CN101027073A - 促尿钠排泄化合物、轭合物及其用途 - Google Patents

促尿钠排泄化合物、轭合物及其用途 Download PDF

Info

Publication number
CN101027073A
CN101027073A CNA2005800252228A CN200580025222A CN101027073A CN 101027073 A CN101027073 A CN 101027073A CN A2005800252228 A CNA2005800252228 A CN A2005800252228A CN 200580025222 A CN200580025222 A CN 200580025222A CN 101027073 A CN101027073 A CN 101027073A
Authority
CN
China
Prior art keywords
conjugates
natriuretic compounds
natriuretic
compounds
peptide
Prior art date
Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
Pending
Application number
CNA2005800252228A
Other languages
English (en)
Inventor
肯尼斯·D·詹姆斯
伯勒辛加姆·拉达克里希南
纳瓦迪普·B·马尔卡
马克·A·米勒
瑙奇瑞·N·埃克沃瑞博
Current Assignee (The listed assignees may be inaccurate. Google has not performed a legal analysis and makes no representation or warranty as to the accuracy of the list.)
Biocon Ltd
Nobex Corp
Original Assignee
Nobex Corp
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Nobex Corp filed Critical Nobex Corp
Publication of CN101027073A publication Critical patent/CN101027073A/zh
Pending legal-status Critical Current

Links

Images

Classifications

    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
    • A61K39/395—Antibodies; Immunoglobulins; Immune serum, e.g. antilymphocytic serum
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
    • C07K14/435—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans
    • C07K14/575—Hormones
    • C07K14/58—Atrial natriuretic factor complex; Atriopeptin; Atrial natriuretic peptide [ANP]; Cardionatrin; Cardiodilatin
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K47/00—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient
    • A61K47/50—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates
    • A61K47/51—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent
    • A61K47/56—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent the modifying agent being an organic macromolecular compound, e.g. an oligomeric, polymeric or dendrimeric molecule
    • A61K47/59—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent the modifying agent being an organic macromolecular compound, e.g. an oligomeric, polymeric or dendrimeric molecule obtained otherwise than by reactions only involving carbon-to-carbon unsaturated bonds, e.g. polyureas or polyurethanes
    • A61K47/60—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent the modifying agent being an organic macromolecular compound, e.g. an oligomeric, polymeric or dendrimeric molecule obtained otherwise than by reactions only involving carbon-to-carbon unsaturated bonds, e.g. polyureas or polyurethanes the organic macromolecular compound being a polyoxyalkylene oligomer, polymer or dendrimer, e.g. PEG, PPG, PEO or polyglycerol
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P9/00—Drugs for disorders of the cardiovascular system
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P9/00—Drugs for disorders of the cardiovascular system
    • A61P9/04—Inotropic agents, i.e. stimulants of cardiac contraction; Drugs for heart failure
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P9/00—Drugs for disorders of the cardiovascular system
    • A61P9/10—Drugs for disorders of the cardiovascular system for treating ischaemic or atherosclerotic diseases, e.g. antianginal drugs, coronary vasodilators, drugs for myocardial infarction, retinopathy, cerebrovascula insufficiency, renal arteriosclerosis
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
    • C07K14/435—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans
    • C07K14/46—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans from vertebrates
    • C07K14/47—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans from vertebrates from mammals
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
    • C07K14/435—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans
    • C07K14/705—Receptors; Cell surface antigens; Cell surface determinants
    • C07K14/72—Receptors; Cell surface antigens; Cell surface determinants for hormones
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K16/00—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies
    • C07K16/18—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans
    • C07K16/26—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans against hormones ; against hormone releasing or inhibiting factors
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K38/00—Medicinal preparations containing peptides

Abstract

本发明公开了修饰的促尿钠排泄化合物及其轭合物。尤其是，本发明提供了hBNP的轭合形式，且其包括至少一种与其相连的修饰部分。所述修饰的促尿钠排泄化合物保留了刺激cGMP产生、结合于NPR－A受体的活性；在一些实施方案中，与未修饰的对应促尿钠排泄化合物相比，本发明所公开的促尿钠排泄化合物在循环中具有改善的半衰期。可将所述化合物和轭合物的口服、肠胃外、经肠、皮下、经肺和静脉内形式制备成适于心脏疾病尤其是充血性心力衰竭的治疗剂和/或治疗方法。本发明还公开了含有具有不同长度和构象的寡聚结构的修饰部分。本发明还公开了促尿钠排泄化合物的类似物，其具有不同于天然序列的氨基酸序列。

Description

促尿钠排泄化合物、轭合物及其用途
1.相关申请
本申请基于递交日为2004年5月26日，未决的，题为“促尿钠排泄化合物、轭合物及其用途”的美国临时专利申请第60/574,436号，并要求其优先权。本申请将该申请中全部公开内容都全文引用作为参考，与此同时，出于这些权利要求合法主张的全部目的，本申请还要求该专利申请中递交日所主张的权益。
2.政府支持声明
本发明是在NIH拨款#1 R43 HL074529-01资助的研究计划下申请的。美国政府对本发明拥有某些权利。
3.发明领域
本发明涉及促尿钠排泄化合物轭合物和促尿钠排泄化合物变体，及其在治疗充血性心脏病和与该病症相关病症中的用途。例如，本发明的所述组合物提供了具有药理活性的促尿钠排泄剂和原药，其可适用于口服、经鼻、静脉内或皮下给药的制剂中。本发明还提供了制备所述促尿钠排泄化合物轭合物，化合物以及含有这些化合物和轭合物的制剂制剂的方法，同时还提供了使用这些轭合物和化合物的方法。例如，所述促尿钠排泄化合物轭合物包含如下的促尿钠排泄肽：该肽包括NPR-A结合基序，至少一个修饰部分轭合位点，同时还包括与所述修饰部分轭合位点连接的至少一个修饰部分。在一些实施方案中，所述化合物轭合物保留了天然促尿钠排泄肽的药理活性，与此同时，还具有改进的特征，例如改进的生物利用率，对蛋白水解活性提高的抗性，和/或在血液中延长的活性。在其他实施方案中，所述化合物轭合物被作为可水解原药提供，与天然促尿钠排泄肽相比，原药形式其药理活性有所降低，并且当所述原药在体内水解后，可以释放出具有活性的促尿钠排泄化合物。
本发明还涉及重组肽和蛋白领域，以及制备这些重组肽和蛋白的方法。尤其是，本申请在此公开了促尿钠排泄肽和蛋白质的类似物。在一些实施方案中，本发明所述促尿钠排泄化合物的类似物被描述成具有如下的氨基酸序列：与所述对应的促尿钠排泄肽的天然序列相比，该序列具有至少一个取代的氨基酸。在一些实施方案中，本发明所述的促尿钠排泄化合物的类似物被描述成具有以下肽的天然形式的药理活性：脑型促尿钠排泄肽(BNP)，尤其是人BNP(hBNP)，尿扩张素，犬脑促尿钠排泄肽(cBNP)，心房促尿钠排泄肽(ANP)，尤其是人ANP(hANP)，树眼镜蛇促尿钠排泄肽(DNP)，或C-型促尿钠排泄肽(CNP)，尤其是人CNP(hCNP)。
