CN101151379A - 检测生物样品中的人乳头瘤病毒的系统、方法和组合物 - Google Patents

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    • C12Q1/6879—Nucleic acid products used in the analysis of nucleic acids, e.g. primers or probes for sex determination

Abstract

本发明包括但不限于为检测、治疗和/或管理癌症和发育异常而检测、鉴定和定量生物样品中低至单拷贝水平的人乳头瘤病毒(HPV)的系统、方法和组合物，所述生物样品包括但不限于哺乳动物体液和宫颈刮样。

Description

检测生物样品中的人乳头瘤病毒的系统、方法和组合物
相关申请的交叉参考
[0001]本申请要求2005年1月14日提交的美国临时专利申请60/644,374的优先权，该申请全文纳入本文作为参考。
授权信息
[0002]本发明的工作部分得到了Michigan Life Sciences Corridor(MEDC-410)、Michigan Tri-Technology Corridor、NIH(R21 DK69877、R21 DK070237、CA104830和CA94328)、NIH Head/Neck Cancer SPORE(1P50CA97248)和MDRTC Cell andMolecular Biology Core(DK20572)资金的资助。政府对本发明享有一定权利。
发明领域
[0003]本发明涉及检测和管理生物样品中的微生物制剂领域。
发明背景
[0004]最近的研究表明，人乳头瘤病毒(“HPV”)与宫颈癌、头/颈癌、肛门癌以及血吸虫病相关的膀胱癌有重要联系。宫颈癌和肛门癌几乎一律与HPV感染有关。研究最近公布的报道发现，HPV DNA在头和颈肿瘤中的普遍率达到35％。更最近，一些研究者采用定量PCR(“QPCR”)在253个肿瘤样本的大量研究中证实了这些发现，他们在25％的样本中检测到HPV DNA。HPV也与肛门发育异常和癌症有关。其它研究者还发现，接近50％的血吸虫病造成的膀胱癌通过原位杂交而具有HPVDNA。
[0005]HPV类型16和18属于‘高风险’病毒类型，因为它们的存在与肿瘤前损伤和癌症有关。相反，‘低风险’类型通常是HPV类型6和11，它们通常与良性损伤有关。HPV的致癌潜能主要是由于两种病毒癌蛋白E6和E7。HPV类型之间致癌潜能的差异是由于E6和E7蛋白的种类特异性差异。致癌HPV毒株的E6蛋白显示与p53蛋白相互作用并促进其通过依赖于遍在蛋白的途径降解。类似地，E7癌蛋白与视网膜细胞瘤(Rb)蛋白复合并将其激活。p53和Rb都是重要的肿瘤抑制基因，它们的产物调节细胞周期、管理DNA修复过程、并参与程序化细胞死亡或凋亡。HPV会破坏这些肿瘤抑制蛋白，从而导致发生突变和细胞永生。
[0006]已经在研究检测血清DNA以发现异常癌细胞基因组的技术以作为一种可能的癌症的分子检测方法。尽管一些研究者发现TaqMan定量PCR法可检测一些头/颈癌和宫颈癌患者血清中的HPV DNA，但用这种技术检测到的血清和其它生物部位的HPV DNA的量不足以用作临床工具用于大多数对象。
[0007]目前的限制的一个例子是与目前的标准HPV检测法Digene检验[1]有关的问题，其中包括：
[0008]1.Digene检验与已知致病类型之外的HPV类型非特异性交叉反应[2]。因此用Digene检验不可避免地会得到假阳性；
[0009]2.Digene检验要求至少数千个HPV分子以得出阳性结果[1]。因此当血清和/或血液中存在小量分子时就无法进行筛检；和
[0010]3.Digene检验不显示宫颈ThinPrep中发现的是何种HPV类型。这点是重要是，因为如果无法鉴别非致病类型HPV产生的信号则这种类型的HPV会产生假阳性结果。
[0011]从这些限制以及本领域的其它缺点开来，仍旧需要检测和鉴定用现有方法无法检测其水平的生物样品中各种HPV的的系统、方法和组合物。
发明概述
[0012]本发明包括但不限于为检测、治疗和/或管理癌症和发育异常而检测、鉴定和定量生物样品中低至单拷贝水平的HPV的系统、方法和组合物，所述生物样品包括但不限于哺乳动物体液和宫颈刮样。在一些优选的实施方案中，本发明包括更加灵敏的质谱技术，该技术可鉴定单个HPV序列、提高HPV DNA检测的灵敏度、并提供血清和/或外周血HPV-DNA与几类肿瘤更频繁相关的证据。因此，本发明包括能够从外周血和血清中筛检作为HPV相关的残余肿瘤和发育异常标志的HPVDNA的系统、方法和组合物。
[0013]精通本领域的技术人员通过阅读下面的附图和详细描述将了解本发明的其它方面。
附图简述
[0014]本发明现通过举例方式参照附图进行描述，图中：
[0015]图1显示了在一次如本发明所述反应中筛检13种不同HPV类型的质谱结果。
[0016]图2概括了本发明一些实施方案所述的流程图，但不限于此。
[0017]图3A-D分别显示了肿瘤(3A)、Pap-阳性标本(3B)、HC2-阳性标本(3C)和Pap-阴性标本(3D)中的HPV滴度。
发明详述
[0018]在一些实施方案中，本发明包括同时分析和测定肿瘤或发育异常组织中与癌症或发育异常相关的一种或多种类型的致病性HPV的系统、方法和组合物，但不限于此。采用本发明，可对低至100个或更少的HPV拷贝数量进行这种分析和测定，这种方法比美国食品药品管理局(“FDA”)目前批准用于检测HPV的需要1000-5000个拷贝的测试法更加灵敏[1]。本发明还能检索给定的HPV单个序列而提高了灵敏度，能够检测低至1aM(在一些实施方案中，5微升PCR体积中只有1个分子)。这种高灵敏度能够检测包括血液和血清在内的其它生物样品中的病理性HPV。
[0019]此外，本发明包括的系统、方法和组合物能以目前所用某些方法无法达到的灵敏度、特异性和定量性能详细描述与给定肿瘤相关的HPV类型[1]，目前的方法检测时采用许多探针的组合但不能定量。
[0020]在一些实施方案中，一旦根据本发明确定了一种或多种HPV类型，本发明还能灵敏且特异地筛检生物样品(包括但不限于哺乳动物的体液)中单拷贝水平的HPV，但不限于此。这种单拷贝水平的灵敏且特异的筛检之前是不可能做到的。本发明揭示了一种之前未知的自然状态，即血清和/或血液中存在HPV均与发育异常或癌症相关，而正常对象则不。这种筛检没有出现参考文献[4]中所述的假阳性，从而使得这种筛检非常适合鉴定发育异常或癌症。
[0021]在一些优选的实施方案中，本发明包括在一次检测中测定生物样品中存在的致病性HPV的类型和数量的系统、方法和组合物，但不限于此。在一些实施方案中，本发明包括构建用于质谱测定系统的检测一种或多种高风险或中等风险HPV类型的探针。可采用Digene ThinPrep检验[1]鉴定方法选择这种高风险或中等风险HPV类型，Digene ThinPrep检验是目前FDA批准用于分析宫颈刮样中HPV的检验法。本发明的一些实施方案在Digene检验的13种HPV类型中增加了另外6种类型可引起宫颈癌和肛门癌的高风险性HPV[5，6]。这种检测可在低至至少100aM(约300个分子)时进行，其数量级比需要数千个HPV分子以得到阳性结果的目前的Digene法灵敏许多[1]。此外，本发明能够确定肿瘤或发育异常、或者外推至直接从肿瘤获得的材料(例如，宫颈ThinPrep)中存在何种类型的HPV。最后，本发明的一些实施方案包括与已有的非定量检测相比能进行定量分析的系统、方法和组合物，但不限于此。将这种定量检测法与本发明所述的确定HPV类型的方法联用具有明显的临床效用[6]，从而可通过不同解剖学部位的HPV拷贝数来反映临床严重性。
[0022]根据一些实施方案，通过灵敏且特异的质谱测定检测肿瘤或细胞提取物中一种或多种类型的致病性HPV的存在，但不限于此([8-10]；图1)。通常，本发明的质谱测定包括通过PCR扩增在HPV中发现的短核苷酸片段；消化引物和核苷酸；并用合适的双脱氧核苷酸延伸“嵌套式(nested)”质谱测定引物。这样导致只有当给定的HPV模板来自第一次PCR反应时才在质谱测定延伸序列中加入单个双脱氧核苷酸。
[0023]根据一些实施方案，进行筛检的方式是，如果某给定的HPV类型为阳性，则用能产生特征性信号的可鉴别探针单独检测每个样品中一种或多种致病性HPV类型，一个例子是，19种致病性HPV类型之一。这使得我们能够筛检总共19种HPV类型，表示为最初筛检出13种核心类型(图1；HPV 16、18、31、33、35、39、45、51、52、56、58、59和68[1])外加有可能致病的HPV类型23、26、53、66、73和82[5]。
[0024]一些实施方案还包括所有人类基因组DNA单拷贝片段的探针(例如但不限于erbB-2基因内含子单拷贝片段的探针)。除了在至少低至100阿摩尔(aM＝10-18M)的水平进行高灵敏度的筛检，本发明能够确定与给定的肿瘤或发育异常相关的HPV的类型。此外，还可以确定HPV序列的拷贝数，这也可提供有用的预后数据[7]。
[0025]在一些实施方案中，如果上述第一次筛检呈阳性，可仅用第一次筛检中呈阳性的HPV类型的探针通过更加灵敏的质谱测定检测体液中HPV的存在。这可用之前的筛检方法完成，从而得到给定的肿瘤或发育异常中存在的HPV类型的细节。用这种技术能够通过检测血液和/或血清筛检肿瘤的复发。
[0026]在单拷贝水平对血清和/或血液中的HPV进行灵敏检测得到了意想不到的且之前无法得到的结果：
[0027]1.根据本发明，可通过筛检血清和/或血液来检测宫颈发育异常。采用基于TagMan的技术以前未能证明这一点，但基于TagMan的技术会产生误差，导致大部分正常情况产生异常结果[4]。相反，本发明显示了意想不到的且之前无法得到的结果：大多数宫颈发育异常情况与血清和/或血液中的HPV有关。为进行比较，正常对照和成功治愈的宫颈发育异常的血清和血液样品中不含这种HPV。在本发明之前，无法正确评价血清和血液各自的信息资料。推测这是由于这些疾病有着不同的发病机制；血清所含的HPV来自细胞裂解，而血液所含的HPV来自循环的完整肿瘤细胞被吞噬的肿瘤细胞(不完全消化)；
[0028]2.根据本发明，出乎意料地发现血吸虫病相关的膀胱癌均与HPV有关。之前认为这些癌症中只有一半是HPV导致的[11]。采用本发明的单拷贝水平的更加灵敏的分析还发现，血清(26/27)和尿沉积物(15/24)都可用于诊断。尽管27例中有26例存在血清HPV，但不存在血液HPV；
[0029]3.采用本发明，还显示血液和血清分析都可用于诊断和监测由HPV造成的头/颈癌的治疗。之前，虽然在肿瘤中常存在高水平的HPV时这种分析可行，但不能检测到较低水平使得血液和血清分析不能用于血清检测呈阴性的大多数病例[3]。相反，本发明的检测显示，大多数与HPV有关的肿瘤可在血清和/或血液中被检测出。这可延伸到各种致病性HPV类型，证明这种筛检具有临床价值，因为在临床上没有意义的HPV类型不会干扰该分析；和
[0030]4.采用本发明，显示所有检测的正常对照呈阴性，其中包括所检测的所有40种正常尿沉积物、所有27种正常血清样品、所有20种正常血液样品和所有9种胎盘。
[0031]在一些实施方案中，本发明包括一种足够灵敏且特异的检测低至单个分子水平的两(2)阶段筛检方法，但不限于此。第一阶段包括筛检具有一组所有19种致病性HPV类型的肿瘤或发育异常细胞。一旦已知HPV的类型，该类型可用来以更高灵敏度筛检相关体液，所述灵敏度高于同时采用所有19种序列时的灵敏度。其结果是，以升高的灵敏度和特异性筛检体液提高了临床效用。在这种筛检中，血清和血液独立提供信息，反映出这些液体中产生HPV的发病机制不同。血清中存在的HPV是由于携带有HPV的异常细胞裂解。血液中存在HPV是由于存在循环肿瘤细胞和/或异常细胞的吞噬作用，检测到未完全消化的HPV序列可证明这一点。因此，有用的信息来自对血液和血清的独立检测。本发明包括可用于所有体液(例如，尿液、脑脊液、汗液、精液、泪液等)的系统、方法和组合物。
[0032]实施例
[0033]提供了本发明一些实施方案的以下实施例，但本发明不仅限于这里所述的那些实施方案。
[0034]根据一些优选的实施方案，本发明包括采用衬质辅助激光解吸电离-飞行时间(“MALDI-TOF”)质谱(“MS”)来进行定性和定量基因表达分析，该方法组合采用竞争性PCR、引物延伸反应和MALDI-TOF MS(通常见图2)，但不限于此。在被认为含有分离自生物样品的HPV DNA的样品中加入约100m长的合成的寡核苷酸(竞争者)，竞争者的序列与感兴趣HPV的DNA序列的一部分相同或基本匹配，但大致位于感兴趣序列中间的一个碱基除外。在一些实施方案中，以已知浓度加入竞争者。在存在正向和反向引物时共同扩增竞争者和感兴趣的DNA。PCR之后用本领域的一般技术人员已知的方法除去过量的dNTP和引物，这种方法的一个例子是酶消化和适当洗涤，但不限于此。然后用延伸引物和不同ddNTP的组合(一个例子是G和C)进行碱基延伸反应。延伸引物恰在突变位点之后杂交并在竞争者和DNA中有区别地加入两种ddNTP碱基中的至少一种，从而得到两种具有不同分子量的寡核苷酸产物。一种典型的分子量窗约为5,000-8,500道尔顿(Da)，如果两种寡核苷酸的差别大于约20Da则MALDI-TOF MS可以方便地加以区分。根据本发明，这些差异延伸产物的质量相同，例如，如果已知加入的竞争者序列的浓度，则可根据MALDI-TOFMS得到的它们的比例确定它们的浓度。在一些实施方案中，如文中进一步的描述，通过根据需要在碱基延伸引物的5’末端附加间隔物分子可进一步获得所需分子量间隔，但不限于此。
[0035]制备样品和DNA的定量。在进行肿瘤活检时从癌症患者分离肿瘤、血清、外周血和尿沉积物样品。血清和/或外周血分离自未接触HPV的正常对照、从血吸虫病患者(发生或未发生膀胱癌)、从手术除去肿瘤的血吸虫病相关的膀胱癌患者、从头/颈癌患者、以及从宫颈癌或肛门癌或宫颈发育异常患者。尿沉积物分离自血吸虫病相关的膀胱癌患者和未患膀胱肿瘤的对照对象。尿沉积物是将尿液中BeckmanJ2-21M离心机中以约8,000rpm离心约10分钟后分离出的团块。胎盘在正常出生后获得。用ZR基因组DNAI试剂盒(Zymo Research Corp，Orange，CA)分离组织、外周血和尿沉积物的DNA。用ZR血清DNA分离试剂盒从约0.3-0.5ml血清分离DNA。
[0036]宫颈样品收集于ThinPrep PreservCyt溶液(Digene Corporation，Gaithersburg，MD)。报告患者结果之后使样本与患者的标识符无关，取出等份并通过质谱PCR法检验。我们将约5ml ThinPrep溶液与ZR血清DNA分离试剂盒中的约10μl Zymo珠一起旋转以分离其中的DNA。将该珠加入样品中并加入约4倍体积的基因组裂解缓冲液(Zymo Research Corporation)。混合物在约4℃翻转过夜。按照制造商的说明从所述珠制备DNA。最终得到小量(约20μl)洗脱缓冲液的悬浮液。然后按照制造商的说明对样品进行Digene HC2和Roche分析(包括反向线性印迹(reverseline blotting))[1、12]。然后按照本发明以盲试方式对样品进行质谱分析。
[0037]为确定所给样品中DNA的量，我们在Bio-RadiCycler上对erbB-2基因中的独特内含子进行TaqMan荧光QPCR[13]。我们采用的引物为5’-ACCTTCTCTTGACCTTTCAGAATATGT-3’(SEQ ID NO.129)和5’-AGAGAGTCTTGGCCCTTTCCA-3’(SEQ ID NO.129)，TaqMan探针为5’-AGAGGGCCCTCTGCCTGCTGC-3’(SEQ ID NO.130)。我们采用根据经验得到的值，即7.7×103个单倍体基因组等价物/erbB-2探针的荧光单位。
[0038]构建简并TaqMan HPV DNA探针。在病毒的L1区构建简并HPV DNAPCR探针[13]。GP5+和GP6+引物来自Roda Husman等[15]。MY18和MY1019引物来自Nelson等[16]。为构建简并TaqMan[13]组，我们将序列组合以产生含有2个外部引物(基于GP5+和GP6+)和探针(基于MY18和MY1019)的TaqMan组。解链温度(Tm)用Qiagen的寡核苷酸计算器(oligo calculator)获得(http://www.operon.com/oliqos/toolkit.php？)。
[0039]引物1(GP5+类似物)：将下述4种引物中的每一种等量组合以构建GP5+类似物：
GCACAGGGACATAATAAT(SEQ ID NO.131)Tm＝53.8℃
GCACAGGGTCATAATAAT(SEQ ID NO.132)Tm.＝.53.8℃
GCCCAGGGACATAAT(SEQ ID NO.133)Tm.＝.53.8℃
GCCCAGGGTCATAAT(SEQ ID NO.134)Tm.＝.53.8℃。
[0040]引物2(GP6+类似物)：GAATATGATTTACAGTTTATTTTTC(SEQ ID NO.135)Tm＝53.1℃
