CN1011243B - 酵母菌异源基因表达的调节区 - Google Patents

Abstract

本发明涉及新的DNA顺序，它关系到甲醇和不抑制碳源的可分解产物和碳素缺乏的出理及包含该DNA顺序的新工程产物以及用它转化的微生物。还涉及制造该DNA顺序及其工程产物的方法。也叙述了在该调节区控制下生产肽的方法。

Description

本发明是有关重组DNA的生物技术。一方面它是关于调节DNA转录成信息RNA（mRNA）及调节由mRNA转译成蛋白质的DNA片段。另一方面它还涉及包括上述DNA片段的表达载体。此外，本发明还涉及用上述表达载体转化的新微生物，以及有关多肽的生产。

背景

由于重组DNA技术最近几年的发展，通过微生物生产各种各样的有用的肽已成为可能。通过不同的微生物已经生产出很多真核生物的多肽，诸如人生长激素，白细胞干扰素，人胰岛素和人的胰岛素原等。我们手中申请的技术是希望今后能通过微生物生产出更多其它有用的肽。

重组DNA领域所用的基本技术已为该领域的普通专业人员所知。在重组DNA技术实践中使一个宿主微生物有用的所需因素包括但不被限制在下述几个方面：

（1）给一个或多个所需要肽编码的提供在宿主微生物中表达它所需的适当的控制顺序的一个基因。

（2）一个基因可被插入的载体，通常为质粒。载体保证把特定基因转移到细胞中，在细胞中保持DNA顺序，同时能保证上述基因有一个高水平的表达。

（3）一个合适的宿主微生物，可被携带所需要基因的载体转 化，宿主微生物也有自己细胞器允许插入基因带来信息的表达。

用于重组DNA技术的一个基本因素是质粒，它是在一些微生物中发现的染色体外双链DNA。在一些微生物中质粒被发现是自然产生的，每个细胞可产生多个拷贝。除了自然产生的外，也制备出很多人造质粒或杂交载体。被编码在质粒DNA的信息就需要在子细胞中繁殖质粒而复制，也就是需要自主地复制顺序或称为一个复制起点。质粒DNA中还必须包括一个或多个供选择用的表现型特征。供选择的表现型特征使得含有意义质粒的宿主细胞的克隆可以通过在选择培养基上生长的细胞中被识别和选出。

质粒的实用性在于它们可以特异地被一种或另一种限制性内切酶或限制酶切割，每种酶可识别质粒上一个特定的，唯一的位点。因而，来自于其它非宿主生物的同源或异源基因或基因片段都可通过切割的质粒和所需遗传材料在切点或在邻近切点的重组端连接而插入进质粒。因而所得重组DNA材料可被看作是杂交载体。

DNA重组是在宿主微生物外进行的。得到的杂交载体又通过已知的转化过程进入宿主微生物。随着转化了的微生物的生长，可得到大量的杂交载体。基因随着插入到支配编码DNA信息的质粒中，使得到的杂交载体能用于直接生产被插入基因编码的肽。这种方式生产肽我们称之为基因表达。

基因表达是在称为启动子区的DNA区开始的。在表达的转录期，DNA解旋暴露出来作为合成信息RNA模版。RNA聚合酶结合到启动子区，并沿着解旋的DNA从它的3′末端移到5′末端把DNA编码链的信息以mRNA5′端到3′端的合成转录成信息RNA。信息RNA来自则附着在核糖体上，在那儿mRA转译成肽 链。每个氨基酸都被一个核苷酸三联体或称密码子所编码，它们是构成结构基因部分，也就是说给表达产物氨基酸顺序编码的基因部分。由于三个核苷酸为每个氨基酸编码，所以核苷酸顺序就可以以三种不同方式被“阅读”。为所需肽产物编码的特定读码被称叫特定的读码。

附着到启动子上后，RNA聚合酶从mRNA5′末端开始转录，然后转译起始或称起始密码使结构基因内核苷酸密码转译。为了得到所需基因产物，必须使起始因子或起始密码通过核糖体正确开始转录才能以适当读码转译信息RNA。最后，终止密码在结构基因末端被转录，即使mRNA的附加顺序已在RNA聚合酶与DNA模板相互作用过程中被形成，但终止密码阻止该顺序在核糖体中被转译为肽。因此，终止信号决定着转译终止，并把肽末端氨基酸结合到肽产品上去。然后破碎宿主细胞获得肽产物，通过适当方法使其与其它微生物蛋白分离，纯化。或在某些情况下把微生物分泌的肽从它生长的发酵基质中分离纯化出来。

实际上，应用重组DNA技术可以制造能全部表达异源肽的微生物，异源肽即不是在某特定微生物中发现并为它制造的所谓直接表达产生的肽。相反，它能表达一种融合蛋白，即将一种异源肽融合剂，一种在野生型宿主微生物中发现或由它产生的同源肽氨基酸顺序一部分内，这称之为非直接表达。用这种非直接表达开始得到的融合蛋白产物有时是对其目的用途不显示活性的，必须在细胞外把同源/异源肽部分切割方显活性。例如：用溴化氰裂解融合的同源/异源肽的蛋氨酸残基得到生长激素抑制素，胸腺素α1和人胰岛素的A和B链，而用酶切特定的残基得到了β-内啡肽。

迄今为止，为生产不同肽所作的应用重组DNA技术的商业努力已把注意力放在用大肠杆菌作宿主微生物上。然而在某些情况下大肠杆菌已被证实不适于作宿主。例如：大肠杆菌含有一些有毒的热源因子，用作药物的肽必须排除这些因子。当然，纯化所得肽的效率也因不同肽而异。此外，大肠杆菌的蛋白水解活性也严重地限制了有用产物的产量，特别是在用真核生物生产肽产品出现后，这些和其它另一些因素使人们增加了对其它宿主的兴趣。

与原核系统诸如：大肠杆菌生产重组DNA编码的肽相比，在真核系统生产肽方面应用酵母可能提供意味深长的优越性。几世纪以来，酵母用来大规模发酵，而最近几年才出现用大肠杆菌的大规模发酵。酵母可以比细菌更高的细胞密度生长和更容易适应连续发酵工艺事实上，像巴斯德毕赤酵母以超高细胞密度，即超过100克/升密度生长已为Wigner所揭示（在美国专利4，414，329已转让给菲力浦石油公司）。酵母宿主的优点还包括机体的很多机能例如：氧化磷酸化磷位于细胞器之中，从而不受机体生产的外源于野生宿主细胞的多肽的危害作用。作为真核生物，酵母还能表达后的肽产物糖基化，这种糖基化作用对肽产物的生物活性是重要的。它还显示与高等生物一样的密码选择性，从而可更有效地生产哺乳动物基因或从哺乳动物mRNA反向转录的互补DNA的表达产物。

具特征性酵母种未能很好地发展为宿主/载体系统是由于缺乏关于转化条件及合适载体方面的知识。此外，营养缺陷型突变常是不可利用的，因而它通过营养缺陷互补而直接阻止了选择转化体。如果重组DNA技术能充分地支持它的希望，新的宿主/载体系统必定会设计出来，以满足基因工程及使插入的DNA顺序充分表达，从而可在 人工控制条件下高产地生产所需肽。

发明目的

因此本发明的目的是涉及对甲醇存在起反应的新调节区。

另一个目的涉及一种新的降解产物敏感的调节区，它对某些碳源的存在有反应性，而与另一些碳源的存在无反应活性。

本发明的再一个目的是与碳源缺乏有关的新调节区。

本发明还有一个目的是能表达插入的肽编码顺序的载体。

本发明再有一个目的是Pichia和Sa    charomyces属的一些新酵母菌株。

本发明进一步的目的是用上述新酵母菌株生产肽的一个方法。

本发明的这些目的从说明书和权利要求中揭示的内容中可明显看出。

发明的陈述

根据本发明，我们发现，分离和定性了控制DNA转录成mRNA和mRNA转译成肽产物的DNA顺序。本发明的这新的DNA顺序通过（a）能以甲醇为碳源和能源而生长的酵母菌株，（b）能在葡萄糖，乙醇，果糖及类似物上生长的酵母菌株，和（c）能生长在甘油，半乳糖，乙酯及类似物上的酵母菌株而用于生产肽产物。

图示

图1表示基因组克隆（pPG6.0）和蛋白P⁷⁶的cDNA克隆（pPC15.0）间关系。

图2表示基因组克隆（pPG4.0）和蛋白P⁷²（醇氧化酶）的CDNA克隆（pPC8.3和pPC8.0）的关系。

图3表示基因组克隆（pPC4.8）和蛋白P⁴⁰的CDNA 克隆（pPC6.7）的关系。

图4表示从克隆pPG6.0得到的本发明调节区的限制酶切图。

图5是从克隆pPG4.0得到的本发明的调节区的限制酶切图。

图6是从克隆pPG4.8得到的本发明调节区的限制酶切图。

图7是从P⁷⁶结构基因3′末端得到的一段DNA顺序的限制酶切图。

图8是P⁷²（醇氧化酶）结构基因3′末端得到的DNA顺序的限制酶切图。

图9是P⁴⁰结构基因3′末端得到的DNA顺序的限制酶切图。

图10是蛋白P⁷⁶的结构基因及它的5′端调节区的限制酶切图。

图11是蛋白P⁴⁰的结构基因及它的5′端调节区的限制酶切图。

图12是蛋白P⁷⁶CDNA的限制酶切图。

图13是蛋白P⁷²（醇氧化酶）CDNA的限制酶切图。

图14是蛋白P⁴⁰CDNA的限制酶切图。

图15是本发明建立的两个新的P⁷⁶调节区-Lacz DNA的限制酶切图。

图16是本发明建立的一个新的P⁷²（醇氧化酶）调节区-Lacz DNA的限制酶切图。

图17是质粒PSAOH1的限制酶切图。

图18是质粒PSAOH5的限制酶切图。

图19是质粒PSAOH10的限制酶切图。

图20是质粒PTAFH85的限制酶切图。

图21是质粒PT76H1的限制酶切图。

图22是质粒PT76H2的限制酶切图。

图22a是质粒PT76H3的限制酶切图。

图22b是质粒PT76H4的限制酶切图。

图23是质粒PYA2的限制酶切图。

图24是质粒PYA4的限制酶切图。

图25是质粒PYJ8的限制酶切图。

图26是质粒PYJ8Δcla限制酶切图。

图27是质粒PYJ30的限制酶切图。

图28是提供一个质粒PTAFH1的限制酶切图，说明该质粒是如何衍生的。

图29提供一个质粒PTAO12的限制酶切图，说明该质粒是如何衍生的。

图30是质粒PTAO13的限制酶切图。

图30a是质粒PT76U1的限制酶切图。

图31提供一个质粒PTAO1的限制酶切图，说明该质粒是如何衍生的。

图32提供一个质粒PTAF.85的限制酶切图，说明该质粒是如何衍生的。

图33提供质粒YEp13的限制酶切图。

图34是质粒pBPf1的限制酶切图。

下面本申请说明书用的缩写表示所用的限制性内切酶：

A＝AsuⅡ    Rs＝RsaⅠ

B＝BamHⅠ    S＝SalⅠ

B₂＝BglⅡ S₃＝Sau3AⅠ

Bc＝BclⅠ    Sc＝SacⅠ

C＝ClaⅠ    Sm＝SmaⅠ

H₂＝HincⅡ Sp＝SphⅠ

H₃＝HindⅢ Ss＝SstⅠ

K＝KpnⅠ    St＝StuⅠ

Nd₁＝NdeⅠ T＝TaqⅠ

Nr＝NruⅠ    Th＝ThaⅠ

Ps＝PstⅠ    Xb＝XbaⅠ

PV₂＝PVuⅡ Xh＝XhoⅠ

R₁＝EcoRⅠ Xm＝XmaⅠ

Rs＝EcoRⅤ

附图中DNA片段的切点用括号中内切酶的缩写标出。

发明的详细描述

本发明提供的包含一个调节区的新的DNA片段关系着至少下列情况之一的出现：只有甲醇存在，细胞生长在一些除甲醇外的底物的缺乏碳源时期，以及存在除甲醇之外的抑制碳源的非降解产物。本发明的DNA片段调节区，在mRNA位于为它编码的DNA5′末端时，能控制它的转录。上述DNA片段的突变体也在我们的发明范围内。

进而本发明还提供一个包含着在mRNA位于它编码的肽的3′末端时能控制mRNA转录的聚腺苷酰化和终止以及mRNA转译的终止的调节区的DNA片段。控制mRNA转录和转译的调节区负责着至少下列情况之一的出现：只有甲醇存在，细胞生长在一些除甲醇 外的底物的缺乏碳源时期，以及存在除甲醇之外的抑制碳源的非降解产物。上述DNA片段的突变体也在我们的发明范围内。

根据本发明的特定实施例，还提供了指导把其编码的肽引入过氧化物酶体中的DNA片段。过氧化物酶体是大量出现在生长于甲醇环境中的酵母细胞中的细胞内含物。这些细胞内含物可用于把掺入的肽产物从细胞液和蛋白酶中分离出来。

根据本发明另一个实施例，还提供了为醇氧化酶编码的一个基因，一个为大约40KD蛋白编码的基因和一个为大约76KD蛋白编码的基因。

本发明的又一体现是提供了含有以上描述的DNA片段的质粒及转化的微生物。

本发明的再一个实施例是提供了制造本发明一系列质粒，DNA片段以及异质肽（即不是宿主固有的肽）的方法。

从Pichia    Pastoris中分离调节基因

用从生长在以甲醇为唯一碳源的巴斯德毕赤酵母中分离的PolyA⁺RNA（见例Ⅲ）在E.Coli中制备含大约20，000个CDNA的基因文库。再用从生长在甲醇或乙醇上的巴斯德毕赤酵母分离出的激酶化的PolyA⁺RNA杂交筛选基因文库。经过几轮正负筛选，鉴定出三个明显不同质的CDNA克隆作为甲醇特异的信息RNA的拷贝。这些克隆命名为pPC6.4，pPC8.0和pPC15.0。并测定了它们分别含470，750和110个核苷酸长的插入部分。

为得到更长的CDNA克隆，用较温和的S1核酸酶酶解制备第二CDNA基因文库，这个新文库的成员用32P标记的CDNA克 隆pPC6.4，pPC8.0和pPC15.0分别筛选。结果分离出相应CDNA克隆pPC6.4和pPC8.0的较大的CDNA克隆。发现较大的克隆pPC6.7和pPC8.3分别含有1200和2100个核苷酸的插入体。（见图2和图3）。筛选了40，000个CDNA克隆后没观察到具有大于1100个核苷酸的pPC15.0的插入体的CDNA克隆。

用32P标记的pPC15.0，pPC8.0或pPC6.4与染色体DNA杂交，然后用限制性的内切酶酶解该Pichia    Pastoris    DNA，跑电泳，再切下电泳带用电泳洗脱分离相应于这些CDNA克隆的基因组DNA片段，再把这些片段克隆到大肠杆菌中去。然后用上述每个CDNA的探针多次筛选鉴定合适的基因组克隆。

每个CDNA克隆与它相应的基因组克隆的关系示在图1、2和3。pPC15.0是被编码在克隆pPG6.0中的一个6000个核苷酸的HindⅢ基因组片段内（图1）。为pPC15.0编码的基因的5′末端朝向包含在pPG6.0的1300个碱基对的HindⅢ-EcoRⅠ片段，而其3′末端接近pPG6.0的PStⅠ切点。

CDNA克隆pPC8.3包括在基因组克隆pPG4.0之中（图2），pPG4.0含有一个邻近基因组DNA的4，000个核苷酸的EcoKⅠ-PVuⅡ插入体。pPC8.3在pPG4.0中的方向是沿着紧靠着BamHⅠ切点是CDNA克隆的基因的5′末端，而这基因的3′末端位于PVuⅡ切点附近。pPC8.0（一个有关的CDNA克隆）在pPG4.0内的方向是这个CDNA的 5′末端沿着pPG4.0    3′末端方向靠近KPnⅠ切点，这个CDNA3′末端位于PVaⅡ切点附近。

CDNA克隆pPC6.7完全置于一个4800个核苷酸的EcoRⅠ-BamHⅠ基因组片段中（图3）。相反克隆pPC6.4完全位于CDNA克隆pPC6.7之中。由于pPC6.7是一个比pPC6.4更完全的拷贝，因此后者没有被进一步研究。该基因的5′末端靠近基因组克隆pPG4.8的BamHⅠ端而不是它的EcoRⅠ端（图3）。

在所有在上述这些的基因组克隆中，至少有侧面连接基因组DNA顺序的1.2Kb碱基对，它是每个CDNA克隆复制的结构基因的5′末端。

每个上述的基因组和CDNA的克隆都已被贮藏在美国北部研究中心，（Peoria，Iuinois）为保证本申请作为专利的充分公开，所有克隆均被贮存在大肠杆菌宿主中：

质粒    宿主    贮藏编号

pPG6.0    E.coli    LE392-pPG6.0    NRRLB-15867

pPG4.0    E.coli    LE392-pPG4.0    NRRLB-15868

pPG4.8    E.coli    LE392-pPG4.8    NRRLB-15869

pPC15.0    E.coli    LE392-pPC15.0    NRRLB-15870

pPC8.3    E.coli    LE392-pPC8.3    NRRLB-15871

pPC6.7    E.coli    LE392-pPC6.7    NRRLB-15872

pPC8.0    E.coli    MM294-pPC8.0    NRRLB-15873

所有上述菌株都稳定地被贮存，以便从1984年8月31日供公众 取用。

pPG6.6，pPG4.0和pPG4.8对噬甲醇酵母的唯一性

pPG6.6，pPG4.0和pPG4.8CDNA克隆都被标记以用作一系列同化甲醇的酵母和一个不同化甲醇的酵母的染色体DNA顺序的探针。在几乎所有同化甲醇的酵母中都发现有上面三个CDNA的同源基因，但它们明显地不存在于不同化甲醇的酵母中（S.cerevisiae）。因此人们相信这些基因对同化甲醇的酵母是特有的。此外，在例ⅩⅦ中详述的Southern分子杂交试验也表明了从不同的能同化甲醇的酵母中分离的该基因是高度同源的。

pPG6.0，pPG4.0和pPG4.8基因的RNA转录的定性

研究这些基因对转录的作用，可通过观察甲醇对这些克隆的基因表达的影响而完成。从生长在以乙醇或甲醇为唯一碳源的巴斯德毕赤酵母细胞分离PolyA⁺RNA，将其用于制备性Northern滤纸杂交（见例Ⅳ），三对用生长在甲醇和乙醇上细胞RNA转移得到的滤纸分别用32P标记的pPC15.0，pPC8.0和pPC6.4杂交标记。克隆pPC15.0，pPC8.0和pPC6.4与从生长在甲醇上的细胞得到的RNA分子（分别大约为2400，2300和1300个核苷酸）杂交。用从乙醇的培养基上生长的细胞得到RNA没有观察到与pPC1.5和pPC8.0探针杂交。而来自于生长在乙醇细胞中的一个1300个核苷酸的RNA分子与pPC6.4杂交，这RNA分子与在甲醇培养基上生长的细胞中得到的一样，但其数量上低于甲醇培养基上细胞得到的RNA5倍。 确定pPG6.0，pPG4.0和pPG4.8编码的蛋白质产物大小