4.发明背景
无论性别或种族如何，心血管疾病是美国人的头号死亡原因。在这些疾病当中，充血性心力衰竭(CHF)是唯一一类呈普遍上升趋势的疾病(Massie and Shah 1997；Packer and Cohn 1999)。根据美国心脏协会的报道，从1979年到1999年，由于CHF出院和死亡的患者数量都大约升高了2.5倍。目前，大约有5百万美国人被诊断患有CHF，并且每年还会新增大约550,000个病例(美国心脏协会2001)。这种致命的疾病总是伴随着巨大的金钱花费。事实上，这是最大的单项医疗保险开销(Kayser 2002)。据估计，治疗CHF的直接和间接费用高达560亿美元(Hussar 2002)。用于治疗HF的医院花费甚至比那些治疗所有类型癌症费用合起来的两倍还多(O’Connell and Bristow 1994)。
CHF是一种常见的死亡原因，其通常都伴随有高额的间接治疗费用以及较高的死亡率。一旦患者被诊断患有CHF，一年内的死亡率为约20％(美国心脏协会2001)。由于相同病症的再次入院可能性也非常高，近来也进行了若干关于再次入院的研究(Chin and Goldman 1997；Krumholz，Parent et al.1997；Krumholz，Chen et al.2000)。确诊一年内的再次入院率超过35％是很常见的(Tsuchihashi，Tsutsui et al.2001)。这样频繁的复发会导致多次急救就诊以及入院治疗(Krumholz，Parentet al.1997)。多次入院治疗和不充分的治疗就是那些患CHF的患者面对的现状。
一项最近的随机研究表明，基于家庭的干涉可以极大地降低CHF患者的重新入院率，延长存活率，并且改善生活质量(Stewart，Marley etal.1999)。在一项针对社会经济因素的独立研究中，Tsuchihashi等人认为，为了降低与CHF相关的死亡率和总开销，门诊处理和基于家庭的照顾都是必要的(Tsuchihashi，Tsutsui et al.2001)。显而易见，在这一不断增长的市场中，亟需针对基于门诊病人的应用广泛的新疗法。
脑型促尿钠排泄肽(BNP)是涉及心血管、肾脏和内分泌稳态的肽家族之一。它是在1988年发现的(Sudoh，Kangawa et al.1988)，几乎是在心房促尿钠排泄肽(ANP)发现之后的十年。虽然它最初是从猪脑中分离得到的，但其却以对心血管平滑肌和内皮细胞中的受体具有活性而为公众所知。BNP是一种由心脏产生的内源肽。其首先是以原前-BNP产生的，随后缩短两倍成为活性形式，即具有一个二硫键的32个氨基酸的肽。
如图1所示，BNP结合于促尿钠排泄肽受体A(NPR-A)，其是细胞表面的膜结合蛋白。该结合事件引发了细胞液中由鸟苷酸环化酶导致的cGMP合成。正是通过这种第二信使，使得BNP实现了与其相关联的心血管、肾脏和内分泌效应。可以通过几种不同的方式实现对BNP的调节。可以将结合于NPR-A和刺激cGMP产生的BNP分子从循环中去除，还可以通过其他方法在不引起其他反应的条件下去除BNP。最常见的去除方式是通过与清除受体、促尿钠排泄肽受体C(NPR-C)的结合来实现。当与NPR-C结合后，所述肽即被摄入细胞并且被酶促清除。另一种主要的清除方式是采用中性肽内切酶(NEP)的降解，所述内切酶是细胞表面的一种膜结合酶。最后，通过肾滤过作用将BNP清除至较低水平。
在正常情况下，在心房和心室中都能低量产生BNP。然而，当心室在心代偿过程中进行收缩时，BNP的产量急剧升高。虽然也涉及到心房，但心室依然是主要的产生位置。在CHF发病时，响应于在心代偿过程中心室的收缩，心脏产生了BNP。BNP的效应包括尿钠增多，利尿，血管舒张和舒张压降低。这些效应都是通过第二信使，即环鸟苷单磷酸(cGMP)的作用产生的。当BNP与促尿钠肽受体A(NPR-A)，即位于血管、肾脏和肺内皮细胞表面的膜结合受体相互作用时，引发了cGMP的产生。BNP的血浆浓度随着CHF严重程度的增加而增加。除了这样的增加，BNP的有益效果会在严重的CHF中受到钝化，从而在明显的CHF中提高相对缺乏状态的可能性。或者，考虑到目前采用的旨在测定BNP的血浆浓度的分析方法不能将前原-BNP和成熟形式特异性区分开来，在明显的CHF中，这种原-激素并未被充分地加工成其成熟形式。因此，无论是心脏产生的BNP量过量，或者是前原-BNP并未充分地转化成其活性形式，其有益作用都会降低。由于其产生于心脏疾病发病的早期，BNP就成了检测患者具有逐渐发展成CHF的较高风险的重要诊断标记(Yamamoto，Burnett et al.1996；McDonagh，Robbet al.1998；Richards，Nicholls et al.1998；Nagaya，Nishikimi et al.2000；Kawai，Hata et al.2001；Maisel，Krishnaswamy et al.2002；McNairy，Gardetto et al.2002)。
BNP可以几种方式发挥作用来缓解心失代偿。顾名思义，BNP可导致钠的排泄和尿排出量的上升，其能够降低充血。其还可作为血管舒张剂来发挥作用，该效果可通过若干其他作用得到增强。这些作用中最值得注意的是BNP在干扰肾素-血管紧张素-醛固酮系统(RAAS)中起的作用。这导致了肾素的抑制，而肾素是血管收缩肽血管紧张素产生的关键酶。其可以抑制血管组织衬里上皮细胞的过度生长，当其保持未受抑制状态时，可以极大地降低血流。BNP发挥缓解心代偿作用的最后一种方式是其松弛性作用。其可改善心室的心肌舒张，从而导致较低的舒张压。
在将肽用作药物时有许多客观的限制。消化道和血液中的蛋白质水解作用是将肽用作治疗剂的主要障碍。非内源性肽所遭遇到的另一个难题是免疫原性。综上，制药业的策略是采用药物化学的方法生产小的非肽类分子。虽然这一方法有所成功，但其成本高，费时，且在药代动力学和毒性方面具有不确定性。此外，在肽受体上对具有激动剂活性的有机小分子进行鉴定也格外地具有挑战性。
迄今为止，尽管“PEG化”蛋白的使用已经日臻成熟，但其还是仅局限于注射用途。本发明提供了可口服的多肽轭合物，例如人脑型促尿钠排泄肽(hBNP)。特别地，本发明提供了包括如下组成的轭合物：在充血性心力衰竭的治疗制剂中，与治疗性肽和蛋白相连的PAG。这些制剂随后可发挥作用来保护hBNP免受蛋白水解酶的消化，并允许这一制剂作为有效的人促尿钠排泄肽受体A的激动剂。作为这种激动剂活性的结果，cGMP的产量会有所升高。
2001年8月，hBNP(天然肽)被FDA批准为治疗急性充血性心力衰竭的药物，商品名为Natrecor_(Nesiritide(奈西立肽))。Natrecor_是在12年中第一个被批准用于治疗CHF的药物。其是通过静脉连续灌注48小时以上进行给药的。由于该药物昂贵并要求住院治疗，Natrecor_仅被用于大多数急性病例。与一些其他的治疗相比，尽管Natrecor_昂贵且使用不便，其还是通过减少患者在重症监护病房所度过的时间而较为便宜。
目前，约有5百万美国人患有CHF，并且每年还新加超过550,000个病例(美国心脏协会2001)。目前，用于治疗CHF的直接开销已超过200亿美元(美国心脏协会2001)。伴随着现已获得的能够在心脏病发生之前就对发生心力衰竭进行检测的诊断方法，亟需可用于门诊病人或基于家庭应用的用途广泛的药物。
5.发明概述
本发明广泛地包括了与其天然存在对应物相比具有一种或多种益处的若干天然存在的促尿钠排泄肽、蛋白、类似物的变体和修饰形式，以及这些促尿钠排泄肽的化学轭合物。例如，这些益处包括对蛋白酶降解的抗性的提高，在血流中持续时间的延长，和/或穿过细胞膜屏障的能力的改善。
如本发明某些实施方案所述的促尿钠排泄化合物轭合物包括如下的促尿钠排泄化合物，该促尿钠排泄化合物含有促尿钠排泄蛋白受体A结合基序(NPR-A)，至少一个修饰部分轭合位点，以及至少一个与所述修饰部分轭合位点结合的修饰部分。如本说明书所述，由于与所述促尿钠排泄化合物连接的修饰部分可作为所述轭合物的一部分，所以，与不含有修饰部分的天然促尿钠排泄化合物相比，所述促尿钠排泄化合物轭合物可具有被修饰的亲水性质。例如并不局限于此，正如在此将更详细说明的那样，所述修饰部分可采取任一尺寸(大小)、形状、取代和构象的寡聚物形式。
在一些情况下，与天然促尿钠排泄化合物的对应未轭合形式相比，所述促尿钠排泄化合物轭合物的特征在于其至少部分增加了对酶降解，例如蛋白水解的抗性。与对应的未轭合天然促尿钠排泄化合物相比，这些化合物轭合物的进一步特征在于其保留了生物学活性，例如cGMP刺激活性的治疗显著性百分比。所述保留的cGMP刺激活性通常为体内测定的促尿钠排泄肽未轭合形式的cGMP活性的至少30％，40％，50％，60％，70％，90％，95％，或者甚至高于99％或100％。与未修饰(未轭合)的促尿钠排泄化合物相比，具有修饰部分的本发明所述促尿钠排泄化合物轭合物的其他改进特征包括所述促尿钠化合物穿过GI道并且进入血流的能力的改善；所述促尿钠化合物亲水性、疏水性或双亲性的改善；所述促尿钠化合物在水性环境或有机溶剂中的溶解性的改善；所述促尿钠化合物穿过细胞膜的能力的改善；所述促尿钠化合物穿过血脑屏障的能力的改善；所述促尿钠化合物靶定某种受体、细胞、组织或器官的能力的改善；以及所述促尿钠化合物的药代动力学的分布的改善。在优选实施方案中，在pH为约2，时间少于约2小时的条件下，所述促尿钠化合物的生物学活性成分的降解要弱于未修饰(未轭合)的生物学活性促尿钠排泄化合物的降解。在存在有血浆、蛋白酶、肝脏匀浆、酸性条件和/或碱性条件的情况下，所述促尿钠排泄化合物的促尿钠排泄化合物成分作为所述促尿钠排泄化合物轭合物的成分，例如可比未轭合促尿钠排泄化合物更稳定。
本发明的促尿钠排泄肽轭合物可包括与所述天然肽相关的抗高血压效应，心血管效应，肾效应，和/或内分泌效应。在一些实施方案中，对所述促尿钠排泄肽的修饰将保护诸如hBNP的肽免于蛋白水解并协助其穿过消化道递送至系统循环中，从而导致尿钠增多，利尿，和/或血管舒张。本发明的促尿钠排泄肽轭合物可因此被作为口服制剂(而不是在医院环境中持续数天的静脉灌注)有效地进行递送。可以预期，通过进行此前尚无可能的自我给药，这一优点可降低与其他CHF治疗相关的医院费用，并且将促尿钠排泄肽，尤其是hBNP的治疗用途扩展至包括早期(例如1类)和慢性CHF以及急性CHF。本发明的一个优选实施方案是非免疫原性肽轭合物，其对分解酶具有增强的抗性，同时适于口服递送且能够穿过肠上皮。
本发明还提供了若干制备所述促尿钠排泄化合物轭合物的方法。这些修饰部分，例如，可采用线性和分支PAG或其他聚合结构的形式。
6.定义
除非另有说明，本说明书中所采用的所有技术和科学术语都与本发明所述领域技术人员的常规理解相一致。用于本发明说明书中的术语仅旨在对特定的实施方案进行描述而并非旨在对本发明进行限制。小标题的使用是为了方便读者亦非对本发明进行限制。和在本文中通过其商品名所涉及到的任一商品药的药品说明书一样，在此涉及的全部出版物、专利申请、专利和其他参考文献都被全文引用作为参考。
除非文中特别说明，单数形式的“a”，“an”和“the”也都包括了复数形式。
正如在本说明书和权利要求中所用到的，这些术语的意义如下：
除非特别说明，在本说明书中的“氨基酸”是指以L或D立体异构形式存在的任一天然存在、人工生产或合成的氨基酸。术语“残基”可以与术语“氨基酸”相互替换，并通常被指定在氨基酸的给定序列的特定位置上。
正如37C.F.R.§1.822(b)中所指定的那样，用于本说明书中的全部氨基酸缩写都为美国专利和商标局所接受。本发明的说明书中使用的是以下单字母氨基酸缩写。Xaa用于指代未知或未命名的氨基酸。在此提供的位于特定残基结构上的整数是该残基的位置编号。这一残基编号可用来与单字母氨基酸名称相连，如下所述，可对促尿钠排泄肽类似物，例如hBNP和ANP中发生取代的残基进行指定。
因此，例如，当合成了突变体hBNP，即野生型hBNP的3位残基上的赖氨酸(K)为精氨酸(R)所替代时，可使用“BNPK3R”或“hBNP(1-32)K3R”进行命名。如下所示，可以采用逗号将每个取代分隔开来的方式对多个取代的情况进行指名。
术语“hBNP(1-32)K3R，K14R，K27R”是指上述的hBNP序列具有在残基位置3的赖氨酸为精氨酸所取代(即，K3R)，残基位置14的赖氨酸为精氨酸所取代(即，K14R)和残基位置27的赖氨酸为精氨酸所取代(即，K27R)的三重hBNP突变体。其他的突变体也可按类似的方式进行定义。
术语“hBNP(1-32)K3R，K14R”是指在hBNP残基位置3和14的赖氨酸为精氨酸所取代的双重突变体。
A＝ala＝丙氨酸      L＝leu＝亮氨酸      nle＝正亮氨酸
R＝arg＝精氨酸      K＝lys＝赖氨酸      cha＝环己基丙氨酸
N＝asn＝天冬酰胺    M＝met＝甲硫氨酸    A*＝har＝高精氨酸
D＝asp＝天冬氨酸    F＝phe＝苯丙氨酸    orn＝鸟氨酸
C＝cys＝半胱氨酸    P＝pro＝脯氨酸      pen＝青霉胺
Q＝gln＝谷氨酰胺    S＝ser＝丝氨酸      phg＝苯基甘氨酸
E＝glu＝谷氨酸      T＝thr＝苏氨酸      mpa＝巯基丙酸
G＝gly＝甘氨酸      W＝trp＝色氨酸      a＝ala*＝D甘氨酸
H＝his＝组氨酸      Y＝tyr＝酪氨酸      C*＝高半胱氨酸