[0041]探针：将等体积的MY1019类似物1与MY1019类似物2混合以构建最终的MY1019探针。最终的探针用等量的MY18类似物和MY1019最终类似物构建。
[0042]MY18类似物：
CTGTTGTTGATACTACACGCAGTAC(SEQ ID NO.136)Tm＝62.8℃
[0043]MY1019最终类似物从1/1的下述混合物构建：
[0044]MY1019类似物1：GTGGTAGATACCACACGCAGTA(SEQ ID NO.137)Tm.＝.63.4℃
[0045]MY1019类似物2：GTGGTAGATACCACTCGCAGTA(SEQ ID NO.138)Tm.＝.63.4℃
[0046]由Biosearch按照我们的要求合成引物和探针。探针在5’-末端用荧光素6-FAM标记，在3’-末端用Black Hole Quencher 1标记。我们检测了分别携带HPV-16或HPV-18序列(美国模式培养物保藏所)的质粒对简并引物-探针的收集。采用简并探针，我们用任何一种质粒获得了等量的扩增。
[0047]PCR扩增简并TaqMan探针。尽管所有正常血清都含有少量正常的基因组DNA[16]，我们用TaqMan erbB-2基因组DNA探针证实血清DNA制备自所有样品[13]。用类似地方法，我们证实DNA分离自所使用的所有其它样品。在约95℃变性约5分钟后，采用在约95℃变性约15秒并在约60℃退火约30秒的两步骤过程对erbB-2进行40轮扩增。在约95℃变性约5分钟后，我们采用的在Perkin-Elmer 7700型机器上对HPV DNA进行QPCR扩增的条件被优化为一两步骤过程，即在约52℃进行约60秒(以退火和延伸)并在约95℃变性约15秒，共40轮。我们还对许多样品进行这一过程约55轮以与质谱-PCR法最后的扩增步骤所用的55轮相匹配。比约52℃的正常退火和延伸温度低是因为我们采用的是简并探针。为用简并HPV DNA探针进行TaqMan反应，各值重复4次。样品在Perkin Elmer 7700型机器上通过TaqMan法[13]分析。DNA测序由密歇根大学核心测序机构(University of Michigan Coresequencing facility)完成。
[0048]HC2法的应用。HC2反应包括与13种高风险HPV类型中每一种的DNA互补的RNA探针。用靶向RNA:DNA杂合体的捕获抗体检测HPV DNA与任何互补RNA探针之间的杂交[1]。在最初的检测中，相对轻单位(RLU)截止率≥10的样本被认为是阳性。RLU截止率＜约0.8的样本被认为是阴性。RLU截止率约为0.8-9.99的样本需要重新检测。如果再次测得的RLU截止率≥1，则认为样品是阳性。再次检测不呈阳性的不确定的样本被排除在该研究之外。将样品分成2组(HC2(+)和HC2(-))；匿名并用MassARRAY技术研究过量的ThinPrep材料。
[0049]另一种分析HPV类型的方法。如文中所述，我们通过Roche法即反向线性印迹分析区分所选样品的HPV类型[12]。或者，我们采用HPV L1区的简并引物来检测可用这些简并引物扩增的最丰富的HPV序列[15、17]。这种方法对除HPV52之外的所有13种致病性HPV类型有效(在我们的检测中，HPV52和简并引物之间的差异过大而无法允许引物结合)。
[0050]测量人类基因组DNA。为确定所给样品中DNA的量，我们在Bio-RadiCycler上对erbB-2基因中的独特内含子进行TaqMan荧光QPCR[12]。引物为5’-ACCTTCTCTTGACCTTTCAGAATATGT-3′(SEQ ID NO.139)和5’-AGAGAGTCTTGGCCCTTTCCA-3′(SEQ ID NO.140)，TaqMan探针为5’-AGAGGGCCCTCTGCCTGCTGC-3’(SEQ ID NO.141)。我们得到的值为7.7×103个单倍体基因组等价物/erbB-2探针的荧光单位。我们还将该内含子的探针掺入22种探针的混合物，这22种探针通过质谱仪分析(表1)而不再需要在iCycler上进行单独分析。
[0051]分析PCR的定量质谱法。根据一些实施方案，本发明包括一多步骤过程，该过程包括在载有基质的硅芯片阵列上进行实时竞争性PCR(rcPCR)、引物延伸和MALDI-TOF MS分离产物，以检测少至若干个最初的分子[8]，但不限于此。合成竞争性核苷酸模板(例如，约100nt)以与HPV靶序列相匹配以进行PCR，但竞争者中的一个碱基突变除外，该突变是在合成期间引入的。然后可采用引物延伸反应并在MALDI-TOF MS上通过质量(用道尔顿表示)区分产物以区分单个碱基变化和HPV靶等位基因，如SNP基因分型所做的那样[10]。优选在PCR反应中加入已知量的竞争性模板从而可通过滴定产生标准曲线以确定靶DNA的量，但不限于此。当靶等位基因和竞争性模板等位基因的峰面积相等时，这两种分子的浓度比约为1∶1，代表了反应中靶DNA的量。在这种示例性实施方案中，质谱分析非常特异，可以低至约20道尔顿的分辨率鉴定给定的引物延伸产物。因此任何污染产物必需具有这种特定的大小才会产生假阳性信号。存在的这种内标物(竞争性模板)也证实，PCR所需的酶发挥了作用，且样品被纯化不含PCR抑制剂。
[0052]用实时竞争性PCR和DNA的质谱分析确定HPV的类型和量。根据一些实施方案，通过用Primer3软件(http://frodo.wi.mit.edu/cgi-bin/primer3/primer3www.cgi)从各种HPV毒株的E6区首先衍生出PCR和延伸引物序列而设计了13重(13-plex)HPV测定法，但不限于此。然后用这些序列来定义输入序列的边界以用于MassARRAY测定法设计者软件v3.0。(Sequenom，Inc.，San Diego，CA)[8]。采用这种方法，我们能够将13种单独的高风险HPV类型各自加以区分(图1)[1]。正向和反向引物、延伸引物和竞争者序列描述于表2。一些实施方案还包括采用为此目的定制的我们详细描述的不同软件进行更加强的筛检。采用这种软件，我们构建了由22种序列类型构成的探针，其中包括最初的13种HPV类型、6种额外的HPV类型、能够定量给定等分量中人DNA的量的基因组DNA单拷贝探针、以及淋病奈瑟菌(Neisseria gonorrhoea)和沙眼衣原体(Chlamydia trachomatis)的探针(参见例如表1A-1C)。第一次PCR反应的温度约为60℃，第二次引物延伸反应的温度约为58℃。
[0053]已经描述过PCR的多重rcPCR质谱分析的条件[18、19]。反应开始于制备96孔主平板，用MultiMek机器人从主平板建立384孔反应平板。对各HPV毒株而言，4个孔中给定的竞争者的浓度为0aM(阿摩尔＝10-18M)，4个孔中给定的竞争物浓度为1aM。然后定量测定对于给定的HPV序列呈阳性的反应物以得到各种阳性HPV的量。我们用10aM、100aM和1fM(飞摩尔＝10-15M)竞争者定量反应物。如果反应物的阳性过强而无法滴定，则将标本稀释100倍并重新滴定。
[0054]由于MassARRAY不是一种均匀的(homogeneous)测定法，在建立反应物时需要注意。我们用两种机器人(最初的PCR之前和之后)来建立反应物并使污染程度最小。每块平板中的常规对照显示，正常样品呈阴性，证明这些技术可有效防止污染。这里报告的所有值代表至少8个独立数据点的分析结果。
[0055]对照样品。我们检测了组织、血清、外周血和尿沉积物的一系列对照。组织对照为正常胎盘的DNA样品。血清和外周血对照为从已知未接触过HPV的匿名对象的血清和外周血分离的DNA样品。尿沉积物对照为正常志愿者的DNA样品。在这里报道的所有病例中，通过TaqMan与erbB-2对照探针的反应呈阳性，证实存在QPCR质量的DNA。在所有4个孔中对照样品对简并HPV DNA探针通常呈阴性，极少情况下在1/4的孔中呈阳性。因此，我们仅保守地将在≥3/4的孔中反应的样品认为是阳性的。
[0056]采用上文在Perkin-Elmer 7700型上分析样品所作的定义，能与该简并HPVDNA探针反应的正常尿沉积物为0/40、正常血清样品为0/27、正常外周血样品为0/20、胎盘(正常组织样品的对照)为0/9。此外，用质谱-PCR系统进行的更加灵敏的分析还显示，任何这些正常样品中都不存在HPV DNA。
[0057]采用高度保守的反向引物(GP6+类似物)作为DNA测序的起始引物，我们然后能够通过双脱氧测序确定HPVDNA的类型。以下是我们所观察到的：
[0058]在所有对照组织中简并探针适当呈阴性；和
[0059]我们看见血吸虫病相关的膀胱癌(表3)、头/颈癌(表4)和宫颈癌(表5)中存在HPV DNA的证据。这与提及这种关系的大量文献相一致。
[0060]仅作为另一个实施例而非限制本发明可能的实施方案，在第一阶段，用本发明的质谱测定法就13种致病类型[1]中的一种筛检肿瘤或宫颈ThinPrep以在一次反应中单独鉴定13种不同致病性HPV类型中的任何一种。产生HPV的E6区序列，该序列是HPV转化细胞所必需的。致癌HPV毒株的E6蛋白与p53蛋白相互作用而促进其通过依赖于遍在蛋白的途径降解[20]。产生导致人癌症的13种HPV类型每一种E6区的序列(http://hpy-web.lanl.gov/)，并通过至少一种已有方法-Digene筛检法了解该序列[1；表2]。
[0061]在一些实施方案中，对序列进行调节以获得良好的分子量间隔，而无需不适当改变引物的大小(这可能会导致改变PCR的最佳温度)，但不限于此。我们采用该方法用表1A-1C详细描述的22种探针来进一步筛检。在一些实施方案中，采用不超过15个毗连碱基，并用“百搭”碱基脱氧肌苷代替脱氧鸟苷、脱氧腺嘌呤或脱氧胸苷。这一概念源自与人类基因组大小的关系，因此，16种或更多碱基提供的置换的数目(约416)大于人类基因组的大小。用这种实施方案，我们发现取代内部脱氧肌苷对PCR条件或PCR测定的性能没有影响。我们用于22种靶序列的引物列于表1。因此，在这些实施方案中，我们未采用＞15个核苷酸的序列段，否则这会与人类基因组中的给定序列有关(序列必需具有这种长度才能为人类基因组所特有)。因此，在一些实施方案中，所用毗连序列太小而无法为人类基因组所特有。
[0062]此外，在一些实施方案中，也可按照需要在MassEXTEND引物(例如，表1B和1D)的5’末端附加间隔物分子以获得所需的分子量间隔，MassEXTEND引物是用于所用质谱测定法的内部引物[8]，但不限于此。这样可使我们的引物序列获得所需间隔而不对引物长度造成巨大改变(这会影响PCR条件)，从而使所有引物组的最佳PCR条件维持在相同条件以使PCR最佳化。总而言之，如一些实施方案所用，采用脱氧肌苷和修饰剂的方法产生了一组适用于这种方法的引物。
[0063]在一些实施方案中，对序列进行选择以使与未延伸的引物、野生型基因、以及19种不同HPV类型中每一种的内部竞争者相对应的序列间的分子量重叠都不小于约20nt。我们还加入了沙眼衣原体和淋病奈瑟菌的探针，因此最终这种技术可检测并定量19种HPV类型，得出要分析多少基因组DNA的标准，并确定是被衣原体或淋病奈瑟菌感染。总之，这种系统将能区分3×22＝66种不同峰中的每一种(通过质谱区分的峰为未延伸的引物；未延伸的引物+野生型基因序列(未延伸的引物+C或G，取决于基因的下一个核苷酸)；以及未延伸的引物+内部竞争者序列(未延伸的引物+G或C，取决于竞争者的下一个核苷酸)。这些区别依据质谱方法可区分相差约20个道尔顿的两种分子量的能力。
[0064]图1显示了按照本发明对13种致病性HPV类型进行质谱测定筛检得到的曲线，这13种致病性HPV类型是在Digene检验[1]中筛检出的(HPV 16、HPV 18、HPV 31、HPV 33、HPV 35、HPV 39、HPV 45、HPV 51、HPV 52、HPV 56、HPV 58、HPV 59、HPV 68)。所显示的13个不同的峰对应于13种不同高风险HPV类型(HPV16、18、31、33、35、39、45、51、52、56、58、59和68[3])中每一种的MassEXTEND引物[16]的分子量。没有峰的线条表示此处为MassEXTEND竞争者和基因产物(表现为总共可能有3×13＝39个不重叠的峰；为简单起见，只显示了13个未延伸的峰)。
[0065]图1说明本发明能够检测和区分各种HPV DNA序列。在一些实施方案中，我们对各个约100nt的HPV E6序列、基因组DNA标准、沙眼衣原体、以及淋病奈瑟菌采用了一组合适的外部引物和合适的未延伸的引物MassExtend序列(约20nt)。合成了对应于各个约100nt序列的寡核苷酸，其中有一个碱基被改变(C→G，或G→C)。例如，用市售的寡核苷酸合成仪(例如，由Integrated DNA Technologies(IDT)提供)完成合成。用与19种不同HPV类型、基因组DNA标准、沙眼衣原体以及淋病奈瑟菌中每一种的内部竞争者序列相对应的序列合成长约100nt的寡核苷酸。对于这22种序列中的每一种，合成与这些约100nt长的寡核苷酸的右端和左端相对应的约20nt的引物(在引物上添加标签以消除对图1所示质谱曲线的干扰)。最后合成质谱测定延伸引物，其中包含直接毗连C或G的序列(不同情况下内部竞争者导致分别掺入G或C)，从而有可能用这一个核苷酸差异区分野生型基因序列和内部竞争者序列。
[0066]在一些实施方案中，野生型基因序列和内部竞争者的引物序列相同。野生型基因序列和内部竞争者之间的唯一差别是毗连未延伸的引物序列的一个核苷酸。由于这种序列相同性，可以相同的功效扩增野生型基因序列和内部竞争者。其结果是，本发明可用已知量的内部竞争者的扩增来确定扩增的野生型基因序列的量。
[0067]在一些实施方案中，未延伸的引物、未延伸的引物+鸟苷以及未延伸的引物+胞嘧啶(3×22种引物＝总共66种引物)的分子量都应在约5000-8500道尔顿之间，且相互之间的最小间隔为约20道尔顿，但不限于此。同时，引物的长度受限于对于它们在较小温度范围内结合和作为模板的要求，以使它们在相同温度下都被扩增。为实现这些目的，我们开发了将不同内部间隔物分子附加到未延伸的引物的5’末端的新方法。
[0068]对于一些实施方案，用于第一次PCR扩增的扩增引物示于表1A，但不限于此。用于PCR介导的延伸的引物示于表1B。竞争者的序列示于表1C。我们采用的间隔物详细描述于表1D。给出了HPV类型16、18、23、26、31、33、35、39、45、51、52、53、56、58、59、66、68、73和82的引物序列。我们还包括用基因erbB-2的内含子测量所有输入的基因组DNA，以及检测2种妇科侵入感染(沙眼衣原体和淋病奈瑟菌)。还对引物序列进行了检测，发现可对它们进行操作。其结果是，本发明包括同时筛检19种HPV类型、测量总基因组DNA、并检测是否被沙眼衣原体和淋病奈瑟菌感染。
[0069]该实施方案的方法可与本文所述的本发明其它方面一起应用来测定血清和/或血液中存在的包括但不限于导致肿瘤发生的HPV的种类和含量。由于当筛检所选HPV探针时筛检血清和/或血液的技术最灵敏，因此可通过筛检肿瘤和/或ThinPrep来确定是否存在HPV，如果存在，是何种HPV类型。然后用该HPV类型以最大效率筛检血液和/或血清；如果存在几种HPV类型，则可单独筛检各种类型。本发明的该实施方案成功利用了肿瘤或ThinPrep中存在的浓度高于血清和/或血液的HPV。一旦确定了HPV的类型则可以最大灵敏度筛检血清和/或血液以确定肿瘤中发现的HPV类型。
[0070]如上所述，Digene检验不能揭示宫颈ThinPrep中发现的HPV的类型。在一些实施方案中，将本发明用于血液和/或血清时重要的是，当仅筛检一种已知的致病性HPV类型而非全面筛检所有13种致病性HPV类型时的灵敏度最高。由于癌症和发育异常病例的血清和血液中通常只存在极少HPV DNA，使用者可能优选一次仅用一种HPV探针进行这种筛检以提高灵敏度，即便是采用本发明的这种灵敏的质谱测定分析[3]。
[0071]本发明的一些优选实施方案通过以下几点克服了Digene反应的缺点，但不限于此：
[0072]1.利用了质谱测定筛检的多种功能；
[0073]2.准确诊断，由于各种HPV类型特异性反应产物的分子量精确地相差±20道尔顿而不会与相关HPV序列发生交叉反应，因此对某给定HPV类型的序列具有特异性。事实上，本发明的质谱测定检测能区分Digene筛检可检测的13种致病性HPV类型中的每一种，而不会与其它HPV病毒发生交叉反应(图1)；
[0074]3.在低至一个分子水平(此水平上我们可看到预期的泊松变化(Poissonianvariation))时本发明的质谱测定呈阳性；以及
[0075]4.本发明的质谱测定反应能够区分宫颈ThinPrep中存在何种HPV类型。由于当筛检所选HPV探针时筛检血清和/或血液的技术最灵敏，因此可通过筛检肿瘤和/或ThinPrep来确定是否存在HPV，如果存在，是何种HPV类型。然后用这种特定类型的HPV以最大效率筛检血液和/或血清。这种筛检成功利用了宫颈刮样ThinPrep或肿瘤中存在的浓度高于血清和/或血液的HPV。一旦确定了ThinPrep或肿瘤中HPV的类型则可以最大灵敏度筛检血清和/或血液以确定肿瘤中发现的HPV类型。