为鉴定上述每种CDNA克隆编码的蛋白产物，用从生长在甲醇培养基上的Pichia Pastoris细胞得到的Poly A⁺RNA与每种CDNA选择性地杂交。把杂交选择的mRNA，即与每个CDNA克隆杂交的mRNA用于体外翻译，其相应的蛋白产物用SDS变性电泳分析之（见例Ⅴ），体外正杂交翻译试验的结果说明克隆pPC15.0，pPC8.3和pPC6.7分别选择了为P76，P72和P40肽编码的mRNA。当用从甲醇培养基上生长的Pichia Pastoris细胞分离的总体Poly A⁺RNA在相同体外翻译系统转译时，也得到这些相同的蛋白。

确定P72为醇氧化酶A，分子量比较

通过对水透析溶胞产物，可简单地制取高富集的醇氧化酶蛋白（见例Ⅶ），SDS电泳法分析透析得到的结晶沉淀表明主要含有两个肽，分别为76000道尔顿和72000道尔顿。进一步用Sephacryl    200层析以纯化该沉淀（见例Ⅶ），证明醇氧化酶的活性是相对于72，000道尔顿的肽。这个肽的大小与CDNA克隆pPC8.3选择的蛋白相同。（见例X）。

B.免疫沉淀法

用免疫沉淀法也证明了克隆pPC8.3和pPG4.0是为醇氧化酶的结构基因编码（例Ⅺ）。从Pichiu Pastoris分离的含76，000和72，000道尔顿肽的蛋白制剂被用来在家兔中产生特异性的抗血清。当从克隆pPC8.3得到选择杂交的Poly A⁺RNA，在体外翻译时，仅72000道尔顿的转译产 物被抗Pichia    Pastoris细胞蛋白制品的抗血清沉淀。

C.予测和现实的氨基酸顺序比较：

为进一步证实克隆pPC8.3确是为Pichiu    Pastoris醇氧化酶编码的CDNA克隆，把该蛋白N末端的氨基酸顺序与被pPC8.3编码的蛋白予测的顺序相比较。72000道尔顿蛋白N末端顺序是：（顺序A，见例Ⅷ）。

Ala-Ile-Pro-Glu-Glu-Phe-Asp-Ile-Len-Val-Leu-Gly-Gly-Ser-Ser-Gly-Ser（顺序A）

与其氨基酸顺序平行，测定了在pPC8.3和pPG4.0中的编码基因的5′末端的核苷酸顺序。予测的从基因组和CDNA克隆的DNA顺序衍化的2-19氨基酸的顺序（见顺序B）与上述测定的Pichia    Pastosis醇氧化酶的头18个氨基酸的顺序完全一致：

予测的氨基酸顺序：Met  ala  ile  pro  glu  glu

核苷酸顺序：5-ATG  GCT  ATC  CCC  GAA  GAG

(_PPC8.3和_PPG4.0)3-TAC CGA TAG GGG CTT CTC

phe  asp  ile  leu  val  leu  gly  gly  gly  ser  ser

TTT  GAT  ATC  CTA  GTT  CTA  GGT  GGT  GGA  TCC  AGT

AAA  CTA  TAG  GAT  CAA  GAT  CCA  CCA  CCT  AGG  TCA

gly  ser

GGA  TCC-3′

CCT  AGG-5′（顺序B）

此外，测定了醇氧化酶基因编码区的整个核苷酸顺序。测定的核苷酸顺序和予测的氨基酸顺序列在顺序B′前，它们是：

予测的氨基酸顺序：Met  ala  ile  pro  glu  glu

核苷酸顺序：5′-ATG  GCT  ATC  CCC  GAA  GAG

(_PPC8.3和_PPG4.0)3′-TAC CGA TAG GGG CTT CTC

phe  asp  ile  leu  val  leu  gly  gly  gly  ser  ser

TTT  GAT  ATC  CTA  GTT  CTA  GGT  GGT  GGA  TTC  AGT

AAA  CTA  TAG  GAT  CAA  GAT  CCA  CCA  CCT  AGG  TCA

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CCT  AGG  ACA  TAA  AGG  CCT  CCT  AAC  CGT  TTG

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AAC  CTG  GTG  AGG  AAC  TTT  CAA  CCA  GAA  TAG  CTT

ala  gly  glu  asn  gln  pro  gln  gln  pro  met  gly

GCA  GGT  GAC  AAC  CAA  CCT  CAA  CAA  CCC  ATG  GGT

CGT  CCA  CTC  TTG  GTT  GGA  GTT  GTT  GGG  TAC  CCA

leu  pro  ser  arg  tyr  leu  pro  lys  lys  gln  lys

CTA  CCT  TCC  AGG  TAT  TTA  CCC  AAG  AAA  CAG  AAG

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CCG  AGC  TTT  TGT  CTC  CTG  AAC  GAA  GGT  AAC  TAC

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TCT  TTG  GTG  CTG  TTG  AAC  ATG  AAC  TAG  ACA  TTG

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AGA  GCT  GCT  GCT  GTT  AGA  ACC  GTT  CCA  AGC  AAG

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TAC  CGT  GCT  AGA  AAG  CAA  ATC  TTT  TTG  TCT  TGT

ATG  GCA  CGA  TCT  TTC  GTT  TAG  AAA  AAC  AGA  ACA

gly  thr  ile  ser  ser  pro  leu  val  leu  gln  arg

GGT  ACC  ATC  TCC  TCT  CCA  TTG  GTT  TTG  CAA  AGA

CCA  TGG  TAG  AGG  AGA  GGT  AAC  CAA  AAC  GTT  TCT

ser  gly  phe  gly  asp  pro  ile  lys  leu  arg  ala

TCC  GGT  TTT  GGT  GAC  CCA  ATC  AAG  TTG  AGA  GCC

AGG  CCA  AAA  CCA  CTG  GGT  TAG  TTC  AAC  TCT  CGG

ala  gly  val  lys  pro  lys  val  asn  leu  pro  gly

GCT  GGT  GTT  AAG  CCT  TTG  GTC  AAC  TTG  CCA  GGT

CGA  CCA  CAA  TTC  GGA  AAC  CAG  TTG  AAC  GGT  CCA

val  gly  arg  asn  phe  gln  asp  his  tyr  cys  phe

GTC  GGA  AGA  AAC  TTC  CAA  GAC  CAT  TAT  TGT  TTC

CAG  CCT  TCT  TTG  AAG  GTT  CTG  GTA  ATA  ACA  AAG

phe  ser  pro  tyr  arg  ile  lys  pro  gln  tyr  glu

TTC  AGT  CCT  TAC  AGA  ATC  AAG  CCT  CAG  TAC  GAG

AAG  TCA  GGA  ATG  TCT  TAG  TTC  GCA  GTC  ATG  CTC

ser  phe  asp  asp  phe  val  arg  gly  asp  ala  glu

TCT  TTC  GAT  GAC  TTC  GTC  CGT  GGT  GAT  GCT  GAG

AGA  AAG  CTA  CTG  AAG  CAG  GCA  CCA  CTA  CGA  CTC

ile  gln  lys  arg  val  val  asp  gln  trp  tyr  ala

ATT  CAA  AAG  AAG  GTC  GTT  GAC  CAA  TGG  TAC  GCC

TAA  GTT  TTC  TCT  CAG  CAA  CTG  GTT  ACC  ATG  CGG

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AAT  GGT  ACT  GGT  CCT  CTT  GCC  ACT  AAC  GGT  ATC

TTA  CCA  TGA  CCA  GGA  GAA  CGG  TGA  TTG  CCA  TAG

glu  ala  gly  val  lys  ile  arg  pro  thr  pro  glu

GAA  GCT  GCT  GTC  AAG  ATC  AGA  CCA  ACA  CCA  GAA

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glu  leu  ser  gln  met  asp  glu  ser  phe  gln  glu

GAA  CTC  TCT  CAA  ATG  GAC  GAA  TCC  TTC  CAG  GAG

CTT  GAG  AGA  GTT  TAC  CTG  CTT  AGG  AAG  GTC  CTC

gly  tyr  arg  glu  tyr  phe  glu  asp  lys  pro  asp

GGT  TAC  AGA  GAA  TAC  TTC  GAA  GAC  AAG  CCA  GAC

CCA  ATG  TCT  CTT  ATG  AAG  CTT  CTG  TTC  GGT  CTG

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AAG  CCA  GTT  ATG  CAC  TAC  TCC  ATC  ATT  GCT  GGT

TTC  GGT  CAA  TAC  GTG  ATG  AGG  TAG  TAA  CGA  CCA

phe  phe  gly  asp  his  thr  lys  ile  pro  pro  gly

TTC  TTC  GGT  GAC  CAC  ACC  AAG  ATT  CCT  CCT  GGA

AAG  AAG  CCA  CTG  GTG  TGG  TTC  TAA  GGA  GGA  CCT

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AAG  TAC  ATG  ACT  ATG  TTC  CAC  TTC  TTG  GAA  TAC

TTC  ATG  TAC  TGA  TAC  AAG  GTG  AAG  AAC  CTT  ATG

pro  phe  ser  arg  gly  ser  ile  his  ile  thr  ser

CCA  TTC  TCC  AGA  GGT  TCC  ATT  CAT  ATT  ACC  TCC

GGT  AAG  AGG  TCT  CCA  AGG  TAA  GTG  TAA  TGG  AGG

pro  asp  pro  tyr  ala  ala  pro  asp  phe  asp  arg

CCA  GAC  CCA  TAC  GCA  GCT  CCA  GAC  TTC  GAC  CGA

GGT  CTG  GGT  ATG  CGT  CGA  GGT  CTG  AAG  CTG  GCT

gly  phe  met  asn  asp  glu  arg  asp  met  phe  pro

GGT  TTC  ATG  AAC  GAT  GAA  AGA  GAC  ATG  GCT  CCT

CCA  AAG  TAC  TTG  CTA  CTT  TCT  CTG  TAC  CGA  GGA

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ATG  GTT  TGG  GCT  TAC  AAG  TCT  TCT  AGA  GAA  ACC

TAC  CAA  ACC  CGA  ATG  TTC  TTC  AGA  TCT  CTT  TGG

ala  arg  arg  ser  asp  his  phe  ala  gly  glu  val

GCT  AGA  AGA  AGT  GAC  CAC  TTT  GCC  GGT  GAG  GTC

CGA  TCT  TCT  TCA  CTG  GTG  AAA  CGG  CCA  CTC  CAG

thr  ser  his  his  pro  leu  phe  pro  tyr  ser  ser

ACT  TCT  CAC  CAC  CCT  CTG  TTC  CCA  TAC  TCA  TCC

TGA  AGA  GTG  GTG  GGA  GAC  AAG  GGT  ATG  AGT  AGG

glu  ala  arg  ala  leu  glu  met  asp  leu  glu  thr

GAG  GCC  AGA  GCC  TTG  GAA  ATG  GAT  TTG  GAG  ACC

CTC  CGG  TCT  CGG  AAC  CTT  TAC  CTA  AAC  CTC  TGG

ser  asn  ala  thr  gly  gly  pro  leu  asn  leu  ser

TCT  AAT  GCC  TAC  GGT  GGA  CCT  TTG  AAC  TTG  TCT

AGA  TTA  CGG  ATG  CCA  CCT  GGA  AAC  TTG  AAC  AGA

ala  gly  leu  ala  his  gly  ser  trp  thr  gln  pro

GCT  GGT  CTT  GCT  CTC  GGT  TCT  TGG  ACT  CAA  CCT

CGA  CCA  GAA  CGA  GTG  CCA  AGA  ACC  TGA  GTT  GGA

leu  lys  lys  pro  thr  ala  lys  asn  gln  gly  his

TTG  AAG  AAG  CCA  ACT  GCA  AAG  AAC  GAA  GGC  CAC

AAC  TTC  TTC  GGT  TGA  CGT  TTC  TTG  CTT  CCG  GTG

val  thr  ser  asn  gln  val  glu  leu  his  pro  asp

GIT  ACT  TCG  AAC  CAG  GTC  GAG  CTT  CAT  CCA  GAC

CAA  TGA  AGC  TTG  GTC  CAG  CTC  GAA  GTA  GGT  CTG

ile  glu  tyr  asp  glu  glu  asp  asp  lys  ala  ile

ATC  GAG  TAC  GAT  GAG  GAG  GAT  GAC  AAG  GCC  ATT

TAG  CTC  ATG  CTA  CTC  CTC  CTA  CTG  TTC  CGG  TAA

glu  asn  tyr  ile  arg  glu  his  thr  glu  thr  thr

GAG  ACC  TAC  ATT  CGT  GAG  CAC  ACT  GAG  ACC  ACA

CTC  TTG  ATG  TAA  GCA  CTC  GTG  TGA  CTC  TGG  TGT

trp  his  cys  leu  gly  thr  cys  ser  ile  gly  pro

TGG  CAC  TGT  CTG  GGA  ACC  TGT  TCC  ATC  GGT  CCA

ACC  GTG  ACA  CCA  GGT  TGG  ACA  AGG  TAG  CCA  GGT

arg  glu  gly  ser  lys  ile  val  lys  trp  gly  gly

AGA  GAA  GGT  TCC  AAG  ATC  GTC  AAA  TGG  GGT  GGT

TCT  CTT  CCA  AGG  TTC  TAG  CAG  TTT  ACC  CCA  CCA

val  leu  asp  his  arg  ser  asn  val  tyr  gly  val

GTT  TIG  GAC  CAC  AGA  TCC  AAC  GTT  TAC  GGA  GTC

CAA  AAC  CTG  GTG  TCT  AGG  TTG  CAA  ATG  CCT  CAG

lys  gly  leu  lys  val  gly  asp  leu  ser  val  cys

AAG  GGC  TIG  AAG  GTT  GGT  GAC  TTG  TCC  GTG  TGC

TTC  CCG  AAC  TTC  CAA  CCA  CTG  AAC  AGG  CAC  ACG

pro  asp  asn  val  gly  cys  asn  thr  tyr  thr  thr

CCA  GAC  AAT  GTT  GGT  TGT  AAC  ACC  TAC  ACC  ACC

GGT  CTG  TTA  CAA  CCA  ACA  TTG  TGG  ATG  TGG  TGG

ala  leu  leu  ile  gly  glu  lys  thr  ala  thr  leu

GCT  CTT  TTG  ATC  GGT  GAA  AAG  ACT  GCC  ACT  TTG

CGA  GAA  AAC  TAG  CCA  CTT  TTC  TGA  CGG  TGA  AAC

val  gly  glu  asp  leu  gly  tyr  ser  gly  glu  ala

GTT  GGA  GAA  CAT  TTA  GGA  TAC  TCT  GGT  GAG  GCC

CAA  CCT  CTT  CTA  AAT  CCT  ATG  AGA  CCA  CTC  CGG

leu  asp  met  thr  val  pro  gln  phe  lys  leu  gly

TTA  GAC  ATG  ACT  GTT  CCT  CAG  TTC  AAG  TTG  GGC

AAT  CTG  TAC  TGA  CAA  GGA  GTC  AAG  TTC  AAC  CCG

thr  tyr  glu  lys  thr  gly  leu  ala  arg  phe

ACT  TAC  GAG  AAG  ACC  GGT  CTT  GCT  AGA  TTC

TGA  ATG  CTC  TTC  TGG  CCA  GAA  CGA  TCT  AAG

TAA-3′

ATT-5′

（顺序B′）

把上面的核苷酸顺序与已发表的（Ledeboer等人）Hansenula    Polymorpha的醇氧化酶的核苷酸顺序及予测的氨基酸顺序比较，有一些明显的不同，实测的基因大小（及编码蛋白大 小）及所用编码习惯等方面也有差异。

确定P⁷⁶为二羟基丙酮合成酶

P⁷⁶基因的头51个核苷酸顺序已用标准技术测定，从它推测出的P⁷⁶蛋白氨基末端的氨基酸顺序如下：

可把这个蛋白P⁷⁶的顺序与已发表的Hansenula Polymorpha（ManoWicz等人）的二羟基丙酮合成酶（DHAS）的氨基酸顺序比较。虽有些差别，但仍可看出两个蛋白间的相似性：

根据其明显的同质程度和相似的蛋白大小（大约76000道尔顿），P⁷⁶被推测为Pichia的DHAS。

如上分析醇氧化酶基因的方法，把Pichia    DHAS蛋白的头51个编码核苷酸与已发表的（Janowicz等人）Hansenula    DHAS的编码核苷酸比较，说明在遗传密码巴斯德毕赤酵母使用习 惯，予测的氨基酸顺序及基因的大小诸方面均可差异。

含有来自于调节启动子的DNA片段

本发明的5′端调节区的限制酶切图示在图4、5和6。控制多肽p76表达的5′端调节区位于图4a所绘的DNA片段内。如下面详述，清楚地表明大约2.9千对碱基的HindⅢ-XhoⅠ片段含有调节功能。因为CDNA克隆pPC15.0不是一个完全的CDNA拷贝，但似乎它至少是图4a所示包括为P76肽编码结构基因的DNA片段的一部分。因此，人们相信调节功能区位于图4b所示约1300个碱基对的HindⅢ-ECORⅠ片段中。新的含重组部分的β-半乳糖苷酶基因将在下面详细讨论以支持上面的说明。

