，包括炎性肠病、溃疡性结肠炎、克罗恩病、关节炎、特应性皮炎或牛皮癣。

52.权利要求49的方法，其中所述疾病是急性炎性疾病。

53.权利要求52的方法，其中所述疾病是急性炎性疾病，其包括内毒素血症、败血症、中毒性休克综合征或传染性疾病。

54.权利要求49的方法，其中所述抗体、抗体片段或结合多肽还包含放射性核素、酶、底物、辅助因子、荧光标记物、化学发光标记物、肽标签、磁性颗粒、药物或毒素。

55.抗体，其包括特异性结合人IL-22RA(SEQ ID NO：3)抗原表位的单克隆抗体，所述抗原表位选自：

(a)由SEQ ID NO：3中的氨基酸1(脯氨酸)至氨基酸6(天冬氨酸)氨基酸序列构成的表位；

(b)由SEQ ID NO：3中的氨基酸26(丝氨酸)至氨基酸32(脯氨酸)氨基酸序列构成的表位；

(c)由SEQ ID NO：3中的氨基酸41(赖氨酸)至氨基酸47(天冬氨酸)氨基酸序列构成的表位；

(d)由SEQ ID NO：2中的氨基酸49(缬氨酸)至氨基酸62(半胱氨酸)氨基酸序列构成的表位；

(e)由SEQ ID NO：3中的氨基酸41(赖氨酸)至氨基酸62(半胱氨酸)氨基酸序列构成的表位；

(f)由SEQ ID NO：3中的氨基酸84(丙氨酸)至氨基酸97(丝氨酸)氨基酸序列构成的表位；

(g)由SEQ ID NO：3中的氨基酸103(苏氨酸)至氨基酸108(天冬氨酸)氨基酸序列构成的表位；

(h)由SEQ ID NO：3中的氨基酸130(精氨酸)至氨基酸135(组氨酸)氨基酸序列构成的表位；

(i)由SEQ ID NO：3中的氨基酸164(甘氨酸)至氨基酸166(赖氨酸)氨基酸序列构成的表位；

(j)由SEQ ID NO：3中的氨基酸175(酪氨酸)至氨基酸179(谷氨酸)氨基酸序列构成的表位；

(k)由SEQ ID NO：3中的氨基酸193(赖氨酸)至氨基酸196(丙氨酸)氨基酸序列构成的表位；

(l)由SEQ ID NO：3中的氨基酸203(赖氨酸)至氨基酸209(苏氨酸)氨基酸序列构成的表位；

(m)由SEQ ID NO：3中的氨基酸序列构成的表位；和

(n)由SEQ ID NO：4中的氨基酸序列构成的表位；

并且，其中所述抗体降低或中和人IL-22(SEQ ID NO：6)或IL-20(SEQ ID NO：8)的活性。

56.权利要求55的抗体，其中所述抗体降低或中和人IL-22(SEQID NO：6)和IL-20(SEQ ID NO：8)两者的活性。

57.权利要求55的抗体，其中所述抗体选自：(a)鼠类单克隆抗体、(b)来源于(a)的人源化抗体、(c)抗体片段和(d)人单克隆抗体。

58.权利要求57的抗体，其中所述抗体还包含PEG化。

59.权利要求56的抗体，其中所述抗体选自：(a)鼠类单克隆抗体、(b)来源于(a)的人源化抗体、(c)抗体片段和(d)人单克隆抗体。

60.权利要求59的抗体，其中所述抗体还包含PEG化。

61.治疗与IL-22RA活性相关的受试者的病理状态的方法，包括给予有效量的权利要求55的抗体，从而治疗所述的病理状态。

62.权利要求61的方法，其中所述病理状态是慢性炎性状态。

63.权利要求62的方法，其中所述慢性炎性状态包括炎性肠病、溃疡性结肠炎、克罗恩病、关节炎、特应性皮炎或牛皮癣。

64.权利要求61的方法，其中所述病理状态是急性炎性状态。

65.权利要求64的方法，其中所述急性炎性状态包括内毒素血症、败血病、中毒性休克综合征或传染性疾病。

66.治疗患有IL-22RA在其中起作用的炎性疾病的哺乳动物的方法，其包括：

给哺乳动物施用IL-22RA的拮抗剂以减轻炎症，其中所述拮抗剂包含特异性结合IL-22RA(SEQ ID NO：3)的多肽或多肽片段的抗体、抗体片段或结合多肽；和

其中炎症活性被降低。

67.权利要求66的方法，其中所述疾病是慢性炎性疾病。

68.权利要求67的方法，其中所述疾病是慢性炎性疾病，包括炎性肠病、溃疡性结肠炎、克罗恩病、关节炎、特应性皮炎或牛皮癣。

69.权利要求66的方法，其中所述疾病是急性炎性疾病。

70.权利要求69的方法，其中所述疾病是急性炎性疾病，包括内毒素血症、败血病、中毒性休克综合征或传染性疾病。

71.权利要求66的方法，其中所述抗体、抗体片段或结合多肽还包含放射性核素、酶、底物、辅助因子、荧光标记物、化学发光标记物、肽标签、磁性颗粒、药物或毒素。

72.权利要求66的方法，其中所述抗体、抗体片段或结合多肽还包含PEG化。

73.降低炎症的方法，包括给患有炎症的哺乳动物施用足以降低炎症的量的权利要求55的抗体的组合物。