[0076]在一些优选的实施方案中，在本发明的第二阶段(阶段2)，一旦鉴定了HPV的类型，则可用在阶段1中鉴定的HPV类型筛检体液(如血清和血液)或复发肿瘤或重复ThinPrep，但不限于此。可继续进行这些研究以确定HPV的类型和持续是否可用于预后，一个例子是确定之前就该疾病进行过治疗的个体中是否存在残余的肿瘤，但不限于此。如果没有本发明就不能进行这种研究，因为即便采用TaqMan技术进行分析，对血清和/或血液中HPV的分析也不够灵敏或特异[3]。相反，我们目前的研究证明用本发明的这种灵敏且特异的质谱测定技术研究血清和血液方便易行。
[0077]另一个实施例是，在一些包括质谱测定系统的实施方案中，在所有24种血吸虫病相关的膀胱肿瘤中检测到了HPV 16DNA(表3的右栏)，但不限于此。在所有这些样品中，除了一个样品，匹配的血清呈阳性。在另外3例未能得到肿瘤DNA的病例中，血清对HPV 16DNA呈阳性。在大多数但不是所有血吸虫病相关的膀胱癌病例的尿沉积物中检测到HPV 16DNA。这些数据表明血吸虫病相关的膀胱癌中存在HPV 16感染。比较看来，一些实施方案中实时TaqMan QPCR(表3的左栏)不如质谱测定分析(表3的右栏)灵敏。这些病例的血液(棕黄层)在实时QPCR和质谱测定中均呈阴性(数据未显示)。证明存在HPV DNA的异常读数用黑体表示。阿摩尔(aM)＝10-18M；飞摩尔(fM)＝10-15M；我们用于PCR的体积为5μl，1aM相当于约3个分子。
[0078]将本发明的质谱测定结果(表3的右栏)与之前的原位杂交数据[10]以及标准的40轮TaqMan数据(表3的左栏)进行比较，显示本发明比原位杂交或TaqManQPCR更加灵敏。表3左栏的数据缺乏再现性(数据未显示)，说明操作TaqMan技术时受限于其灵敏度且不够精确。此外，TaqMan技术不能定量区分肿瘤、血清和尿沉积物。也试用了55轮的TaqMan RT-QPCR能否模拟一些实施方案的质谱测定方法。但观察到信噪比没有改善，这更加说明了TaqMan技术的局限性。相反，本发明得到的表3右栏所示的数值与预期的发现相符，即肿瘤(样品)阳性比血清和/或尿沉积物(样品)的阳性更强。
[0079]该实施例中，本发明的质谱测定实施方案保持了特异性和灵敏度。采用本发明，在所检测的所有血吸虫病相关膀胱肿瘤样品(24/24)、这些病例的几乎所有血清样品(26/27)以及这些病例的大多数尿沉积物样品(15/24)中检测到了HPV 16 DNA。但这些病例的血液不含可检测的HPV DNA(数据未显示)。
[0080]在相关实施例中，显示存在HPV DNA不仅仅是血吸虫病。检测了10例有血吸虫病同时有一些在临床上无法证实的膀胱癌的病例。这些病例中的8例血清中没发现HPV 16或HPV 18 DNA；2例发现了HPV 16DNA。这说明HPV DNA与血吸虫病本身无关，而与患膀胱癌的血吸虫病病例中肿瘤的发展有关。还说明，采用本发明有助于临床数据提示有但无法确诊的可疑病例的诊断。
[0081]还发现血清HPV 16DNA在肿瘤切除后迅速消失。检测了手术切除膀胱癌后2周内7名血吸虫病对象的血清。在所有7个病例血清中都未检测到HPV 16DNA。虽然未获得手术前的血清，但肿瘤的HPV 16均呈阳性特征(表3)表明，HPV有可能存在但已被手术根除。
[0082]还研究了在诊断头/颈癌时获得的相匹配肿瘤、血液和血清样品中是否存在HPV DNA。各份样品的原发性肿瘤位置是已知的。也尝试了用TaqMan荧光QPCR扩增分析但未能检测到血液和血清中含有HPV DNA，这与其它学者发现TaqMan技术在临床应用上不够灵敏[3，21]相符。相反，本发明的质谱测定分析产生的数据总结于表4。证明存在HPV 16DNA的读数用黑体表示。
[0083]肿瘤、血清和血液分离自头/颈癌病例(所有对象不一定能获得所有的样品类型；所缺的样品用空白表示)。对这些肿瘤、血液和血清样品进行质谱测定以确定是否存在HPV 16DNA；用HPV 18DNA探针没有样品呈阳性，虽然我们做的DNA测序显示另一例头/颈肿瘤样品为HPV 18DNA阳性。证明存在HPV DNA的异常读数用黑体表示。阿摩尔(aM)＝10-18M；飞摩尔(fM)＝10-15M。
[0084]对于头/颈通道前部(例如，舌、扁桃体)的肿瘤和后部(例如，喉、声门上区)的肿瘤存在着强烈偏差，前者对于HPV呈阳性，而后者呈阴性。这与之前的报道相一致[22-29]。我们发现只有3例口腔肿瘤(3/16)对HPV 16DNA和HPV 18DNA呈阴性(阴性口腔肿瘤仍可能为其它HPV类型阳性)。在10例(咽下部肿瘤)中我们仅发现1例肿瘤位于口腔后并对HPV 16呈阳性。在肿瘤呈阳性并可分析血液和血清的9个样品中，有肿瘤对HPV DNA呈阳性的情况，其中所述HPV DNA仅存在于血清中、仅存在于血液中、或同时存在于血清和血液中。
[0085]宫颈癌几乎一律与HPV有关[16，22]。用本发明的质谱测定来检测宫颈肿瘤和发育异常中的13种高风险人乳头瘤病毒(HPV)序列，我们发现：
[0086]1.实际上，所有肿瘤都具有13种致病性HPV类型中的一种，且致病性HPV类型的含量持续降至0。在发育异常但实质上不存在肿瘤的病例中发现了非致病性HPV，这支持只有有限的HPV类型才引起宫颈癌。质谱测定独有的鉴定低至几个病毒水平的能力使我们能够检测其它方法无法实现的甚至很低水平的病理性HPV类型；
[0087]2.在宫颈肿瘤中，HPV滴度通常低于1HPV分子/单倍体肿瘤基因组，比在发育异常中看到的最高值低好几个数量级。这与“袭击并逃离(hit and run)”模型一致，因此HPV感染是产生发育异常所必需的，但不足以造成肿瘤发生；
[0088]3.实际上，所有病理异常性(CIN 1或2)宫颈发育异常都显示13种致病性HPV类型中的一种。我们通常发现不同滴度的多种致病性HPV类型。被多种致病性HPV感染在病理异常性发育异常中比在肿瘤中更加常见(72％比17％)。此外，采用其它方法，我们在发育异常中经常检测到以较高滴度存在的其它HPV类型。然而，我们在肿瘤中未检测到这些类型，说明肿瘤发生是由一组通过我们的质谱测定发现的有限的HPV类型导致的；和
[0089]4.通过目前临床上采用的Digene HC2法检测其它HPV类型会产生假阳性。所述质谱测定减轻了这一问题。
[0090]目前检测宫颈疾病的方法主要取决于以下两种方法：1.用Dr.G.N.Papanicolaou开发的‘Pap’涂片检测剥落的宫颈细胞的细胞学异常[30]；和2.检测HPV感染[1]。细胞学的主要缺点是观察者间(inter-observer)可靠性有问题、灵敏度有限(≤85％)以及依赖于经过高级训练的个体来进行检验[30，31]。实际上，只有通过重复筛检才认为Pap涂片的灵敏度适用于临床目的。因此，定期随访个体的流失以及甚至不能重复用细胞学Pap检验来检测所有宫颈发育异常的个体都影响到筛检人群中宫颈癌的发病率判断。
[0091]另一种细胞学方法是直接检测HPV，HPV是实际上造成所有宫颈癌的直接原因[1，5，32]。目前通过FDA批准的HC2检验TM(Digene Corporation，Gaithersburg，MD)[1]或Roche的一套诊断试验[35]检测HPV，前者使用种类特异性杂交探针的混合物来检测与宫颈恶性肿瘤有关的13种高风险HPV类型以及采用简并寡核苷酸的PCR[15，33，34]，后者检测HPV然后测定存在的HPV的类型[1]。这些方法的主要缺点是灵敏度、特异性和定量能力有限。灵敏度受到限制是因为若要用这些检测方法检测必须有约102-103个分子[1，13]。特异性受到限制是由于HC2与非高风险HPV毒株的交叉反应。约10％的情况是由于与非高风险HPV毒株交叉反应[2][2，36]。此外，HC2检验不易于准确定量。HC2的定量区分受到限制是由于很少标准化成总细胞含量，检测的可变性受到限制，且当存在多个HPV序列时无法确定造成所观察到的信号的HPV类型的量。采用Roche的技术来解决这些限制要求多种类型的检测，这这使得检测非常难以进行。由于这些困难，定量变得非常复杂且很少进行。
[0092]相反，我们公开的发明包括一种监测宫颈发育异常的基于质谱测定的方法，从而种类特异性区分及宫颈HPV的定量最终可与血液和血清检测相结合。在我们的一些工作中，我们采用与FDA批准的2法所检测的相同的13种HPV类型作为高风险毒株(HPV 16、18、31、33、35、39、45、51、52、56、58、59和68)[1]。引物序列和分子量以及竞争者序列示于表2。
[0093]采用一些实施方案的质谱测定，当用13种HPV类型的探针进行研究时，我们发现35种血液对照样品中完全不存在HPV(数据未显示)。这证明这种高度灵敏的技术不会产生假阳性背景。我们的数据说明以下几点：首先，我们观察到样品具有13种致病性HPV类型中唯一的一种，因此在质谱测定中HPV类型之间不会发生交叉反应。当存在多种HPV类型时没有发现与其它HPV类型一致的HPV类型也支持了这一点。第二，在这些最低水平观察到的泊松变化证实，质谱测定达到的灵敏度在单个分子水平。第三，相比HC2阳性损伤(32％＝36/113)和肿瘤(17％＝13/78)，在具有CIN I/II的发育异常中更常见的是被这13种类型中的多种HPV感染(72％＝70/97)。第四，每个细胞的病毒滴度在发育异常中高于肿瘤中(肿瘤的值一律为每个单倍体基因组等价物小于1个HPV拷贝(图3A)，而在Pap阳性发育异常中该值为每个单倍体基因组等价物约103个HPV拷贝(图3B)，在HC2阳性发育异常中为每个单倍体基因组等价物约104个HPV拷贝(图3C))。因此，样品中最丰富HPV序列的中值为，对HC2阳性样品约为8.4×100，对CIN I/II样品约为3.0×10-1，对肿瘤约为2.9×10-2。因此，肿瘤中的HPV滴度中值比发育异常中低1-2个数量级。相比，大多数具有正常Pap涂片的女性样品不具有HPV或仅有较低HPV滴度(图3D)。第四，实际上所有宫颈肿瘤中存在13种致病性HPV类型中的一种(81/82；表5)。在所有病例中，致病性HPV的量连续改变降至0拷贝/单倍体基因组。
[0094]这包括只有质谱测定才足够灵敏以检测最低滴度的HPV类型的肿瘤样品。我们通过质谱测定检测了非常低量(低至约1aM＝单个分子)的HPV，这用其它灵敏度稍低的技术是不可能的。通过由材料和方法(表5)中所述的简并引物引导的DNA测序证实，实际上所有肿瘤都携带13种致病性HPV类型中的一种。除了由于用于DNA测序的分子数不够而导致DNA测序失败，我们通常证实的质谱测定结果中，相关HPV类型为13种高风险HPV类型中的一种。
[0095]通过质谱测定检测的HPV类型和通过简并DNA测序检测的类型之间有极好的一致性。由于这两种技术的目标不同因此而有分歧，一些不同之处是可以预期的。一例中，用质谱测定结果仅有约2aM HPV 31时，用DNA测序检测到HPV 73，则是一种在13种致病性HPV类型中未发现的类型(但在我们新筛检的19种HPV类型当中)。因此，这种肿瘤具有两种HPV类型，而致病性HPV 31低于DNA测序的检测限。还有3例中质谱测定和DNA测序结果不一致，但在每例中通过DNA测序只鉴定出属于13种致病性HPV类型的HPV类型。
[0096]对病理性宫颈发育异常进行质谱测定、反向线性印迹和简并DNA测序。我们比较了质谱测定和反向线性印迹的结果[12]以确定病理异常样品的发育异常阶段是处于宫颈上皮内瘤CIN I或CIN II。对于49个样品，当质谱测定技术证实13种致病性HPV类型中的一种以至少约40aM的浓度存在时，质谱测定和反向线性印迹结果完全一致(数据未显示)。然而，当HPV量较低时这种一致性被打破了(表6)。质谱测定分析能够检测含量小于约40aM的13种致病性HPV类型中的一种，而此时DNA测序和反向线性印迹法都无法检测13种高致病性HPV类型中的一种或检测其它类型的HPV(表6)。我们通过简并DNA测序证实了该结果，简并DNA测序显示了反向线性印迹可看见的HPV类型或不同的非致病性HPV类型(反向线性印迹和DNA测序测得的HPV类型的谱线仅部分重叠，这就解释了为什么这两种技术可得到不同的答案；然而，这两种技术可用于所有13种致病性HPV类型(但不能用简并测序法良好扩增的HPV 52除外))。注意，与对照血液样品(不存在HPV)或Pap阴性样品(大多少样品中不存在HPV(图3D))不同，用其它不十分灵敏的方法无法得到这种低滴度结果。这强烈说明了这些之前未重视的低滴度致病性HPV的重要性，它们可能代表了以前曾经显著但现在正在消失的HPV感染的逐渐消失痕迹。这与大多数HPV感染在6个月至2年后被清除的观察结果一致。总之，这说明了获得纵向滴度的重要性，如果可以在时间上跟踪它们，则可以避免许多对自身已局限化肿瘤病灶实施根治性外科手术。
[0097]HC2阳性发育异常的质谱测定、反向线性印迹和简并DNA测序。对于病理异常性宫颈发育异常样品，质谱测定比反向线性印迹、简并DNA测序HC2更加灵敏。当鉴别出的致病性HPV类型至少有约50个拷贝时，质谱测定和反向线性印迹法之间有极好的一致性，当鉴别出的致病性HPV类型至少有约500个拷贝时，质谱测定和简并DNA测序法之间有极好的一致性，而当鉴别出的致病性HPV类型至少有约5000个拷贝时，HC2和质谱测定之间有极好的一致性。在125例通过质谱测定分析的拷贝数大于约5000的HC2阳性样品中，有98例中所有这三种技术有良好的一致性(表7)。在剩余的27例致病性HPV滴度小于约5000个拷贝的HC2(+)病例中，反向线性印迹和/或简并DNA测序法检测的HPV类型不同于通过我们的质谱测定检测的13种高致病类型(表8)。通过HC2鉴定的发育异常中可能有很大比例为假阳性[2，36]。
[0098]通过DNA测序未检测出HPV的样品可能是：含有浓度相似的多种HPV类型从而无法获得单一HPV类型的DNA序列的样品，含有的HPV类型与引物差别太大而无法用简并引物扩增的样品，和/或所含的HPV量不足以产生扩增产物的样品。
[0099]我们发现，在18例宫颈肿瘤中具有可检测的HPV 16DNA的病例中有17例在血清和/或血液中也有可检测的HPV 16DNA。在肿瘤对HPV 16DNA和HPV 18DNA呈阴性的3例中均未在血清和/或血液中检测到HPV 16DNA或HPV 18DNA。与我们在头/颈癌中所观察到的相同，在大多数宫颈癌病例中血液和血清结果不同。在肿瘤中呈阳性的18个样品中：8个在血清和血液中均呈阳性；5个在血清中呈阳性但在血液中呈阴性；4个在血液中呈阳性但在血清中呈阴性；1个在血清和血液中均呈阴性。
[00100]然后根据本发明检测宫颈发育异常女性的血清和血液样品。通过采用简并探针的TaqMan分析在这些女性的血清或血液中均为检测到HPV DNA。相反，采用质谱测定分析的一些实施方案在一小部分宫颈癌(表9)或高度发育异常(表10)个体的血清和/或血液中检测到小量HPV 16DNA。5例高度宫颈发育异常中有4例对HPV16DNA呈阳性。还在1名具有不明意义的非典型鳞状上皮细胞的对象和另一名被诊断有I级外阴上皮内瘤和低度宫颈发育异常的对象的血清中检测到HPV 16DNA。在没有活动性病灶的个体血液或血清中未观察到HPV 16DNA。此外，在成功切除先前高度发育异常或原位癌后血清或血液HPV 16DNA的质谱测定检测一直为阴性(病例4、5、6、15、16、17、22、24、27、44)。这些病例在切除发育异常宫颈前没有获得样品。患高度宫颈发育异常但血清或血液无HPV DNA的1名对象(病例1)可能已感染了我们那时所用的HPV 16或HPV 18探针无法检测的其它HPV类型。
[00101]我们然后延伸了这些发现以确保我们可以测定宫颈发育异常个体血液和/或血清中除16或18外的其它HPV类型。如表11所示，当宫颈发育异常中存在病毒时大部分血液和/或血清样品对HPV呈阳性。这包括一些HPV类型不是16或18的病例。这强调了临床上应采用能检测低至单个分子水平的高灵敏技术监测血液和/或血清。
[00102]这说明了包括本发明一些实施方案但不限于该实施方案可能范围的灵敏、特异性定量质谱测定的用途。我们的工作证明了以下重要观点，即肿瘤中存在的HPV少于发育异常，在不存在HPV或者可能存在其它不大致病或非致病性HPV类型的许多肿瘤和发育异常中可能存在小量致病HVP。具体地说，基本上在所有肿瘤中都发现了致病性HPV，其含量继续演变降至0，这支持了以下假说，即一组有限的致病性HPV类型受另一类型HPV的损害而导致肿瘤生长非常缓慢。最后，只有采用这种灵敏的技术才能检测到血液和/或血清中非常低滴度的HPV。因为这种发现只发生在发育异常或癌症人群中，当切除发育异常宫颈后随之消失，应该说这代表了一种检测这些病灶和/或监测切除这些病灶的技术的治疗效果的极佳方法。
[00103]根据本发明的一些实施方案，实现在这种HPV水平洞察力的技术发展包括能以高度灵敏且特异的方式检测不丰富的HPV序列，但不限于此。因此，本发明实现了诊断单个HPV拷贝所需的灵敏度和特异性，这是第一次。因此，本发明包括达到这种灵敏度和特异性水平的系统、组合物和/或方法，并能够检测之前无法完成的事件，包括发现宫颈发育异常与血液和/或血清中可检测的HPV相关，而通常情况下没发现与血液和/或血清中可检测的HPV相关。这就避免了采用不当的TaqMan技术，该技术如用于检测血清HPV常产生假阳性[4]和假阴性(我们未公开的结果)。