控制p72肽（醇氧化醇）表达的5′端调节区位于图5所示的大约2000个碱基对的EcokⅠ-BamHⅠ    DNA片段内。下面讨论的含有重组部分的新的β-半乳糖苷酶基因将说明这个DNA片段的可调节的本质。

图6提供一个大约3千对碱基的BamHⅠ-SalⅠ    DNA片段的限制酶切图，该片段包括控制产生p40肽的5′端调节区。该片段与图4、5中详述的5′端调节区在限制酶切点分布上明显的不同。

图10、2a和11分别提供了肽p76，p72（醇氧化酶）和p40的调节区和结构基因的限制酶切资料。然而图10提供控制和为p76肽编码的Pichia    Pastoirs基因组DNA中3.8千对碱基的HindⅢ-PstⅠ片段的详图。图2a提供控制和编码合成p72肽（醇氧化酶）的Pichia    Pastoris基因组DNA的40千对碱基的EcoRⅠ-PruⅡ片段的详图。图11表示控制和编码合成肽p40的3.7千对碱基的BamHⅠ-EcoRⅡ片段。

基因组克隆pPG6.0，pPG4.0和pPG4.8也都用限制酶切图定性了。因此克隆pPG6.0在图1a中详述。DNA片段的5′端被认为是起始点。克隆pPG6.0是一个Pichia    Pastoris染色体DNA的HindⅢ片段，大约6千对碱基长，被不同的限制酶如下切割：

限制酶    切点数    距起始点距离（碱基对）

HincⅡ    5    1070，1740，1890

3320    5520

EcoRⅠ    2    1300，3450

XhoⅠ    1    2860

PstⅠ    2    3820，4200

PvuⅡ    1    4120

PvuⅠ    1    4950

在图2a中详示了克隆pPG4.0，该克隆是染色体DNA的一个EcoRⅠ-HindⅢ片段，大约4千对碱基长。把该克隆的5′端作为起始点，下面是对pPG4.0的内切酶切割资料：

限制酶    切点数    距起始点距离（碱基对）

HindⅢ    3    400，600，1840

PstⅠ    1    850

BamHⅠ    2    1960，1970

SalⅠ    1    2620

BglⅡ    2    1040，2700

KpnⅠ    2    500，2730

XbaⅠ    1    3330

StuⅠ    1    3880

NdeⅠ    1    420

HincⅡ    2    870，2430

SstⅠ    1    1200

BclⅠ    2    1710，4080

AsuⅡ    2    1900，2300

EcoRⅤ    1    1930

PvuⅡ    1    4120

图3a详示了克隆pPG4.8。它是具有下列限制酶切点的Pichia    Pastoris染色体DNA的一个4.8千对碱基的BamHⅠ-EcoRⅠ片段。

限制酶    切点数    距起始点距离（碱基对）

ClaⅠ    1    410

KPnⅠ    3    500，3890，4280

PvuⅠ    1    1120

SalⅠ    1    2900

PvuⅡ    1    4135

EcoRⅤ    2    3690，3890

BglⅡ    1    4500

XmaⅠ    1    4800

基因组克隆pPG6.0，pPG4.0和pPG4.8分别被插入大肠杆菌pBR322质粒的唯一的限制酶切部位中。克隆pPG6.0是一个HindⅢ片段，可按常规克隆到pBR322的HindⅢ切点中去。克隆pPG4.0克隆到pBR322的EcoRⅠ-PruⅡ切点间而克隆pPG4.8克隆到pBR322的 EcoRⅠ-BanaHⅠ切点间（见例Ⅵ）。用这些质粒转化的大肠杆菌菌株已贮藏在北部地区研究中心（Peoria，Illinois），以保证在本专利申请公开时公众可以取用。贮存号如下：

基因组    实验室命名    贮存号

pPG6.0    LE392-pPG6.0    NRRL    B-15867

pPG4.0    LE392-pPG4.0    NRRL    B-15868

pPG4.8    LE392-pPG4.8    NRRL    B-15869

图7、8和9分别提供了肽P76，P72（醇氧化酶）和P40的3′末端调节区限制酶切图。3′末端调节区是用于控制为上述核苷酸顺序编码的mRNA的转录的结束和聚腺苷酰化以及转译的结束。因而肽p76基因的3′末端调节区，图7所示一个2.7千对碱基的EcoRⅠ-HindⅢ片段用于控制为肽p76或其它从3′端调节区上游插入基因衍生的mRNA转录的结束和聚腺苷酰化以及转译的结束。图8a详示的p72基因的0.2千对碱基StuⅠ-PvuⅡ片段，图8b详示的p72基因的0.3千对碱基的StuⅠ-HiudⅢ片段，图8c详示的p72基因的3.2千对SalⅠ-EcoRⅠ片段及图9详示的p40基因的1.9千对碱基的Pvu-Ⅱ-EcoRⅠ片段不仅对它们的结构基因，也对野生型巴斯德毕赤酵母有关基因及任何插入3′端调节区上游的外源（即异质）基因具有相似的实用性。

因为在pPG4.0中的醇氧化酶基因结束在AO基因转录结束点的几百个碱基对内，图8c中详示的附加3′顺序按下述步骤得到。第一步是用EcoRⅠ和SalⅠ酶解Pichia染色体DNA，然后 一个2.0千对碱基的32P标记的AO基因BamHⅠ-HindⅢ片段用Southern吸印法与酶解的DNA杂交。与AO基因探针杂交的Pichia    EcoRⅠ-SalⅠ酶解片段中，一个3.2千对碱基的片段为AO基因的3′末端及3′末端侧部的顺序编码。

通过凝胶洗脱回收EcoRⅠ-SalⅠ切割的大约3.2千对碱基的Pichia    DNA片段，克隆3′AO基因片段，把它插入到用EcoRⅠ和SalⅠ酶解的PBR322质粒中。最后通过用标记的AO基因片段作为探针进行菌落杂交来鉴定含3′AO基因片段的AO重组质粒pPG3.2。用pPG3.2质粒转化大肠杆菌的一个菌株，它已被贮存在北部地区研究中心（NRRC）。贮存号为NRRLB-15999。图8c表示pPG3.2中的Pichia    DNA片段的限制酶切点图。该片段含1.5千对碱基为3′AO部分，从切点SalⅠ到HindⅢ段的编码区，和大约1.7千对碱基的AO基因的3′端顺序。

确定CDNA克隆

也用限制酶切图为Pichia    Pas-toris可调节基因的CDNA克隆定性。在图12详示了一个1.1千对碱基的p76CDNA片段。引用该DNA的5′末端为起始点，限制酶XhoⅠ在距起始点500对碱基处切p76CDNA，HincⅡ从距起始点950对碱基处切割，EcoRⅠ从1050-1000对碱基处切CDNA。图12所示CDNA克隆以及在图13和14中所示CDNA克隆都具有PstⅠ的末端切点。这些是人为制造的切点，首先是用互补DNA通过G-C尾端配对得到的，从而有利于把DNA片段克隆到PBR322中去。基于Northern杂交及肽产物大小的研究，估计 CDNA克隆pPC15.0是p76mRNA的一个不完全的拷贝，只代表整个mRNA的一半。

在图13中，是一个由重叠克隆pPC8.3和pPC8.0建立的p72（醇氧化酶）CDNA的合成的限制酶切图。如上述，DNA的5′端作为起始点，用不同的限制酶处理的醇氧化酶CDNA得到如下大小的片段：

限制性内切酶    切点数    距起始点距离（碱基对）

AsuⅡ    2    20，420

EcoRⅤ    1    50

BamHⅠ    2    80，90

HincⅡ    1    550

SalⅠ    1    820

BglⅡ    1    820

KpnⅠ    1    850

XbaⅠ    1    1450

RsaⅠ    1    1760

StuⅠ    1    2000

pPC8.0和pPC8.3克隆中的醇氧化酶基因3′末端的限制酶切图揭示了克隆pPC8.3的CDNA失去了大约醇氧化酶mRNA顺序的250个核苷酸（图2）。醇氧化酶mRNA3′端顺序是在与pPC8.3重叠大约500个核苷酸的pPC80克隆中。

图14是肽p40的一个1.2千对碱基片段的CDNA的限制 酶切图。以其5′端为起始点，pPC6.7克隆被SalⅠ（和HincⅢ）从起点切割大约1000个碱基。

把每个CDNA片段都克隆到pBR322中去，用它们转化大肠杆菌。转化菌株已贮存在NRRC使专利申请公开时公众可以得到。

其贮藏号为：

CDNA克隆    实验室编号    贮存号

pPC15.0    LE392-pPC15.0    NRRL    B-15870

pPC8.3    LE392-pPC8.3    NRRL    B-15871

pPC8.0    MM294-pPC8.0    NRRL    B-15873

pPC6.7    LE392-pPC6.7    NRRL    B-15872

上述每个CDNA克隆都用作探针，鉴定和分离对以甲醇为唯一碳源和能源的酵母特有的一些肽编码的染色体DNA。因此，当巴斯德毕赤酵母生长在甲醇上时，可用这些克隆鉴定含为其特有肽编码的调节或结构顺序的染色体DNA片段。以相似的方式，这些CDNA克隆也作为探针鉴定和分离从其它同化甲醇的酵母得来的等同基因，例如：Torulopsis    molischiana，

Hansenula    Capsu-latum，

H.nonfer    mantons等酵母（见例ⅩⅦ）

详细分析醇氧化酶基因

克隆pPG4.0的5′端调节区进一步通过测定其5′端上游的核苷酸顺序来定性，这是p72（醇氧化酶）结构基因区。其RNA转译起始点（ATG码）前的250个核苷酸是：

5′-ATGCTTCCAA    GATTCTGGTG    GGAATACTGC    TGATAGCCTA

ACGTTCATGA    TCAAAATTTA    ACTGTTCTAA    CCCCTACTTG

GACAGGCAAT    ATATAAACAG    AAGGAAGCTG    CCCTGTCTTA

AACCTTTTTT    TTTATCATCA    TTATTAGCTT    ACTTTCATAA

TTGCGACTGG    TTCCAATTGA    CAAGCTTTTG    ACTTTAACGA

CTTTTAACGA    CAACTTGAGA    AGATCAAAAA    ACAACTAATT

ATTCGAACG-3′

（顺序C）

克隆pPG4.0启动子作用看来是包含在这个核苷酸碱基顺序中。

为更充分叙述这个新DNA片段，上面顺序C上游的附加301个核苷酸也已测定。这样其mRNA转译起点前的头551个核苷酸为：

5′AATGGCCCAAA    ACTGACAGTTT    AAACGCTGTC    TTGGAACCTA

ATATGACAAA    AGCGTGATCT    CATCCAAGAT    GAACTAAGTT

TGGTTCGTTG    AAATCCTAAC    GGCCAGTTGG    TCAAAAAGAA

ACTTCCAAAA    GTCGCCATAC    CGTTTGTCTT    GTTTGGTATT

GATTGACGAA    TGCTCAAAAA    TAATCTCATT    AATGCTTAGC

GCAGTCTCTC    TATCGCTTCT    GAACCCGGTG    GCACCTGTGC

CGAAACGCAA    ATGGGGAAAC    AACCCGCTTT    TTGGATGATT

ATGCATTGTC    TGATAGCCTA    ACGTTCATGA    TCAAAATTTA

ACTGTTCTAA    CCCTGTCTTA    AACCTTTTTT    TTTATCATCA

AAGGAAGCTG    CCCTGTCTTA    AACCTTTTTT    TTTATCATCA

TTATTAGCTT    ACTTTCATAA    TTGCGACTGG    TTCCAATTGA

CAAGCTTTTG    ATTTTAACGA    CTTTTAACGA    CAACTTGAGA

AGATCAAAAA    ACAACTAATT    ATTCGAACG-3′（顺序D）

包含在顺序D中的额外的核苷酸（与顺序C比较）被认为是一个不知道的机制，给顺序C中的启动予以附加的调节功能。必须认识到顺序D只代表例ⅩⅣ和ⅩⅤ中所示1.1千对碱基的DNA片段的一部分顺序，能在酵母中控制基因表达。在1.1千对碱基的DNA片段的附加的控制机能在顺序D中没有详述。

为进一步叙述这新的1.1千对碱基的DNA片段，完全地叙述了例ⅩⅣ或ⅩⅤ所示整个1.1千对碱基的DNA片段的顺序以指出这能控制酵母基因表达的附加顺序。该核苷酸顺序为如下的顺序D′：

5′-AGATCTAA    CATCCAAAGA

CGAAAGGTTG    AATGAAACCT    TTTTGCCATC    CGACATCCAC

AGGTCCATTC    TCACACATAA    GTGCCAA  CG    CAACAGGAGG

GGATACACTA    GCAGCAGAGG    TTGCAAACGC    AGGACTCATC

CTCTTCTCTA    ACACCATTTT    GCATGAAAAC    AGCCAGTTAT

GGGCTTGATG    GAGCTCGCTC    ATTCCAATTC    CTTCTATTAG

GCTACTAACA    CCATGACTTT    ATTAGCCCTGT    CTATCCTGGC

CCCCCTGGCG    AGGTCATGTT    TGTTTATTTC    CGAATGCAAC

AAGCTCCGCA    TTACACC  GA    ACATCACTCC    AGATGAGGC

TTTCTGAGTG    TGGGGTCAAA    TAGTTTCATG    TTCCCAAATG

GCCCAAAACT    GACAGTTTAA    ACGCTGTCTT    GGAACCTAAT

ATGACAAAAG    CGTGATCTCA    TCCAAGATGA    ACTAAGTTTG

GTTCGTTGAA    ATCCTAACGG    CCAGTTGGTC    AAAAAGAAAC

TTCCAAAAGT    CGCCATACCG    TTTGTCTTGT    TTGGTATTGA

TTGACGAATG    CTCAAAAATA    ATCTCATTAA    TGCTTAGCGC

AGTCTCTCTA    TCGCTTCTGA    ACCCGGTGGC    ACCTGTGCCG

AAACGCAAAT    GGGGAAACAA    CCCGCTTTTT    GGATGATTAT

GCATTGTCCT    CCACATTGTA    TGCTTCCAAG    ATTCTGGTGG

GAATACTGCT    GATAGCCTAA    CGTTCATGAT    CAAAATTTAA

CTGTTCTAAC    CCCTCTCTTAA    ACAGGCAATA    TATA  ACAGA

AGGAAGCTGC    CCTGTCTTAA    ACCTTTTTTT    TTATCATCAT

TATTAGCTTA    CTTTCATAAT    TGCGACTGGT    TCCAATTGAC

AAGCTTTTGA    TTTTAACGAC    TTTTAACGAC    AACTTGAGAA

GATCAAAAAA    CAACTAATTA    TTCGAAACG-3′（顺序D′）

与顺序C和D相比，它们上游（即5′端方向）的顺序D′为附加的控制机能区编码。

为确定醇氧化酶RNA转录从哪儿开始，比较基因组克隆pPC4.0和基因组克隆pPC8.3的这个基因5′末端附近的DNA顺序。CDNA克隆pPC8.3含有醇氧化酶基因非转译区5′端的大约100个核苷酸。基于这个顺序，一个15个碱基的寡核苷酸（5′-CTTCTCAAGTTGTCG-3′）与从-29到-43个核苷酸互补，其中转译起点A（编码为ATG）被命名为+1，而5′端的G被命名为-1。合成该寡核苷酸（见例Ⅸ），并用它作为合成醇氧化酶mRNA到5′端的引物。从这个引物扩展试验得到的CDNA顺序揭示了三个不同的巴斯德毕赤酵母醇氧化酶mRNA转录起始点。大的转录子起始于从转录起始密码开始的114个核苷 酸。两个小的转录子开始于醇氧化酶AUG密码上游5′端的117和111核苷酸。

55个在醇氧化酶mRNA起始点前的核苷酸含一个推定的Goldberg-Hogness    box（TATAA    box）结构。TATAAA顺序是发生在醇氧化酶mRNA主要转录子5′末端的-40位，即从该蛋白起始密码上游的165个核苷酸。

醇氧化酶的3′端调节区通过测定为p72（醇氧化酶）编码的结构基因下游的约120核苷酸的顺序而定性，该顺序作为顺序D″表示如下：

5′-TCAAGAGGAT    GTCAGAATGG    CATTTGCCTG

AGAGATGCAG    GCTTCATTTT    TGATACTTTT

TTATTTGTAA    CCTATATAGT    ATAGGATTTT

TTTTGTCAAA    AAAAAAAAAA    AAAAAAAAAA-3′

（顺序D″）

详细分析p76基因

通过测定给p76编码的结构基因克隆的5′端上游的核苷酸顺序进一步为克隆pPG6.0的5′端调节区定性。该mRNA转录（编码为ATG）前的头622个核苷酸被认为是：

5′-TT    CACCCATACA    ACTATAAACC    TTAGCAATTG

AAATAACCCC    AATTCATTGT    TCCGAGTTTA    ATATACTTGC

CCCTATAAGA    AACCAAGGGA    TTTCAGCTTC    CTTACCCCAT

GAACAGAATC    TTCCATTTAC    CCCCCACTGG    AGAGATCCGC

CCAAACGAAC    AGATAATAGA    AAAAAACAAT    TCGGACAAAT

AGAACACTTT    CTCAGCCAAT    TAAAGTCATT    CCATGCACTC

CCTTTAGCTG    CCGTTCCATC    CCTTTGTTGA    GCAACACCAT

CGTTAGCCAG    TACGAAAGAG    GAAACTTAAC    CGATACCTTG

GAGAAATCTA    AGGCGCGAAT    GAGTTTAGCC    TAGATATCCT

TAGTGAAGGG    TGTCCGATAC    TTCTCCACAT    TCAGTCATAG

ATGGGCAGCT    TGTATCATGA    AGAGACGGAA    ACGGGCATAA

GGGTAACCGC    CAAATTATAT    AAAGACAACA    TGCCCCAGTT

TAAAGTTTTT    CTTTCCTATT    CTTGTATCCT    GAGTGACCGT

TGTGTTTAAT    ATAAAAGTT    CGTTTTAACT    TAAGACCAAA

ACCAGTTACA    ACAAATTATA    ACCCCTCTAA    ACACTAAAGT

TCACTCTTAT    CAAACTTCA    AACATCAAAA-3′（顺序D′″）

虽然本领域专业人员都知道调节区在朝向5′端的上游而不在顺序D′″中，但克隆pPG6.0的启动部分含在这个核苷酸碱基顺序之中。

通过测定p76结构基因的3′端下游的约180个核苷酸顺序进一步给克隆pPG6.0    3′端调节区定性。该顺序作为顺序D″″示如下：

5′-

GTCAGCAGTG    TTTCCTGCCA    AAGCCATCAA    GAGGACGTAC

ATGCTCTCAT    TTTTTGGTTT    TCACTGTCCG    ACGGGGTTCG

TAAACTGGCT    TCCTCCTTTT    CCTTTCCTGT    TGCATTTTAT

TTGGTCAAAC    AAAACTAGGG    TCTTTTCCTA    AAACCTTATG

TCAATGGACC    TACCACATAG-3′（顺序D″″）

在转化的酵母中表达

本发明的上述质粒用于转化酵母。通过把转化的微生物置于碳源 缺乏的培养条件可用本发明新的DNA片段调节酵母中基因的表达。酵母在各种抑制碳素的可分解产物和不可分解产物上生长后，碳源缺乏诱导的基因产物表达将持续在本发明调节区的控制下。使转化了的酵母的适当种属表达所需基因产物的另一方法是将其置于甲醇上生长。还有另一种诱导所需基因表达的方法是使转化的酵母生长在含被抑制的碳源的不可分解产物的基质上。