I＝ile＝异亮氨酸    V＝val＝缬氨酸
“两性分子的”是指具有能够溶解于水和脂类中的能力和/或具有亲水性和疏水性的特征，而术语“两性部分”和“两性化合物”则是指具有两性分子特征，和/或当与肽或非肽药物连接时，能够增加所得轭合物，例如，PEG-脂肪酸寡聚物，糖脂肪酸寡聚物双亲性的部分。
“生物学活性”是指具有治疗或药理活性的制剂，例如激动剂、部分激动剂或拮抗剂。
在本说明书中的“有效量”是指无毒性但足以提供所需要治疗效果的量。正如下文所指出的，，根据患者的年龄，患者的一般情况，拟进行治疗病症的严重程度，所给药的特殊生物学活性制剂等，所需要的确切量在患者与患者之间有所差异。在任一单个病例中，适当的“有效”量都可以由本领域所属技术人员参考相关文本和文献和/或采用常规的实验来进行确定。
“可水解的”是指可在生理条件下水解的分子键。
“亲水性的”是指溶解于水的能力，而术语“亲水性部分”或“亲水物”则是指具有亲水性，和/或当与其他化学实体连接时，能够增加所述化学实体亲水性的部分。实例包括但不限于糖和诸如聚乙二醇的聚烷撑部分。
“亲脂性的”是指对脂肪具有亲和性，例如能够在脂肪和脂肪组织中积累的化学物质，能够在脂类中溶解，和/或能够穿透生物膜，与生物膜相互作用和/或横贯生物膜的能力，而术语“亲脂性部分”或“亲脂物”则是指具有亲脂性，和/或当与其他化学实体连接时，能够增加所述化学实体亲脂性的部分。
“低级烷基”是指具有1，2，3，4，5或6个碳原子的取代或未取代的烷基部分。
“单分散的”是指这样的化合物混合物，该混合物中约100％的所述化合物都具有相同的分子量。
在本发明所述组合物中，“药用的”成分，例如盐，载体，赋形剂或稀释剂，是指能与所述组合物中其他成分配伍的成分，其能够在不消除所述生物学活性制剂的生物学活性条件下与本发明的所述促尿钠排泄化合物轭合物结合，并可适用于本说明书所提供的患者而不产生不适当的副作用(例如毒性、刺激，和过敏反应)。当所述药物组合物产生的风险高于其提供的益处时，副作用即为“不适当的”。药用成分的例子包括，但不限于，任意的标准药物载体，例如磷酸缓冲盐溶液，水，诸如油/水乳剂的乳剂，微乳剂和多种类型的湿润剂。
“聚烷撑二醇”或PAG是指线性或分支的聚烷撑二醇聚合物，例如聚乙二醇(PEG)，聚丙二醇(PPG)和聚丁二醇(PBG)，及其组合(例如，包括两种或更多种不同PAG亚单位，例如两种或更多种选自PEG，PPG，PPG和PBG亚单位的不同PAG亚单位的线性或分支的聚合物)，还包括了聚烷撑二醇的单烷基醚。在特定的实施方案中，所述聚烷撑二醇是聚乙二醇或“PEG”。术语“PEG亚单位”是指单个聚乙二醇单位，即，-(CH2CH2O)-。术语“PPG亚单位”是指单个聚丙二醇单位，即，-(CH2CH2CH2O)-。术语“PBG亚单位”是指单个聚丁二醇单位，即，-(CH2CH2CH2CH2O)-。PAG亚单位还可包括烷基侧链，例如甲基，乙基或丙基侧链。
“原药”是指经过化学衍生得到的生物学活性制剂，因此，当对患者给药后，所述原药可被代谢从而产生具有生物学活性的制剂。
在本说明书中的“治疗”或“进行治疗”是指能够给予患疾病或病症患者以益处的任意类型的治疗，包括改善患者的疾病(例如，在一种或多种症状方面)，延缓所述疾病的发展，预防或延缓所述疾病或病症的发生，增强正常的生理官能等。
7.附图说明
图1所示为BNP的作用方式和调节方式。
图2所示为寡聚物活化和遵循三层次轭合策略的轭合的代表性示意图。1类修饰部分是非水解性的，2类修饰部分是微PAG化的，而3类修饰部分是可完全水解性的。
图3所示为HAEC细胞的环GMP产生与hBNP或hBNP轭合物的浓度间的函数关系。(■＝天然的，▲＝BN-002，_＝BN-021，◆＝BN-022，●＝BN-024)
图4所示为BNP和BNP轭合物的胰蛋白酶消化。(-●-＝时间(分钟)比％BND1，·●·＝时间(分钟)比％BND2，_＝时间(分钟)比％BND2，_＝时间(分钟)比％BN034 D1，■＝时间(分钟)比％BN034 D2)
图5所示为大鼠口服给药之后不同时间的hBNP轭合物的血浆水平。(■＝BN-002，▲＝BN-021，◆＝BN-022，●＝BN-024)
图6a-d所示为1类、2类和3类轭合物的检测结构和结果的数据。
8.发明详述
如本发明某些实施方案所述的促尿钠排泄化合物轭合物包含有如下的促尿钠排泄化合物，该促尿钠排泄化合物包括促尿钠排泄蛋白受体A结合基序(NPR-A)，至少一个修饰部分轭合位点，以及至少一个与所述修饰部分轭合位点结合的修饰部分。如本说明书所述，由于与促尿钠排泄化合物连接的修饰部分可作为所述轭合物的一部分，所以，与不含有修饰部分的天然促尿钠排泄化合物相比，所述促尿钠排泄化合物轭合物可具有被修饰的亲水性性质。例如但并不局限于此，正如在此将更详细说明的那样，所述修饰部分可采取任一大小、形状、取代和构象的寡聚物形式。
8.1促尿钠排泄化合物
本发明的所述促尿钠排泄化合物轭合物含有如下的促尿钠排泄化合物，该促尿钠排泄化合物包括有促尿钠排泄肽受体，例如NPR-A的结合位点，以及与修饰部分结合的轭合位点。
8.1.1天然促尿钠排泄肽
促尿钠排泄化合物可含有来自不同种属，例如人类、犬类和大鼠天然促尿钠排泄肽，例如ANP，BNP，CNP或DNP，尿扩张素的氨基酸序列。优选的天然促尿钠排泄肽是人BNP，大鼠BNP，犬BNP或hANP。天然序列还可包括原-促尿钠排泄肽和前-原肽。
8.1.2促尿钠排泄化合物类似物
促尿钠排泄化合物还可以是天然促尿钠排泄肽(促尿钠排泄类似物)的生物学活性类似物。例如，生物学活性类似物可以是具有截短、缺失、插入、取代、替换、侧链延伸和融合蛋白的天然促尿钠排泄化合物，或者是不会消除该原始化合物生物学活性的前述化合物的组合。优选地，所述类似物包括天然或人工NPR-A结合基序，并且保留了一些或全部的NPR-A结合活性。
可采用多种方式获得促尿钠排泄肽类似物。例如，可以在不消除相互结合能力的条件下，用某些氨基酸取代天然促尿钠排泄肽结构中的另一些氨基酸。在一些情况中，正如在本领域中所描述的那样，与清除受体NPC-C相比，这样的修饰可导致对NPR-A的亲和力的升高，从而获得延长的半衰期。
优选地，所述类似物可包括促尿钠排泄分子结合基序，例如NPR-A结合基序。
所述促尿钠排泄肽可以，例如，具有以下序列：
CFGRXMDRISSSSGLGC(SEQ ID NO 1)，
其中X是包括有修饰部分轭合位点的化合物，例如，氨基酸残基。在一些实施方案中，X含有与修饰部分连接的氨基酸。例如，X可含有与修饰部分连接的Lys或Cys。在其他实施方案中，X还可以是除赖氨酸之外的氨基酸；在这些实施方案中，本发明的另一方面是未轭合的肽，其中X是精氨酸，或者可以建立轭合位点的除赖氨酸之外的其他氨基酸。
这些实施方案的其他结构是：
CFGRX1MDRIX2GLGC(SEQ ID NO.2)，
其中X1是赖氨酸，X2是一个至四个氨基酸。X2可以是S，SS，SSS，SSSS(SEQ ID NO.3)，K，KS，KSS或KSSS(SEQ ID NO.4)。其中K可包括于X2中或X2的部分序列中，作为修饰部分轭合位点。
所述促尿钠排泄化合物可以，例如，具有以下结构：
X1-CFGRX3MDRISSSSGLGC-X2(SEQ ID NO.5)，
其中，X1和X2中至少之一存在，X1是1到10个氨基酸的肽，其中X2是1，2，3，4，5或6个氨基酸的肽，且其中X3是除赖氨酸之外的氨基酸，例如精氨酸。例如，X1可包括hBNP的全部或从其N末端的1-10个氨基酸残基序列的C末端片段。在一个实施方案中，X1包括SPZ1MVQGSG-(SEQ ID NO：6)，SPZ1MVQG(SEQ ID NO.7)，SPZ1MVQ(SEQ ID NO.8)，SPZ1MV(SEQ ID NO.9)，SPZ1M(SEQ ID NO.10)，SPZ1，PZ1MVQGSG(SEQ ID NO.11)，Z1MVQGSG(SEQ ID NO.12)，其中Z1是赖氨酸或精氨酸。当Z1是赖氨酸时，可以提供修饰部分轭合位点。在另一个实施方案中，X2可包括hBNP的全部或从其C末端的1-6个氨基酸残基序列的N末端片段。在一个实施方案中，X2是序列Z2VLRRH(SEQ.ID.NO.13)，Z2VLRR(SEQ.ID.NO.14)，Z2VLR(SEQ.ID.NO.15)，Z2VL，K，R，RVLRR(SEQ.ID.NO.16)，RVLR(SEQ.ID.NO.17)，RVL，RV或R，其中Z2可以是赖氨酸或精氨酸。当Z2是赖氨酸时，可以提供修饰部分轭合位点。当Z1是赖氨酸时，Z2可以是除赖氨酸之外的氨基酸，而当Z2是赖氨酸时，Z1可以是除赖氨酸之外的氨基酸。或者，X1和X2可以是从任意促尿钠排泄肽获得的任意N末端或C末端氨基酸序列。在一些实施方案中，可以存在有N-末端和/或C末端序列，但却不能是hBNP的N末端和C末端序列或其任意片段。应该理解未轭合促尿钠排泄化合物也是本发明的一个方面。
在一个实施方案中，所述促尿钠排泄化合物类似物具有以下氨基酸序列：
X1MVQGSGC1FGRX2MDRISSSSGLGC2X3(SEQ ID NO.18)，
其中X1，X2和X3都独立选自Lys和除Lys之外的氨基酸，而且其中X1，X2和X3中至少有一个是Lys且X1，X2和X3中至少有一个是除Lys之外的氨基酸；且
C1和C2是半胱氨酸并可通过二硫键结合。应该理解未轭合的肽类似物也是本发明的一个方面。
在一个实施方案中，X1，X2和X3中至少有一个是Arg。在其他实施方案中，X1是Lys，X2是Arg且X3是Arg。这一实施方案还可包括如本说明书所述的氨基酸序列，至X1的N末端和/或至X3的C末端。例如，所述N末端序列，当存在时，可以是S-或SP-，而所述C末端，当存在时，可以是-VLRRH(SEQ ID NO.19)，-VLRR(SEQ ID NO.19)，-VLR，-VL或-V。在一些实施方案中，存在有N-末端和/或C末端序列，但却不能是hBNP或其片段的N末端和C末端。
在其他实施方案中，所述促尿钠排泄肽类似物包括以下氨基酸序列：
CFGRX1MDRISSSSGLGCX2(SEQ ID NO 20)，
其中，X1和X2中至少有一个是氨基酸，该氨基酸包括与所述修饰部分结合的修饰部分轭合位点，而另一个则是任意其他氨基酸或未轭合的Lys。在一个实施方案中，X1是在其侧链与所述修饰部分结合的Lys，而X2是其他氨基酸，例如Gly或Arg。或者，X2是在其侧链与所述修饰部分结合的Lys，而X1是其他氨基酸，例如Gly，Arg或除赖氨酸之外的氨基酸。在其他实施方案中，X1是在其侧链与所述修饰部分结合的Lys，而X2是未轭合的Lys。或者，X2是在其侧链与所述修饰部分结合的Lys，而X1是未轭合的Lys。应该理解所述未轭合的肽也是本发明的一个方面。
实际上，可以根据本发明对任意促尿钠排泄肽进行修饰。例如，作为适合于进行修饰的候选物的肽/蛋白描述在PCTUS0217567中，在此具体引入用作参考。BNP，例如，包括有天然序列中的Lys残基，其可优选作为寡聚物的轭合位点。在BNP为天然肽的本发明某些实施方案中，所希望的是从所述肽的结合区域去除任意的轭合位点或去除结合位点。当希望寡聚物不与所述肽序列的特定Lys残基连接时，可使用其他氨基酸，例如精氨酸来取代所述Lys。例如，在这一区域与非水解性寡聚物的轭合的活性是至关重要的，尽管本申请人惊奇地发现在Lys14位置上的轭合导致所保留的活性量很明显。因此，希望采用具有类似化学性质但却不易轭合的氨基酸来替换这样的轭合位置。例如，在hBNP序列中，可采用Arg来取代Lys14，由此使得所述肽在该肽序列的Lys3上更容易与天然BNP轭合。可以选择氨基酸取代方法使用不容易轭合的氨基酸来替换Lys。
在一些情况下，所需要的是添加适于轭合的其他位置。例如，在一些实施方案中，可采用Lys残基替代荷正电的氨基酸残基，例如，在ANP肽(天然序列)中，可采用Lys替代Arg27。
可以选择通过突变来增加轭合位置，从而使得突变和轭合都不会削减所得的肽轭合物的活性，尤其是其对NPR-A的亲和性。在一个实施方案中，所述促尿钠排泄化合物被定义为这样的天然hBNP氨基酸序列，其中具有一个或多个插入在所述hBNP序列之内和/或加入到所述hBNP序列末端的Lys残基，和/或缺失或被保守取代所替换的一个或多个天然Lys残基。优选地，这样的取代或插入是所述促尿钠排泄肽的一种或多种末端氨基酸序列。
在一些实施方案中，可以在所述N-末端或其附近对轭合位置进行插入、替换或添加，例如，在N-末端氨基酸序列内进行插入或替换，优选地在所述N-末端，或在所述N-末端开始的第1，2，3，4或5个氨基酸位置上，或者在形成构成环的部分Cys桥的N-末端的Cys开始，沿N-末端方向的第1，2，3，4，5，6，7，8或9个氨基酸位置上。在优选实施方案中，所述促尿钠排泄化合物被定义为这样的天然hBNP序列，该天然hBNP序列具有一个或多个选自Lys3→Arg，Lys14→Arg，Arg30→Lys和Lys27→Arg的突变，一个或多个突变并不会消除所述促尿钠排泄肽化合物的生物学活性。添加多于一个的修饰部分，例如寡聚物可以改善酶的稳定性和/或增强吸收。