[00104]本发明的另一个优点是可定量、灵敏和特异性，从而能够测定肿瘤负荷，因为很多或大多数侵袭性肿瘤推测可能与较高的HPV负荷有关，而较高的HPV负荷反映为在宫颈样品(按总DNA标准化后)[7]、血清和/或血液中有较高水平的HPV。此外，确定血清和/或血液是否有病毒感染在临床上有益。例如，肿瘤发生血源播散可能与血液中的病毒增加有关，而肿瘤裂解增加可能与血清中病毒增加有关。总之，质谱测定技术更加灵敏，同时能提供全部特异性。可将这种用途扩展到许多处于发生这些肿瘤风险的人群，和以前曾诊断为肿瘤且目前正在观察中的个体。
[00105]优选的本发明的实施方案包括通过以下过程检测人类患者中上述癌症的系统、方法和组合物：获得所述患者的生物样品，所述生物样品例如但不限于血液、血清或尿液样品以及其中两种或多种的组合；按照技术检测样品中HPV基因组的拷贝数，所述技术包括但不限于这里所述的那些检测灵敏度低于任何目前批准的检验法如Digene检验的技术；并计算已知体积或其它浓度值的样品中HPV基因组的拷贝数，如本发明所述，样品中存在低至单拷贝水平的HPV表明该患者可能患有癌症。一个例子是，虽然Digene检验不能检测每份低于5000个拷贝的血清样品，而本发明能检测低至单拷贝水平，但不限于此。
[00106]本发明包括在非常灵敏的水平进行检测以完成这里所述的之前不可能的观察的系统、组合物和/或方法。因此，本发明包括发现体液中的小量HPV与癌症或发育异常相关，这种相关性然后可通过除去肿瘤或发育异常而消除。实际上，发现宫颈发育异常会在血清和血液中产生可检测的异常，但正常对照的血清和血液呈阴性，这是全新的概念。根据本发明，测定血液诊断头/颈癌和宫颈肿瘤的想法也是新的发现，以前的权利要求采用的筛检血液技术灵敏度不够高而不能避免假阴性，和/或特异性不够高而不能避免假阳性。以前检测血清HPV所用的技术不够灵敏和/或不够特异。采用本发明更加灵敏且特异的质谱测定系统现在可以检测大多数血吸虫病相关的膀胱肿瘤、宫颈肿瘤和头/颈肿瘤中的HPV，这些肿瘤都与有限而可检测的血清HPV水平有关。
[00107]本发明包括以下发现，即当采用足够灵敏且特异的检测低至单拷贝水平的分析方法对尿沉积物、血清和/或血液进行非常灵敏且特异的分析时会发现，宫颈癌和发育异常中HPV呈阳性(尽管在非常低数量时由于泊松分布固有的不确定性会带来不可避免的限制；但进行多次分析可克服)。此外，在宫颈发育异常病例中可在血清和/或血液中检测到HPV；当发育异常被根除后HPV也随之消失。总之，本发明能够测定处于发育异常或癌症危险期或正在接受治疗的对象中是否存在HPV相关的癌症。
[00108]所有参考文献通过引用全文纳入本文，这就如同在本文中全文列出。
[00109]尽管已经具体展示了本发明并参考上述优选实施方案和其它实施方案进行了描述，但精通本领域的技术人员应该理解，在实践本发明时可对这里所述的本发明的实施方案进行各种改变而不背离如以下权利要求所定义的本发明的精神和范围。本发明的描述应理解为包括这里所述要素的所有新的和非显而易见的组合，且权利要求可以这些要素的任何新的和非显而易见的组合的形式出现在本申请或之后的申请中。上述实施方案是示例性的，对于在该申请或之后的申请中可能被要求权利的所有可能的组合而言，没有一个特征或要素是必需的。当权利要求提及“一个”或“第一”要素或其等价表述形式时，这种权利要求应理解为包括一个或多个这种要素的组合，不一定也不排除是两个或多个这种要素。以下权利要求定义了本发明的范围以及落入这些权利要求及其等价物范围内的系统、方法和组合物。
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序列表
表1A.第一次PCR扩增的引物
应在60℃引导
PCR产物
长度(nt)正向引物序列                                  引物长度 反向引物序列                               引物长度
102     HPV18       TGAAAAACGACGAITTCACAAC(SEQ ID NO.1)  22   HPV18       GTITCTCIGCGTCGTTGGAG(SEQ ID NO.23)  20
94      HPV45       GTGCCAGAAACCAITGAACC(SEQ ID NO.2)    20   HPV45       ACACTGCCCICGGTACTGTC(SEQ ID NO.24)  20
100     HPV39       AGAACGGCCAIACAAATTGC(SEQ ID NO.3)    20   HPV39       TTGCTGTAGIGGTCGTCTGC(SEQ ID NO.25)  20
104     HPV59       TGTTTTGCAAIGGGGAACTG(SEQ ID NO.4)    20   HPV59       TTTCAGACICGCTGCATACG(SEQ ID NO.26)  20
83      HPV56       TTAACTCCGGIGGAAAAGC(SEQ  ID NO.5)    19   HPV56       AAACAIGACCCGGTCCAAC(SEQ ID NO.27)   19
86      HPV53       GACCACGTACAITGCACCAG(SEQ ID NO.6)    20   HPV53       TGCCTTCTIGCAGAACACAC(SEQ ID NO.28)  20
92      HPV51       AAGGGTTAIGACCGAAAACG(SEQ ID NO.7)    20   HPV51       TTCGTGGTCTTTCCCTCTTG(SEQ ID NO.29)  20
104     HPV31       AAAGTGGTGAICCGAAAACG(SEQ ID NO.8)    20   HPV31       TGCAATTICCGAGGTCTTTC(SEQID NO.30)   20
102     HPV35       ACATGTCAAIAACCGCTGTG(SEQ ID NO.9)    20   HPV35       GGACATACICCGACCTGTCC(SEQ ID NO.31)  20
84      HPV33       GGAAAAACCICGAACATTGC(SEQ ID NO.10)   20   HPV33       TTGCATTCCICGCACTGTAG(SEQ ID NO.32)  20
87      HPV58       AGGAGAAICCACGGACATTG(SEQ ID NO.11)   20   HPV58       TTTTGCATTCIACGCATTTC(SEQ ID NO.33)  20
80      HPV52       GAGGATCCIGCAACACGAC(SEQ ID NO.12)    19   HPV52       TGCAGCCTIATTTCATGCAC(SEQ ID NO.34)  20
104     HPV73       TCCACTGGAIAAGCAAAAGC(SEQ ID NO.13)   20   HPV73       CAGTTGCAGAIGGTCTCCAG(SEQ ID NO.35)  20
104     HPV26       AGAACGICCCAGAACGCTAC(SEQ ID NO.14)   20   HPV26       CAGCCCATIGTAAGGTTTCC(SEQ ID NO.36)  20
86      HPV66       CGGAGGAAIAACAATTGCAC(SEQ ID NO.15)   20   HPV66       CCAACACIGCAAACATGACC(SEQ ID NO.37)  20
84      HPV68       AATGGCGCIATTTCACAACC(SEQ ID NO.16)   20   HPV68       ACGTCAIGCAATGTGGTGTC(SEQ ID NO.38)  20
110     HPV16       TGCACAGAGCIGCAAACAAC(SEQ ID NO.17)   20   HPV16       ATGCATAAAICCCGAAAAGC(SEQ ID NO.39)  20
85      HPV82       TGCAGTCCCGIGCTATTACC(SEQ ID NO.18)   20   HPV82       TCCCAAAIACAAGGCCATC(SEQ ID NO.40)   20
104     HPV23       TGGCTGTGCITATGCTTCTG(SEQ ID NO.19)   20   HPV23       TTTGGCCTAIAGGTCGTTGC(SEQ ID NO.41)  20
        内含子                                                内含子
108     ERB         CTAGCGAATGITTGTGTTGTC(SEQ ID NO.20)  21   ERB         CCTCAGAGGIGGTACATGAG(SEQ ID NO.42)  20
108     沙眼衣原体  GTTCGGATTGIAGTCTGCAAC(SEQ ID NO.21)  21   沙眼衣原体  CGGGCGGIGTGTACAAGG(SEQ ID NO.43)    18
103     淋病奈瑟菌  GCTAACGCGIGAAATTGACC(SEQ ID NO.22)   20   淋病奈瑟菌  GAATTAATCCICATCATCCACC(SEQ ID NO.44)22
表1B.MassEXTENSION引物
(注意：质量已按脱氧肌苷取代纠正)                                                                                       ID(U＝未延伸的
                                                                                                     分子量  与下一峰  t＝靶范围
                                                                                                     (道尔顿)的差别    C＝内部竞争者)
扩增引物(所有扩增-PCR引物标准化成58℃计算出的Tm)                  长度              靶   修饰剂
SBE延伸应在58℃进                                                 有/没有修饰       SBE  分子量 1    5199    289       18u
1    HPV18＊     CCGAGCICGACAGGAAC(SEQ ID NO.45)                  17                G           2    5489    40        18c
2    HPV45       /5AmMC12/AGACACCITAAGGACAAAC(SEQ ID NO.46)       19                G    264    3    5529    39        18t
3    HPV39       /5dSp/TTGCAGGACAITACAATAGC(SEQ ID NO.47)         20                C    180    4    5568    89        31u
4    HPV59       /5AmMCI2/GGAACIGCAAGAAAGAGAG(SEQ ID NO.48)       19                G    264    5    5657    159       35u
5    HPV56       /5AmMCI2/GGAAAGCAAITGCATTGTGACA(SEQ ID NO.49)    22                G    264    6    5816    41        16u
6    HPV53       /5SpC3/CATTGCTGGAGCIGCAACTTG(SEQ ID NO.50)       21                G    138    7    5857    40        31t
7    HPV51       /5dSp/GGTGCATAIAAAAGTGCAGTG(SEQ ID NO.51)        21                G    180    8    5897    49        31c
8    HPV31       /5Phos/GTGCAAACCIACAGACGC(SEQ ID NO.52)          18                C    80     9    5946    40        35c
9    HPV35       /5SpC3/CCATAACAICGGTGGACG(SEQ ID NO.53)          18                G    138    10   5986    87        35t
10   HPV33       /5Phos/GAACATIGCATGATTTGTGC(SEQ ID NO.54)        20                C    80     11   6073    32        45u
11   HPV58       CATTGCATGAITTGTGTCAGG(SEQ ID NO.55)              21                C           12   6105    40        16c
12   HPV52       /5AmMC6T/TGTGTGAGGIGCTGGAAGAATC(SEQ ID NO.56)    22                G    458    13   6145    73        16t
13   HPV73       /5AmMC6T/GAAAAAAAACGGITTCATCAAATAG(SEQ ID NO.57) 25                C    458    14   6218    19        59u
14   HPV26       /5Sp18/AGCTATGIGAAAGCTTGAATA(SEQ ID NO.58)       21                C    344    15   6237    78        33u
15   HPV66       /5AmMC6T/AGGAAAAACAAITGCACTGTGAA(SEQ ID NO.59)   23                C    458    16   6315    47        39u
16   HPV68       /5Phos/GCGCTATTICACAACCCTGAG(SEQ ID NO.60)       21                G    80     17   6362    40        45c
17   HPV16       AAGCAACAGITACTGCGAC(SEQ ID NO.61)                19                G           18   6402    54        45t
18   HPV82       /5SpC3/CCGTGCTATIACCTGCCAAAAG(SEQ ID NO.62)      22                G    138    19   6456    21        68u
19   HPV23       /5AmMC6T/CAAITTGAAAITCAACAATTTTAT(SEQ ID NO.63)  24                C    458    20   6477    30        58u
20   内含子ERB   GCGCAATTCAITACCTCATTTAA(SEQ ID NO.64)            23                C           21   6507    19        59c
21   沙眼衣原体  /5Phos/ATGAAGTCGGAAITGCTAGTAAT(SEQ ID NO.65)     23                G    80     22   6526    21        33t
22   淋病奈瑟菌  CGCAAGATTAAAACICAAAGGAATT(SEQ ID NO.66)          25                G           23   6547    19        59t