由于本发明的调节区显示可在不同条件下被诱导，因而它们可用于所有酵母菌株的表达。能生长在甲醇或抑制碳源的不可分解产物上的酵母可诱导产生外源产物，即直接产生异源肽，而能生长在抑制碳源的可分解产物上的酵母可通过把它置于碳素缺乏条件下诱导产生外源肽。

本发明优选的转化酵母包括下列属：

白色念株菌属（Candida），（Kloeckera）酵母属（Saccharomyces），裂殖酵母属（Schisosaccharomyces），红色球拟酵母（Rhodotorula），hansenula，球拟酵母cToru    lopsis），Pichia和Kluyrromyces。选择这些属是因为用它们在生长条件，操作等方面较安全并在先有技术中已知。

在本发明的实施例中特别选用能生长在甲醇上以它为碳源和能源的酵母菌株。能在甲醇上生长的酵母属包括：

白色念株菌属（Candida），Kloeckera，酵母属（Saccharomyces），红色球拟酵母（Rhodotomla），Hansenula，球拟酵母（Torulopsis）和Pichia。

通过使酵母生长在抑制碳源的不可分解产物上及生长在碳素缺乏 基质上以诱导本发明调节区。酵母能生长在诸如下述的非甲醇底物：葡萄糖、乙酯、甘油、乙醇、乳糖、半乳糖、果糖、蔗糖等。它们两种或多种混合物也用于本发明的实例。通过使宿主微生物生长在一个适当的能抑制诸如甘油或半乳糖的非甲醇碳源的不可分解产物，或使其生长在一个适当的能抑制碳源的诸如乙醇，葡萄糖和果糖等碳源的可分解产物，再使宿主处于碳素缺乏状态，本发明调节区控制下的基因产物即可表达。

此外本发明调节区处于不同生长条件时即能诱导也可能抑制表达因此调节一个基因产物的表达要在本发明的调节区控制下才能完成。例如：细胞生长在仅能低水平诱导外源基因表达的碳源上，然后转到甲醇上，它即可强烈地诱导基因表达。另外，还可用诱导/抑制喂料的混合物使调节基因表达，例如：甲醇-葡萄糖混合物。另一方面，酵母生长在甲醇上高的表达水平可通过加入诸如葡萄糖或乙醇等抑制碳源的生长介质而降低。当然，本领域的技术人员会认识到改变喂料混合物及喂入次序可以在很大程度上控制本发明调节区的基因表达水平。

一个特别优选的宿主菌株是突变菌株巴斯德毕赤酵母Gs115，它是一个不能制造组氨酸的突变，它的命名是由于它具有突变基因型his4。Gs115是从巴斯德毕赤酵母NRRL Y-11430衍生的，被贮存在Peoria Illinoss的美国农业部北部区研究中心。贮存号为NRRL Y-15851，贮存日为1984年8月31日。这个特别的宿主被使用，因为它是一个不能合成组氨酸的营养缺陷型突变株。用含HIS₄基因的质粒转化宿主很容易得到转化宿主。

由于本发明的调节区是用于调节酵母属菌株导源基因产物的表达 该属已有大量营养缺陷型突变菌株人所共知。附加优选的宿主酵母包括ATCC24653（一个trp1，ade1，his2，leu1，gal1，ura1突变），ATCC24684（一个trp1，ade1，his7，gal1，ura1突变），ATCC32810（一个trp5，arg4，his5，lys1，ade2，gal2突变），ATCC34182（一个ade3，his，lys，ura突变），ATCC34352（一个ura2突变），ATCC34353（一个ura2突变），ATCC38523（一个arg1，thr1突变），ATCC38628（一个leu2，his4突变），ATCC38660（一个his4，leu2，thr4突变），ATCC42243（一个ura3突变），ATCC42336（一个ade1，his4，thr4突变），ATCC42403（一个arg4，lys7突变），ATCC42404（一个ade1，his4，leu2突变），ATCC42564（一个ura1，his6突变），ATCC42596（一个his4，leu2，lys1突变），ATCC42957（一个his4，lea2，thr4，trp5突变），ATCC42950（一个ade突变），ATCC42951（一个ade，leu突变），ATCC44069（一个ura1突变），ATCC44070（一个leu2，his4突变），ATCC44222（一个his4突变），ATCC44376（一个his4，ade2突变），ATCC44377（一个his4，Leu1突变），等都是本领域技术人员可以认可的。

本领域技术人员会认识到，有用的宿主菌株不限于营养缺陷型突变。用正选择标记诸如：抗菌素抗性基因，转化原营养菌株也提供了鉴定和分离转化菌株的有用工具。

大肠杆菌也是本发明质粒适用的宿主。先有技术已知很多大肠杆菌的菌株是适用的宿主，本发明用的一些菌株总结如下：

菌株命名    贮存号

MC1061    未知

LE392    ATCC＃33572

MM294    ATCC＃33625

巴斯德毕赤酵母转化过程上面已经叙述了巴斯德毕赤酵母转化，下面详述巴斯德毕赤酵母转化的实验步骤（例Ⅻ），为发展一个巴斯德毕赤酵母转化系统，分离和鉴定出没有组氨酸脱氢酶活性的不能合成组氨酸的营养缺陷型突变GS115（NRRL    Y-15851）。

按下述步骤GS115（NRRL    Y-15851）：先酶解细胞壁得到原生质，然后将其与转化DNA混合，再加钙离子和聚乙二醇保温孵育，然后在缺少组氨酸的选择性培养基中再生。转化DNA包括宿主细胞原无有的HIS4基因，因此只有转化了的细胞才能生长在所用的选择性培养基上。

分离巴斯德毕赤酵母HIS4基因HIS4基因是从巴斯德毕赤酵母NRRL Y-11430菌株通过用Sau3A部分酶解总体染色体DNA，再用庶糖梯度离心分离的。（见例ⅩⅢ），把得到的5到20千对碱基的片段克隆到酿酒酵母一大肠杆菌穿梭载体YEPB（ATCC37115，图33）的BamHⅠ切点中去。产生大约50，000个菌落，然后萃取总体质粒DNA。一个his4 ABC突变的酿酒酵母（S·Cerevisiae）菌株5799-4D（NRRL Y-15859）的原生质与大约1微克的YEPB Pichia DNA文库通过Hinnen等人（1978年）的方法混合，使其在缺少组氨被转化的酸基质中再生。从5×10⁷总的可再生原生质中得到1×10³原营养型酵母菌落对照没与质粒DNA混合孵育的没有菌落。从20个His⁺菌 落中萃取总体酵母DNA，转化大肠杆菌。17个酵母DNA样品产生了抗氨

青霉素的菌落。这些克隆片段进一步定性，用限制酶测其大小及酶切图，并用例ⅩⅢ的§G所述方法测定其与标记酿酒酵母的HIS4片段不太严格地交叉杂交的能力（杂交后用2×SSC在55℃下洗涤）。每个含HIS4的质粒都包含一个或多个与酿酒酵母HIS4基因杂交的片段。一个这样的含HIS4的质粒被再克隆，得到一个图25所示命名为PYJ8的含HIS4的质粒。它含有PBR325顺序，包括抗氯霉素和氨

青霉素基因及Pichia HIS4基因。

从类似的程序从巴斯德毕赤酵母NRRL Y-11430分离的ARG4基因和Arg^-的酿酒酵母菌株S2072A基因（一个从Berkely CA的酵母遗传资源中心得到的arg⁺leu²，trp1gal2的基因）。

本领域的专业人员会认识到Pichia的其它标记基因都可以上述相似的方法用酿酒酵母适当的缺陷型菌株分离。

分离巴斯德毕赤酵母的自主复制顺序

本发明另外有用的载体是既能增加GS1151NRRL    Y-15851）转化频率又能保持质粒为稳定的染色体外成分的Pichia衍生的自主复制顺序（PARS）。

为寻找Pichia ARSs，用TapⅠ部分酶解巴斯德毕赤酵母GS115 DNA，分离出5到10千对碱基的片段，并把它克隆到PYJ8△CLa唯一的CLaⅠ的切点。（见图26）从大约10000个His⁺Pichia菌落中回收质粒DNA，用来转化大肠杆菌。从大约10，000个抗氨基苄青霉素菌落分离质粒，再转化回到GS115。把从40个亚文库转化得到的His⁺酵母菌落分 划线接种到选择培养基，并分别培养。从40个培养物以每一个提取酵母总体DNA，并用其转化基大肠杆菌。其制备的酵母DNA产生大部分抗氨基

大肠杆菌菌落的PYA63（PARS1）和PYA90（PARS2）质粒选作进一步分析。这两种质粒以不同频率转化巴斯德毕赤酵母GS115（NRRL Y-15851），每种均含有一个外源DNA插入体。

为衡量ARSs对保持质粒在Pichia中作为自主成分的能力，把用每种质粒转化的酵母培养在选择培养基中，并定期取样。通过把没酶切的酵母DNA与放射标记的PBR325Sonthern杂交来测定细胞中质粒的顺序状态。在选择培养基中质粒PYA63和PYA90在Pichia内至少保持了10代（150代则与染色体DNA结合）。

把一个欲测的Pichia自主复制顺序（PARSI）克隆到几个其它Pichia载体用以检验维持转化DNA作为自主成分的能力。经过在选择基质（HiS^-）上生长20代后质粒PYJ30（图27中）和PBPf1（图34中）仍以自主成分存在，而且每个细胞内出现多个拷贝。把PYJ30转化的细胞用Sou them吸印法分析显示每个细胞大约有10个拷贝。

为测定含有分别由PYJ30和pBPf1得来的PARS1的质粒PSAOH5（见图18）和PT76H4（见图22b）是否展示对由衍生它们的质粒的稳定性，把这些载体置于有葡萄糖存在的选择条件下（His^-）生长50代。然后将其转移到非选择条件（His⁺）生长，监测其原养性的消失，将这些质粒与PYJ30比较其稳定性。包括移到非选择性基质迅速失去的His原养性方面。人们相信用含有自主复制利序的质粒PARS1试验，提供了自主的质粒DNA基因表达的结果。

含有组成结构的新的β-半乳糖苷酶基因。

为说明本发明的调节区控制合成蛋白的能力，要制备新的DNA。从而，控制为肽P72（醇氧化酶）或P76编码基因的调节区，把大肠杆菌LacZ基因植入一些质粒中。例ⅩⅣ中叙述了制备质粒PsAoH1，PSAOH5，PSAOH10，PTAFH85，PT76H1，PT76H2，PT76H3和PT76H4的过程。

虽然把本发明的调节区-β-半乳糖苷酶基因融合引入酶母细胞是用质粒作为引入工具，本领域的专业人员会认识到并不需要通过质粒把调节区-结构基因组分引入细胞。因此，可应用能在酵母中保持的任何分子。然而，本发明的调节区-结构基因组分可通过除质粒外的其它载体被整合，还可整合到宿主酵母细胞的染色体上。

本领域专业人员也会认识到本发明范围不限于这里揭示的调节区调节下生产β-半乳糖苷酶。本发明调节区调节下生产肽的种类只限于读者的想象内。制备为所需各种肽编码的DNA顺序所需的许多程序都已存在。例如：不同长度的寡核苷酸可用已知程序合成，一些这样的寡核苷酸又可结合起来，根据其特异性的碱基配对加长，形成双链DNA。组成这双链分子的寡核苷酸通过DNA连接酶连接。另一方面，含所需编码顺序的DNA分子还可通过用反转录酶，以所需肽的信息RNA为模板合成之。另一种可能是克隆基因组DNA片段和观察所需产物是否直接表达。

可以通过不同方法修饰为所肽编码的DNA顺序以制备调节区一结构基因组分。例如：上述把制备的DNA末端用连接酶连接到含为特异的限制酶识别的核苷酸顺序的短双链DNA分子上，称之为连接分子。连接后用特异限制酶酶解这些分子，将在制备的DNA顺序末端上产生与特异性限制酶识别切点相对应的末端。

本发明制备的三个特异的调节区-β-半乳糖苷酶基因组分已根据在图15和16中的限制酶切图叙述了。图15a中限制酶切图说明了一个构成从pPG6.0和大肠杆菌的LacZ基因调节区5′端衍生的一个0.85千对碱基HindⅢ-BanHⅠ部分的组分（表示3.6千对碱基BamHⅠ-NruⅠ片段）。分别存在于质粒PTAFH85，PT76H1和PT76H2中的这个相同组分下面已详述（见例ⅩⅣ）。图15b中的限制酶切图叙述了一个从pPG6.6和大肠杆菌LacZ基因调节区5′端衍生的1.3千对碱基的HindⅢ-EcoRⅠ部分的组分（表示3.6千对碱基BamHⅠ-NruⅠ片段）。分别存在于质粒PT76U1，PT76H3和PT6H4中的这个相同组分下面已详述（见例ⅩⅣ）。

图16是一个含从pPG4.0和大肠杆菌LacZ基因调节区5′端衍生的1.1千对碱基EcoRⅠ-RamHⅠ片段的组分的限制酶切图。分别存在于质粒PSAOH1，PSAOH5分别和PSAOH10中的这个组分下面已详述（见例ⅩⅣ）。

图17中图解了质粒PSAOH1，除了含有图16中详示的调节区β半乳糖苷酶基因融合物外，质粒还含有;

（a）包含氨基

青霉素抗性（AmP^R）基因的PBR322顺序：

（b）巴斯德毕赤酵母HIS4基因;

（c）酿酒酵母2u环状DNA;和

（d）酿酒酵母的切断的URA3基因。

因此质粒具有在大肠杆菌和酵母宿主中转化和复制的能力。无论在大肠杆菌还是酵母中，选择的标记都用于基因工程。

图18图示质粒PSAOH5。该质粒与上述的PSHOH1相似，只是缺乏了酿酒酵母2u环状DNA及一些巴斯德毕赤酵母HIS4基 因的侧部DNA，同时加上了一个巴斯德毕赤德酵母自主复制顺序（PYA6的PARS1）。

图19图示了质粒PSAOH10，该质粒含有：

（a）调节基因-β-半乳糖苷酶基因融合物;

（b）包括提供四环素抗性，氯霉素抗性和氨

青霉素抗性基因的PBR326顺序。

（c）酿酒酵母HIS4基因（如上述从质粒PYA2得到）。

质粒PTAFH85，PT76H1和PT76H2是与上述三个质粒类似的，只是所用的调节区-β-半乳糖苷酶基因融合物是图15a叙述的（而不是图16所述融合物）。

质粒PT76H3和PT76H4分别与PSAOH1和PSAOH5相似，只是所用的调节区-β-半乳糖苷酶基因融合物是图15b所述的（不是图16所述的）。

质粒PTAFH85示在图20，包含：

（a）图15a所示的调节区-β-半乳糖苷酶基因;

（b）包含氨基

青霉素抗性基因的PBR322顺序;

（c）巴斯德毕赤酵母HIS4基因;

（d）酿酒酵母2u环状基因;和

（e）酿酒酵母的切断的URA3基因。

质粒PT76H1示在图21中，包含;

（a）图15a所示调节区-β-半乳糖苷酶基因融合物;

（b）包含氨

青霉素抗性基因的PBR322顺序;和

（c）巴斯德毕赤酵母HIS4基因和自主复制顺序（PARS1）。质粒PT76H2示在图22，含有;

（a）图15a所示调节区-β-半乳糖苷酶基因融合物。

（b）含有提供四环素抗性，氯霉素抗性和氨

青霉素抗基因的PBR325顺序;和（c）酿酒酵母HIS4基因。

质粒PT76H3示在图22（a），包含：

（a）图15b示调节区-β半乳糖苷酶基因融合物;

（b）包含氨基

青霉素抗性的PBR322顺序;

（c）巴斯德毕赤酵母HIS4基因。

（d）酿酒酵母2u环状DNA;和

（e）酿酒酵母的切断的URA3基因。

质粒PT76H4示在图22b中，包含：

（a）图15b所示调节区-β-半乳糖苷酶基因融合物;

（b）含有氨

青霉素抗性基因的PBR322;

（c）巴斯德毕赤酵母HIS4基因;和

（d）巴斯德毕赤酵母自主复制顺序（PARSI）

酵母中β-半乳糖苷酶的表达

用含上述新β-半乳糖苷基因的组分转化巴斯德毕亦酵母GS115（NRRL    Y-15851），得到的一些转化酵母菌株已贮存在美国农业部北部区研究中心，贮痕号如下。