许多所述促尿钠排泄肽类似物都包括天然促尿钠排泄肽的环状成分，例如hBNP的Cys10-Cys26，其中Cys10和Cys26通过二硫键结合由此形成了环。在一些情况下，所述环可包括与天然序列有区别的氨基酸取代、缺失和/或插入，只要这些取代、缺失和/或插入不会削减该天然序列的活性。这些改变的环序列的示例可参见Schoenfelda等人的″Mutations in B-type natriuretic peptide mediating receptor-A selectivity，″FEBS Letters 414(1997)263-267，在此将其全文引用作为参考，其描述了与促尿钠排泄肽受体C(NPR-C)相比对促尿钠排泄肽受体A(NPR-A)优选结合的BNP变体(美国专利第6,525,022号和第6,028,055号)。又如，所述促尿钠排泄环可包括这样的天然环，该天然环具有不会削减该环促尿钠排泄活性的一个或多个保守性取代，例如，在一些情况中，所述环可具有天然环(例如，hBNP的天然环)的序列并具有1，2，3，4，5，6，7或8个保守性取代。在其他实施方案中，可以通过去除一组不影响生物学活性的氨基酸来缩短所述环。在一个实施方案中，所述肽类似物包括hBNP的Cys10-Cys26环，其中Lys14被Gly或Arg所取代。在其他实施方案中，所述环的SSSS(SEQ ID NO.3)成分被改变或缺失。
此外，所述促尿钠排泄肽环或天然环的类似物可包括N-末端和/或C-末端，例如天然促尿钠排泄肽的末端，例如，hBNP1-9和hBNP27-32。所述末端是不影响生物学活性的单个氨基酸或肽。在一些情况下，所述末端可以包括与天然序列有区别的氨基酸取代、缺失和/或插入，只要这些取代、缺失和/或插入不会削减该天然序列的活性即可。在一个实施方案中，所述末端都是基于天然序列，但却缩短了一个或多个氨基酸。例如，所述N-末端，当其存在时，可选自hBNP片段8-9，7-9，6-9，5-9，4-9，3-9，2-9和1-9；且任意前述片段中的一个或多个Lys残基都被Gly或Arg残基所取代。类似的，所述C-末端，当其存在时，可选自hBNP片段27-28，27-29，27-30，27-31和27-32；且任意前述hBNP片段，其中的一个或多个Lys残基已被Gly或Arg残基所取代。优选的环加末端促尿钠排泄肽包括hBNP片段1-29；hBNP片段1-26；和任意的前述hBNP片段，其中的一个或多个Lys残基被Gly或Arg残基所取代。
除了前述的类似物，适于本发明使用的多种类似物已描述在现有技术中。例如，申请日为1992年5月19日的美国专利第5,114,923号，其在此被全文引用作为参考，描述了通式为R1-Cys-Phe-Gly-Arg-Lys-Met-Asp-Arg-Ile-Ser-Ser-Ser-Ser-Gly-Leu-Gly-Cys-R2(SEQ ID NO.21)具有促尿钠排泄活性的肽，其中，R1选自(H)；GIy-；Ser-Gly-；Gly-Ser-Gly-；Gln-Gly-Ser-Gly-(SEQ ID NO.22)；Val-Gln-Gly-Ser-Gly-(SEQ ID NO.23)；Met-Val-Gln-Gly-Ser-Gly-(SEQID NO.24)；Lys-Met-Val-Gln-Gly-Ser-Gly-(SEQ ID NO.25)；Pro-Lys-Met-Val-Gln-Gly-Ser-Gly(SEQ ID NO.26)；Ser-Pro-Lys-Met-Val-Gln-Gly-Ser-Gly-(SEQ ID NO.27)；和R3-Ser-Pro-Lys-Met-Val-Gln-Gly-Ser-Gly-(SEQ ID NO.28)，其中R3是人类蛋白1-99位的102个氨基酸序列或其C-末端部分，而R2是(OH)，NH2，NHR′或其中的修饰部分′和修饰部分″独立为低级烷基(1-4C)或R2是Lys；Lys-Val；Lys-Val-Leu；Lys-Val-Leu-Arg(SEQ ID NO.29)；Lys-Val-Leu-Arg-Arg(SEQ ID NO.30)；Lys-Val-Leu-Arg-Arg-His(SEQID NO.31)；或其酰胺(NH2，NHR′或NR′修饰部分″)。
申请日为1990年2月2日的美国专利第4,904,763号，其全文在此被引用作为参考，也描述了适用于本发明的促尿钠排泄肽类似物，例如X-Cys Phe Gly Arg Lys Met Asp Arg Ile Ser Ser Ser Ser Gly Leu GlyCys Lys VaI Leu Arg Arg His-OH(SEQ ID NO.32)，其中X是H，H-Gly-Ser-Gly-，或H-Ser-Pro-Lys-Met-Val-Gln-Gly-Ser-Gly(SEQ ID NO.33)。
申请日为1990年2月27日的美国专利第4,904,763号(其全文在此被引用作为参考)描述了适用于本发明的其他三促尿钠排泄肽类似物，包括X-Cys-Phe-Gly-Arg-Arg-Leu-Asp-Arg-Ile-Gly-Ser-Leu-Ser-Gly-Leu-Gly-Cys-Y(SEQ ID NO.34)(其中2个半胱氨酸通过二硫键成桥)，其中X为H或H-Asp-Ser-Gly，且Y为-Asn-Val-Leu-Arg-Arg-Tyr-OH(SEQ ID NO.35)，-Asn-Val-Leu-Arg-Arg-OH(SEQ ID NO.36)，-Asn-Val-Leu-Arg-Tyr-OH(SEQ ID NO.37)，-Asn-Val-Leu-Arg-OH(SEQID NO.38)，-Asn-Val-Leu-OH(SEQ ID NO.39)或Asn-Ser-Phe-Arg-Tyr-OH(SEQ ID NO.40)，或其盐。其他适用于PCT公开WO8912069号的类似物组合于1989年12月14日公开。
在公开于2003年6月12日的美国专利公开第20030109430号中描述了适用于本发明的其他促尿钠排泄肽类似物组合，在此将其全文引用作为参考。该公开内容描述了具有促尿钠排泄活性通式为R1-Cys-Phe-Gly-Arg-Arg/Lys-Leu/Met-Asp-Arg-Ile-Lys-Met-Gly/Ser-Ser-Leu/Ser-Ser-Gly-Leu-Gly-Cys-R2(SEQ ID NO.41)的肽，其中R1选自(H)；Gly-；Ser-Gly-；Asp/Lys/Gly-Ser-Gly-；Arg/His/Gln-Asp/Lys/Gly-Ser-Gly-(SEQ ID NO.42)；Met/Val-Arg/His/Gln-Asp/Lys/Gly-Ser-Gly-(SEQID NO.43)；Thr/Met-Met/Val-Arg/His/Gln-Asp/Lys/Gly-Ser-Gly-(SEQ IDNO.44)；Lys-Thr/Met-Met/Val-Arg/His/Gln-Asp/Lys/Gly-Ser-Gly-(SEQID NO.45)；Pro-Lys-Thr/Met-Met/Val-Arg/His/Gln-Asp/Lys/Gly-Ser-Gly-(SEQ ID NO.46)；Ser-Pro-Lys-Thr/Met-Met/Val-Arg/His/Gln-Asp/Lys/Gly-Ser-Gly-(SEQ ID NO.47)；或猪、犬或人BNP天然上游序列的10-109氨基酸序列，或其组合物；R2是(OH)，NH2，或NR′R″，其中R′和R″独立为低级烷基(在此情况中，1-4C)或者是Asn/Lys；Asn/Lys-Val；Asn/Lys-Val-Leu；Asn/Lys-Val-Leu-Arg(SEQ ID NO.48)；Asn/Lys-Val-Leu-Arg-Arg/Lys(SEQ ID NO.49)；Asn/Lys-Val-Leu-Arg-Arg/Lys-Tyr/His(SEQ ID NO.50)；或其酰胺(NH2或NR′R″)，条件为如果通式是R1-Cys-Phe-Gly-Arg-Arg-Leu-Asp-Arg-Ile-Gly-Ser-Leu-Ser-Gly-Leu-Gly-Cys-R2(SEQ ID NO.51)，且R1为Asp-Ser-Gly-，那么R2就不能是Asn-Val-Leu-Arg-Arg-Tyr(SEQ ID NO.52)。
其他的类似物组合公开于申请日为1997年11月26号，Scios的欧洲专利EP0542863B1中，其描述了含有从N末端到C末端的融合蛋白：作为Staph V8剪接位点、不含有Glu残基或Asp-Gly序列的约10-约50kDa的载体蛋白；在所述载体的C末端位置具有Glu残基或Asp-Gly序列的Staph V8剪接；和；融合于所述剪接位点不含有StaphV8剪接位点的肽；其中所述融合蛋白的pI为约8.0或更高。该专利还描述了6-20个氨基酸的N末端引导序列的用途。
适用于本发明的其他促尿钠排泄肽类似物描述在2002年7月4日公开的Daiichi的美国专利公开第20020086843号中(在此将其全文引用作为参考)，其中描述了具有生理学活性的多肽X-Cys-Phe-Gly-Arg-Lys-Met-Asp-Arg-Ile-Ser-Ser-Ser-Ser-Gly-Leu-Gly-Cys-Lys-Val-Leu-Arg-Arg-His-OH(SEQ ID NO.53)[其中2个半胱氨酸成桥]，其中X是H，H-Gly-Ser-Gly-，或H-Ser-Pro-Lys-Met-Val-Gln-Gly-Ser-Gly-(SEQ ID NO.54)。
在进行这样的置换时，可以考虑氨基酸的亲水指数。氨基酸亲水指数对多肽发挥交互生物学功能中的重要性在本领域中是公知的。普遍接受的是认为氨基酸的相对亲水性对所得多肽的二级结构具有影响，其反过来决定了所述蛋白与其他分子的相互作用。在疏水性和荷电特征的基础上，每一种氨基酸都具有其亲水指数：异亮氨酸(+4.5)；缬氨酸(+4.2)；亮氨酸(+3.8)；苯丙氨酸(+2.8)；半胱氨酸/胱氨酸(+2.5)；甲硫氨酸(+1.9)；丙氨酸(+1.8)；甘氨酸(-0.4)；苏氨酸(-0.7)；丝氨酸(-0.8)；色氨酸(-0.9)；酪氨酸(-1.3)；脯氨酸(-1.6)；组氨酸(-3.2)；谷氨酸(-3.5)；谷氨酰胺(-3.5)；天冬氨酸(-3.5)；天冬酰胺(-3.5)；赖氨酸(-3.9)；和精氨酸(-4.5)。正如本领域所属技术人员所公知地，可以使用具有类似亲水指数或记分的其他氨基酸对某些氨基酸进行替换，并且依然能够得到具有类似生物学活性的肽，即依然获得了生物功能等价的肽。在进行这些改变时，其亲水指数在±2之间的氨基酸置换是优选的，那些亲水指数在±1之间的氨基酸置换是更优选的，而那些亲水指数在±0.5之间的氨基酸置换是最优选的。
可以在亲水性的基础上采用类似的氨基酸进行有效置换在本领域中也是公知的。美国专利第4,554,101号，在此将其全文引用作为参考，认为蛋白质的最大局部平均亲水性，是由其邻近氨基酸的亲水性所控制的，其与所述蛋白质的生物学性质有关。在美国专利第4,554,101号中，对以下氨基酸残基进行了亲水性值的指定：精氨酸(+3.0)；赖氨酸(±3.0)；天冬氨酸(±3.0±1)；谷氨酸(±3.0±1)；丝氨酸(+0.3)；天冬酰胺(+0.2)；谷氨酰胺(+0.2)；甘氨酸(0)；苏氨酸(-0.4)；脯氨酸(-0.5±1)；丙氨酸(-0.5)；组氨酸(-0.5)；半胱氨酸(-1.0)；甲硫氨酸(-1.3)；缬氨酸(-1.5)；亮氨酸(-1.8)；异亮氨酸(-1.8)；酪氨酸(-2.3)；苯丙胺酸(-2.5)；色氨酸(-3.4)。本领域所属技术人员应该理解，可采用具有类似亲水性值的其他氨基酸进行氨基酸置换，并且依然能够获得生物学等价的，尤其是免疫学等价的多肽。在这些改变中，其亲水性值在±2之间的氨基酸置换是优选的，那些亲水性值在±1之间的氨基酸置换是特别优选的，而那些亲水性值在±0.5之间的氨基酸置换是更特别优选的。
如上所述，可根据氨基酸侧链取代基的相对类似情况，例如其疏水性、亲水性、电荷、尺寸等进行氨基酸置换/插入。将各种前述特征纳入考虑进行的示例性置换(即，在不显著改变所述多肽生物学活性条件下对氨基酸进行交换)是本领域所属技术人员公知的，且包括，例如Arg和Lys；谷氨酸和天冬氨酸；丝氨酸和苏氨酸；谷氨酰胺和天冬酰胺；以及缬氨酸，亮氨酸和异亮氨酸。
本领域所属技术人员应该理解，可采用多种已知的肽合成技术制备促尿钠排泄肽(例如，BNP)类似物，这些技术包括，但不限于，经典(溶液)方法，固相方法，半合成方法，和重组DNA方法。
8.1.3多-BNP肽
所述促尿钠排泄化合物还可以是在序列中具有两个或更多促尿钠排泄化合物单位的多肽，并可任选包括介于所述促尿钠排泄化合物单位之间的间隔序列。所述化合物还可在促尿钠排泄肽化合物的任意一端或两端任选包含引导和/或延伸序列。例如，并非旨在对其进行限制，同时未对每种多肽的结构和/或通式进行限制，其可具有以下结构：
NP-[NP]n；
NP-[间隔物-NP]n；
引导物-NP-[NP]n；
引导序列-NP-[间隔物-NP]n；
引导物-[间隔物-NP]n；
引导物-[间隔物-NP]n-延长物；
引导物-NP-[间隔物-NP]n-延长物；
其中，
n可以是，例如，1，2，3，4，5，6，7，8，9或10；
NP是促尿钠排泄肽或促尿钠排泄肽类似物；
间隔物可以是被酶或酶混合物剪切的氨基酸残基或一系列氨基酸残基，优选为不存在于NP中的氨基酸残基或氨基酸序列(例如，Glu-Asp-Ala-Gly-Glu(SEQ ID NO.55)；Arg-Thr-Arg-Arg(SEQ ID NO.56)；Arg-X-Lys-Arg(SEQ ID NO.57)；Arg-Val；Asp-Lys；Lys-Ile；Arg-Thr；Arg-Ile)；