                                                                                                24   6566    19        33c
                 *HPV18；肌苷代替“A”而非“T”                                                 25    6585   19        53u
26    6604    40         39t
27    6644    80         39c
28    6724    21         51u
29    6745    21         68c
30    6766    19         58t
31    6785    21         68t
32    6806    21         58c
33    6827    20         82u
34    6847    27         26u
35    6874    40         53c
36    6914    53         53t
37    6968    46         内含子-u
38    7013    40         51c
39    7054    28         51t
40    7081    35         56u
41    7117    20         82c
42    7136    20         26t
43    7157    20         82t
44    7176    40         26c
45    7217    40         沙眼衣原体-u
46    7257    40         内含子-t
47    7297    42         内含子-c
48    7338    32         52u
49    7371    40         56c
50    7411    95         56t
51    7506    40         沙眼衣原体-c
52    7546    36         沙眼衣原体-t
53    7582    46         66u
54    7628    40         52c
55    7668    33         52t
56    7701    76         淋病奈瑟菌-u
57    7777    94         23u
 58     7871     40            66t
 59     7911     79            66c
 60     7990     40            淋病奈瑟菌-c
 61     8030     36            淋病奈瑟菌-t
 62     8066     40            23t
 63     8106     77            23c
 64     8183     28            973u
 65     8472     40            73t
 66     8512                   73c
表1C.竞争者序列(SBE位已改变)
HPV18         FTTTCTCTGCGTCGTTGGAGTGGTTCCTGTCGTGCTCGGTTGCAGCACGAATGGCACTGGCCTCTATAGTGCCCAGCTATGTTGTGAAATCGTCGTTTTTCA(SEQ ID NO.67)
HPV45         ACACTGCCCTCGGTACTGTCCAGCTATGCTGTGAAATCTTGGTTTGTCCTTAAGGTGTCTACGTTTTTCTGCTGGGTTCAATGGTTTCTGGCAC(SEQ ID NO.68)
HPV39         TTGCTGTAGTGGTCGTCTGCAATAGACACACGCTATTGTAATGTCCTGCAAGGTGGTGTCCAGCGTTGTGCACAGGTCTGGCAATTTGTATGGCCGTTCT(SEQ ID NO.69)
HPV59         TTTCAGACACGCTGCATACGGTGTACAGTCTCTATACACTATAAATAAGTCATTAAAAGCAAATTCAAATAGCTCTCTTTCTTGCAGTTCCCCTTTGCAAAACA(SEQ ID NO.70)
HPV56         AAACATGACCCGGTCCAACCATGTGCTATTAGATGAAATCGTCTTTTTGTGTCACAATGCAATTGCTTTTCCTCCGGAGTTAA(SEQ ID NO.71)
HPV53         TGCCTTCTTGCAGAACACACAGGCAAGTTGCAGCTCCAGCAATGGTTTATTCACAACTTCACATAGCTGGTGCAATGTACGTGGTC(SEQ ID NO.72)
HPV51         TTCGTGGTCTTTCCCTCTTGTCTTCGAACATGGTGTTCTTCTATACTTTTAGCACTGCACTTTTATATGCACCGTTTTCGGTCATAACCCTT(SEQ ID NO.73)
HPV31         TGCAATTTCCGAGGTCTTTCTGCAGGATTTTGAACATCGCGTCTGTAGGTTTGCACAAAATACTATGTGCTTTATATACCAACCGTTTTCGGTTCACCACTTT(SEQ ID NO.74)
HPV35         GGACATACACCGACCTGTCCAGCGTCCACCGATGTTATGGAATCGTTTTTTTTCTTCTAAATGTCTTTGCTTTTCAACTGGACACAGCGGTTTTTGACATGT(SEQ ID NO.75)
HPV33         TTGCATTCCACGCACTGTAGTTCAATGTTGTGTATAGTTGTCTCCAATGCTTCGCACAAATCATGCAATGTTCGTGGTTTTTCC(SEQ ID NO.76)
HPV58         TTTTGCATTCAACGCATTTCAATTCGATTTCATGCACAGATGTCTCCAACCCCTGACACAAATCATGCAATGTCCGTGGTTTCTCCT(SEQ ID NO.77)
HPV52         TGCAGCCTTATTTCATGCACGGATTCTTCCAGCACCTCACACAATTCGTGCAGGGTCCGGGGTCGTGTTGCTGGATCCTC(SEQ ID NO.78)
HPV73         CAGTTGCAGATGGTCTCCAGCACCGTGTACAGCGTCCGGTCCACTGTTCTCCTATTTGATGAAACCGTTTTTTTTCATCTACATGCTTTTGCTTTTCCAGTGGA(SEQ ID NO.79)
HPV26         CAGCCCATTGTAAGGTTTCCTTGCAATATACACACTGTACCTGCAAATTTTGCAAAGTACTATTCAAGCTTTCACATAGCTCATGTAGCGTTCTGGGTCGTTCT(SEQ ID NO.80)
HPV66         CCAACACTGCAAACATGACCCGGTCCATGCATATGCTATATAATGAAATCGTCTTTTATCTTCACAGTGCAATTGTTTTTCCTCCG(SEQ ID NO.81)
HPV68         ACGTCATGCAATGTGGTGTCCAATGTCCTGCACAGGTCTGGCAATTTGTATGGCCGTTGCTCAGGGTTGTGAAATAGCGCCATT(SEQ ID NO.82)
HPV16         ATGCATAAATCCCGAAAAGCAAAGTCATATACCTCAGGTCGCAGTAACTGTTGCTTGCAGTACACACATTCTAATATTATATCATGTATAGTTGTTTGCAGCTCTGTGCA(SEQ ID NO.83)
HPV82         TCCCAAAATACAAGGCCATCATAAGGATCCTTTTTAGGGGCAGGGGCGGAAGGACGCTTTTGGCAGGTAATAGCACGGGACTGCA(SEQ ID NO.84)
HPV23         TTTGGCCTATAGGTCGTTGCTCCTCCTGCTCAATTTCACGACCATACACAGTTAGCTCATAAAATTGTTGAATTTCAAATTGAGCAGAAGCATAAGCACAGCCA(SEQ ID NO.85)
内含子erbB-2  CCTCAGAGGAGGTACATGAGACTTAAATGAGGTAATGAATTGCGCAGCCATCTGTAAACATGACGAGGCTTTGTAAACAGAACTGGGACAACACAAACATTCGCTAG(SEQ ID NO.86)
沙眼衣原体    CGGGCGGTGTGTACAAGGCCCGGGAACGTATTCACGGCGTTATGGCTGACACGCGATTACTAGCAATTCCGACTTCATGTAGTCGAGTTGCAGACTACAATCCGAAC(SEQ ID NO.87)
淋病奈瑟菌    GAATTAATCCACATCATCCACCGCTTGTGCGGGTCCCCGTGAATTCCTTTGAGTTTTAATCTTGCGACCGTACTCCCCAGGCGGTCAATTTCACGCGTTAGC(SEQ ID NO.88)
表1D.附加于延伸引物5’末端的间隔物的标识
修饰            道尔顿  标识(整合DNA技术)
磷酸化           80     /5Phos
C3间隔物         138    /5SpC3
D间隔物          180    5dSp/
氨基修饰剂C12    264    /5AmMC12/
间隔物18         344    /5Sp18/
氨基修饰剂C6dT   458    /5AmMC6T/
表2.用于采用13种HPV类型的质谱PCR测定的引物
HPV
类型   正向引物序列                                    反向引物序列                                     MassEXTENSION引物
HPV16  ACGTTGGATGACTGCAATGTTTCAGGACCC(SEQ ID NO.89)    ACGTTGGATGTAGTTGTTTGCAGCTCTGTG(SEQ ID NO.90)     GAGCGACCCAGAAAGTTAC(SEQ ID NO.91)
HPV18  ACGTTGGATGATAGCTGGGCACTATAGAGG(SEQ ID NO.92)    ACGTTGGATGTGTGTTTCTCTGCGTCGTTG(SEQ ID NO.93)     GCCATTCGTGCTGCAAC(SEQ ID NO.94)
HPV31  ACGTTGGATGCAGGATTTTTGAACATGGCG(SEQ ID NO.95)    ACGTTGGATGTGGTGAACCGAAAACGGTTG(SEQ ID NO.96)     ATGGCGTCTGTAGGTTT(SEQ ID NO.97)
HPV33  ACGTTGGATGCACAGTGCAGTTTCTCTACG(SEQ ID NO.98)    ACGTTGGATGCGATTTCATAATATTTCGGG(SEQ ID NO.99)     ACACGCCGCACAGCGCCCT(SEQ ID NO.100)
HPV35  ACGTTGGATGTTCCAACAGGACATACACCG(SEQ ID NO.101)   ACGTTGGATGCGCTGTGTCCAGTTGAAAAG(SEQ ID NO.102)    ACCTGTCCACCGTCCAC(SEQ ID NO.103)
HPV39  ACGTTGGATGGCCATACAAATTGCCAGACC(SEQ ID NO.104)   ACGTTGGATGTCGTCTGCAATAGACACAGG(SEQ ID NO.105)    TTGCCAGACCTGTGCACAAC(SEQ ID NO.106)
HPV45  ACGTTGGATGCTGTGCACAAATCTGGTAGC(SEQ ID NO.107)   ACGTTGGATGAAGTGCATTACAGGATGGCG(SEQ ID NO.108)    AAATCTGGTAGCTTGTAGGGTCGTT(SEQ ID NO.109)
HPV51  ACGTTGGATGGGTTATGACCGAAAACGGTG(SEQ ID NO.110)   ACGTTGGATGGTCTTTCCCTCTTGTCTTCG(SEQ ID NO.111)    CGGTGCATATAAAAGTGCAGTG(SEQ ID NO.112)
HPV52  ACGTTGGATGATTGTGTGAGGTGCTGGAAG(SEQ ID NO.113)   ACGTTGGATGACCTCTCTTCGTTGTAGCTC(SEQ ID NO.114)    GTGCTGGAAGAATCGGTG(SEQ ID NO.115)
HPV56  ACGTTGGATGCAAACATGACCCGGTCCAAC(SEQ ID NO.116)   ACGTTGGATGGTTAACTCCGGAGGAAAAGC(SEQ ID NO.117)    CAACCATGTGCTATTAGATGAAAT(SEQ ID NO.118)
HPV58  ACGTTGGATGTGATTTGTGTCAGGCGTTGG(SEQ ID NO.119)   ACGTTGGATGTACCTCAGATCGCTGCAAAG(SEQ ID NO.120)    GTGTCAGGCGTTGGAGACAT(SEQ ID NO.121)
HPV59  ACGTTGGATGGCAGTTCCCCTTTGCAAAAC(SEQ ID NO.122)   ACGTTGGATGCTGCCTGATTTGAGCACAAC(SEQ ID NO.123)    TTGCAAAACACACAATTGATG(SEQ ID NO.124)
HPV68  ACGTTGGATGACCCCGTCCCTATATACTAC(SEQ ID NO.125)   ACGTTGGATGTGCAGAAGGCAACTACAACG(SEQ ID NO.126)    CCCTATATACTACATTTAAGTCA(SEQ ID NO.127)
用于各HPV类型的竞争者为：
HPV16-竞争者    TAGTTGTTTGCAGCTCTGTGCATAACTGTCGTAACTTTCTGGGTCGCTCCTGTGGGTCCTGAAACATTGCAGT(SEQ ID NO.142)
HPV18-竞争者    TGTGTTTCTCTGCGTCGTTGGAGTCGTTCCTGTCGTGCTCCGTTGCAGCACGAATGGCACTGGCCTCTATAGTGCCCAGCTAT(SEQ ID NO.143)
HPV31-竞争者    CAGGATTTTTGAACATGGCGTCTGTAGGTTTCCACAAAATACTATGTGCTTTATATACCAACCGTTTTCGGTTCACCA(SEQ ID NO.144)
HPV33-竞争者    TCACAGTGCAGTTTCTCTACGTCGGGACCTCCAACACGCCGCACAGCGCCCTCCCCAACGACCCGAAATATTATGAAATCG(SEQ ID NO.145)
HPV35-竞争者    TTCCAACAGGACATACACCGACCTGTCCACCGTCCACGGATGTTATGGAATCGTTTTTTTTCTTCTAAATGTCTTTGCTTTTCAACTGGACACAGCG(SEQ ID NO.146)
HPV39-竞争者    TCGTCTGCAATAGACACAGGCTATTGTAATGTCCTGCAAGGTGGTGTCCAGGGTTGTGCACAGGTCTGGCAATTTGTATGGC(SEQ ID NO.147)
HPV45-竞争者    CATGTATTACACTGCCCTCGGTACTGTCCACCTATGCTGTGAAATCTTCGTTTGTCCTTAAGGTGTCTACGTTTTTCTGCTGGG(SEQ ID NO.148)
HPV51-竞争者    GTCTTTCCCTCTTGTCTTCGAACATGGTGTTCTTCTATACTTTTAGCACTGCACTTTTATATGCACCGTTTTCGGTCATAACC(SEQ ID NO.149)
HPV52-竞争者    ACCTCTCTTCGTTGTAGCTCTTTTTTGCACTGCACACACTGCAGCCTTATTTCATCCACCGATTCTTCCAGCACCTCACACAAT(SEQ ID NO.150)