宿主    质粒    转化菌株贮存号

GS115    PSAOH1    NRRL    Y-15852

GS115    PSAOH5    NRRL    Y-15853

GS115    PSAOH10    NRRL    Y-15854

GS115    PTAFH85    NRRL    Y-15855

GS115    PT76H1    NRRL    Y-15856

GS115    PT76H2    NRRL    Y-15857

含新的β-半乳糖苷酶基因的组分也用于转化大肠杆菌。转化的菌株也贮存在NRRC，以保证专利公开后为公众索取。转化菌株贮藏号如下：

宿主    质粒    转化菌株贮存号

MC1061    PSAOH1    NRRL    B-15861

MC1061    PSAOH5    NRRL    B-15862

MC1061    PRAOH10    NRRL    B-15863

MC1061    PTAFH85    NRRL    B-15864

MC1061    PT76H1    NRRL    B-15865

MC1061    PT76H2    NRRL    B-15866

MC1061    PTAOI3    NRRL    B-15875

MC1061    PT76H3    NRRL    B-18000

MC1061    PT76H4    NRRL    B-18001

MC1061    PT76U1    NRRL    B-18002

把上述本发明含醇氧化酶和p76调节区-LacZ基因融合物的头八个质粒分别转化的巴斯德毕赤酵母GS115（NRRL    Y-15851）置于补加了生物素及葡萄糖作为碳源的基本培养基在静止期培养。一旦细胞达到静止相就将其转移到补加生物素和甲醇作为碳源的基本培养基上。细胞在30℃下生长3～5代后，将其转移到补加生物素的新鲜基本培养基上，然后再在以葡萄糖或甲醇为碳源的培养基上生长。不同的时间取样用例Ⅶ和ⅩⅤ方法分析醇氧化酶和β-半乳糖苷酶的存在。

发现细胞在以葡萄糖为碳源的基质上生长没观察到β-半乳糖苷酶或醇氧化酶。而以甲醇为唯一碳源时，醇氧化酶和β-半乳糖苷酶 却以明显的水平表达。还发现在葡萄糖上生长的细胞再放在碳源缺乏条件下也能表达出可测量的醇氧化酶和β-半乳糖苷酶。因此，很清楚，本发明的调节区在甲醇存在或碳源缺乏时才起作用。

为了证明本发明的调节区是当生长在抑制碳源的不能分解上以及在碳素缺乏条件下才起作用，含醇氧化酶调节区的质粒PTAO13和含p76调节区的质粒PT76U1都被用于转化一种利用非甲醇碳源的酵母菌株-酿酒酵母。实验室命名为SEY2102-PTAOB的转化菌株贮存在NRRC，以供公众索取。贮存号为NRRLY-15858。酿酒酵母NRRLY-15858和SEY2102-PT76U1先生长在葡萄糖、果糖、乙醇、甘油和半乳糖上大约五代，再置于碳源缺乏的条件。五代后用常规方法测定β-半乳糖苷酶（见例ⅩⅤ）表明在甘油和半乳糖上生长的细胞产生大量β-半乳糖苷酶，而在葡萄糖和果糖上生长的细胞基本上没有β-半乳糖苷酶。在置于硫源缺乏下生长6小时后测量β-半乳糖苷酶，观察到生长在葡萄糖及果糖上转化细胞生产中等量的该酶，而生长在甘油和半乳糖的细胞生产了大量的该酶。因此，本发明的调节区可控制在遗传上非常不同的酵母宿主中生产蛋白产品，而且不局限于用在利用甲醇菌株。

实例

下面例子中所用缓冲液和溶液的组成如下：

1MTris（三羟甲基氨基甲烷）缓冲液;

把1.21克Tris碱溶到800毫升水中，加35%盐酸溶液调节PH至所需值，室温冷却，调至PH到最后值，稀释到终体积1升。

S-缓冲液：

把1.5M山梨醇溶在0.04M磷酸钠缓冲液中、PH调至6.6PK缓冲液：

把0.14M氯化钠，1%SDS（十二烷基磺酸钠），0.01M    EDTA（乙二胺四乙酸），置于0.05M（PH8.4）的Tris缓冲液。ETS缓冲液：

把10mMHDTA，0.2%SDS置于0.01M（PH7.4）的Tris缓冲液。

TE缓冲液：

把0.1mMEDTA置于0.01M（PH7.4）Tris缓冲液。

SSC：

含0.15M氯化钠及15mM柠檬酸钠，用氢氧化钠调PH至7。

TAE：

将40mM乙酸，5mMEDTA置于0.02M（PH8.3）的Tris缓冲液。

PBS（碳酸缓冲盐溶液）：

含10mM磷酸钠（PH7.0）及0.15M氯化钠。

Laemmli负载缓冲液：

含62.5mM    Tris-Hcl（PH6.8），2%    SDS，10%甘油，5%2-硫基乙醇，0.01%溴酚兰。

RIPA缓冲液：

PBS中含1%NP40（Sigma公司出品），1%脱氧胆酸钠，0.1%SDS：

20XSSPE：

含20mMEDTA，0.16M氢氧化钠，0.2M含水磷酸二氢 钠，3.6M氯化钠，用氢氧化钠调PH至7.0。

Denhardts氏溶液（50X）：

把5g聚庶糖，5g聚乙烯吡咯烷酮，5g牛血清白蛋白（Pentaxv部分）加水使总体积为500ml。

予杂交缓冲液：

含5XSSPE，5XDenhardt氏溶液，50%去离子甲酰胺，0.2%SDS，200μg/ml打碎与变性的鲑鱼精子DNA。

LB培养基：

把5g    Bacto-蛋白胨，5g    Bacto-酵母提取物，2.5g氯化钠加入水使之终体积为1升，用氢氧化钠调PH至7.5。

YPD培养基：

含1% Bacto酵母提取物，2%细菌蛋白胨（Bac+0^-PePton），2%右旋糖（Dextrose）。

SD培养基：

把6.75克不含氨基酸的酵母含氮碱DIFCO，2%右旋糖加水到1升。

SED含1M山梨醇，25mMEDTA，50mMDTT。

SCE缓冲液：含9.1g山梨醇，1.47g柠檬酸钠，0.168g    EDTA，加水至50ml，用Hcl调PH至5.8。

CaS：含1M山梨醇，10mM氯化钙，过滤消毒。

PEG溶液：

含20%聚乙二醇-3350，10mM氯化钙，10mM    Tri-Hel（PH7.4）过滤清毒。

SOS：含1M山梨醇，0.3XYPD培养基，10mM氯化钙。

甲酰胺染料混合液;0.1%二甲苯氰醇FF，0.2%溴酚兰，10mMEDTA，95%去离子甲酰胺。

顶层凝胶（ToPgel）：76.8g尿素，24ml丙烯酰胺毋液，8ml    10XTBE，加水最终体积为160ml。

丙烯酰胺毋液：38克丙烯酰胺，2克N-N′-亚甲双丙烯酰胺，加水使最终体积达100ml。

低层凝胶（BOttmgel）：14.4克尿素，3.0克庶糖，

7.5毫升10×TBE，4.5毫升丙烯酰胺母液，0.3ml溴酚兰液（0.01克/ml），加水至30ml。

杂交选择用的予杂交缓冲液：

50%甲酰胺，0.75%氯化钠，0.1MTris（PH7.4），0.008MEDTA，0.5%SDS，200μg/ml兔肝tRNA（西格马公司）。0.5MNETS缓冲液：

0.5M氯化钠，10mMEDTA，10mMTris（PH7.4），0.2%SDS。

10XRT缓冲液：

500mM氯化钠，340mM    Tris（PH8.3），60mM氯化镁，50mM二硫苏糖醇（DTT）。

dilRT液：

4ul水，1ul    10×RT缓冲液，5ul反向转录酶15单位/ul（Life    Scienccs公司出品）

dideoxy：（二脱氧三磷酸核苷）

二脱氧ATP    0.49mM，二脱氧CTP    0.1165mM， 二脱氧GTP0.369mM，二脱氧TTP0.82mM。

dNTP混合液;

0.625mM脱氧GTP，0.625脱氧ATP，0.625mMTTP，Chase溶液：

1×RT缓冲液中含1.125mM脱氧ATP，1.125mM脱氧CTP，1.125mM脱氧GTP，1.125mMTTP。

除了特别说明的外，上述溶液都代表Ⅸ的基本浓度。例中所用不同浓度的上述溶液，其用量为1×浓度的倍数。

下面用例中的缩写的含义为：

EDTA    乙二胺四乙酸

TEMED    N，N，N′，N′-四甲基乙二胺

DTT    二硫苏糖醇

BSA    牛血清蛋白

EtBr    溴化乙锭

Ci    居里

dATP    脱氧腺苷三磷酸

dGTP    脱氧鸟苷三磷酸

TTP    胸苷三磷酸

dCTP    脱氧胞苷三磷酸

dXTP    一般的脱氧三磷酸核苷酸

（OligacdT）12-18来源于联合研究公司（Collaborative    Research    Inc）

酵解酶Zymolyase    60，000来源于：Miles实验室

根据标准程序的所用常规方法，将在这里详述。

离心时间和速度以使离心上清液澄清为准。对酵母细胞需以1500g转速离心至少5分钟。

用苯酚/氯仿/异戊醇萃取核酸包括把含核酸溶液混入等体积的50∶48∶2的上述混和液。再用等体积的氯仿/异戍醇（48∶2）混合液处理。

凝胶或滤纸冲洗或浸泡在某一特定溶液时，把整个凝胶或滤纸浸在其中（在盆、盘或试管中）使整个凝胶或滤纸等与感兴趣的溶液充分接触。

用乙醇沉淀核酸包括首先调整含核酸溶的盐含量。然后使溶液与二倍体积冷乙醇混合。

例1：酵母细胞的生长和制备

使巴斯德毕赤酵母（Pichia Pastoris）NRRL Y-11430生长在含甲醇或乙醇为唯一碳源的Wegner美国专利4，414，329叙述的IM1盐基本培养基上，在30℃下连续培养。IM1基本培养基每升含36mM KH2PO4，23mM（NH₄）₂SO₄，2mM MgSO₄6.7mMKCI.0.7mMCacI₂，0.2uMCaSO₄，5H₂O，1.25uMKI，4.5uM MnSO₄，2uM Na₂MOO₄，0.75uMH₃BO₃，17.5uMZnSO₄，44.5uMFecl₂和1.6uM生物素。生长在甲醇上细胞密度在孵育时间为12小时后达到140g/l（干重）。生长在乙醇上的经过11.5小时的孵育密度达90g/l。把甲醇或乙醇喂入发酵器时，分别用20%和45%醇贮进料液。

把10g巴斯德毕赤酵母细胞发酵产物用离心法收集。再以10⁸细胞/ml悬在含1%2-巯基乙醇的0.1MTris（PH8.0）。把这些细胞孵育在37℃下5到10分钟，再离心收集。沉淀用 30ml的S-缓冲液洗一次，再以5ml/g细胞悬在S-缓冲液中。把酵解酶（来自Miles生化公司）加到细胞悬液使其最终浓度达500μg/ml。将细胞在37℃孵育20分钟，再离心。除去上清液，收集细胞沉淀。将这沉淀冷冻在液氮中并贮存在-70℃备用。

例Ⅱ：分离酵母RNA

用研缸磨碎例Ⅰ中制备的冷冻沉淀，再在Waring    Btender搅拌器中在液氮存在下，进一步磨碎冷冻沉淀2-5分钟，然后以每克细胞加7.5ml的浓度加PK缓冲液，再加蛋白酶K，使悬液蛋白酶K，使悬液蛋白酶K终浓度为400μg/ml，然后将其置室温下孵育10分钟。用苯酚/氯仿/异戍醇混合液萃取RNA，再用氯仿/异戍醇混合物萃取。将水相调至含0.25M氯化钠再加乙醇沉淀核酸。将得到的沉淀悬在尽可能小体积的ETS缓冲液，即加入的体积足够溶解核酸即可。一般大约每ml缓冲液可溶100μg到1mg核酸，可用苯酚/氯仿/异戊醇重新萃取，再用氯仿/异戍醇萃取，最后用乙醇沉淀之。

把核酸再溶在尽量小体积的TE缓冲液中。将该溶液中的RNA通过4ml氯化铯垫（所用缓冲液含1克氯化铯/ml，1mM EDTA，10mMTrisPH7.4）离心沉淀，或在2M氯化锂溶液中于4-8℃下放置过夜，然后再通过离心收集，从而富集了RNA。通过在寡胸腺苷（oligadT）纤维素柱亲和层析从溶液中选出PolyA⁺RNA（聚腺苷RNA）。一般5到10毫克总体RNA需0.25克oligadT纤维素，3型（来自Collaboratire Research）用作层析。把0.25克OligdT纤维素混入2ml ETS缓冲液中，使其浓度低于约10ml/ml，置65℃水浴中2分钟，然后立即移至冰中。然后置于室温下并加5M Nacl液使RNA溶液的最终Nacl浓度为0.5M。将该RNA液装入oligadT纤维素柱，使其以1滴/5秒的速度缓慢流过柱，流出的材料收集在管中，再重新装入柱顶部再层析，从底部收集材料再第二次装入柱顶，RNA溶液三次通过柱，然后收集流出物质并标上PolyA^-的标签，即不是PolyA⁺-RNA。然后用30ml 0.5M NETS洗脱，最后用5ml ETS缓冲液进柱使其缓慢流过柱以洗脱出PolyA⁺RNA，然后以5ml的小份从柱底收集PolyA⁺RNA假设PolyA⁺RNA，中没有Nacl，将它的Nacl浓度调至0.25M然后用乙醇沉淀该RNA。

例Ⅲ：建立CDNA文库

互补DNA（CDNA）克隆合成如下：把10ug例Ⅱ制备的PolyA⁺RNA重悬在7ul水中，使CH₃HgoH终浓度为2.7mM，然后置于室温孵育5分钟。在一个含50mM Tris（PH8.3），10mM Mgcl₂，30mM2-巯基乙醇，70mM Kcl，500μM的dATP dGTP和TTP，200μM的cdcTP，25μg/ml寡（dT），60μg/ml的放射菌素D，25单位的RNasin，25μ居里α-³²P dcTP（32.5PM）和120个单位的反向转录酶的溶液中，42℃下孵育15分钟，第一个CDNA链被合成，把该反应混合液在37℃再孵育15分钟，通过加入2μl的0.5MEDTA和0.5μl 20%SDS结束反应。再将其NaoH浓度调至0.3M，在65℃下孵育30分钟。加10μl的1MTris（PH7.4）以中和反应混合液，再把其Hcl浓度调至0.21M。然后用苯酚/氯仿/异戍醇混合液萃取反应液，然后用氯仿/异戍醇萃取，最后通过用TE缓冲 液平衡的Sepha    dexG    50柱层析。把具放射标记的单链CDNA合在一起，用丁醇萃取或真空离心浓缩使体积为100μl。再用乙醇沉淀浓缩单链CDNA液，离心收集，再重悬在100μl水中。

把上述单链CDNA水溶液调至含2.5M醋酸铵，然后用乙醇再沉淀，离心收集，重悬到20μl的水中。然后用含5mM Mgcl₂1mM2-巯基乙醇250μM的dATP，dGTP和TTP，125μMdCTP，25μ居里的α-³²P dcT（32.5PM）和8个单位Klenow DAN POLⅠ片段的50mM磷酸钾缓冲液（PH7.4）与之混合，将其终体积调至50μl。把上述混合液在37℃下孵育1小时以合成互补的第二条DNA链。加入2μl的0.5MEDTA结束反应。用苯酚/氯仿/异戍醇萃取双链DNA，再用氯仿/异戍醇萃取，然后通过一个用TE缓冲液平衡的SePha d eXG50柱层析。将收集的双链CDNA合，浓缩，再如上述用于单链CDNA方法沉淀之。

乙醇沉淀后离心收集的双链CDNA，其沉淀重悬在20.25μl水中。然后用含10mM Mgcl₂，30mM2-巯基乙醇，70mM Kcl，500μM dXTP和150个单位的反向转录酶的50mMTris（42℃下PH8∶3）将终体积调至50μl，把得到溶液在42℃下孵育15分钟以保证第二个CDNA链的合成的互补。加2μl的0.5MEDTA结束反应，浓缩并如上用于沉淀单链CDNA方法沉淀之。

把双链CDNA沉淀重悬在42μl水中，加入含2.8M Nacl，200mM NaoAc（醋酸钠）和45mM ZnSO₄的5μl母液使其终体积为47μl。再用Hcl在22℃下调PH 至4.5。为酶解发夹结构，用三个不同浓度的S₁核酸酶（Sigma公司）进行三个分别进行的反应。在50μl上述混合液中分别加入1单位，10单位或100单位的S₁核酸酶，于22℃下孵育30分钟。加2μl0.5MEDTA和2.67μl的2MTris结束反应。加6μg兔肝tRNA为载体，然后浓缩混合液，如上述沉淀之，只是DNA沉淀重悬在TE缓冲液而不悬在水中。在最后沉淀后，DNA沉淀重悬在20μlTE缓冲液，用含10PM的α-³²P-dCTP，2μMdCTP和21个单位的末端转移酶（RatLiff生化公司产品）的末端转移酶缓冲液（BRL）把终体积调至50μl。所得溶液在37℃下孵育30分钟以把一个Polyd（c）尾加到双链CDNA的3′-OH端。加5μl0.5MEDTA结束反应。萃取，层析得到乙醇沉淀贮存起来。

将有d（c）尾巴的双链CDNA或直接重退火连接到PstⅠ位点打开的含Polyd（G）尾巴的质粒PBR322上或与从SePharose    CL    4B-200柱上洗脱的最大部分（25μl）混合退火。对于未分组分的文库，150ng    Polyd（c）尾巴的双链CDNA在180μl10mM    Tris（PH7.4）中被退火，对于使用900ngd（G）尾巴的在PstⅠ部分切开的PBR322载体，用NaCl中是0、1M，而用EDTA是1mM。把每个25μl层析后文库部分与125mg    POlgd（G）尾巴的PBR322退火，终体积50μl，退火混合液如上。退火反应在65℃下进行3分钟。然后置42℃下2小时，再缓慢冷却到室温。