引导物可以是，例如，单个氨基酸，氨基酸序列，肽(例如，引导肽或信号肽)，或蛋白；且引导物被选定阻止N末端进行轭合，从而协助所述多肽(例如，可使用酶混合物：V8蛋白酶(内蛋白酶Glu-C)剪切的(His)6-Ala-Asp-Gly-Glu-(SEQ ID NO.58)，(His)6-Ala-Asp-Arg-Thr-Arg-Arg-(SEQ ID NO.59)或(His)6-Ala-Asp-Arg-X-Lys-Arg(SEQ ID NO.60)，其中X可以是任一氨基酸或可由弗林蛋白酶剪切的(His)6-Ala-Asp-Arg-Glu-Arg-Arg(SEQ ID NO.61)；可由尿激酶剪切的(His)6-Ala-Asp-Arg-Val-(SEQ ID NO.62)；可由肠激酶剪切的(His)6-Ala-Asp-Lys(SEQ ID NO.63)或(His)6-Ala-Asp-Lys-Ile(SEQ IDNO.64)；可由凝血因子Xa或凝血因子10a剪切的(His)6-Ala-Asp-Arg-Thr(SEQ ID NO.65)或(His)6-Ala-Asp-Arg-Ile-)(SEQ ID NO.66)的纯化，改进溶解度和/或协助细胞分泌(例如，Ala-Asp-Gly-Glu(SEQ ID NO.67))，和/或纯化(例如，(His)6-Ala-Asp-Gly-Glu(SEQ ID NO.68))；与此同时，优选地采用不剪切NP的酶进行酶学剪切或化学剪切从所述所述多肽剪切引导物；所述引导物可以是来自于天然NP的引导肽。
延伸物可以是，例如，单个氨基酸，氨基酸序列，肽(例如，引导肽或信号肽)，或蛋白；且延伸物被选定阻止N末端进行轭合，从而协助所述多肽(例如，(His)6-Ala-Asp-Gly-Glu-)(SEQ ID NO.68)的纯化，改进溶解度，和/或协助细胞分泌(例如，可使用酶混合物：V8蛋白酶(内蛋白酶Glu-C)和内蛋白酶(Asp-N)剪切的Ala-Asp-Gly-Glu(SEQ ID NO.67)，Arg-Thr-Arg-Arg-(SEQ ID NO.56)或Arg-X-Lys-Arg(SEQ ID NO.57)，其中X可以是任一氨基酸或可由弗林蛋白酶剪切的Arg-Glu-Arg-Arg(SEQ ID NO.69)；可由尿激酶和羧肽酶B混合物剪切的Arg-Val-；Asp-Lys或可由肠激酶剪切的Lys-Ile；可由凝血因子Xa或凝血因子10a剪切的Arg-Thr或Arg-Ile-)；与此同时，优选地采用不剪切NP的酶进行酶学剪切或化学剪切从所述多肽优选地剪切所述延伸物。
可优选地选择诸如那些包括在间隔物之内的酶剪切位点，或将引导物和/或延伸物与NP分开的酶剪切位点，从而使得单种酶或酶混合物就能够剪切全部的剪切位点。例如，所述剪切位点可以是为弗林蛋白酶所剪切的Arg-Thr-Arg-Arg(SEQ ID NO.56)。
在一个实施方案中，引导物是(His)6-Ala-Asp-Gly-Glu(SEQ ID NO.68)，延伸物是(His)6-Ala-Asp-Gly-Glu(SEQ ID NO.68)，间隔物是Glu-Ala-Asp-Gly-Glu(SEQ ID NO.70)。这一实施方案可被V8蛋白酶(内蛋白酶Glu-C)所剪切。所得产物是NP-Glu或NP-Glu轭合物。
在其他实施方案中，引导物是(His)6-Ala-Asp-Gly-(-Arg-Thr-Arg-Arg(SEQ ID NO.71)或Arg-X-Lys-Arg(SEQ ID NO.72))(其中X可以是任意氨基酸)，延伸物是(His)6-Ala-Asp-Gly-(-Arg-Thr-Arg-Arg(SEQID NO.71)或Arg-X-Lys-Arg(SEQ ID NO.72))(其中X可以是任意氨基酸)，而间隔物是Arg-Thr-Arg-Arg(SEQ ID NO.56)或Arg-X-Lys-Arg(SEQ ID NO.57)(其中X可以是任意氨基酸)。这一实施方案可被弗林蛋白酶所剪切。所得产物是NP或NP轭合物。
在其他实施方案中，引导物是(His)6-Ala-Asp-Gly-Arg-Val(SEQ IDNO.73)，延伸物是(His)6-Ala-Asp-Gly-Arg-Val(SEQ ID NO.73)，而间隔物是Arg-Val。这一实施方案可被尿激酶/羧肽酶B混合物所剪切。所得产物是NP或NP轭合物。
在其他实施方案中，引导物肽是(His)6-Ala-Asp-Gly-(-Asp-Lys(SEQID NO.74)或-Lys-Ile(SEQ ID NO.75))，延伸物是(His)6-Ala-Asp-Gly-(-Asp-Lys或-Lys-Ile)，而间隔物是Asp-Lys或Lys-Ile。这一实施方案可被肠激酶所剪切。所得产物是NP或NP轭合物。
在其他实施方案中，引导物是(His)6-Ala-Asp-Gly-(-Arg-Thr(SEQID NO.76)或-Arg-Ile(SEQ ID NO.77))，延伸物是(His)6-Ala-Asp-Gly-(-Arg-Thr(SEQ ID NO.76)或-Arg-Ile(SEQ ID NO.77))，而间隔物是Arg-Thr或Arg-Ile。这一实施方案可被凝血因子Xa或凝血因子10a/羧肽酶B混合物所剪切。所得产物是NP或NP轭合物。
在另一实施方案中，间隔物是Arg-Arg-Asp-Ala-Glu-Asp-Pro-Arg(SEQ ID NO.78)，引导物是Glu-Gly-Asp-Arg-Arg(SEQ ID NO.79)，延伸肽是(His)6-Glu-Gly-Asp-Arg-Arg(SEQ ID NO.80)。在这个实施方案中，可以在受控条件下使用胰蛋白酶和羧肽酶B来释放出NP或NP轭合物。
在另一实施方案中，间隔物是Arg-Arg-Asp-Ala-Glu-Asp-Arg-Arg(SEQ ID NO.81)，引导物是Glu-Gly-Asp-Arg-Arg(SEQ ID NO.82)，延伸物是(His)6-AAA-Glu-Gly-Asp-Arg-Arg(SEQ ID NO.83)，其中AAA是长度为3-40氨基酸残基的任意氨基酸序列，优选为3-15个残基。在这个实施方案中，可以在受控条件下使用胰蛋白酶和羧肽酶B来释放出NP或NP轭合物。
在其他实施方案中，间隔物是Arg-Gly-Asp-Ala-Glu-Asp-Pro-Arg(SEQ ID NO.84)，引导物是Glu-Gly-Asp-Pro-Arg(SEQ ID NO.85)，而延伸物是(His)6-Glu-Gly-Asp-Pro-Arg(SEQ ID NO.86)。在这个实施方案中，可以使用凝血酶(thrombine)和羧肽酶B的酶混合物来释放NP或NP轭合物。
在其他实施方案中，间隔物是Ala-Arg-Gly-Asp-Ala-Glu-Asp-Pro-Arg(SEQ ID NO.87)，引导物是Glu-Gly-Asp-Pro-Arg(SEQ ID NO.88)，而延伸物是(His)6-Glu-Gly-Asp-Pro-Arg(SEQ ID NO.89)。在这个实施方案中，可以使用凝血酶和羧肽酶A的酶混合物来释放NP或NP轭合物。
在其他实施方案中，间隔物是Met-Met，引导物是Met-Met，而延伸物是(His)6-AAA-Met-Met(SEQ ID NO.90)，其中AAA是长度为3-40氨基酸残基的任意氨基酸序列。在这个实施方案中，可以使用CNBr来释放NP或NP轭合物。
在其他实施方案中，间隔物是Asp-Asp-Ala-Gly-Glu(SEQ ID NO.91)，引导物是Ala-Asp-Gly-Glu(SEQ ID NO.92)，而延伸物是(His)6-Ala-Asp-Gly-Glu(SEQ ID NO.58)。在这个实施方案中，可以使用V8蛋白酶(内蛋白酶Glu-C)和内蛋白酶Asp-N的混合物来释放NP或NP轭合物。
在其他实施方案中，间隔物是Glu-Ala-Gly-Glu(SEQ ID NO.93)，引导物是Ala-Asp-Gly-Glu(SEQ ID NO.67)，而延伸肽是(His)6-Ala-Asp-Gly-Glu(SEQ ID NO.68)。在这个实施方案中，可以使用V8蛋白酶(内蛋白酶Glu-C)来释放NP或NP轭合物从而产生NP-Glu，其是一种新的NP类似物或NP-Glu的轭合物。
在其他实施方案中，间隔物是Glu-Glu，在C末端的引导物是Glu-Gly-Asp-Ala(SEQ ID NO.94)，而延伸物是Glu-Gly-Asp-Ala(His)6-Glu(SEQ ID NO.95)，其中所述C末端连接于融合部分，即适当的融合蛋白，其能够，例如被肠激酶所剪切。在这个实施方案中，可以使用V8蛋白酶(内蛋白酶Glu-C)来释放NP或NP轭合物从而产生NP-Glu，其是一种新的NP类似物或NP Glu的轭合物。
在其他实施方案中，间隔物是Glu-Glu，引导物是Ala-Asp-Gly-Glu(SEQ ID NO.67)，而延伸物是(His)6-Ala-Asp-Gly-Glu(SEQ ID NO.68)，其中所述N-末端连接于融合部分，即适当的融合蛋白，其能够，例如被肠激酶所剪切。在这个实施方案中，可以使用V8蛋白酶(内蛋白酶Glu-C)来释放NP或NP轭合物从而产生NP-Glu，其是一种新的NP类似物或NP Glu的轭合物。
在其他实施方案中，间隔物是Glu-Glu，引导物是Glu-Gly-Asp-Ala-Glu(SEQ ID NO.96)，而延伸物是Glu-Gly-Asp-Ala-Glu(SEQ ID NO.96)，所述C末端连接于融合部分，即适当的融合蛋白。在这个实施方案中，可以使用V8蛋白酶(内蛋白酶Glu-C)来释放NP或NP轭合物从而产生NP-Glu，其是一种新的NP类似物或NP Glu的轭合物。
在其他实施方案中，间隔物是Glu-Glu，引导物是Ala-Asp-Gly-Glu(SEQ ID NO.67)，而延伸物是Glu-(His)6-Ala-Asp-Gly-Glu(SEQ ID NO.97)，其中所述N末端连接于融合部分，即适当的融合蛋白。在这个实施方案中，可以使用V8蛋白酶(内蛋白酶Glu-C)来释放NP或NP轭合物从而产生NP-Glu，其是一种新的NP类似物或NP Glu的轭合物。
8.2修饰部分
修饰部分是修饰促尿钠排泄化合物的部分，例如BNP肽化合物，并提供了具有如本说明书所述的所希望性质的化合物。例如，所述修饰部分可以在多种环境(例如GI肠道，和/或血流)中降低促尿钠排泄化合物的分解速度，从而使得具有修饰形式的促尿钠排泄化合物要比缺乏所述修饰部分的促尿钠排泄化合物在这样的环境中降解的要少一些。优选的修饰部分是允许所述促尿钠排泄化合物进行轭合从而保留了治疗显著百分比的母体促尿钠排泄化合物的生物学活性的那些部分。
8.2.1影响稳定性、溶解性和/或生物学活性的部分
可有多种部分可连接于促尿钠排泄化合物从而形成本说明书中的促尿钠排泄化合物轭合物，其能够修饰母体促尿钠排泄化合物的稳定性，溶解性和/或生物学活性。示例包括亲水性聚合物或寡聚物，两性聚合物或寡聚物，和亲脂性聚合物或寡聚物。
所述聚合物(或短链寡聚物)可在其主链中包括较弱的或可降解的连接。例如，聚烷撑二醇可包括水解不稳定的连接，例如交酯，乙交酯，碳酸盐，酯，氨基甲酸盐等，其都对水解敏感。这使得所述聚合物可被剪切成低分子量的片段。这些聚合物的例子在，例如，Hubbell等人的美国专利第6,153,211中有所描述。
以下将更详细地描述代表性的亲水性、两性和亲脂性聚合物和寡聚物。
8.2.2亲水性部分
正如本领域所属技术人员所理解的那样，所述亲水性部分可以是多种亲水性部分，包括，但不限于，聚烷撑二醇部分，其他亲水性聚合物，糖部分，聚山梨醇酯部分，及其组合。
8.2.2.1聚烷撑二醇部分
聚烷撑二醇是具有重复烷撑二醇单位的化合物。在一些实施方案中，所述单位是一致的(例如，聚乙二醇或聚丙二醇)。在其他实施方案中，所述烷撑单位是不同的(例如，聚乙二醇聚丙二醇共聚物，或PLURONICS_)。所述聚合物可以是无规共聚合物(例如，当环氧乙烷和环氧丙烷共聚合时)或分支或接枝共聚合物。
聚乙二醇，或PEG，是优选的聚烷撑二醇，且可适用于生物学应用，因为其具有良好的预期性质并被FDA认为是公认安全的(GRAS)。PEG的通式为-(CH2CH2O)n-，其中n可从约2至约4000或更多。PEG通常是无色，无味，水溶性或水混溶的(取决于其分子量)，热稳定，化学惰性，水解稳定且通常是无毒的。PEG同样是生物适合的，并且在体内通常不会产生免疫反应。本发明的优选PEG部分包括多种PEG亚单位，这些PEG亚单位选自以下递增优选次序的范围：2-50，2-40，2-30，2-25，2-20，2-15，2-10。在某些实施方案中，所述修饰部分可包括2，3，4，5，6，7，8，9或10个亚单位。
PEG可以是单分散的(例如，如之前本申请人所述的申请日均为2001年6月4日的美国专利申请第09/873,731号和第09/873,797号，在此将其全文引用作为参考)或多分散的，正如在市场上普遍供应的。采用单分散的，意味着所述聚烷撑二醇可以具有单一的分子量，或相对较窄范围的分子量。使用所述相对低分子量单分散聚合物的一个优势在于其较容易对轭合分子进行限定，从而可以协助重复性合成和FDA的审批。