HPV56-竞争者    CAAACATGACCCGGTCCAACCATGTGCTATTAGATGAAATGGTCTTTTTCTGTCACAATGCAATTGCTTTTCCTCCGGAGTTAAC(SEQ ID NO.151)
HPV58-竞争者    TACCTCAGATCGCTGCAAAGTCTTTTTGCATTCAACGCATTTCAATTCGATTTCATGCACACATGTCTCCAACGCCTGACACAAATCA(SEQ ID NO.152)
HPV59-竞争者    GCAGTTCCCCTTTGCAAAACACACAATTGATGGGAATATCATGCAGAGGAATATTCAATGTTGTGCTCAAATCAGGCAG(SEQ ID NO.153)
HPV68-竞争者    ACCCCGTCCCTATATACTACATTTAAGTCAGCAAAGGCAAATTCATATACCTCTGTCCGTTGTAGTTGCCTTCTGCA(SEQ ID NO.154)
表3.对血吸虫病相关的膀胱癌中的HPV16DNA进行质谱测定分析
  用荧光QPCR检测
  样品编号#   肿瘤   血清   尿沉积物
  134   8.9E-06   6.2E-05   8.8E-05
  138   7.5E-05   8.6E-05   阴性
  17   阴性   4.4E-06
  20   阴性   7.6E-06   3.0E-05
  204   2.4E-06   7.5E-06   2.9E-03
  216   2.6E-04   2.1E-05   阴性
  242   8.4E-05   1.3E-05   阴性
  296   2.2E-05   7.6E-05   阴性
  323   阴性   7.2E-06   阴性
  358   2.4E-05   阴性   阴性
  380   阴性   6.3E-06   阴性
  385   3.9E-06   2.3E-06   2.1E-05
  388   2.2E-05   阴性
  40   7.5E-05   2.2E-05   阴性
  44   1.5E-05
  407   9.4E-05   4.0E-06
  414   阴性   2.0E-06
  417   4.8E-06   1.1E-07
  424   阴性   阴性
  427   3.5E-05   9.7E-06
  466   9.9E-06   5.2E-06
  用质谱测定检测
  样品编号   肿瘤   血清   尿沉积物
  134   ＞1fM   0.3aM   1.2aM
  138   10aM   4.1aM   阴性
  17   100aM   阴性
  20   10aM   0.2aM   3.0aM
  204   ＞1fM   ＞10aM   2.9aM
  216   ＞1fM   16aM   阴性
  242   100aM   ＞10aM   ＞10aM
  296   10aM   4.0aM   0.5aM
  323   ＞1fM   2.2aM   0.5aM
  358   ＞1fM   1.6aM   1.6aM
  380   100aM   0.8aM   阴性
  385   10aM   10.4aM   阴性
  388   ＞1fM   1.3aM   阴性
  40   100aM   0.5aM   阴性
  44   40aM   0.4aM   0.6aM
  407   ＞1fM   5.7aM   1.8aM
  414   100aM   69aM   5.8aM
  417   57aM   3.8aM
  424   1fM   ＞10aM   ＞10aM
  427   ＞1fM   6.7aM
  466   100aM   1.1aM   1.0aM
  51   4.0E-04   1.3E-04   阴性
  64   4.1E-04   4.0E-05
  84   1.9E-06   4.8E-06   阴性
  65   4.0E-04   8.5E-06   阴性
  269   1.1E-05   阴性
  382   阴性   阴性
  51   100aM   2.1aM   ＞10aM
  64   100aM   0.4aM   ＞10aM
  84   100aM   1.0aM   阴性
  65   ＞10aM   ＞10aM
  269   ＞10aM   阴性
  382   0.8aM   阴性
aM＝阿摩尔；fM＝飞摩尔
表4.对头/颈肿瘤、血液和血清中的HPV 16DNA进行质谱测定分析
  肿瘤   含量   血液   含量   血清   含量   肿瘤部位
  T19   ＞1fM   B61   阴性   S2048x   1aM   口咽
  T3   2aM   B57   1aM   S47x   阴性   舌
  T30   40aM   B134   1aM   S2070x   1aM   舌
  T5   1aM   B160   1aM   S2016x   阴性   舌
  T23   200aM   舌
  T10   ＞1fM   舌
  T9   1fM   B142   1aM   S2040x   100aM   舌
  T18   30aM   舌
  B140   10aM   S2057x   1aM   舌
  T15   阴性   B18   阴性   S2100x   阴性   舌
  T1   ＞1fM   扁桃体
  T17   100aM   S2078x   1aM   扁桃体
  T8   100aM   扁桃体
  T27   ＞1fM   B141   1aM   S2053x   阴性   扁桃体
  T28   阴性   扁桃体
  T2   阴性   S2047x   阴性   软腭
  T4   100aM   B126   10aM   S2056x   1aM   咽下
  T22   阴性   B23   阴性   喉
  T13   阴性   B76   阴性   S2028x   阴性   喉
  T12   阴性   B44   阴性   S46x   阴性   喉
  T16   阴性   喉
  T24   阴性   S2045x   阴性   喉
  T14   阴性   B112   阴性   S2020x   阴性   声门上
  T11   阴性   声门上
  T6   阴性   声门上
  T7   阴性   B125   阴性   声门上
aM＝阿摩尔；fM＝飞摩尔
表5.肿瘤：通过质谱分析和简并DNA测序确定HPV类型
  肿瘤  通过质谱确定的HPV类型   病毒数/单倍体基因组等价物   通过DNA测序确定的HPV类型
  C10C12C14C16C18C20C22C24C26C27C28C30C32C33AC37C37C3aC411C41C43C49C51C53C55C57C5TC6C62C63C64C67  HPV16HPV16HPV18HPV52HPV18HPV18HPV35HPV18HPV16HPV52HPV16HPV18HPV16，45HPV52HPV16HPV16HPV16HPV18HPV68HPV16HPV16HPV16HPV31HPV31HPV16HPV16HPV45HPV52，16HPV18HPV16HPV16   4.5E-037.6E-032.3E-021.5E-021.2E-032.9E-025.5E-029.2E-034.4E-021.7E-021.2E-021.7E-025.3E-052.4E-054.0E-021.5E-011.1E-014.3E-022.3E-034.8E-021.8E-021.2E-017.8E-024.1E-053.1E-030.0E+007.0E-026.1E-03，2.3E-054.9E-025.7E-044.3E-01   HPV16HPV16HPV18无无HPV18HPV35HPV18HPV16无HPV16HPV18HPV16无HPV16HPV16HPV16HPV18无HPV16HPV16HPV16HPV31HPV73HPV16HPV16HPV45无HPV18HPV16HPV16
  C73C8CS122TCS179TCS18TCS191TCS195TCS196TCS198TCS19TCS202TCS203TCS204TCS205TCS208TCS210TCS211TCS213TCS214TCS22TCS24TCS2TCS30TCS32TCS36TCS43TCS45TCS46TCS47TCS49TCS51TCS59TCS59TCS63TCS6T   HPV18NoneHPV18HPV16HPV59，16HPV33HPV59HPV16HPV16HPV16HPV16HPV16HPV16HPV16，33HPV18HPV16HPV18HPV35，16HPV16HPV16HPV16HPV45HPV56HPV52，16HPV16HPV16HPV16HPV16HPV16HPV45，16，56HPV45，16HPV16HPV31HPV31HPV33.16   8.2E-030.0E+004.5E-021.2E+008.1E-02，3.6E-042.0E-029.1E-034.8E-019.0E-042.8E-026.9E-016.9E-011.7E-04，2.0E-054.8E-033.5E-013.0E-011.2E-02，3.2E-052.5E-034.9E-031.1E-011.2E-023.2E-025.4E-02，1.5E-034.6E-028.1E-033.3E-019.5E-023.2E-011.5E-02，4.2E-03，2.6E-041.6E-02，1.7E-032.5E-023.7E-037.5E-011.4E-02，1.4E-03   无无HPV18HPV16HPV16HPV18无HPV16HPV68HPV16HPV16HPV16HPV16HPV16HPV18HPV16HPV18HPV35HPV16HPV16HPV16HPV45无HPV16HPV16HPV16HPV16HPV16HPV16无HPV16HPV31HPV31无
  CS74TCS80TCS83TCS85TCS8TCS90TCS91TCS92TCS93TCS96TCS98TCS9TUMC-2TUM-C3TUMC-3TUMC-4T对照细胞系CaskiSiHaHela   HPV45HPV16HPV16HPV16HPV16HPV18，16HPV18.16HPV16HPV18HPV16HPV45HPV16HPV59HPV18HPV18HPV45HPV16HPV16HPV18   2.2E-022.0E-021.0E-013.2E-011.3E-038.4E-03，3.5E-042.0E-01，4.3E-051.5E-019.9E-012.9E-021.5E-021.3E-045.7E-031.4E-011.4E-017.2E-028.1E-016.3E-035.9E-02   无HPV16HPV16HPV16HPV16HPV18HPV18HPV16HPV18HPV16HPV45HPV16无无无HPV45HPV16HPV16HPV18
表6.质谱测定鉴定的病理性发育异常中低含量的病理性HPV
样品 通过质谱确定的HPV类型 通过质谱得到的HPV的量   通过测序确定的HPV类型  通过反向线性印迹确定的HPV类型 病理学等级
  PO 033PO 044PO 179PO 110PO 155PO 185PO 223PO 224PO 231PO 053PO 183PO 129PO 091PO 130PO 134PO 025PO 150PO 141   HPV16，HPV35，HPV59HPV39，51，16HPV39，51，59，68HPV35，58HPV51HPV35，39，58HPV52HPV59HPV35，58HPV35，HPV 39HPV35，HPV56HPV39，58HPV52HPV39HPV31HPV39，HPV51HPV35HPV39，HPV68   都～1aM8aM，～1aM  ～1aM～10aM，～10aM，～1aM，～10aM～1aM，～1aM～1aM43aM，～1aM，～1aM～1aM～1aM～1aM，～1aM～5aM，～10aM～10aM，440aM～10aM，50aM～10aM～5aM1.3aM～5aM，～1aM～10aM～5aM，～5aM   无无HPV81HPV35无HPV81HPV87HPV35HPV43HPV91HPV66HPV66无HPV73HPV73HPV43  无HPV无HPV无HPVHPV73HPV81HPV6HPV84HPV81HPV42HPV53HPV53&83HPV55HPV66HPV66HPV66HPV73HPV73HPV84   CIN ICIN IICIN ICIN ICIN ICIN ICIN ICIN ICIN ICIN ICIN ICIN ICIN ICIN ICIN ICIN IICIN ICIN I
表7.宫颈ThinPrep样品中HPV的类型和每个单倍体基因组DNA中HPV的拷贝数(aM)
  通过Digene法确定为阳性的样品(HC II(+))   通过质谱确定的HPV类型   拷贝数(aM)/单倍体基因组
  CDK01   HPV16   3.40E+02
  CDK02   HPV16   4.60E-03
  CDK03   HPV39   2.70E+00
  CDK04   阴性   0.00E+00
  CDK05   HPV16   1.30E-01
  CDK05   HPV51   2.00E-03
  CDK06   HPV39   7.40E-01
  CDK07   HPV16   2.70E-02
  CDK08   HPV16   2.90E+00
  CDK08   HPV58   4.10E-01
  CDK09   HPV16   7.90E-03
  CDK10   HPV31   4.00E-01
  CDK10   HPV39   1.00E-04
  CDK11   HPV33   8.80E-02
  CDK12   HPV59   1.40E+00
  CDK12   HPV18   1.20E+00
  CDK 13   HPV18   3.20E-01
  CDK 14   阴性   0.00E+00
  CDK 15   阴性   0.00E+00
  CDK 16   HPV33   1.10E+00
  CDK 17   HPV35   1.80E-01
  CDK 18   HPV31   1.30E-01
  CDK 19   HPV16   9.70E-01
  CDK 19   HPV31   1.40E-03
  CDK 19   HPV52   2.20E-04
  CDK20   HPV31   1.40E+00
  CDK21   HPV52   1.20E+00
  CDK22   HPV45   7.20E-03
  CDK23   HPV16   2.20E+00
  CDK 24   HPV39   2.20E-02
  CDK24   HPV56   2.80E-04
  CDK25   阴性   0.00E+00
  CDK76   HPV45   3.30E+01
  CDK77   HPV16   3.30E+00
  CDK78   HPV31   2.40E+00
  CDK78   HPV16   2.10E+00
  CDK78   HPV52   1.40E+00
  CDK78   HPV45   2.30E-02
  CDK79   HPV56   1.80E+03
  CDK80   HPV52   6.70E+02
  CDK81   HPV16   2.80E-01
  CDK82   HPV56   2.20E+02
  CDK82   HPV16   4.10EE-01
  CDK83   HPV16   6.20E+01
  CDK83   HPV56   3.20E+00
  CDK84   HPV31   5.60E+00
  CDK85   阴性   0.00E+00
  CDK86   阴性   0.00E+00
  CDK87   HPV31   1.50E+01
  CDK88   HPV16   6.80E-01
  CDK89   HPV58   1.30E+01
  CDK90   HPV31   2.30E+01
  CDK91   HPV33   7.90E+00
  CDK91   HPV68   1.20E-02
  CDK92   HPV16   1.50E+00
  CDK92   HPV33   1.70E-01
  CDK93   HPV59   1.40E+01
  CDK93   HPV16   4.70E-03
  CDK94   HPV16   3.40E+01
  CDK95   HPV18   2.80E+01
  CDK95   HPV56   9.30E-01
  CDK96   HPV31   3.20E+00
  CDK97   HPV16   9.30E-03
  CDK98   HPV39   2.20E+04