退火了的CDNA文库转化到感受态的大肠杆菌LH932（ATCC3357），方法如下：把LH392接种到2×LB培 养基，37℃下培养过夜，取5ml接种到200ml新鲜2×LB培养基中，并在37℃下生长到细胞浓度为oD600＝0.2～0.3。将其置于冰中10分钟，在4℃下离心收集细胞。然后将其重悬到80ml冰冷却的0.1M Cacl₂中，于4℃下孵育25分钟。4℃下离心收集细胞。再将其重悬在2ml冰冷0.1M Cacl₂中，用之前在4℃下孵育至少2小时。然后，每50μl退火混合液用200μl具有感受态的细胞转化之。将感受态细胞与DNA结合，在约4℃下孵育10分钟，再在37℃下孵育5分钟，最后置于冰中10分钟。把等体积的2×LB培养基加到转化混合液，再在37℃下孵育45分钟。将转化细胞以250μl/培养皿置于含15μg/ml，四环素的140mm2×LB的培养皿中。将培养器置于37℃孵化24小时，贮存在4℃。

将硝酸纤维素滤纸盖到滤出培养皿中菌落的滤纸上得到复制滤纸，将这些复制滤纸置于2×LB-Tet（含15μg/ml四环素）培养皿上孵育。为制备滤纸上的被探测菌落，通过把这些滤纸转移到含200μg/ml氯霉素的2×LB-Tet培养器在37℃孵育至少12小时，然后将其浸在含1.5MNacl和0.5M    NaoH溶液池中10分钟以溶解菌落。然后将其浸在含1.5M    Nacl和0.5M    Tris（PH7.4）的溶液池15分钟以中和滤纸，重复这个中和步骤。然后风干滤纸，最后在70℃，真空下干燥2小时。

例Ⅵ：菌落杂交

将上例制备含CDNA文库的真空干燥的硝酸纤维滤纸在予杂交缓冲液中于42℃下予杂交5小时，取出滤纸，用带手套的手在5×SSPE液中轻擦滤纸以除去细胞残留物。然后将滤纸置于杂交缓冲液（除1×Denhardt氏外，其余成分与予杂交缓冲液相同）。用 32p标记的单链CDNA（10⁶cPm/ml）或用尾端标记的PoLYA⁺RNA与上述滤纸在42℃杂交17小时。然后用2×SSPE液于22℃下洗滤纸，再用0.1×SSPE于65℃下洗两次，每次洗10分钟。

将2μg PolyA⁺mRNA加到含50mM Tris（PH9.5）的50ul溶液中，加热到100℃保持3分钟，然后迅速在冰中冷却以制备末端标记的PolyA⁺mRNA。将该RNA溶液稀释到200μl，调至Tris为50mM（PH9.5），Mgcl₂为10mM，DDT5mM，³²P-α-ATP为50PM，再加10个单位T₄多聚核苷酸激酶，将混合液于37℃孵育1小时。加入10ml的0.5MEDTA以结束激酶化反应，再用苯酚/氯仿/异戍醇萃取之，再通过SePhadeXG50层析以除去未结合的放射性标记。

例Ⅴ：NOYthern杂交

把2-5μg的PoLYA⁺mRNA在含50%甲酰胺，2.2M甲醛和0.5mM EDTA的10mM磷酸钠缓冲液（PH7.4）中于65℃下加热5分钟。然后置于室温冷却之。加入适当量的5X样品缓冲液（一般为被处理样品体积的0.2倍，该缓冲液含0.5% SDS，0.025%溴酚兰，25%甘油和25mMEDTA）。再将样品置于1.5%琼脂糖凝胶上（该凝胶在含1.1M甲醛的10mM磷酸钠缓冲液上中制备（PH7.4），然后在同样缓冲液中电泳。凝胶用溶在10mM磷酸钠缓冲液（PH7.4）的吖啶橙（33μg/ml）染色，通过浸泡在同样缓冲液10分钟，浸泡在10×SSPE中至少10分钟来脱色。RNA如例Ⅵ所述方法转到硝酸纤维膜上。

例Ⅵ：分离基因组DNA和克隆

用例Ⅱ中分离Pichia    RNA方法分离它的基因组DNA。把核酸沉淀重悬在尽量小体积的TE缓冲液中，加20μg/ml核糖酸酶A在37℃下孵育30分钟。然后加Nacl使溶液中Nacl浓度为0.14M，然后用20μg/ml的蛋白酶K在22℃下处理15分钟。用苯酚/氯仿/异戍醇萃取，再用氯仿/异戍醇萃取，然后用乙醇沉淀之。把DNA沉淀重悬在尽量小体积的TE缓冲液中，离心澄清DNA溶液。

把上述制备的Pichia基因组DNA10μg用不同的限制性内切酶（在BRL缓冲液中）酶解，再在含TAE的1%琼脂糖凝胶上走电泳。将含DNA片段的凝胶浸在1.5MNacl，0.5MNaoH中20分钟使DNA变性。再浸在1.5MNacl，0.5M    Tris（PH7.4）中20分钟以中和。转移前再把凝胶浸在10×SSPE中至少5分钟。把硝酸纤维素膜切成凝胶一样大小，用水湿润再浸在10×SSPE中，将该滤纸铺在凝胶上面，将凝胶另一面置于一块玻璃板上，将一张Whatman滤纸和一叠手纸置于硝酸纤维纸上面以将DNA从凝胶中吸出并移入硝酸纤维纸。用一块有份量的物体压在纸上以利于DNA转移。以此方法至少要转移3小时。然后将滤纸浸入5×SSPE中，风干，再在真空条件，70℃下干燥2小时，通过用例Ⅳ中所述予杂交，杂交和洗脱缓冲液，用缺口翻译的CDNA克隆pPC8.0，pPC6.4和pPC15.0杂交来鉴定互补基因组片段。

将200ng的CDNA克隆在含50mM Tris-Hcl（PH7.4），10mM MgSO₄，10μMDTT，50μg/ml BsA，20 μM和dGTP，TTP和dATP，31.25PM³²P-α-dcTP（3200居里/mM，NEN），2个单位的大肠杆菌DNA Poly-Ⅰ（在BRL缓冲液中）和0.02ng的脱氧核糖核酸酶Ⅰ的30μl的混合液中，于14℃下缺口转译90分钟。加1μl的0.5MEDTA和1μl的20%SDS结束反应。把标记了DNA溶液加NaoH，使NaoH浓度为0.3M，然后将其置于沸水中3分钟，将此混合液在一个SePhadex G50柱上层析。将收集的各部分标记DNA合并在一起，测定其比活性，用于杂交实验的探针。

分离与CDNA探针杂交的基因组片段是通过用不同限制酶酶解200μg的Pichia基因组DNA，然后将其置于TAE液配制的1%琼脂糖凝胶上走电泳。从凝胶切下适当大小的带，用电泳洗脱其中的DNA，再将其通过一个ELutip柱（Lscheicher和Schuell方法），再用乙醇沉淀之。

把上述得到的片段重悬在水中，把200ng片段与在适当限制酶切点切割，必要时去磷酸化的PBR322 500ng连接。连接反应在含6.6mM Mgcl₂，10mM DTT，0.4m MATP，25μg/ml BSA和4.0-8.0个单位的T₄DNA连接酶的300μl 66mM Tris（PH7.4）缓冲液中进行。然后在4℃下孵育24小时。把连接混合液直接转到感受态的LE392大肠杆菌细胞内。细胞是处于感受态的，转化如例Ⅲ完成了。用10，40和100ng的PBR322（加上插入体）进行三个转化，每转化都在100μl感受态细胞中进行。细胞如例Ⅲ方法被涂在培养皿中，只是抗菌素选择是用50μg/ml的氨基

青霉素。将所得 克隆转到硝酸纤维纸上，复制如例Ⅲ所述的方法准备杂交。滤纸用合适的缺口转译的CDNA片段探测。划线纯化的杂交正菌落用于制备附加质粒如下。

把携带质粒的LE392大肠杆菌在含50μg/ml氨 青霉素的1×LB培养基中生长到D600＝1，再加氯霉素终浓度达200μg/ml，放置过夜以扩增，在0.8%Nacl，20mM Tris（PH8.0），20mM EDTA混合液中洗细胞，然后将在25%庶糖50mM Tris（PH7.4）和20mM EDTA中加溶菌酶450μg/ml处理细胞。加5mM Nacl，使混合液的Nacl达2.0M，再加等体积的0.2%Triton X-100和40mMEDTA溶解细胞。将其在20，000转/分离心45分钟以澄清溶液。然后将上清液用苯酚/氯仿/异戍醇萃取。再用氯仿/异戍醇萃取，乙醇沉淀。沉淀重悬在FE缓冲液中，用核糖核酸酶A处理，苯酚/氯仿/异戍醇萃取，再用氯仿/异戍醇萃取，加CScl使溶液Cscl浓度达800μg/ml，再加溴化乙锭，使其终浓度为1mg/ml。在20℃下用Vit50转头，以49，000转/分离心18-20小时。

质粒带在UV荧光下可见。用针和针管从离心后的试管中抽出质粒带。用正-丁醇萃取四次。然后用乙醇在-20℃沉淀质粒。重悬成溶液再沉淀反复至少两次以除去所有Cscl，将乙醇沉淀贮存在-20℃下。

例Ⅶ：纯化醇氧化酶

制备生长在用甲醇培养基上的巴斯德毕赤酵母细胞得到的蛋白样品，如例Ⅰ所述通过溶解酵母细胞，然后离心以除去细胞残渣制备， 方法如下：把发酵器中流出的一部分移出，用氢氧化铵调PH至7.5，然后将其置于0.6升均质杯在KDL型DYno-MiLL上在30℃下用组合3号带以每小时流入20～30ml速率连续均质。磨中装进直径为0.3～0.5mm游离的玻璃珠。所得均质液在5℃下以20，000Xg速度离心30分钟以得到不含细胞的上清液。

将六个130ml的上清液分别装醋酸纤维透析袋，在5℃下于8升的双蒸馏水中透析。4天后除去每袋中水相。残留的固体含两类固体。将上面白色的一个薄层仔细除去。下面的黄褐色部分是结晶醇氧化酶，取其中一部分溶于蒸馏水中（用10倍于固体体积的蒸馏水），用过氧化酶染色法测定显示94EU/ml的醇化醇活性意味着每毫克蛋白含10.4EU的该酶。

上述结晶沉淀悬液再对0.05M磷酸钾缓冲液（PH7.5）中透析，再在同样缓冲液平衡的2×200cm的SePhacrgl200（Pharmacia公司）柱上层析。以10ml/小时流速以每份3.5ml收集产物，测定醇氧化酶活性。

醇氧化酶与甲醇反应的活性通过下列方法（过氧化酶染色法）测定，把0.1ml    1%（重量比）的邻联（二）茴香胺溶液与12ml的充气的0.1M磷酸钠缓冲液（PH7.5）混合制备染料缓冲液。把2.5ml染料-缓冲液，50μl甲醇，10μl过氧化酶溶液（含1mg辣根过氧化酶-SigmaⅡ型）和25μl的醇氧化酶溶液混合制备试验混合液。把试验混合液装在一个4×1×1cm比色杯中，保持25℃，2到4分钟记录由于料染导致的在460mM处消光率的增加。酶活性通过下式计算：

活性（μm/分/ml或酶单位/ml）＝ (消光率增加)/(分钟) ×11.5

其中11.5是基于用已知的整分的H₂O₂作的标准曲线测得的一个系数，△A（消化率增加）是在试验时间间隔内消光率的变化。

从每个组分中取出总蛋白为0.1μg的小部分用SDS聚丙烯酰胺（12%）电泳进行醇氧化酶含量试验。

例Ⅷ：DNA和蛋白的氨基酸顺序

用噬菌体M13双脱氧链加长法（Sanger等人方法，1980年）或化学修饰法（MaXam等人，1980年）测定DNA顺序。相对于醇氧化酶基因5′端的DNA片段插入到M13mP8和M13mP9载体中，或用该顺序区限制酶切点的化学修饰方法标记末端。

用HindⅢ酶解33μg质粒，把P^PG4.0的710千对碱基HindⅢ/salⅠ片段末端标记得MaXam-Gihert顺序。反应混合液用苯酚/氯仿/异戍醇萃取，再用氯仿/异戍醇萃取，然后用乙醇沉淀。离心收集沉淀，再重悬在31μl水中，把100μ居里32P-α-dcTP（3200居里/克分子）和二个单位的Klenow POlⅠ DNA片段加到混合液中以得到终体积为50μl含400μMdATP，400μM dGTP，50mM Tris（PH7.4），10mH MgSO₄和1mMDTT的溶液。将其置于37℃下孵育1小时，加2μl0.5M EDTA中止反应。然后用苯酚/氯仿/异戍醇萃取，再用氯仿/异戍醇萃取，再用氯仿/异戍醇萃取，然后在SePhadeXG 50柱上层析，将收集的各部分标记了的核酸合并，再用乙醇沉淀。离心后，将DNA沉淀重悬在水中，用SalⅠ酶解。在用TAE缓冲液配制的1%琼 脂糖凝胶上跑电泳。然后将710千对碱基的带从凝胶上切下，用电泳法洗脱DNA，再用丁醇萃取，乙醇沉淀。然后将其重悬在100μl的TE缓冲液调节醋酸铵至2.5M，再用乙醇沉淀。得到的DNA片段再悬在TE缓冲液中得50，000cPm/μl的溶液。

四个修饰碱基的反应如下进行：（a）乌嘌呤反应：把含1μl（50，000CPM）的标记DNA片段，4μl水，200μl的50mM二甲胂酸钠（PH8.0），1mM    EDTA（在DMS缓冲液中）和1μl二甲基磺酸盐溶液共同孵育在22℃下8分钟。加入含1.5M乙酸钠（PH7.0），1M-2巯基乙醇和100μg/ml    tRNA的50μlDMS缓冲液中止反应，再加750μl乙醇，置反应混合液于-70℃至少15分钟（b）乌嘌呤/腺嘌呤反应：把含2μl（100，000CPm）的标记的DNA片段，8μl水和30μl甲酸混合液共同在22℃下孵育10分钟。加200μlHZ缓冲液（0.3M醋酸钠，PH5.5，0.1MEDTA和25μg/ml    tRNA）中止反应。然后加750μl乙醇，置于-70℃至少15分钟，（c）胸腺嘧啶/胞嘧啶反应：将2μl（100，000CPm）标记的DNA片段，18μl水和30μl肼混合液在22℃下孵育10分钟。同（b）方法中止反应。（d）胞嘧啶反应：将1μl（50，000CPm）标记了的DNA片段，4μl水，15μl    5M    Nacl和30μl的肼混合液在22℃下孵育10分钟，用与（b）相同方法中止反应。

离心收集DNA沉淀，重悬到250μl    0.3M醋酸钠（PH5.5），用750μl    95%乙醇沉淀之。再离心收集沉淀，在真 空下干燥5分钟，通过将沉淀悬在100μl稀释10倍的六氢吡啶溶液切割DNA。将其孵育在90℃下30分钟，加500μl98%乙醇，60mM醋酸钠（PH5.5）和10μg/ml    tRNA中止反应。然后置于干冰/乙醇浴（约-70℃）中5分钟，离心收集DNA片段。将沉淀重悬50μl0.3M醋酸钠（PH5.5），用100μl95%乙醇沉淀几次，再用95%乙醇洗，离心时真空浓缩。再把沉淀重悬在10μl80%甲酰胺，10mM    NaoH，1mMEDTA，0.1%二甲苯氰醇，0.1%溴酚兰混合液中，取2-3μl置于0.4mm厚TBE缓冲液配制的10%聚丙烯酰胺凝胶上电泳。

醇氧化酶氨基酸顺序由Seguemat公司用2mg纯化的Pichia    Pastoris醇氧化醇测定。成熟蛋白的头17个氨基酸为：

Ale-Ile-Pro-Glu-Glu-Phe-Asp-Ile-Leu-Val-Leu-Gly-Gly-Gly-Ser-Gly-Ser

例Ⅸ：测定醇氧化酶转录起始点

为测定醇氧化酶mRNA转录起点，一个引物延伸试验是以醇氧化酶基因5′端DNA顺序的一个合成寡核苷酸拷贝作为引子，以10μg PolgA⁺巴斯德毕赤酵母mRNA作为模板。将10μg PolgA⁺mRNA与3ng引子（5′-CTT CTC AAG TTG TCG-3′）混合在一个9.3μl终体积含43mM Nacl，29.2mM Tris（PH8.3），5.2mM Mgcl₂和4.3mMDTT的缓冲液中，置70℃将核酸变性5分钟。再使其缓慢到22℃冷却再退火。把再退火混合液中倒入含4μl dNTP混合液及0.8μl RT缓冲液和1μl32P-α-dcTP（800居里/毫克 分子）的试管中。将3μl的该混合液分别加到1μl四种相应的ddNTP。最后取混合液3μl加到1μl水中。加1uldil    RT缓冲液开始反应，置42℃下孵育15分钟。用3μl    Chase    RT溶液在42℃下孵育15分钟以加长核酸链。再加7.5μl甲酰胺-染料混合液中止反应，取4～5μl反应液置于0.4mm厚1×TBE缓冲液配制的梯度凝胶电泳，然后用含10%甲醇的10%乙酸液固定凝胶，真空下干燥之，使XARX射线胶片放射自显影。

梯度凝胶制备如下：将300μl    10%过硫酸铵，14μl    TEMED，加入30ml顶部凝胶，将75μl    10%过硫酸铵和3.5μl    TEMED加入7ml的底部凝胶，用移液管先吸6ml顶部凝胶液，再吸6ml底部凝胶液，然后将其放入凝胶板间，然后倒22ml顶部凝胶。

例Ⅹ：mRNA杂交-选择和体外翻译

正杂交-翻译试验是用不同限制酶酶解20μg线状克隆的Pichia基因组DNA（如上述例Ⅵ）。加0.3M    NaOH使其变性。于65℃孵育10分钟。含变性DNA的溶液被迅速置于冰中冷却，再通过用0.5MTris-Hcl调pH至7.4中和之。在DNA结合到硝酸纤维素膜前立即把等体积的20×SSPE加入变性DNA。将DNA转到膜前（Schlicher和Schuell    BA83，9mm直径）将其用水湿润，然后煮沸10分钟，用10×SSPE冲洗三次。把10μg    DNA点样到每张滤纸，风干，然后在真空条件下，70℃干燥2小时。

予杂交前，将结合上DNA的滤膜置于1ml的无菌水中，在100℃下加热1分钟，再在冰中冷却，用VorteXing（一种转 动搅拌装置）在1ml无菌水中冲洗，再用1ml予杂交缓冲液冲洗。将滤膜置于1ml予杂交缓冲液中予杂交：然后将40μg（2μg/ml ETS）的PolgA⁺mRNA直接加入予杂交缓冲液，将其置65℃加热10分钟，再在42℃下孵育24小时。