所述PEG可以是在每个末端都具有羟基的线性聚合物(在与剩余的促尿钠排泄化合物轭合之前)。所述PEG还可以是烷氧基PEG，例如甲氧基-PEG(或mPEG)，其中一个末端是相对惰性的烷氧基基团，而另一个末端则是羟基基团(该基团与所述促尿钠排泄化合物结合)。所述PEG可以是分支的，其在一个实施方案中可以R(-PEG-OH)m表示，其中R代表中部(通常是多羟基)核心制剂，例如季戊四醇或甘油，且m代表分支的数量。每个分支都可以不同，并都可以用，例如，醚和/或酯终止。分支数m可以从3直至100或更高，而可有一个或多个所述末端羟基结合于剩余的所述促尿钠排泄化合物，或者进行化学修饰。其他的分支PEG包括通式为(CH3O-PEG-)PR-Z的PEG，其中p等于2或3，R代表中心核，例如Lys或甘油，而Z则代表能够进行迅速化学活化的基团，例如羧基。其他的分支形式，含侧基的PEG，也具有反应基团，例如羧基，其是沿着PEG主链，而不是，或除此之外的，所述PEG链的末端。叉状的PEG可由通式PEG(-LCHX2)n代表，其是另一种形式的分支PEG，其中L是连接基团而X是活化的末端基团。术语聚乙二醇或PEG代表或包括了所有形式的线性或分支的PEG，而聚烷撑二醇或PEG则包括了全部形式的线性或分支的PEG。
8.2.2.2糖部分
正如本领域所属技术人员所公知的那样，本说明书中的所述促尿钠排泄化合物可包括糖部分。一般地，所述糖部分是至少一种蔗糖基团的碳水化合物产物。代表性的糖部分包括，但不限于，甘油部分，单糖，双糖，三糖和寡糖，以及多糖，例如淀粉，糖原，纤维素和多糖胶。特异性的单糖包括C6和更多碳原子(优选为C6-C8)的糖，例如葡萄糖，果糖，甘露糖，半乳糖，核糖和景天庚酮糖；二糖和三糖包括具有两个或三个单糖单位的部分(优选为C5-C8)，例如蔗糖，纤维二糖，麦芽糖，乳糖和棉子糖。含有糖部分的修饰部分的示例如下：
Figure A20058002522200381
使用糖部分进行轭合可参见美国专利第5,681,811号，第5,438,040号和第5,359,030号的描述，在此将其全文引用作为参考。
8.2.2.3聚山梨醇酯部分
正如本领域所属技术人员所公知的那样，本说明书中的所述聚山梨醇酯部分可以是多种聚山梨醇酯部分，包括，但不限于，山梨聚糖酯，和从聚氧乙烯延生得到的聚山梨醇酯。使用聚山梨醇酯部分进行轭合可参见美国专利第5,681,811号，第5,438,040号和第5,359,030号的描述，在此将其全文引用作为参考。
8.2.2.4生物适合的水溶性聚阳离子部分
在一些实施方案中，可以采用生物适合的水溶性聚阳离子聚合物。生物适合的水溶性聚阳离子聚合物包括，例如，可作为侧基进行连接的具有阳离子杂环的任意聚合物。“水溶性”是指整个聚合物在20-37℃的温度下可溶解于水性溶液，例如缓冲盐水或加入了少量有机溶剂作为助溶剂的缓冲盐水中。在一些实施方案中，所述聚合物本身并不能充分地溶解于水性溶液中，但却可通过水溶性聚合物，例如PEG链的接枝而溶解在溶液中。示例包括在聚合物主链或聚合物侧链上具有酰胺基团的聚酰胺，例如，聚-L-Lys和其他荷正电的天然或合成氨基酸或氨基酸混合物的聚氨基酸，包括聚(D-Lys)，聚(鸟氨酸)，聚(Arg)，和聚(组氨酸)，和非肽聚酰胺，例如聚(氨基苯乙烯)，聚(氨基丙烯酸酯)，聚(N-甲基氨基丙烯酸酯)，聚(N-乙基氨基丙烯酸酯)，聚(N，N-二甲基氨基丙烯酸酯)，聚(N，N-二乙基氨基丙烯酸酯)，聚(氨基甲基丙烯酸酯)，聚(N-甲基氨基甲基丙烯酸酯)，聚(N-乙基氨基甲基丙烯酸酯)，聚(N，N-二甲基氨基甲基丙烯酸酯)，聚(N，N-二乙基氨基甲基丙烯酸酯)，聚(乙撑亚胺)，季胺聚合物，例如聚(N，N，N-氯代三甲基氨基丙烯酸酯)，聚(氯代甲基丙烯酰氨基丙基三甲基铵)，和天然或合成的多糖，例如壳聚糖。
8.2.2.5其他亲水性部分
也可以使用其他的亲水性聚合物。示例包括聚(氧乙基化的聚醇)，例如聚(氧乙基化的甘油)，聚(氧乙基化的山梨醇)，和聚(氧乙基化的葡萄糖)；聚(乙烯醇)(″PVA″)；右旋糖苷；基于碳水化合物的聚合物等。所述聚合物可以是基于以上聚合物单体、直链或分支的均聚物或无规或嵌段共聚物和三元共聚物。
适合的其他聚合物特定示例包括，但不限于，聚(唑啉)，双官能聚(丙烯酰吗啉)(″PAcM″)，和聚(乙烯吡咯烷酮)(″PVP″)。PVP和聚(唑啉)是本领域公知的聚合物，且其制备对本领域所属技术人员而言也是显而易见的。PacM及其合成和用途在美国专利第5,629,384号和第5,631,322号中有所描述，在此将其全文引用作为参考。
8.2.3生物附着性聚阴离子部分
某些亲水性聚合物可具有特别有用的生物附着性质。这些聚合物的示例可在，例如，Mathiowitz等人的美国专利第6,197,346号中找到。那些含有羧基(例如，聚(丙烯酸))的聚合物表现出了生物附着性，并很容易与本说明书中的促尿钠排泄化合物进行轭合。在降解过程中将羧基基团暴露出来的快速生物侵蚀聚合物，例如丙交酯-乙交酯共聚物，聚酐，和聚正酯，都可以是生物附着聚合物。这些聚合物都可被用于将促尿钠排泄化合物递送至胃肠道。当所述聚合物降解时，其可将羧酸基团暴露出来从而使得该羧酸基团能够与胃肠道强烈结合，并且协助促尿钠排泄化合物轭合物的递送。
8.2.4亲脂性部分
在一些实施方案中，所述修饰部分包含亲脂性部分。正如本领域所属技术人员所理解的那样，所述亲脂性部分可以是多种亲脂性部分，包括，但不限于，烷基部分，烯基部分，炔基部分，芳基部分，芳基烷基部分，烷基芳基部分，脂肪酸部分，金刚烷基，和胆甾烯基，以及亲脂性聚合物和/或寡聚物。
所述烷基部分可以是饱和或不饱和的，直链，支链或环碳链。在一些实施方案中，所述烷基部分具有至少1，2，3或更多碳原子。在其他实施方案中，所述烷基部分是直链的，饱和或不饱和烷基部分，其具有1，2，3，4，5，6，7，8，9，10，11，12，13，14，15，16，17，18，19或20个碳原子。示例包括饱和的，直链烷基部分，例如甲基，乙基，丙基，丁基，戊基，己基，庚基，辛基，壬基，癸基，十一烷基，十二烷基，十三烷基，十四烷基，十五烷基，十六烷基，十八烷基，十九烷基和二十烷基；饱和的，支链烷基部分，例如异丙基，仲丁基，叔丁基，2-甲基丁基，叔戊基，2-甲基戊基，3-甲基戊基，2-乙基己基，2-丙基戊基；以及从上述饱和烷基部分衍生而来的不饱和烷基部分，包括，但不限于，乙烯基，烯丙基，1-丁烯基，2-丁烯基，乙炔基，1-丙炔基，和2-丙炔基。在其他实施方案中，所述烷基部分是低级烷基部分。在其他实施方案中，所述烷基部分是C1-C3的低级烷基部分。在一些实施方案中，所述修饰部分特异性地不由烷基部分组成，或特异性地不由低级烷基部分组成，或特异性地不由烷部分组成，或特异性地不由低级烷部分组成。
所述烷基基团既可以是未取代的，也可以被一个或多个取代基所取代，且这些取代基优选地既不会干扰所述轭合物的合成方法，也不会去除所述轭合物的生物学活性。可使用保护基团适当地封闭潜在的干扰官能团从而使得所述官能团不具有干扰性。每个取代基都可任意地为其他非干扰性取代基所取代。术语“非干扰的”是指所述取代基不会不利地地影响如本发明所述方法所进行的任意反应。
所述脂肪酸部分可以是多种脂肪酸部分，包括天然或合成，饱和或不饱和，直链或支链的脂肪酸部分。在一些实施方案中，所述脂肪酸部分具有至少2，3，4或更多个碳原子。在其他实施方案中，所述脂肪酸部分具有2，3，4，5，6，7，8，9，10，11，12，13，14，15，16，17，18，19，20，21，22，23或24个碳原子。
当所述修饰部分是芳环时，可采用定位的亲核官能团(例如OH，SH，或NHR′)对所述环进行官能化，从而使得其可以分子内方式与氨基甲酸盐部分反应并且协助其水解。在一些实施方案中，可采用能被水解或在体内能降解的保护基团对所述亲核基团进行保护，其结果是，当所述保护基团脱保护时，所述轭合物水解，并可协助母体促尿钠排泄化合物的释放。
8.2.5两性分子的部分
在一些实施方案中，所述修饰部分包括两性分子的部分。许多聚合物和寡聚物都具有两性分子的性质。这些分子通常是含有亲水部分和亲脂部分的嵌段共聚物，支共聚物或接枝共聚物，可以是寡聚物和/或聚合物的形式，例如直链，支链或接枝聚合物或共聚物。
所述亲水性聚合物或寡聚物可包括在此所述任意亲脂性和亲水性部分的组合。这些聚合物或寡聚物通常包括至少一个反应性官能团，例如，卤素，羟基，酰胺，巯基，磺酸，羧酸，异氰酸盐，环氧化物，酯等，其通常位于所述聚合物的末端。这些反应性官能团可用于连接亲脂性直链或支链烷基，烯基，炔基，芳基烷基，或烷基芳基基团，或亲脂性的聚合物或寡聚物，从而增加所述亲水性聚合物或寡聚物的亲脂性(并由此使其具有一般性的两性分子性质)。
亲脂性基团可以，例如，从单-或二羧酸衍生得到，或者，当适合时，从羧酸的反应等价物，例如酐或酰基氯衍生得到。适用于亲脂基团的适当前体示例有乙酸，丙酸，丁酸，戊酸，异丁酸，三甲基乙酸，己酸，辛酸，庚酸，癸酸，壬酸，月桂酸，肉豆蔻酸，棕榈酸，硬脂酸，辣木子油酸，木蜡酸，ceratic酸，montanoic酸，异硬脂酸，异壬酸，2-乙基己酸，油酸，蓖麻油酸，亚油酸，亚麻酸，芥子酸，大豆脂肪酸，亚麻籽脂肪酸，脱水蓖麻脂肪酸，塔罗油脂肪酸，桐油脂肪酸，向日葵脂肪酸，红花脂肪酸，丙烯酸，甲基丙烯酸，马来酸酐，正邻苯二甲酸酐，对苯二酸，异酞酸，己二酸，壬二酸，癸二酸，四氢邻苯二甲酸酐，六氢邻苯二甲酸酐，琥珀酸和聚烯烃羧酸。
末端亲脂性基团不需要相同，即所得的共聚物可包括相同或不同的末端亲脂性基团。所述亲脂性基团可从不止一种上述的单-或双官能烷基，烯基，炔基，环烷基，芳基烷基或烷基芳基基团衍生得到。
8.2.5.1 PEG/烷基修饰部分
所述修饰部分可以是直链或支链的聚合部分，其含有一个或多个直链或支链的聚烷撑二醇部分和/或一个或多个直链或支链的取代或未取代的烷基部分。然而，在某些实施方案中，所述修饰部分特异性地不由烷基部分组成，而在其他实施方案中，所述修饰部分特异性地不由烷部分组成。在一些实施方案中，所述聚烷撑二醇部分包括1，2，3，4，5，6，7，8，9，10，11，12，13，14，15，16，17，18，19，20，21，22，23，24或25个PAG亚单位，优选为PEG或PPG亚单位或其组合。所述烷基部分是饱和或不饱和的，并优选具有1，2，3，4，5，6，7，8，9，10，11，12，13，14，15，16，17，18，19或20个碳原子。所述烷基部分优选为烷部分。
所述修饰部分可以，例如，具有如下通式：
Figure A20058002522200431
(通式I)
其中每个C都是独立选择的并且是含有m个碳的烷基部分，且m是1，2，3，4，5，6，7，8，9，10，11，12，13，14，15，16，17，18，19或20；且每个PAG都是独立选择的并且是含有n个亚单位的聚烷撑二醇部分，且n是1，2，3，4，5，6，7，8，9，10，11，12，13，14，15，16，17，18，19，20，21，22，23，24或25；每个X都是独立选择的并且是将PAG结合于C的连接部分，且优选地为-C-，-O-，-C(O)-，-C(O)O-，-OC(O)-，-NH-，-NHC(O)-或-C(O)NH-。在一些实施方案中，缺乏Cm-X部分，且所述PAGn部分用加帽基团，例如-OH部分或-OCH3部分所终止。例如，所述PAG可以是含有1，2，3，4，5，6，7，8，9，10，11，12，13，14，15，16，17，18，19或20个PEG亚单位的甲氧基终止或羟基终止的PEG。
在一个优选实施方案中，所述修饰部分具有如下通式：
Figure A20058002522200441
(通式1A)
其中，C，m，X和n如通式I所述。优选n为2，3，4，5，6，7，8，9或10。X优选为0，而m优选为1。
在其他优选实施方案中，所述修饰部分具有如下通式：
Figure A20058002522200442
(通式1B)
其中n如通式I所述。优选n为2，3，4，5，6，7，8，9或10。
在另一方面，所述修饰部分可具有如下通式：
Figure A20058002522200443
(通式II)
其中PAG是具有n个亚单位的聚烷撑二醇部分，且n为1，2，3，4，5，6，7，8，9，10，11，12，13，14，15，16，17，18，19，20，21，22，23，24或25；X为-O-，或-NH-；每一个o都是独立选择的且为0，1，2，3，4，5，6，7，8，9，10，11，12，13，14或15。
在另一方面，所述修饰部分可具有如下通式：
Figure A20058002522200451
(通式III)
其中，每一个C都是独立选择的并且是含有m个碳原子的烷基部分，且m为1，2，3，4，5，6，7，8，9，10，11，12，13，14，15，16，17，18，19或20；而每个PAG都是独立选择的并且是含有n个亚单位的聚烷撑二醇部分，且n是1，2，3，4，5，6，7，8，9，10，11，12，13，14，15，16，17，18，19，20，21，22，23，24或25；每一个X都是独立选择的，并且是将PAG和C轭合的连接部分，且优选为-C-，-O-，-C(O)-，-C(O)O-，-OC(O)-，-NH-，-NHC(O)-，或-C(O)NH-；o为0，1，2，3，4，5，6，7，8，9，10，11，12，13，14或15。所述Cm-X部分可以不存在，且可以使用-OH部分或-OCH3部分来终止所述PAGn部分。例如，，所述PAG可以是含有1，2，3，4，5，6，7，8，9，10，11，12，13，14，15，16，17，18，19或20个PEG亚单位的甲氧基终止或羟基终止的PEG。