  CDK99   HPV16   7.70E+00
  CDK100   HPV18   9.90E+00
  CDK100   HPV16   3.70E+00
  CDK100   HPV52   2.30E+00
  CDK101   HPV31   1.30E+00
  CDK101   HPV59   5.00E-03
  CDK102   HPV35   9.50E+00
  CDK102   HPV39   3.90E-01
  CDK103   HPV39   4.60E-03
  CDK104   HPV52   1.30E-03
  CDK104   HPV39   2.20E-05
  CDK105   HPV39   3.20E-01
  CDK105   HPV56   3.20E-01
  CDK105   HPV16   3.20E-02
  CDK106   HPV33   3.00E+00
  CDK107   HPV56   1.40E-01
  CDK107   HPV39   2.40E-03
  CDK108   HPV59   2.20E-01
  CDK108   HPV39   2.00E-03
  CDK108   HPV56   2.00E-03
  CDK109   HPV56   2.40E-01
  CDK109   HPV16   1.80E-01
  CDK110   HPV31   2.60E+01
  CDK110   HPV18   2.60E-01
  CDK111   HPV16   9.30E+00
  CDK112   HPV56   3.20E+01
  CD K112   HPV35   7.60E-03
  CDK113   HPV51   6.50E-03
  CDK114   HPV51   1.90E+02
  CDK114   HPV35   3.90E+00
  CDK114   HPV56   3.90E-01
  CDK114   HPV39   6.50E-03
  CDK115   HPV51   3.70E+01
  CDK115   HPV39   1.40E-03
  CDK116   HPV31   2.60E+00
  CDK117   阴性   0.00E+00
  CDK118   HPV33   1.40E+02
  CDK119   HPV51   2.90E+02
  CDK120   HPV39   1.40E+00
  CDK121   阴性   0.00E+00
  CDK122   HPV58   2.40E+01
  CDK123   HPV58   2.60E+02
  CDK124   HPV16   5.10E+00
  CDK124   HPV52   7.50E-03
  CDK125   HPV68   3.80E-03
  CDK126   HPV31   9.20E-01
  CDK127   HPV52   1.60E+01
  CDK127   HPV16   2.80E-02
  CDK128   HPV56   6.40E-03
  CDK129   HPV16   2.90E+00
  CDK130   HPV16   3.90E-01
  CDK130   HPV35   8.50E-03
  CDK131   HPV39   5.90E-03
  CDK132   HPV16   2.00E+00
  CDK133   HPV35   7.90E-03
  CDK134   HPV51   1.20E-01
  CDK135   HPV16   1.80E-03
  CDK136   HPV56   4.30E+02
  CDK136   HPV18   3.60E+01
  CDK136   HPV16   5.00E-01
  CDK137   HPV39   1.10E+00
  CDK138   HPV59   3.50E+00
  CDK139   HPV58   4.10E-01
  CDK140   阴性   0.00E+00
  CDK141   HPV18   3.90E+01
  CDK142   HPV52   1.40E+02
  CDK142   HPV31   6.70E-01
  CDK143   HPV56   2.50E-02
  CDK144   HPV16   6.90E-02
  CDK145   HPV51   7.20E-01
  CDK146   HPV39   8.30E-03
  CDK147   HPV16   1.40E+00
  CDK148   HPV16   4.60E-01
  CDK149   HPV31   9.00E+00
  CDK150   HPV16   1.90E+01
  CDK176   阴性   0.00E+00
  CDK177   HPV51   2.00E+00
  CDK178   阴性   0.00E+00
  CDK179   HPV58   2.30E+00
  CDK180   阴性   0.00E+00
  CDK181   HPV52   1.30E+02
  CDK181   HPV18   1.50E+00
  CDK182   HPV51   1.60E+03
  CDK183   HPV39   1.80E+01
  CDK184   HPV51   6.70E+00
  CDK185   HPV56   9.10E+00
  CDK186   HPV51   2.20E+01
  CDK187   HPV16   6.10E+00
  CDK187   HPV33   1.50E+00
  CDK188   HPV16   1.10E+01
  CDK189   HPV16   2.30E+01
  CDK189   HPV59   1.00E+01
  CDK190   HPV16   4.60E+00
  CDK191   HPV58   7.30E+02
  CDK192   HPV51   7.50E+01
  CDK192   HPV18   7.50E-02
  CDK193   阴性   0.00E+00
  CDK194   HPV56   1.10E+03
  CDK195   HPV56   8.00E-02
  CDK196   HPV56   3.00E+00
  CDK197   HPV59   3.60E+01
  CDK198   HPV16   5.00E+02
  CDK198   HPV59   1.80E+02
  CDK199   HPV33   2.40E+01
  CDK199   HPV45   1.90E+00
  CDK200   HPV16   3.90E+01
  表8.通过质谱分析HC2阳性发育异常中的低含量病理性HPV
  样品   通过质谱确定的HPV类型   HPV拷贝数/基因组等价物   DNA测序   反向线性印迹
  CDK135   HPV16   1.80E-03   HPV67   HPV67
  CDK97   HPV16   9.30E-03   HPV66   HPV66
  CDK20   HPV31   1.40E-03   阴性
  CDK133   HPV35   4.70E-03   HPV32
  CDK103   HPV39   6.50E-03   Negative   HPV40，51
  CDK146   HPV39   1.70E-02   HPV66   HPV66
  CDK22   HPV45   7.20E-03   HPV91
  CDK113   HPV51   6.50E-03   阴性
  CDK104   HPV52   1.30E-03   阴性
  CDK80   HPV52   6.70E-02   HPV67
  CDK128   HPV56   1.30E-02   HPV90
  CDK143   HPV56   6.50E-02   阴性
  CDK195   HPV56   8.00E-02   HPV90   HPV84，89
  CDK125   HPV68   1.10E-02   阴性
  CDK 14   阴性   0.00E+00   HPV53   HPV53
  CDK 15   阴性   0.00E+00   HPV53   HPV53
  CDK117   阴性   0.00E+00   HPV66   HPV66
  CDK131   阴性   0.00E+00   HPV30   阴性
  CDK140   阴性   0.00E+00   HPV82   HPV IS39
  CDK176   阴性   0.00E+00   HPV26   HPV82
  CDK178   阴性   0.00E+00   HPV53   HPV53
  CDK25   阴性   0.00E+00   HPV54   HPV54
  CDK85   阴性   0.00E+00   HPV67   HPV42，52，56，89，XR
  CDK86   阴性   0.00E+00   HPV67   HPV61
  CDK121   阴性   0.00E+00   阴性   阴性
  CDK180   阴性   0.00E+00   阴性   HPV53
  CDK193   阴性   0.00E+00   阴性
表9.对宫颈癌中的HPV 16DNA进行质谱测定分析
  样品编号   肿瘤   外周血   血清
  13   ＞1fM   10aM   1aM
  19   ＞1fM   10aM   阴性
  38   ＞1fM   10aM   阴性
  17   ＞1fM   1aM   3aM
  42   ＞1fM   阴性   60aM
  12   ＞1fM   阴性   阴性
  37   900aM   2aM   阴性
  32   900aM   阴性   5aM
  39   800aM   16aM   10aM
  16   500aM   1aM   1aM
  3   400aM   阴性   3aM
  14   100aM   10aM   1aM
  36   100aM   1aM   10aM
  1   100aM   1aM   1aM
  41   100aM   1aM   阴性
  18   100aM   阴性   5aM
  20   50aM   5aM   1aM
  25   50aM   阴性   10aM
  9   阴性   阴性   阴性
  26   阴性   阴性   阴性
  40   阴性   阴性   阴性
表10.对宫颈发育异常中的HPV 16DNA进行质谱测定分析
  样品编号   血液   血清   诊断
  1   阴性   阴性   高度宫颈发育异常
  4   阴性   阴性   现在正常；之前有高度宫颈发育异常
  5   阴性   阴性   现在正常；之前有高度宫颈发育异常
  6   阴性   阴性   现在正常；之前有高度宫颈发育异常
  15   阴性   阴性   现在正常；之前有高度宫颈发育异常
  16   阴性   阴性   现在正常；之前有1级阴道上皮内瘤形成和1级宫颈上皮内瘤形成，用5-FU及手术治疗
  17   阴性   阴性   现在正常；之前有3级外阴上皮内瘤形成，用手术治疗
  22   阴性   阴性   现在正常；随访发现之前有用LEEP治疗的高度宫颈发育异常
  24   阴性   阴性   现在正常；之前有高度宫颈发育异常
  27   阴性   阴性   现在正常；之前有用阴道镜切除的1级宫颈上皮内瘤形成
  44   阴性   阴性   现在正常；高度宫颈发育异常前10天用s/p LEEP处理
  58   阴性   36aM   高度宫颈发育异常
  65   阴性   41aM   具有不明意义的非典型鳞状上皮细胞
  55   阴性   340aM   1级外阴上皮内瘤形成+低度宫颈发育异常
  60   180aM   43aM   高度宫颈发育异常
  67   ＞1000aM   130aM   高度宫颈发育异常
  70   59aM   100aM   高度宫颈发育异常
  表11.发育异常宫颈中存在的不同HPV类型及血液和/或血清中HPV的存在情况
  发育异常宫颈中的HPV类型   在血液和/或血清中呈阳性的比例
  HPV 16   12/24
  HPV 18   3/9
  HPV 31   1/1
  HPV 33   1/5
  HPV 35   0/1
  HPV 45   0/4
  HPV 52   1/1
  HPV 58   0/1
  HPV 59   0/1

Claims (50)

1.一种检测、鉴定和/或定量哺乳动物生物样品中的HPV DNA的方法，所述方法包括以下步骤：
提取哺乳动物生物样品的DNA；
在存在至少一种竞争者序列时通过PCR对至少部分提取的DNA进行第一次扩增，所述竞争者序列包含与已知HPV类型的DNA序列中的多核苷酸基本同源的多核苷酸，所述竞争者序列具有所述HPV DNA序列中不存在的核苷酸取代；
在存在至少一种所述已知HPV类型的延伸引物和至少两种不同双脱氧核苷酸时通过PCR进行第二次扩增；和
通过质谱测定任何扩增的所述已知HPV类型的延伸引物的水平。
2.如权利要求1所述的方法，其特征在于，所述哺乳动物生物样品是体液或组织样品。
3.如权利要求1所述的方法，其特征在于，所述测定步骤包括检测浓度低至约200阿摩尔的任何扩增的延伸引物。
4.如权利要求1所述的方法，其特征在于，所述第一次扩增包括存在多种竞争者序列类型，各竞争者序列包含与不同已知HPV类型的DNA序列中的多核苷酸基本同源的多核苷酸，所述竞争者序列类型具有所述相应HPV DNA序列中不存在的核苷酸取代，且其中所述第二次扩增包括存在多种各不同已知HPV类型的外部引物类型。
5.如权利要求4所述的方法，其特征在于，所述多种已知HPV类型包括HPV类型16、18、23、26、31、33、35、39、45、51、52、53、56、58、59、66、68、73和82中的两种或多种。
6.如权利要求4所述的方法，其特征在于，所述多种已知HPV类型包括HPV类型16、18、23、26、31、33、35、39、45、51、52、53、56、58、59、66、68、73和82中的至少一种。
7.如权利要求4所述的方法，所述方法还包括：
在存在至少一种竞争者序列时通过PCR对至少部分提取的DNA进行第一次扩增，所述竞争者序列包含与淋病奈瑟菌或沙眼衣原体的DNA序列中的多核苷酸基本同源的多核苷酸，所述竞争者序列具有所述淋病奈瑟菌或沙眼衣原体DNA序列中不存在的核苷酸取代；
在存在至少一种所述淋病奈瑟菌或沙眼衣原体的延伸引物和至少两种不同双脱氧核苷酸时通过PCR进行第二次扩增；和
通过质谱测定任何扩增的淋病奈瑟菌或沙眼衣原体的延伸引物的水平。
8.如权利要求1所述的方法，其特征在于，所述第一次扩增包括存在至少一种竞争者序列，所述竞争者序列包含与基因erbB-2的DNA序列中的多核苷酸基本同源的多核苷酸，所述竞争者序列类型具有所述基因erbB-2中不存在的核苷酸取代。
9.如权利要求1所述的方法，包括在所述测定步骤之后诊断、监测或评价哺乳动物的宫颈癌、宫颈发育异常、宫颈上皮内瘤、肛门癌、肛门上皮内瘤、头/颈癌、血吸虫病相关的膀胱癌或乳头状瘤的额外步骤。
10.如权利要求1所述的方法，其特征在于，至少一种竞争者序列选自SEQ ID No.67、SEQ ID No.68、SEQ ID No.69、SEQ ID No.70、SEQ ID No.71、SEQ ID No.72、SEQ ID No.73、SEQ ID No.74、SEQ ID No.75、SEQ ID No.76、SEQ ID No.77、SEQID No.78、SEQ ID No.79、SEQ ID No.80、SEQ ID No.81、SEQ ID No.82、SEQ IDNo.83、SEQ ID No.84或SEQ ID No.85。
11.如权利要求10所述的方法，还包括，至少一种竞争者序列选自SEQ ID No.86、87或88。
12.如权利要求1所述的方法，其特征在于，所述第一次扩增包括至少一组相匹配的所述已知HPV类型的正向和反向引物序列，所述组由以下序列构成：SEQ ID NO.1和SEQ ID NO.23，SEQ ID NO.2和SEQ ID NO.24，SEQ ID NO.3和SEQ ID NO.25，SEQ ID NO.4和SEQ ID NO.26，SEQ ID NO.5和SEQ ID NO.27，SEQ ID NO.6和SEQ ID NO.28，SEQ ID NO.7和SEQ ID NO.29，SEQ ID NO.8和SEQ ID NO.30，SEQ ID NO.9和SEQ ID NO.31，SEQ ID NO.10和SEQ ID NO.32，SEQ ID NO.11和SEQ ID NO.33，SEQ ID NO.12和SEQ ID NO.34，SEQ ID NO.13和SEQ ID NO.35，SEQ ID NO.14和SEQ ID NO.36，SEQ ID NO.15和SEQ ID NO.37，SEQ ID NO.16和SEQ ID NO.38，SEQ ID NO.17和SEQ ID NO.39，SEQ ID NO.18和SEQ ID NO.40，以及SEQ ID NO.19和SEQ ID NO.41。