杂交后滤纸在含0.5%SDS的1×SSPE中22℃下洗2次，在含0.5%SDS的1×SSPE中，50℃下洗7次，每次洗5分钟;再在0.1×SSPE中50℃下洗3次，每次5分钟;最后在0.1×SSPE中65℃下洗10分钟。将滤纸在含15μg兔肝tRNA的300μlH₂O中煮沸，1分钟以洗脱RNA。然后将其迅速在干冰乙醇浴中冻干。然后让其升到室温，除去滤纸。将混合液的醋酸铵浓度调至2.5M沉淀RNA，再用乙醇沉淀两次，最后重悬出100μlH₂O中，再冷冻干燥。

转译是根据本领域专业人员共知的标准技术进行，例如：用Neu    England    Nucleao体外兔内织网溶解物转译系统。蛋白产物置于含4.5%浓缩凝胶的8%聚丙烯酰胺凝胶上电泳。

例Ⅺ：抗血清的制备及兔疫沉淀测定：

用标准程序制备兔的含P76肽和P72（醇氧化酶）肽的Pichia    Pastoris细胞萃取液的抗血清。注射前将萃取液对PBS透析。在八周内，给每个兔注射三次，每次用量含1mg全蛋白的0.1ml萃取液和0.2ml    Freund氏完全佐剂。在兔的6-10处皮下注射。八周末给兔放血，根据Outherlony双扩散法用抗血清对纯化的Pichia    Pastris醇氧化酶作测定。

将粗血清通过一个用CNBr偶联的P72（醇氧化酶）-P76    SePharosc    4B柱（Pharmaeia的产品），亲和层析纯化兔抗 P72和P76蛋白的抗体。将1克CNBr活化的凝胶置于200ml的1mM的Hcl中，以水合凝胶，再在50ml偶联缓冲液（含0.1M碳酸钠PH8，0.5M    Nacl）洗三次。将溶在偶联液中6mg/ml    P72-P76溶液Sml加入凝胶，在4℃下轻轻搅拌过夜。用50ml偶联缓冲液洗三次以除去未结合的蛋白。再在1M乙醇胺（PH8）中孵育2小时以封闭残留的活性基因。用50ml含2M硫氰化钠的PBS液洗凝胶以除去未共价结合的物质。抗血清层析前，将凝胶用50ml    PBS液最后洗三次，把5ml澄清的抗P72-P76血清与凝胶混合，在4℃及搅拌条件下孵育2小时。然后将抗血清-凝胶混合液用移液管装到1×8cm的柱上，用150ml    PSS洗柱。用6ml含2M硫氰化钠的PBS将纯化的抗体从柱上洗脱下来。再对含0.02%叠氮化钠的PBS进一步透析。

将亲和纯化的抗血清加入含1%    NP40的PBS体外翻译混合液，4℃下孵育过夜。用Pansorbin（Calbiochem公司产品）在冰浴上2.5小时沉淀抗体-抗原复合物。制备Pansorbin要在RIPA缓冲液中洗。Pansorbin沉淀物在RLPA缓冲液中洗4次，并溶在Laemmli负载缓冲液再进行电泳。

例Ⅻ：Pichia    Pastoris转化程序

A、细胞培养

1、将一个巴斯德毕赤酵母GS115（NRRL    Y-15851）菌落接种到大约10ml    YPD培养基里，在30℃下摇动培养12-20小时。

2、将细胞稀释到OD600为0.001-0.1，使细胞持 续在YDD培养基中以对数生长期生长6～8小时。

3、取0.5ml    OD600为0.1（或相当量的）种子培养液接种到100ml的YDD培养基。摇床30℃培养12-20小时。

4、当OD600为0.2～0.3时（大约16～20小时）以1500×g速度离心5分钟收集培养物。

B、制备原生质

1、用10ml无菌水洗细胞一次。（在1-5步所有离心都在1500×g和5分钟条件下）;

2、用10ml新配制的SED液洗一次细胞;

3、在10ml无菌1M山梨醇中洗细胞两次;

4、将细胞重悬在10ml    SCE缓冲液;

5、加5～10μl，4mg/ml的溶菌酶60，000（MiLes实验室制品）。将混合混量30℃孵育30～60分钟。

由于原生质制备是转化的关键步骤，必须按下面方法监测厚生质形成，溶菌酶后或稍前时刻，及在孵育的不同时刻把100μl细胞加入900μl    5%    SDS和900μl    1M山梨醇中。当细胞在SDS中溶解而不在山梨醇中溶解时（通常30～60分钟）停止孵育;

6、通过1000×g速度离心5～10分钟在10ml无菌1M山梨醇洗原生质两次。（离心时间和速度可以变化，以足以沉淀原生质又使其不致破碎为度）;

7、在10ml无菌CaS中洗一次;

8、重悬在0.6ml无菌Cas中。

C、转化：

1、把DNA样品（高达20μl体积）加到12×75mm的无菌聚丙烯管中。（DNA必须在水或TE缓冲液中;为用少量DNA可得到最大转化频率，建议每个样品中加大约1μl的5mg/ml超声处理的大肠杆菌DNA）;

2、每个样品中加100μl的原生质，在室温下孵育约20分钟;

3、每个样品中加1ml聚乙二醇溶液，在室温下孵育约15分钟;

4、在1000×g下离心5～10分钟，除去PEG溶液;

5、把样品重悬在150μl    SOS液中，室温下孵育30分钟;

6、加850μl无菌的1M山梨醇，如下述涂样品。

D、再生原生质：

1、再生琼脂培养基配方。

a、琼脂-山梨醇：9g    Bacta琼脂，54.6g山梨醇，240ml水，高压灭菌。

b、10×葡萄糖液：20g葡萄糖，100ml水，高压灭菌。

c、10×SC：6.75g含氮碱不含氨基酸的酵母（Yeast    Nitrogen    Base），100ml水，高压灭菌。（在高压灭菌前或后可加任何所需氨基酸或核酸使其浓度达200μg/ml）。

d、把30ml    10×葡萄糖液和30ml    10×SC加到溶融 的琼脂-山梨醇溶液，加0.6ml    0.2mg/ml的生物素及20μg/ml其它所需氨基酸或核酸。在55～60℃下溶融再生琼脂。

2、涂置转化样品：

转化样品前至少30分钟，向每培养皿倾注10ml再生琼脂。把10ml再生琼脂在45～50℃水浴中加入装有悬在SOS溶液中转化样品的试管中。将试管中样品及琼脂倒入准备好的琼脂培养皿中。

3、测定原生质质量：

取出10μl样品，加990μlM的山梨醇稀释到100倍。再取10μl稀释液，再加990μl1M山梨醇再稀释100倍，将两种稀释液各取100μl涂散在YPD琼脂培养基上以测定残留的未脱膜的细胞的浓度。在每种100μl的稀释液中加10ml补加40μg/ml组氨酸的再生琼脂以测定全部再生的原生质。转化试验的较好值为含1-3×10⁷总再原生质/ml和1×10³完整细胞/ml。

4、把涂皿置于30℃下孵育3～5天。

例ⅩⅢ：分离巴斯德毕赤酵母HIS₄基因及自主复制顺序。

A、菌株：所用菌株包括：

（a）巴斯德毕赤酵母菌株NRRL    Y-11430;

（b）巴斯德毕赤酵母GS115（his4;NRRL    Y-15851）

（c）酿酒酵母（S·Cere Visiae）菌株5799-4D（ahis₄-260 his₄-39;NRRL Y-15859）;和

（d）大肠杆菌菌株848（F^-met，thi gal.Ti^R80^ShsdR^-，hsdM⁺）。

B、质粒：

PYA₂（见图23，由酿酒酵母在9.3千对碱基Pst1片段上HIS4基因插入到PBR325的PSTⅠ点组成），是酿酒酵母HIS4基因片段，它被贮存在大肠杆菌宿主中，贮存号为B-15874。

YEP13从ATCC可以得到，在那儿的贮藏号为ATCC37115。

C、培养基

巴斯德毕赤酵母生长在YPD（富营养型）或IMG（基本型）培养基。IMG组成如下：

（1）IM，盐的终浓度是含36.7mM KH₂PO₄，22.7mM（NH₄）₂SO₄，2.0mM MgSO₄7H₂O，6.7mM Kcl，0.7mMCacl₂·2H₂O，要制备成10倍母液，并高压灭菌。

（2）痕量盐，其终浓度含0.2μM CaSO 4.5H₂O，1.25μMKI，4.5μM MnSO₄·H₂O，2.0μM NaMoO₄，0.75μM H₃BO₃，17.5μM ZnSO₄·7H₂O，44.5μM FeCL₃·6H₂O，制备成400倍母液，然后过滤灭菌。

（3）0.4μg/ml生物素;和

（4）2%葡萄糖：

大肠杆菌生长在补加100mg/ml色氨酸和0.2%酪蛋白氨基酸的LB培养基或2B培养基（含0.2%NH₄PO₄，1.2%Na₂HPO₄，0.013%MgSO₄·7H₂O，0.074% Cacl₂·2H₂O，1μg/ml硫胺素和0.4%葡萄糖）。

D、分离DNA：

（1）大规模制备酵母DNA：

将巴斯德毕赤酵母和酿酒酵母细胞分别置于100ml基本培养基中生长直到A600为1-2，再用2000×g速度离心5分钟以收集细胞。用水洗一次细胞，再在SED中洗一次，在1M山梨醇中洗一次，然后悬在5ml的1M山梨醇的0.1M    Tris-Hcl（PH7.0）中。把细胞与50～100μl的4mg/ml溶菌酶60，000（Miles实验室产品）组合，在30℃下孵育1小时以溶解细胞壁。然后在1000×g下离心5-10分钟收集原生质，再将其悬在溶胞缓冲液（0.1%SDS，10mM    Tris-Hcl    PH7.4，5mMEDTA和50mM    Nacl）。加蛋白酶K（Boeringer    Mannheim产品）和核糖核酸酶A（Sigma公司产品）使其浓度为100μg/ml，将得到混合液在37℃下孵育30分钟。加等体积的氯仿/异戍醇（24/1，V/V）混合使DNA温和地去蛋白，以12，000×g速度离心20分钟以分离两液相。把上面水相吸出移到一了干净试管，用等体积的酚/氯仿/异戍醇萃取之。如前离心分离两相，将上面水相置于含2～3倍体积的冷100%乙醇的试管中。样品与乙醇轻轻地混合，用一塑料棒缠搅收集DNA，然后将其立即溶在1ml的TE缓冲液中，对100倍体积的TE缓冲液4℃下透析一夜。

（2）小规模酵母DNA制备：

取在基本培养基中生长到A600达1-5的酵母培养液5ml，在2000×g下离心5分钟收集细胞。将其悬在1ml的SED中，转移到一个1.5ml微离心管中，用1M山梨酵次一次，重悬在含1M山梨醇的0.5ml    0.1M    tris-Hcl（PH7.4）中，加 溶菌酶60，000（4mg/ml溶液加10μl）在30℃孵育30～60分钟。将其离心1分钟，悬在溶胞缓冲液中在65～70℃下孵育。15分钟后，将样品与100μl5M醋酸钾混合，置于冰浴中15分钟，再离心5分钟。将上清液到入含1ml    100%的乙醇的干净的微离心管中，混合，离心10秒，将得到的DNA沉淀风干10～15分钟，溶在5μl的TE缓冲液中。

（3）大规模大肠杆菌DNA的分离：

为大规模制备（0.5～1升）质粒，将大肠杆菌在37℃下摇动培养在补加如上述物质及适当抗生素的2B培养基中。为得到含PBR322衍生质粒的细胞，使细胞培养生长到A550约0.7时加足够的氯霉素使其浓度达100μg/ml大约15小时后收集细胞。把含PBR32.5衍生质粒的菌株在A550达0.01～0.05时接种到含补加物质的2B培养基中，在37℃下摇动孵育20～24小时，然后收集之。

（4）小规模大肠杆菌DNA的分离：

为小规模迅速地分离质粒，将生长在含补加物质和抗生素的2B培养基中的培养物2ml于37℃下摇动培养一夜。移至1.5ml微离心管中离心收集之。用Birnboim和DOly（1979年）所述方法，碱水解从各制备液中分离质粒。

E、限制酶切DNA和其片段的分离：

从New    Eng    Land    Biolabs和Bethesda    Resealch    Laboratories得到限制酶，用常规技术酶解。比较有插入DNA与无插入DNA平行酶解的质粒绘制限制酶切图。通过电泳洗脱提纯酶切片段。将其从琼脂糖凝胶转移到衬在透析管上的Whatman    3MM 纸条。从滤纸和管子上回收DNA片段即用含0.1M    Macl，50mM    Tris-Hcl（PH8.0）和1mMEDTA的溶液0.1～0.2ml洗3-4次。最后用苯酚/氯仿/异戍醇萃取，再用乙醇沉淀，将离心得到的沉淀重溶在小体积的TE缓冲液中。

F、在大肠杆菌中建立巴斯德毕赤酵母基因文库：

为建立巴斯德毕赤酵母DNA-YEPB文库，将100μg的YEP13用BamHⅠ完全酶解并用小牛肠道碱性磷酸脂酶处理以从DNA除去5′端磷酸。取巴斯德毕赤酵母（NRRL Y-11430）得到的野生型巴斯德毕赤酵母DNA100μg用10单位Sau3AⅠ部分水解，总体积为1ml，在37℃下孵育5分钟。用5～20%庶糖梯度离心选择5～10千对碱基的片段。将1μg载体和2μg的Pichia Sau3AⅠ片段与20个单位的T4DNA连接酶在总体积200μl中混合，于4℃下孵育一夜。为用连接后的DNA转化大肠杆菌，把全部连接反应混合液加到2ml感受态的大肠杆菌848细胞，在0℃下孵育15分钟。将混合液加热到37℃5分钟，然后加40ml的LB培养基，继续在37℃下孵化1小时。加入氨

青霉素，使其浓度为100μg/ml，再孵育1个小时。最后在3，000g下离心细胞10分钟，将沉淀重悬在1ml新配制的LB培养基，将等量悬液涂散在含100μg/ml氨 青霉素的10LB琼脂皿上。将得到的约50，000个菌落从平器取出，在A550约0.1时其中一部分接种到500ml含补加物质的2B培养基。培养物长成后用上述方法萃取质粒。取出菌落用来建立文库。96%菌落为四环素敏感的，7/10菌落含有具插入DNA的质粒。

为建立巴斯德毕赤酵母DNA-PYJ8△eLa文库，用CLaⅠ使其完全水解，再用小牛肠道碱性磷酸酯处理以从DNA除去5′末端磷酸。用20个单位的TaqⅠ以总体积1ml在65℃下孵化5分钟以部分水解100μg巴斯德毕赤酵母（NRRL Y-15851）DNA。电泳从0.5%琼脂糖凝胶中洗脱出5到10千对碱基不同大小的片段（见例Ⅱ，E部分），将1μg载体，2μg Pichia TaqⅠ片段与20个单位T4 DNA连接酶混合总体积为200μl，在4℃下孵育一夜。为用连接后DNA转化大肠杆菌，将全部连接反应混合液与2ml感受态的大肠杆菌848细胞，在0℃下孵育15分钟。将混合液加热到37℃5分钟，加入40ml LB培养基，于37℃下连续孵化1小时。加入氨 青霉素，使其浓度达100μg/ml，再孵化一小时。最后以3000×g离心10分钟，重悬在1ml的新配制的LB基质。将等量的悬液涂在含100μg/ml氨 青霉素的10LB琼脂平皿上。将得到的约10，000菌落从平皿取出，将其中一部分在A550约0.1时接种到500ml含补加物质的2B培养基。培养物长好后按上述方法萃取质粒。

G、Southen杂交：

为把大的或超螺旋DNA分子转移到硝酸纤维素膜上，将琼脂糖凝胶浸在0.25MHcl 10分钟，然后用碱使其变性，从而DNA被部分水解。在含50%甲酰胺，6×SSC，5×Denhardt氏液，0.1%SDS，1mM EDTA和100μg/ml的变性鲑鱼精子DNA的混合液中将酿酒标记的酵母HIS₄基因片段与Pichia Pastoris DNA在42℃下杂交。然后在1× SSC，1mM    EDTA，0.1%SDS和1%焦磷酸钠混合液中于65℃下洗杂交DNA膜。32P标记是用例Ⅳ的方法。

H、测定DNA顺序：

用Sangu等人（1980）的二脱氧核苷酸链中断方法测DNA顺序。

Ⅰ、转化酵母：

用Hinnen等人（1978年）制备原生质的方法来转化酿酒酵母。

用下述程序转化巴斯德毕赤酵母。

J、分析巴斯德毕赤酵母转化体：

按下述程序测定每种质粒作为自主成分在巴斯德毕赤酵母细胞内维持的能力;从再生琼脂平器上取一个转化菌落，将其划线接种到含SD基质的琼脂皿上再接种到IMG液体培养基中，SD皿置于30℃孵育三天，然后取一个单菌落在划痕接种到第二SD皿和接种到第二瓶IMG培养基中。再重复一次这个步骤。然后将三个在1MG瓶中的培养物于30℃下摇动培养到A600达约1-2，再离心收集。用上述方法萃取酵母DNA，再置0.8%琼脂糖凝胶上以30伏、30毫安条件电泳10～15小时，转移到硝酸纤维膜上，与32P-标记的PBR322或PBR325杂交。用一个含10ng大肠杆菌质粒的样品和一个含1-2μg未转化巴斯德毕赤酵母GS115DNA的样品作为对照与被测样品平行电泳。