在另一方面，所述修饰部分可具有通式：
Figure A20058002522200452
(通式IV)
其中每个C都是独立选择的并且是含有m个碳的烷基部分，且m是1，2，3，4，5，6，7，8，9，10，11，12，13，14，15，16，17，18，19或20；且每个PAG都是独立选择的并且是含有n个亚单位的聚烷撑二醇部分，且n是1，2，3，4，5，6，7，8，9，10，11，12，13，14，15，16，17，18，19，20，21，22，23，24或25；每个X都是独立选择的并且是将PAG结合于C的连接部分，且优选地为-C-，-O-，-C(O)-，-C(O)O-，-OC(O)-，-NH-，-NHC(O)-或-C(O)NH-。
应该理解通式I，IA，IB，II，III和IV的寡聚物都是本发明的发明内容。所述寡聚物可作为，例如，伯醇或活化的寡聚物(参见8.7.1部分的实施例)，并可被用来与除了BNP之外的具有生物学活性化合物，例如胰岛素，降钙素，干扰素，生长激素等轭合。
在另一方面，所述修饰部分可具有如下通式：
Figure A20058002522200461
(通式V)
其中每个R都是独立选择的并且为上述通式I，II，III或IV中的任意一种。
在特别优选的实施方案中，所述修饰部分选自：
或
Figure A20058002522200463
(当这一最后的修饰部分作为单轭合物结合于人BNP的Lys3时，所得的部分称为BN-054)。
在一个优选实施方案中，所述修饰部分具有如下通式：
Figure A20058002522200471
(通式IA)
其中，C，m，X和n如通式I所述。
在其他优选实施方案中，所述修饰部分具有如下通式：
Figure A20058002522200472
(通式1B)
其中n如通式I所述。
所述轭合物的药物特征，例如亲水性/亲脂性都可以通过调节PEG单体的数量，烷基链的类型和长度，PEG-肽键的特性，以及轭合位点的数量来进行改变。可对PEG-肽键的确切特性进行改变，从而使其能够在血浆中在生理pH条件下对水解稳定和/或敏感。
8.2.6形成盐的部分
在一些实施方案中，所述修饰部分包括形成盐的部分。正如本领域所属技术人员所公知的那样，所述形成盐的部分可以是多种适合形成盐的部分，包括，但不限于，羧酸盐和铵。在一些实施方案中，所述修饰部分包括形成盐的部分，所述促尿钠排泄化合物轭合物是以盐形式提供的。在这些实施方案中，正如本领域所属技术人员所公知的那样，所述促尿钠排泄化合物轭合物可以与适当的药物可接受平衡离子相连，其包括，但不限于，诸如氯，溴，碘，磷酸盐，乙酸盐，碳酸盐，硫酸盐，甲苯磺酸盐和甲磺酸盐的阴离子，或者诸如钠，钾，钙，锂和铵的阳离子。
所述修饰部分可以包括任意的亲水性部分，亲脂性部分，两性部分，形成盐的部分，及其组合。在优选实施方案中，所述修饰部分选自(CH2CH2O)PCH3基团，其中p为0，1，2，3，4，5，6，7，8，9，10，11，12，13，14，15，16，17，18，19或20；(CH2)qCH3，其中q为0，1，2，3，4，5，6，7，8，9，10，11，12，13，14，15，16，17，18，19或20；CH2CH2(OCH2CH2)rOH，其中r为0，1，2，3，4，5，6，7，8，9，10，11，12，13，14，15，16，17，18，19或20；C(CH2OH)3；CH(CH2OH)2；C(CH3)3；CH(CH3)2；CH2CH2(OCH2CH2)sC(O)(CH2)tCH3，其中s为0，1，2，3，4，5，6，7，8，9，10，11，12，13，14，15，16，17，18，19或20且t为0，1，2，3，4，5，6，7，8，9，10，11，12，13，14，15，16，17，18，19或20；以及(CH2CH2O)yC(O)(CH2)zCH3其中y为0，1，2，3，4，5，6，7，8，9，10，11，12，13，14，15，16，17，18，19或20，且z为0，1，2，3，4，5，6，7，8，9，10，11，12，13，14，15，16，17，18，19或20。
出于具体描述的目的的前述修饰部分的示例旨在对本发明进行说明，而非以任何形式对其进行限制。本领域所属技术人员应该理解，在本公开及其权利要求所主张的化学轭合机理范围之内，可以获得具有特定官能性轭合的适当部分。因此，如本说明书所述，可以根据本发明的原理对其他部分进行选择和使用。
8.3轭合策略
与对应的未轭合促尿钠排泄化合物轭合物相比，本发明的促尿钠排泄化合物轭合物具有不同水平的生物学活性。在一些实施方案中，所述促尿钠排泄化合物保留了一些或全部未修饰形式的活性，但是由于诸如与修饰部分的轭合程度，在分子上对轭合位点的选择以及对修饰部分的选择等因素的存在，所述促尿钠排泄化合物对体内降解较不敏感，因此具有增加的血浆半衰期。例如，可对本发明的促尿钠排泄化合物进行修饰，从而在适于促进与修饰部分相连的适当连接位点(即修饰部分轭合)上，在所述促尿钠排泄化合物结构的一个，两个，三个，四个，五个或更多位点上具有修饰部分。例如，这些适合的轭合位置可以包括有氨基酸残基，例如Lys氨基酸残基。
在多个实施方案中，例如，所述具有生物学活性的制剂，可以通过结合于受体的活化位置来部分地发挥功能。通常，当对官能团，例如氨基酸残基进行修饰时，该制剂不再结合于所述活化位置。在BNP的情况下，例如，所述肽对与NRP-A的结合具有特别的亲和力。根据所述促尿钠排泄分子被修饰成包含有修饰部分的位点，所述BNP对受体的亲和力可以相同，或者有所降低。在一些实施方案中，所述促尿钠排泄化合物轭合物的活性比天然的未轭合促尿钠排泄化合物轭合物的活性要低，但却保留了比未轭合促尿钠排泄化合物轭合物更好的特性，例如增强的对蛋白水解的抗性和增加的血浆半衰期或增强的穿过细胞膜的能力。可以想见，当需要进行所述促尿钠排泄化合物的长期释放时，所希望的是其活性有所降低。
在一些实施方案中，所述促尿钠排泄化合物轭合物是单轭合物。在其他实施方案中，所述促尿钠排泄化合物轭合物是多轭合物，例如二轭合物，三轭合物，四轭合物，五轭合物等。所述促尿钠排泄化合物修饰部分的数量仅受限于该促尿钠排泄化合物上的轭合位点数量。在其他实施方案中，本发明的所述促尿钠排泄化合物是单-，二-，三-，四-，和/或五修饰部分轭合物的混合物。例如，在一些实施方案中，具有生物学活性的促尿钠排泄化合物是hBNP，在其32个天然氨基酸的序列中包括了4个优选的轭合位点，包括N-末端，Lys3，Lys14和Lys27。本发明人的工作旨在N-末端，Lys3，Lys14和Lys27轭合的单轭合物，以及在对BNP和相关促尿钠排泄肽以及类似物的较高优选策略存在时，在Lys3/Lys14和Lys3/Lys27的二轭合物。
优选地，所述修饰部分与所述促尿钠排泄化合物共价结合。在所述修饰部分上不止一个部分可与所述促尿钠排泄化合物共价结合。结合可以采用可水解键或非水解键或二者的混合物(即，在不同的轭合位点采用不同的键)。
在一些实施方案中，可采用可水解的键(例如，酯，碳酸酯或氨基甲酸酯键)将所述促尿钠排泄化合物与所述修饰部分结合。采用可水解的结合可以使所述促尿钠排泄化合物轭合物象原药那样发挥作用。当所述促尿钠排泄化合物-修饰部分轭合物是非活化(即，所述轭合物缺乏通过促尿钠排泄化合物的初级作用机理来影响机体的能力)时，原药的方法是所希望的，例如，当所述修饰部分轭合位点位于促尿钠排泄化合物的结合区域之内时。使用可水解的结合还可以提供随时间释放或控制释放的效果，在给定时间段内给药所述促尿钠排泄化合物，当一种或多个修饰部分被从其分别的促尿钠排泄化合物-修饰部分轭合物上剪切下来时，可以提供具有活性的原药。
在其他实施方案中，可使用非水解键(例如，氨基甲酸酯，酰胺或醚键)将所述修饰部分结合于所述促尿钠排泄化合物。当希望所述促尿钠排泄化合物-修饰部分轭合物在血流中循环更长的时间，优选为至少2小时时，可优选地使用非水解性键。以非水解形式将所述修饰部分共价结合于促尿钠排泄化合物的键通常选自共价键，醚部分，碳酸酯部分，氨基甲酸酯部分，酰胺部分和仲胺部分。
在其他实施方案中，可以采用部分原药方法，其中部分所述修饰部分被水解。例如，美国专利第6,309,633号(在此将其全文引用作为参考)中描述了修饰部分，其含有亲水性和亲脂性成分，其中所述亲脂性成分可在体内水解从而产生微PAG化的轭合物。
可有超过一种修饰部分(即多种修饰部分)结合于所述促尿钠排泄化合物。优选地，所述多种修饰部分是相同的。然而，应该理解这些多种修饰部分可以是相互不同的，或者，这些修饰部分中有一些是相同的，而另一些是不同的。当多个修饰部分结合于所述促尿钠排泄化合物时，优选地，可采用可水解键将一种或多种修饰部分结合于所述促尿钠排泄化合物，并采用非水解键将一种或多种修饰部分结合于所述促尿钠排泄化合物。或者，全部结合于所述促尿钠排泄化合物的多个修饰部分的键都是可水解的，但却具有不同的水解度，因此，例如，在机体内可以通过水解将一种或多个修饰部分从所述促尿钠排泄化合物上快速地去除，而在机体内可以通过水解将一或多个修饰部分从所述促尿钠排泄化合物上缓慢地去除。
所述修饰部分可以在药物的多个亲核残基，包括，但不限于，亲核羟基官能团和/或氨基官能团上结合于所述促尿钠排泄化合物。亲核羟基官能团可以在，例如，丝氨酸和/或酪氨酸残基上存在，而亲核氨基官能团则可在，例如，组氨酸和/或赖氨酸残基，和/或所述肽的一个或多个N末端上存在。当修饰部分结合于所述促尿钠排泄肽的N-末端时，所述结合优选形成了仲铵。
8.4轭合物的合成
以下将在实施例中对示例性的合成酶进行描述。根据公知的原理可对反应条件(例如，选定的摩尔比，溶剂混合物和/或pH)进行控制。例如，可以通过将反应溶液的pH维持在低于Lys的pKa的条件下，抑制在Lys的氨基官能团上进行轭合。
可以采用例如，HPLC来对促尿钠排泄化合物轭合物的混合物进行区别和分离，从而提供促尿钠排泄化合物轭合物，例如，单-二-或三-轭合物。可以采用多种本领域所属技术人员所公知的技术，包括，但不限于，质谱来确定和/或验证特定分离轭合物的轭合程度(例如，所分离的分子是单-，二-或三轭合物)。可以采用多种本领域所属技术人员所公知的技术，包括，但不限于，序列分析，肽作图，选择性酶切，和/或内肽酶剪切来确定和/或验证特定轭合物的结构(例如，hBNP单轭合物的Lys3，Lys14，Lys27或N末端)。
可以通过，例如，用适当的封闭试剂，例如N-叔-丁氧羰基(t-BOC)或N-(9-芴甲氧羰基)(N-FMOC)与所述促尿钠排泄化合物反应来封闭所述促尿钠排泄化合物上的一个或多个反应位点。当需要形成在所述多肽的一个或多个N末端上具有修饰部分的不饱和促尿钠排泄化合物轭合物(即并非其中的所有亲核残基都被轭合的轭合物)时，这种方法是优选的。在这样的封闭之后，几乎全部单分散的被封闭的促尿钠排泄化合物的混合物可以与活化修饰部分的几乎全部单分散混合物反应，从而提供促尿钠排泄化合物轭合物的混合物，该混合物具有结合于一个或多个亲核残基的修饰部分，以及结合于其他亲核残基的封闭部分。在完成所述轭合反应之后，如本领域所属技术人员所公知的那样，所述促尿钠排泄化合物-修饰部分轭合物可以被去封闭。如果需要的话，可将促尿钠排泄化合物轭合物的混合物进行如上所述的分离，从而提供促尿钠排泄化合物轭合物的混合物。或者，可以在去封闭之前对促尿钠排泄化合物-修饰部分轭合物进行分离。
在本发明的一个令人惊奇的方面，本发明人发现，使用PEG-烷基部分和与邻近促尿钠排泄化合物(即位于促尿钠排泄化合物与PEG部分之间)的烷基部分进行hBNP轭合物的合成，产生了在特别理想的Lys3轭合位点上的优先轭合。因此，在一方面，本发明提供了在Lys3优先轭合hBNP的方法，该方法包括活化PEG-烷基寡聚物的烷基成分以及将活化的PEG-烷基寡聚物与hBNP结合。
8.5药物组合物
可以制备含有如本发明所述促尿钠排泄化合物轭合物的药物组合物。这样的组合物通常包括修饰的促尿钠排泄化合物与可药用载体的组合或是其二者的混合物。所述载体必须与药物组合物中的任意其他成分相容，并且不能对患者有害。所述载体可以是固体或液体，或二者皆可，并优选与作为单位剂量制剂的原药配制，例如，含有从约0.01或0.5％-约95％或99％促尿钠排泄化合物轭合物重量的药片。可以采用任意公知的制药技术，包括，但不限于，混合任选包括一种或多种助剂的成分来制备药物组合物。
符合本发明实施方案的药物组合物包括那些适合口服，直肠，经鼻，表皮，吸入(例如，通过气溶胶)，口腔(例如，舌下)，阴道，胃肠外(例如，皮下，肌肉，皮内，关节内，胸膜内，腹膜内，脑内，动脉内或静脉内)，表皮(即，皮肤和粘膜表面，包括气道表面)和透皮给药的组合物，尽管在任何一种情况下，最适合的方案都依赖于拟进行治疗的疾病本身和其严重程度，并依赖于所使用的特定原药的性质。
适合于口服给药的药物组合物可以分离单位形式存在，例如胶囊，扁囊剂(catchet)，锭剂或片剂，每种都含有预定量的所述原药；作为粉末或颗粒；作为水溶性或非水溶性液体中的溶液或悬液；或作为水包油或油包水的乳剂。可通过包括将原药和适合的载体(其可以含有一种或多种上述的助剂成分)组合在一起的步骤的任意适当的制药方法制备这样的制剂。一般地，可通过将原药与液体或精细分散的固体载体，或其二者均匀地和密切地混合，然后，如果有必要的话，将所得混合物成型来制备符合本发明实施方案的药物组合物。例如，可将含有所述原药，并任意具有一种或多种助剂成分的粉末或颗粒压缩或成型来制备片剂。可通过在适当的机器中，对无流动形式的混合物，例如任意混合有粘合剂，润滑剂，惰性稀释剂，和/或表面活性/分散剂的粉末或颗粒进行压缩来制备压缩片剂。可通过在适当的机器中，将用惰性液体粘合剂湿润的粉末状化合物成型来制备成型的片剂。