13.如权利要求12所述的方法，其特征在于，所述第一次扩增还包括至少一组相匹配的正向和反向引物序列，所述组选自：SEQ ID No.20和SEQ ID No.42，SEQ IDNo.21和SEQ ID No.43，以及SEQ ID No.22和SEQ ID No.44。
14.如权利要求1所述的方法，其特征在于，所述至少一种延伸引物选自SEQ IDNO.45、SEQ ID NO.46、SEQ ID NO.47 SEQ ID NO.48、SEQ ID NO.49、SEQ ID NO.50、SEQ ID NO.51、SEQ ID NO.52、SEQ ID NO.53、SEQ ID NO.54、SEQ ID NO.55、SEQ ID NO.56、SEQ ID NO.57、SEQ ID NO.58、SEQ ID NO.59、SEQ ID NO.60、SEQ ID NO.61、SEQ ID NO.62或SEQ ID NO.63。
15.如权利要求14所述的方法，其特征在于，所述第二次扩增也包括至少一种选自SEQ ID NO.64、SEQ ID NO.65或SEQ ID NO.66的延伸引物。
16.如权利要求1所述的方法，其特征在于，所述第一次扩增包括至少一组相匹配的所述已知HPV类型的正向和反向引物序列，这种序列各自包含至少一个肌苷碱基。
17.如权利要求1所述的方法，其特征在于，所述至少一种延伸引物包含至少一个肌苷碱基。
18.一种检测、鉴定和/或定量哺乳动物体液非细胞组分中的HPV DNA的方法，所述方法包括以下步骤：
提取哺乳动物体液非细胞组分中的DNA；
在存在至少一种竞争者序列时通过PCR对至少部分提取的DNA进行第一次扩增，所述竞争者序列包含与已知HPV类型的DNA序列中的多核苷酸基本同源的多核苷酸，所述竞争者序列具有所述HPV DNA序列中不存在的核苷酸取代；
在存在至少一种所述已知HPV类型的延伸引物和至少两种不同双脱氧核苷酸时通过PCR进行第二次扩增；和
通过质谱测定任何扩增的所述已知HPV类型的延伸引物的水平。
19.如权利要求18所述的方法，其特征在于，所述体液是血浆、血清、尿液、脑脊液、汗液、唾液、痰液或泪液。
20.如权利要求18所述的方法，其特征在于，所述测定步骤包括检测浓度低至约200阿摩尔的任何扩增的延伸引物。
21.如权利要求18所述的方法，其特征在于，所述第一次扩增包括存在多种竞争者序列类型，各竞争者序列包含与不同已知HPV类型的DNA序列中的多核苷酸基本同源的多核苷酸，所述竞争者序列类型具有所述相应HPV DNA序列中不存在的核苷酸取代，且其中所述第二次扩增包括存在多种各不同已知HPV类型的外部引物类型。
22.如权利要求21所述的方法，其特征在于，所述多种已知HPV类型包括HPV类型16、18、23、26、31、33、35、39、45、51、52、53、56、58、59、66、68、73和82中的两种或多种。
23.如权利要求21所述的方法，其特征在于，所述多种已知HPV类型包括HPV类型16、18、23、26、31、33、35、39、45、51、52、53、56、58、59、66、68、73和82中的至少一种。
24.如权利要求21所述的方法，所述方法还包括：
在存在至少一种竞争者序列时通过PCR对至少部分提取的DNA进行第一次扩增，所述竞争者序列包含与淋病奈瑟菌或沙眼衣原体的DNA序列中的多核苷酸基本同源的多核苷酸，所述竞争者序列具有所述淋病奈瑟菌或沙眼衣原体DNA序列中不存在的核苷酸取代；
在存在至少一种所述淋病奈瑟菌或沙眼衣原体的延伸引物和至少两种不同双脱氧核苷酸时通过PCR进行第二次扩增；和
通过质谱测定任何扩增的淋病奈瑟菌或沙眼衣原体的延伸引物的水平。
25.如权利要求18所述的方法，其特征在于，所述第一次扩增包括存在至少一种竞争者序列，所述竞争者序列包含与基因erbB-2的DNA序列中的多核苷酸基本同源的多核苷酸，所述竞争者序列类型具有所述基因erbB-2中不存在的核苷酸取代。
26.如权利要求18所述的方法，包括在所述测定步骤之后诊断、监测或评价哺乳动物的宫颈癌、宫颈发育异常、宫颈上皮内瘤、肛门癌、肛门上皮内瘤、头/颈癌、血吸虫病相关的膀胱癌或乳头状瘤的额外步骤。
27.如权利要求18所述的方法，其特征在于，至少一种竞争者序列选自SEQ IDNo.67、SEQ ID No.68、SEQ ID No.69、SEQ ID No.70、SEQ ID No.71、SEQ ID No.72、SEQ ID No.73、SEQ ID No.74、SEQ ID No.75、SEQ ID No.76、SEQ ID No.77、SEQ ID No.78、SEQ ID No.79、SEQ ID No.80、SEQ ID No.81、SEQ ID No.82、SEQID No.83、SEQ ID No.84或SEQ ID No.85。
28.如权利要求27所述的方法，还包括，至少一种竞争者序列选自SEQ ID No.86、87或88。
29.如权利要求18所述的方法，其特征在于，所述第一次扩增包括至少一组相匹配的所述已知HPV类型的正向和反向引物序列，所述组由以下序列构成：SEQ ID NO.1和SEQ ID NO.23，SEQ ID NO.2和SEQ ID NO.24，SEQ ID NO.3和SEQ ID NO.25，SEQ ID NO.4和SEQ ID NO.26，SEQ ID NO.5和SEQ ID NO.27，SEQ ID NO.6和SEQ ID NO.28，SEQ ID NO.7和SEQ ID NO.29，SEQ ID NO.8和SEQ ID NO.30，SEQ ID NO.9和SEQ ID NO.31，SEQ ID NO.10和SEQ ID NO.32，SEQ ID NO.11和SEQ ID NO.33，SEQ ID NO.12和SEQ ID NO.34，SEQ ID NO.13和SEQ ID NO.35，SEQ ID NO.14和SEQ ID NO.36，SEQ ID NO.15和SEQ ID NO.37，SEQ ID NO.16和SEQ ID NO.38，SEQ ID NO.17和SEQ ID NO.39，SEQ ID NO.18和SEQ ID NO.40，以及SEQ ID NO.19和SEQ ID NO.41。
30.如权利要求29所述的方法，其特征在于，所述第一次扩增包括至少一组相匹配的正向和反向引物序列，所述组选自：SEQ ID No.20和SEQ ID No.42，SEQ ID No.21和SEQ ID No.43，以及SEQ ID No.22和SEQ ID No.44。
31.如权利要求18所述的方法，其特征在于，所述至少一种延伸引物选自SEQ IDNO.45、SEQ ID NO.46、SEQ ID NO.47 SEQ ID NO.48、SEQ ID NO.49、SEQ ID NO.50、SEQ ID NO.51、SEQ ID NO.52、SEQ ID NO.53、SEQ ID NO.54、SEQ ID NO.55、SEQ ID NO.56、SEQ ID NO.57、SEQ ID NO.58、SEQ ID NO.59、SEQ ID NO.60、SEQ ID NO.61、SEQ ID NO.62或SEQ ID NO.63。
32.如权利要求31所述的方法，其特征在于，所述第二次扩增还包括至少一种选自SEQ ID NO.64、SEQ ID NO.65或SEQ ID NO.66的延伸引物。
33.如权利要求18所述的方法，其特征在于，所述第一次扩增包括至少一组相匹配的所述已知HPV类型的正向和反向引物序列，这种序列各自包含至少一个肌苷碱基。
34.如权利要求18所述的方法，其特征在于，所述至少一种延伸引物包含至少一个肌苷碱基。
35.一种检测、鉴定和/或定量哺乳动物生物样品中的HPV DNA的方法，所述方法包括以下步骤：
提取哺乳动物生物样品中的DNA；
在存在至少一种竞争者序列时通过PCR对至少部分提取的DNA进行第一次扩增，所述竞争者序列包含与已知HPV类型的DNA序列中的多核苷酸基本同源的多核苷酸，所述竞争者序列具有所述HPV DNA序列中不存在的核苷酸取代；
在存在至少一种所述已知HPV类型的延伸引物和至少两种不同双脱氧核苷酸时通过PCR进行第二次扩增；和
通过质谱测定任何扩增的所述已知HPV类型的延伸引物的水平；
其中，所述第一次扩增包括至少一组相匹配的已知HPV类型的正向和反向引物序列，该已知HPV类型与至少一种竞争者序列相匹配，且其中所述至少一种延伸引物与相同的已知HPV类型相关。
36.如权利要求35所述的方法，其特征在于，
至少一种竞争者序列选自SEQ ID No.67、SEQ ID No.68、SEQ ID No.69、SEQ IDNo.70、SEQ ID No.71、SEQ ID No.72、SEQ ID No.73、SEQ ID No.74、SEQ ID No.75、SEQ ID No.76、SEQ ID No.77、SEQ ID No.78、SEQ ID No.79、SEQ ID No.80、SEQ ID No.81、SEQ ID No.82、SEQ ID No.83、SEQ ID No.84或SEQ ID No.85；
至少一组相匹配的正向和反向引物序列选自：SEQ ID NO.1和SEQ ID NO.23，SEQ ID NO.2和SEQ ID NO.24，SEQ ID NO.3和SEQ ID NO.25，SEQ ID NO.4和SEQ ID NO.26，SEQ ID NO.5和SEQ ID NO.27，SEQ ID NO.6和SEQ ID NO.28，SEQ ID NO.7和SEQ ID NO.29，SEQ ID NO.8和SEQ ID NO.30，SEQ ID NO.9和SEQ ID NO.31，SEQ ID NO.10和SEQ ID NO.32，SEQ ID NO.11和SEQ ID NO.33，SEQ ID NO.12和SEQ ID NO.34，SEQ ID NO.13和SEQ ID NO.35，SEQ ID NO.14和SEQ ID NO.36，SEQ ID NO.15和SEQ ID NO.37，SEQ ID NO.16和SEQ ID NO.38，SEQ ID NO.17和SEQ ID NO.39，SEQ ID NO.18和SEQ ID NO.40，以及SEQID NO.19和SEQ ID NO.41；和
至少一种延伸引物选自SEQ ID NO.45、SEQ ID NO.46、SEQ ID NO.47 SEQ IDNO.48、SEQ ID NO.49、SEQ ID NO.50、SEQ ID NO.51、SEQ ID NO.52、SEQ IDNO.53、SEQ ID NO.54、SEQ ID NO.55、SEQ ID NO.56、SEQ ID NO.57、SEQ IDNO.58、SEQ ID NO.59、SEQ ID NO.60、SEQ ID NO.61、SEQ ID NO.62或SEQ IDNO.63。
37.如权利要求35所述的方法，其特征在于，所述第一次扩增包括至少一组相匹配的所述已知HPV类型的正向和反向引物序列，这种序列各自包含至少一个肌苷碱基。
38.如权利要求35所述的方法，其特征在于，所述至少一种延伸引物包含至少一个肌苷碱基。
39.如权利要求35所述的方法，其特征在于，所述测定步骤包括检测浓度低至约200阿摩尔的任何扩增的延伸引物。
40.如权利要求35所述的方法，包括在所述测定步骤之后诊断、监测或评价哺乳动物的宫颈癌、宫颈发育异常、宫颈上皮内瘤、肛门癌、肛门上皮内瘤、头/颈癌、血吸虫病相关的膀胱癌或乳头状瘤的额外步骤。
41.如权利要求35所述的方法，其特征在于，所述第一次扩增包括存在多种竞争者序列类型，各竞争者序列包含与不同已知HPV类型的DNA序列中的多核苷酸基本同源的多核苷酸，所述竞争者序列类型具有所述相应HPV DNA序列中不存在的核苷酸取代，且其中所述第二次扩增包括存在多种各不同已知HPV类型的外部引物类型。
42.如权利要求41所述的方法，其特征在于，所述多种已知HPV类型包括HPV类型16、18、23、26、31、33、35、39、45、51、52、53、56、58、59、66、68、73和82中的两种或多种。
43.如权利要求41所述的方法，其特征在于，所述多种已知HPV类型包括HPV类型16、18、23、26、31、33、35、39、45、51、52、53、56、58、59、66、68、73和82中的至少一种。
44.如权利要求41所述的方法，所述方法还包括：
在存在至少一种竞争者序列时通过PCR对至少部分提取的DNA进行第一次扩增，所述竞争者序列包含与淋病奈瑟菌或沙眼衣原体的DNA序列中的多核苷酸基本同源的多核苷酸，所述竞争者序列具有所述淋病奈瑟菌或沙眼衣原体DNA序列中不存在的核苷酸取代；
在存在至少一种所述淋病奈瑟菌或沙眼衣原体的延伸引物和至少两种不同双脱氧核苷酸时通过PCR进行第二次扩增；和
通过质谱测定任何扩增的淋病奈瑟菌或沙眼衣原体的延伸引物的水平。
45.如权利要求35所述的方法，其特征在于，所述第一次扩增包括存在至少一种竞争者序列，所述竞争者序列包含与基因erbB-2的DNA序列中的多核苷酸基本同源的多核苷酸，所述竞争者序列类型具有所述基因erbB-2中不存在的核苷酸取代。
46.如权利要求35所述的方法，其特征在于：
所述第一次扩增包括至少一种选自SEQ ID No.86、SEQ ID No.87或SEQ ID No.88的竞争者序列和至少一组选自SEQ ID No.20和SEQ ID No.42，SEQ ID No.21和SEQ ID No.43，以及SEQ ID No.22和SEQ ID No.44的相匹配的正向和反向引物序列；和
所述第二次扩增包括至少一种选自SEQ ID NO.64、SEQ ID NO.65或SEQ ID NO.66的延伸引物。
47.一种包含竞争者序列以检测、鉴定和/或定量生物样品中的微生物DNA的合成的多核苷酸，所述竞争者序列选自：SEQ ID No.67、SEQ ID No.68、SEQ ID No.69、SEQ ID No.70、SEQ ID No.71、SEQ ID No.72、SEQ ID No.73、SEQ ID No.74、SEQID No.75、SEQ ID No.76、SEQ ID No.77、SEQ ID No.78、SEQ ID No.79、SEQ IDNo.80、SEQ ID No.81、SEQ ID No.82、SEQ ID No.83、SEQ ID No.84、SEQ ID No.85、SEQ ID No.86、SEQ ID No.87和SEQ ID No.88。
48.一对包含正向和反向引物以检测、鉴定和/或定量生物样品中的微生物DNA的合成的多核苷酸，所述正向和反向引物选自：SEQ ID NO.1和SEQ ID NO.23，SEQID NO.2和SEQ ID NO.24，SEQ ID NO.3和SEQ ID NO.25，SEQ ID NO.4和SEQID NO.26，SEQ ID NO.5和SEQ ID NO.27，SEQ ID NO.6和SEQ ID NO.28，SEQID NO.7和SEQ ID NO.29，SEQ ID NO.8和SEQ ID NO.30，SEQ ID NO.9和SEQID NO.31，SEQ ID NO.10和SEQ ID NO.32，SEQ ID NO.11和SEQ ID NO.33，SEQID NO.12和SEQ ID NO.34，SEQ ID NO.13和SEQ ID NO.35，SEQ ID NO.14和SEQ ID NO.36，SEQ ID NO.15和SEQ ID NO.37，SEQ ID NO.16和SEQ ID NO.38，SEQ ID NO.17和SEQ ID NO.39，SEQ ID NO.18和SEQ ID NO.40，SEQ ID NO.19和SEQ ID NO.41，SEQ ID NO.20和SEQ ID NO.42，SEQ ID NO.21和SEQ ID NO.43，以及SEQ ID NO.22和SEQ ID NO.44。
49.一种包含延伸引物以检测、鉴定和/或定量生物样品中的微生物DNA的合成的多核苷酸，所述延伸引物选自：SEQ ID NO.45、SEQ ID NO.46、SEQ ID NO.47 SEQID NO.48、SEQ ID NO.49、SEQ ID NO.50、SEQ ID NO.51、SEQ ID NO.52、SEQID NO.53、SEQ ID NO.54、SEQ ID NO.55、SEQ ID NO.56、SEQ ID NO.57、SEQID NO.58、SEQ ID NO.59、SEQ ID NO.60、SEQ ID NO.61、SEQ ID NO.62、SEQID NO.63、SEQ ID NO.64、SEQ ID NO.65和SEQ ID NO.66。
50.一种检测生物样品中的微生物DNA的试剂盒，所述试剂盒包含一容器和一种或多种如47、48和49所述的合成的多核苷酸。
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