K、分离Pichia    DNA顺序：

根据对酿酒酵母his₄菌株互补能力从Pichia DNA文库中分离出含Pichia HIS4的DNA片段。该文库由插入到酿酒酵母 -大肠杆菌穿梭载体YEp13的BanHⅠ切点的野生型Pichia DNA Sau3AⅠ部分酶解的5-20千对碱基的片段组成，将用Hinnen等人（1978年）的技术得到的酿酒酵母NRRL Y-15859（5799-4D;一个his4 ABC菌株）原生质与Pichia DNA文库混合，再在缺乏组氨酸的介质中再生。从5×10⁷个可再生原生质得到的转化原养型酵母菌落1×10³个。从20个His⁺菌落萃取酵母总体DNA，转化到大肠杆菌中。有17个酵母DNA制备物产生氨 青霉素抗性菌落，而且每菌落都含有包括YEP13和插入DNA的质粒。为证明His⁺转化质粒含有Pichia HIS₄基因而不含一个具有抑制活性的DNA片段，将质粒的限制酶切片段与含酿酒HIS4基因大部分的标记DNA片段杂交，在低紧密控制下洗之。每个与his4酿酒酵母菌株互补的质粒都含与酿酒酵母HIS4基因杂交的顺序。

为探取含Pichia ARS活性的DNA片段，用TagⅠ部分水解巴斯德毕赤酵母GS115（NRRL Y-15851）DNA，分离出5到10千对碱基的片段，将其克隆到PYJ8△Cla的唯一的ClaⅠ切点。（见图26）从大约10，000个His⁺Pichia菌落回收质粒DNA以用作转化大肠杆菌。分离出约10，000个抗氨

青霉素质粒然后再回过头来转化GS115。40个来自亚文库转化的His⁺酵母菌落分别被划线接种到选择培养基分别培养，从40个培养物中分别萃取酵母DNA，转化大肠杆菌。二个含能使大肠杆菌产生氨 青霉素抗性的酵母DNA的质粒PYA63（PARS1）和PYA90（PARS2）用作进一步分析。这两种质粒都高频地转化巴斯德毕赤酵母GS115（NRRL Y-15851），并且都含有一个外源 DNA的插入体。

例ⅪⅤ：调节区-LacZ基因融合的建立

A、p72（醇氧化酶）调节区工程产物：

用PSE1酶切含4千对碱基巴斯德毕赤酵母EcoRⅠ-PVaⅡ基因组DNA片段的质粒pPG4.0，其载体为pBR322，再用S₁核酸酶在切点上制造一个平整末端，然后再用BamH1酶切，得到一个含醇氧化酶调节区和为其头15个氨基酸编码的1.12千对碱基的DNA。它的核酸顺序如下：

1.12千对碱基

S1核酸酶……CTA    CCT    GGT    CB

↑

处理端……GAT    CCA    CCA    CCT    AGB

醇氧化酶    Len11    Gly12    Gly13

这个11.2千对碱基片段连接到大肠杆菌-酿酒酵母穿梭质粒载体PSEY    101（Douglas等人1984年）的EcoRⅠ/SmaⅠ/Ba-mHⅠ连接体（LinKer）（用BamHⅠ和SmaⅠ酶切）。载体PSEY101含有大肠杆菌LacZ基因和一个具有下列碱基顺序的多聚连接物L（PolglinKer）：

R    Sm    B

↓  ↓

…GR′AATTCCC    GGG    G    ATCCC    GTC    GTT…

C    TTAAGGG    GCC    C    TAGGG    CAG    CAA…

↑    ↑    ↑

R1    Sm    B    Val9    Val10

β-半乳糖苷酶 得到了杂种质粒PTAO11（见图29）

由于调节区-LacZ基因与PTAO11的融合在顺序E中所示为β-半乳糖苷酶编码区之外：

载体PTAO11在唯一的BamHⅠ部位被酶切，下面是插入的SmaⅠ连接

因而产生的杂种质粒PTAO12的调节区-LacZ融合体具下列顺序：

而这样PTAO12的调节区-LacZ融合物仍在LacZ读码之外。为了把醇氧化酶结构基因编码N-末端的信息带进一个具LacZ结构基因的打开的读码中，用EcoRⅠ-SmaⅠ处理PT012，所得的DNA片段被连接到用EcoRⅠ和SmⅠ同样处理的PSEY101，产生了杂种质粒PTAO13（见图30和下面的核苷酸顺序）：

R1    1.12千对碱基

…G    AATTCCC……CTA    GGT    GGT    GGA    TCA

C    TTAAGGG……GAT    CCA    CCA    CCT    AGT

↑

R1    Leu11Gly12Gly13Gly14Seg15

Sm    B

↓    ↓

CCC    GGG    GAT    CCC    GTC    GTT…

GGG    CCC    CTA    GGG    CAG    CAA…

↑    ↑

Sm    B

Pro    Gly    Asp    Pro    Val9Val10…β-半乳糖苷酶

然后载体PTAO13被用于转化酿酒酵母SEY2102以供例ⅩⅤ中的进一步研究。

用PstⅠ或PstⅠ-NruⅠ酶切载体PTAO13，包括在上述酶切片 段的调节区-LacZ融合体分别与穿梭载体PTAFH1（见图28）PYJ30（见图27）或PYA₂（见图23）的含HIS4基因的片段连接，得到质粒PSAOH1，PSAOH5和PSAOH10。

P    TAO13与下面质粒连接    得到的质粒

PTAFH1    PSAOH1

PYJ30    PSAOH5

PYA2    PSAOH10

B、P76调节区工程产物：

用P76调节区制备的调节区-LacZ基因融合物如下程序得到：

1.用P^PG6.0的全部5′端部分：

把P^PG6.0的一个1.35千对碱基EcoRⅠ片段克隆到一个大肠杆菌-酿酒酵母的穿梭载体PSEY101的唯一ECORⅠ切点得到质粒PT76U1（见图30a）。

然后用PstⅠ-NruⅠ切载体PT76U1，并且将较大的DNA片段与以上描述的穿梭载体PTAFH1（图28）的含HIS4基因片段连接，得到PT76H3;或与穿梭载体PBPf1（图34）的PStⅠ-EcoRⅠ片段的EcoRⅠ端连接，得到PT76H4。

2.使用P^PG6.05′端的Ba131酶切片段

P^PG6.0的一个1.35千对碱基的EcoRⅠ片段克隆到一个大肠杆菌-酿酒酵母穿梭载体PSEY8的唯一EcoRⅠ切点，PSEY8在邻近Pichia DNA插入点ECoRⅠ也有一个唯一的SalⅠ切点，从而得到质粒PTAOⅠ（见图31）。用SalⅠ酶切PTAO1，再用Bal31外切酶制造一些不同长度的肽P76调节 区的具平整末端的片段。将这些片段与用ECORⅠ酶切的质粒PSEY8的残留物分开，将得到的DNA片段克隆到PSEY101的EceRⅠ-SmaⅠ连接体，得到质粒PTAF。85（见图32）。PTAF。85与图29所示的PTAO11类同，只是它具有P76调节区而不是P72（醇氧化酶）调节区。

用上述处理载体PTAO13一样方法处理PTAF。85，分别得到质粒PTAFH。85，PT76H1和PT76H2。从而把下列载体酶切再连接：

PTAF.85与下面质粒连接    得到的质粒

PTAFH1    PTAFH.85

PYJ30    PT76H1

PYA2    PT76H2

例ⅩⅤ：在巴斯德毕赤酵母中生产β-半乳糖苷酶的调节：

研究了生长在不同碳源上和处于不同条件下一些巴斯德毕赤酵母（GS115（NRRL    Y-15851）转化体生产β-半乳糖苷酶的情况。把转化菌株置于含0.5μg/ml生物素，0.1%葡萄糖的培养基上，在30℃下培养直到达到静止期为止。离心收集细胞，把其转到含0.5μg/ml生物素和0.5%甲醇的基本培养基上，于30℃下生长大约3-5代。在甲醇上开始生长后，将细胞离心收集，并转移到含0.5μg/ml生物素及0.1%葡萄糖或0.3%甲醇为碳源的新配制的基本培养基上。在30℃下生长80小时，定期取样以测定醇氧化酶和β-半乳糖苷酶的水平。20～50小时后，除掉碳源，使细胞处于缺乏碳素状态，结果总结在表Ⅰ。

表1

巴斯德毕赤酵母    NRRL    Y-15851

转化体的半乳糖苷酶和醇氧化酶（单位数/OD600）的最高值（孵育时间以小时计）

β-半乳糖苷酶^a醇氧化酶^a

1%    缺乏    0.3%    1%    缺乏    0.3%

质粒    葡萄糖    葡萄糖    甲醇    葡萄糖    葡萄糖    甲醇

PSAOH1    0    660（20）    1361（0）    0    35    530

PSAOH5    0.1-    567（20）    1168（0）    0    60    550

0.2

PSAOH10    0    886（20）    1559（0）    0    167    425

PTAFH.85    0    0.17（80）    0.5    0    未测    未测

PT76H1    0    3.20（80）    0    0    未测    未测

PT76H2    0    未测    未测    0    未测    未测

PT76H3    0    20    781    0    未测    未测

0.3-

PT76H4    0.6    40（80）    3100    0    未测    未测

a、在不同时间间隔取样，两种酶测定方法如下所述。

醇氧化酶用上述染料-过氧化酶法测定（见例Ⅶ），β-半乳糖苷酶如下述测定：

β-半乳糖苷酶测定

A、所需溶液：终液度

Z缓冲液：↓

Na₂HPO₄·7H₂O 16.1g 0.06M

NHH₂PO₄5.5g 0.04M

Kcl    0.75g    0.01M

MgSO₄·7H₂O 0.246g 0.001M

2-巯基乙醇    2.7ml    0.05M

加水使体积为1升，PH应当是7

O-硝基苯基-β-D-半乳糖苷（ONPG）：

将400mg    ONPG（来自Sigma公司代号N-1127），溶到100ml双蒸馏水中，制得一个4mg/ml的ONPG溶液。

B、测定程序：

1.取出部分培养物（含酵母细胞0.1-0.5OD600）离心收集，用水洗细胞。

2.把1mlZ缓冲液加入细胞沉淀，再加30μl氯仿，30μl的0.1%SDS，在Vortex振荡混匀，30℃下孵育5分钟。

3.加0.2ml    ONPG（4mg/ml），在VorteX振荡混匀开始反应。

4.在适当的时刻（A420＜1时）加入0.5ml1MNa₂CO₃溶液中止反应。

5.测上清液在420nm的消光度。

C、计算β-半乳糖苷酶活性单位：

（1单位）U＝30℃下，PH＝7时每分钟生成1纳摩尔的邻硝基苯（ONP）。1纳摩尔ONP在420nm处，1cm光道长度下消光度（A420）为0.0045;因此在420nm处消光度1代表222纳摩尔ONP/ml，或378纳摩尔/1.7ml，因为分析用上清液的总体积为1.7ml。所以表中的单位数按下式 计算：

单位（U）＝ (消光度（A420）)/(时间（分钟）) ×378

表1的结果说明酵母的外源蛋白，即β-半乳糖苷酶可以在基质中有甲醇调节的巴斯德毕赤酵母中产生，也可在先生长在抑制碳源的可分解产物后再转到缺乏碳素的条件调节的巴斯德毕赤酵母中产生。

例ⅩⅥ：在酿酒酵母中β-半乳糖苷酶生物的调节：

用质粒PTAO13和PT76U1转化需要尿嘧啶亮氨酸和组氨酸为补充物以维持生长的酿酒酵母菌株SEY2102。可以通过箍选不需尿嘧啶维持生长的克隆很容易的分离转化了的菌株。分离出的转化菌株分别以SEY2102-PTAO13，SEY2102-PT76U1作为实验室命名。SEY2102-PTAO13于1984年8月31日贮存在NRRC。贮存号为NRRL-Y-15858。

在含20μg/ml组氨酸和亮氨酸及5%葡萄糖的基本培养基上将NRRL-Y-15858和SEY2102-PT76U1在30℃下孵育3-4代。离心收集细胞，再将其转移到含表Ⅱ所示碳源的3%的YP培养基，在30℃下生长约5代。再在缺乏碳源条件下再孵育50小时。然后定期取样测定β-半乳糖苷醇。结果总结在表Ⅱ。

表Ⅱ

用酿酒酵母生产β-半乳糖苷酶（单位/OD600）

A、醇氧化酶调节区（PTAO13）

碳源3%    5代后    缺乏碳源

6小时    20小时    50小时

葡萄糖    0.2    105    66    未测

果糖    0.3    30    31    28

乙酵    23    137    115    77

甘油    640    806    656    788

半乳糖    982    960    651    766

B、p76调节区（PT76U1）

缺乏碳源

碳源35%    5代后    12小时    25小时    30小时

葡萄糖    2.3    254    815    803

甘油    470    未测    未测    未测

这些结果说明在先将p72（醇氧化酶）和p76调节区调节的酿酒酵母生长在抑制碳源的可分解产物的缺乏碳素条件或将转化的酿酒酵母生长在诸如甘油或半乳糖等抑制碳源的相对不能分解的产物上的缺乏碳素条件下都可以生产如：β-半乳糖苷酶的酵母外源蛋白。

用本发明调节区控制的在酿酒酵母中β-半乳糖苷酶的表达水平可与用其它酿酒酵母调节启动子调节的可能表达水平比较。

β-半乳糖苷酶

启动子→    碳源→

单位/OD600

细胞色素C-IacZ    棉子糖（3%）    460

融合体（CYCI）

半乳糖渗透酶-IacZ    450

融合体（GAL₂） 半乳糖（2%）

转化酶-IacZ    160

融合体（SUC₂）

可以看到本发明调节区令人吃惊地发现至少与酿酒酵母启动子一样有效，或比它更有效。

例ⅩⅦ：用酵母基因组DNA进行Southern杂交

把9个不同的能同化甲醇的酵母和一个不能同化甲醇的酵母分别置于加0.75%甲醇或1%葡萄糖的基本培养基（IM1，见例1）。如例Ⅵ所述分离总体染色体DNA，也就是先分离总体核酸，再用核糖核酸酶A处理之，用苯酚/氯仿/异戍醇萃取，再用氯仿/异戍醇萃取，最后用乙醇沉淀。将沉淀的DNA重悬在尽量小体积的TE缓冲液中，离心以澄清DNA溶液。

如：例Ⅵ所述方法制备Sontern杂交滤膜，即用过量的HindⅢ酶解各种酵母菌的总体DNA10μg，电泳，DNA变性，中和凝胶，将DNA转到硝酸纤维素滤膜上。在下面条件下予杂交;滤膜在50%去离子甲酰胺，6×SSC，5×Denhardt氏液，1mM EDTA，0.1%SDS和100μg/ml变性鲑鱼精子DNA混合液中于42℃，孵育过夜，用上述同样条件，加³²P- 缺口-翻译探针，使其终浓度为10⁶CPm/ml，探针包括具克隆P^PC8.3，P^PC15.0和P^PC6.7的CDNA插入体（PStⅠ片段）及含P.Pastoris HIS4基因的一个2.7千对碱基的BalⅡ DNA片段。每种探针分别用于同样的滤膜杂交，于42℃杂交持续24小时，然后在室温下洗滤纸2次，每次15分钟，再在65℃下洗3次每次15分钟，用于洗滤纸的缓冲液含2×SSC，1mMEDTA，0.1%SDS和0.1%焦磷酸钠。再在低紧缩条件下即55℃和42℃下洗之，为证实杂交结果。将滤纸进行的放射自显影72小时，结果总结在表Ⅲ。

表Ⅲ

巴斯德毕赤酵母基因与不同酵母染色体DNA杂交^＊

P.Pastoris

HIS4 P^PC8.3 P^PC15.0 P^PC6.7

1、巴斯德毕赤酵母    +    +    +    +

NRRL    Y-11430

2、巴斯德毕赤酵母    +    +    +    +

NRRL    Y-1603

3、Hansenula    +    +    +    +

CaPsulatum

4、H.henricii    +    +    （+）    +

5、H.nonfermentans    +    +    +    +

6、H.PolymorPha    （+）    +    （+）    +

7、H.WicKerhamii    +    +    +    +

8、拟球酵母属

molischiana    +    +    +    +

9、酿酒酵母    （+）    -    -    -

10、巴斯德毕赤酵母

NRRL    Y-15851    +    +    +    +

^＊说明：+杂交 （+）弱杂交 -在所用条件下未观察到杂交

表Ⅲ所示结果说明与P⁷⁶，P⁷²和P⁴⁰类似的肽的编码基因出现在所有同化甲醇的酵母中。很明显，不同化甲醇的酿酒酵母DNA的杂交试验证实它不含这三个基因，但巴斯德毕酵母HIS4基因与酿酒酵母的HIS4基因的同质性是一目了然的。

本说明书提供的例子纯为说明本发明的实施，但不限制本发明范围及权利要求。没离开本发明思想和本质的合理改变和修饰都将在本发明要求专利保护范围之内。

参考书目

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Maxam和Gilbert（1980）酶学方法（MethOds    in    EnxymOlOgy）

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Sanger等人（1980）分子生物学杂志

143卷    161-178页

Claims (10)

1、一种制备多肽的方法，包括在含有甲醇作为碳源的培养基上培养转化的酵母菌株并分离和纯化其表达产物诸步骤，其中所说的转化酵母菌株能够表达得自重组DNA材料的插入的多肽编码顺序，其特征在于该重组DNA包含欲表达之多肽的编码区，且还含有图4、5、6所示从PPG6.8(DHAS)，PPG4.0(AOX1)和PPG4.8得到的调节区甲醇反应性DNA片段。

2、根据权利要求1所述的方法，其中所说的甲醇反应性片段具有下列核苷酸顺序：

3、根据权利要求1所述的方法，其中所说的甲醇反应性DNA片段位于所说的多肽编码区的5端。

4、根据权利要求1所述的方法，其中所说的甲醇反应性DNA片段作为调节区用于控制编码醇氧化酶之信息RNA的转录。

5、根据权利要求1所述的方法，其中所说的甲醇反应性DNA片段是从毕赤酵母菌株中衍生的。

6、根据权利要求5所述的方法，其中所说的毕赤酵母属菌株是巴斯德毕赤酵母（PiChia  pastoris）NRRL  Y-11430。

7、根据权利要求1所述的方法，其中所说的多肽编码区是编码醇氧化酶的多肽编码区。

8、根据权利要求6所述的方法，其中所说的醇氧化酶编码区具有下列核苷酸顺序：

9、根据权利要求1所述的方法，其中所说的转化的酵母菌株是巴斯德毕赤酵母NRRL  Y-15852。

10、根据权利要求8所述的方法，其中所说的酵母菌株能生长于以甲醇作碳源的培养基上。

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