适合于口腔(舌下)给药的药物组合物包括锭剂，其含有存在于调味基质，通常是蔗糖、阿拉伯树胶或黄芪胶中的原药；以及锭剂，其含有存在于惰性基质，例如明胶、甘油或蔗糖和阿拉伯树胶中的原药。
适合于肠胃外给药的符合本发明实施方案的药物组合物包括所述原药的灭菌水溶性和非水溶性注射溶液，这样的制剂对预期患者的血液而言是优选等渗的。这些制剂可以含有抗氧化剂，缓冲液，抑菌剂和溶质，其能够使所述组合物与预期患者的血液等渗。水溶性和非水溶性的无菌悬液可以包括助悬剂和增稠剂。所述组合物可以单位/剂量或多剂量包装物的形式存在，例如，密封的安瓿或小管，并可储存于冷冻干燥(冻干)的条件下，只需要加入灭菌的液体载体即可，例如，在使用之前加入盐水或用于注射的水。可以从前述的各种灭菌粉末，颗粒和片剂中制备临时的注射溶液和悬液。例如，可以提供在封闭容器中以单位剂量形式存在的含有原药的可注射的、稳定的、灭菌组合物。原药可以冷冻干产物的形式提供，其能够与适当的可药用载体重组从而形成适合注射入患者体内的液体组合物。其单位剂量形式通常包括约10mg-约10g的原药。当所述原药是基本上水不溶性时，可施加足量的生理可接受的乳化剂，从而在水溶性载体中乳化所述原药。其中一种有用的乳化剂是胆碱磷脂。
适于对皮肤进行局部施用的适合药物组合物优选采用膏剂、乳剂、洗液、糊剂、凝胶剂、喷雾剂、气溶胶或油剂的形式。可使用的载体包括石油凝胶、羊毛脂、聚乙二醇、乙醇、透皮增强剂，及其两种或更多种的组合。
适用于透皮给药的药物组合物可以分离的糊剂存在，该存在方式可适于与接受者的皮肤保持紧密接触更长的时间阶段。还可以通过离子透入法(参见，例如，Pharmaceutical Research 3(6)：318(1986))并通常采用所述原药的任选缓冲水性溶液的形式来递送适合于透皮给药的组合物。适合的制剂包括柠檬酸盐或bis/tris缓冲液(pH6)或乙醇/水并含有0.1-0.2M的活性成分。
8.6给药和治疗的方法
与未修饰(未轭合)的生物学活性的促尿钠排泄化合物相比，本发明的促尿钠排泄化合物轭合物和药物制剂表现出一种或多种改进的特征，所述修饰部分的添加可以保护所述生物学活性促尿钠排泄化合物免于在各种环境(例如胃肠道(GI道))中被降解，从而与缺乏修饰部分情况下被降解的程度相比，以未修饰形式存在的部分在这样的环境中被降解的更少。尤其是，本发明的某些修饰形式可以最终在系统循环中提供药物可接受量所述生物学活性促尿钠排泄化合物的剂量进行口服给药。换言之，可有足量的促尿钠排泄化合物存在于GI道中并进入到血流中，从而使得所述生物学活性的促尿钠排泄化合物能够以足以引发cGMP产生的药理学活性量系统性存在。优选地，在口服给药后，与口服给药未轭合的促尿钠排泄化合物向血流中的递送相比，所述修饰部分的加入可以改善口服给药未轭合促尿钠排泄化合物向血流中的递送。更优选地，对口服给药促尿钠排泄化合物轭合物而言，活性化合物递送进入血流的改善效果是口服给药具有生物学活性的未轭合母体促尿钠排泄化合物递送进入血流效果的至少2倍。更优选地，对口服给药促尿钠排泄化合物轭合物而言，活性化合物递送进入血流的改善效果是口服给药具有生物学活性的未修饰(未轭合)促尿钠排泄化合物递送进入血流效果的至少3，4，5，6，7，8，9，10，15，20，25，30，40，50，60，70，80，90，100，150，200，300，400或500倍。因此，与具有生物学活性未修饰的促尿钠排泄化合物给药相比，本发明所述促尿钠排泄化合物轭合物的给药可提供该具有生物学活性促尿钠排泄化合物的更高的生物利用率。口服方式的给药(而不是在医院环境中成天的连续静脉灌注)可以降低与其他CHF治疗相关的医院费用和/或将hBNP的治疗用途扩展至包括了早期阶段和慢性CHF，以及急性CHF。
因此，在一方面，本发明提供了对治疗敏感的疾病进行治疗的方法，该方法通过使用促尿钠排泄肽化合物向需要接受治疗的患者给药治疗有效量的本发明促尿钠排泄化合物轭合物。可通过适当的，包括，例如，非肠道的和肠道的途径的多种给药途径给药所述促尿钠排泄化合物轭合物。优选的途径包括口服，皮下，舌下，口腔，鼻内，静脉内和肌肉内。
已经有几种方法被用于治疗心力衰竭的本发明促尿钠排泄化合物轭合物的应用中。例如，可以预期所述促尿钠排泄化合物轭合物可作为单治疗形式出现，优选为单独的口服剂量形式。或者，所述促尿钠排泄化合物轭合物可以与多种作为组合治疗部分的常规治疗制剂一起使用。目前所采用药物的主要种类包括：
利尿剂-其能够缓解液体积累以及所产生的与CHF相关的心脏收缩。
血管扩张剂-其能扩张动脉和静脉，从而使血流增加。
收缩剂-其能够增加心肌的收缩力。
洋地黄药物-其能够增加心脏的收缩力并降低心律。
血管紧张素转化酶(ACE)抑制剂-其能够在血管收缩药血管紧张素II合成的最后阶段抑制其产生。
血管紧张素受体阻抑剂(ARB′s)-允许血管紧张素的产生，但却抑制其动脉活性。
钙通道抑制剂-抑制钙流，从而导致血管和平滑肌松弛。
硝酸盐类-松弛平滑肌和扩大静脉和动脉。
β-阻抑剂-阻抑儿茶酚胺的作用，从而导致心脏的压力降低并且降低收缩的力量和频率。
与治疗CHF的其他方法相比，以及进行连续灌注的未修饰形式促尿钠排泄肽的当前应用相比，首先可以考虑所述促尿钠排泄化合物轭合物具有某些优势。本发明的口服促尿钠排泄化合物轭合物具有促尿钠排泄和利尿的性质，可预期该性质能够通过消除钠和过量水缓解充血。这样的功能目前是通过利尿补充剂和钾补充剂来实现的。可以预期本发明的所述促尿钠排泄化合物轭合物具有血管和心肌弛缓药的性质，这一性质目前是采用血管扩张剂，钙通道阻抑剂和硝酸盐类进行影响的。可以预期本发明的所述促尿钠排泄化合物轭合物能够抑制目前使用ACE抑制剂和ARB’s影响的肾素-血管紧张素-醛固酮系统(RAAS)。此外，可以预期所述促尿钠排泄化合物轭合物缺乏与影响肌肉收缩的和洋地黄药物关联的负效应和猝死风险。所述促尿钠排泄化合物轭合物具有诸多，即使不是全部的，若干类型心血管药物的益处，与此同时具有降低的常规治疗剂量或没有常规治疗的负效应。
本发明的所述促尿钠排泄化合物同样具有比NATRECOR_(奈西立肽，由Scios Inc.，生产，桑尼维尔，加利福亚州)更具优势。有些益处是源于如本发明实施方案的两性寡聚物所提供的改进的药代动力学分布。例如，与未轭合肽相比，对蛋白酶(例如NEP)降解的抗性可以导致更长的循环半衰期。其明显的优势是因为BNP或ANP与口服递送的这些寡聚物具有轭合能力。例如，可通过连续灌注48小时以上剂量给药NATRECOR_，且具有较高的每剂量成本还要加上医院的开销。如本发明实施方案所述的口服hBNP化合物轭合物可以普遍来说更低的成本来进行剂量给药，并可以为门诊病人获得并可以自我给药。不是局限于患有急性CHF病例住院病人的应用，如本发明实施方案所述的口服轭合物可应用于那些遭受慢性CHF逐渐发病的患者。给药的方便，减少了对医院资源的需求，和/或较低的费用支持了促尿钠排泄化合物轭合物作为预防性治疗自我给药(例如，在家)给具有高风险心脏衰竭的患者的应用。因此，可期待如本发明实施方案所述的hBNP化合物轭合物口服制剂具有诸多，即使不是全部的Natrecor_的益处，这些益处包括改善的药代动力学分布，更方便的给药，降低的住院开销，将适应症扩展至包括慢性CHF，和/或在早期心血管疾病中的应用。
使用或倾向于使用母体促尿钠排泄化合物的患者还可以选择性(或额外)地使用本说明书所述的促尿钠排泄化合物制剂。例如，患有使用肠胃外给药促尿钠排泄化合物，例如NATRECOR_进行常规治疗病症的患者，可以使用有效量的本说明书所述制剂的修饰形式来进行治疗。有利的是，当这些制剂之前只能通过注射或静脉内给药方式进行给药时，所述促尿钠排泄化合物可以通过吸入，或更优选地口服给药的方式进行给药。
在一个实施方案中，本发明提供了向患者递送生物学活性制剂的方法，其中该生物学活性的制剂是作为本发明的修饰促尿钠排泄化合物成分进行口服给药的，部分所述口服给药的促尿钠排泄化合物能够在胃肠道中完好无损地存在并穿过肠壁进入到血流中，在离开胃肠道之后，一些或全部的促尿钠排泄化合物会在体内水解并产生药物可接受量的生物学活性的制剂。所述水解，例如，可以在血流或肝脏中发生。在这一方法中，与对应的口服给药的未轭合生物学活性制剂的口服生物利用率相比，促尿钠排泄化合物的修饰形式能够增强口服给药生物学活性制剂的口服生物利用率。
所使用的任意促尿钠排泄有效量都在本发明的范围之内，其会随制剂，患者的不同而不同，还会随诸如患者年龄和疾病以及递送方式等因素的不同而不同。可通过本领域所属技术人员公知的常规药理学方法确定这样的剂量。作为一般性的建议，约0.1-约50mg/kg的剂量是具有治疗效力的，而总重量是基于患者的体重进行计算的。在较高水平涉及到的毒性会将静脉剂量限制到较低的水平，例如最高至约10mg/kg，而总重量是基于活性基质的重量进行计算的。约10mg/kg-约50mg/kg的剂量可用于口服给药。通常，0.5mg/kg-约5mg/kg的剂量可用于肌肉内注射。给药的频率通常为每天一次，两次或三次，或根据控制病情的需要。治疗的持续取决于拟进行治疗的疾病类型且有可能对患者而言是终身给药。
适于接受本发明治疗的患者包括，但不限于，禽类和哺乳动物患者，优选为哺乳动物。如本发明所述的哺乳动物包括，但不限于，犬，猫，牛，山羊，马，绵羊，猪，啮齿类(例如，大鼠和小鼠)，兔类，灵长类，人等，并包括了子宫内的哺乳动物。任意需要进行如本发明所述治疗的哺乳动物患者都是适合的。人类患者是优选的。两种性别和处于任意发育阶段(即，新生儿，婴儿，青少年，青年，成人)的人类患者都可以进行如本发明所述的治疗。
如本发明所述的说明性禽类包括鸡，鸭，火鸡，鹅，鹌鹑，雉，走鸟类动物(例如，鸵鸟)和家养鸟(例如，鹦鹉和金丝雀)，还包括在卵中的鸟。
8.7分析
本发明的促尿钠排泄肽类似物可以诱导与天然肽相关的心血管，肾，和/或内分泌效果。基于细胞的分析可用来描述哪种轭合物是导致适当产生cGMP的人促尿钠排泄肽受体A的最佳激动剂。可以使用生物化学分析来显示哪种轭合物提供了抗蛋白水解酶的合适的保护。体内实验可用来显示哪种轭合物提供了所希望的生物利用率。主要的轭合物可以在已建立的狗模型中进行检测。可将所希望的候选物在大鼠和狗中进行详细的药代动力学，药效和毒性研究。如本发明实施方案所述的BNP轭合物可用于治疗早期，慢性和急性充血性心力衰竭。
可在体外测定本发明的新肽和新轭合物对于人促尿钠排泄肽受体A(NPR-A)的激动剂活性。BNP的血管舒张，促尿钠排泄和利尿性质归因于第二信使，环GMP(cGMP)。cGMP的产生是由鸟苷酸环化酶完成的，其是一种能够在BNP结合于NPR-A时被活化的酶。cGMP的产生可以在内源性表达NPR-A的人动脉内皮细胞培养物中进行测定。因此，可以通过这些细胞中cGMP的产生水平来测定本发明促尿钠排泄化合物轭合物和促尿钠排泄肽类似物的相对活性。
可测定出本发明轭合物对蛋白酶具有增加的抗性。一般地，口服递送的药物都容易受到诸如胃蛋白酶、胰蛋白酶和/或糜蛋白酶等消化酶的攻击。在肽药物的情况下，这些酶是特别成问题的。然而，肽轭合物则对这些酶具有增强的抗性。消化酶混合物可用来测定本发明的hBNP轭合物和其他轭合物对消化道中蛋白酶的抗性有所升高。与对应的未轭合促尿钠排泄化合物相比，促尿钠排泄化合物轭合物优选地对蛋白水解分解更不敏感，即与对应的未轭合化合物相比，所述轭合物分解地更慢。
可以测定所述轭合物的口服生物利用率。例如，可以在大鼠中测定所述轭合物的口服生物利用率。可通过口服强饲向胃肠道给药轭合物，并使用可获得的放射免疫分析方法分析血流中存在的hBNP轭合物。如本发明实施方案所述的轭合物可优选地是口服和/或经口的，即可通过口服或经口方式递送治疗显著量的所述轭合物。
所述轭合物可保留一些或全部天然促尿钠排泄肽(例如，hBNP)的活性，还具有口服给药的其他益处。这样的化合物可降低与治疗急性CHF相关的费用，和/或将这种治疗的应用扩展至包括早期和慢性CHF。
在一方面，本发明提供了产生数据的方法，该方法包括分析促尿钠排泄化合物，分析本发明的促尿钠排泄化合物轭合物，或一些这样的促尿钠排泄化合物轭合物，并从这样的分析中得出数据结果。数据本身因此被理解为构成了本发明的另一个实施方案，这些数据的用途也是。
8.8支链寡聚修饰部分
本发明还提供了若干PEG直链或支链，胺，微PAG化和烷基-PEG修饰部分。
8.8.1支链寡聚修饰部分通式s
本发明提供了具有如下通式的化合物：
Figure A20058002522200611
(通式VI)
其中R是-H，-C(O)OH或活化部分，例如C(O)X′(其中X′是卤化物(例如，Cl，Br)或对-硝基苯酚)，或
Figure A20058002522200612
且
C，m，X，PAG和n如通式I所述。
本发明提供了具有如下通式的化合物：
(通式VII)
其中R是H(应该理解在PAG中轭合于R的原子是O，因此终止部分是OH)，C(O)OH或活化部分，例如C(O)X′(where X′是卤化物(例如，Cl，Br)或对-硝基苯酚)，或
Figure A20058002522200614
且
PAG，n，X和o如通式II所述。
在又一个实施方案中，提供了具有如下通式的化合物：
Figure A20058002522200621
(通式VIII)
其中R是-H，-OH，-C(O)OH或活化部分，例如C(O)X′或OC(O)X′(其中X′是卤化物(例如，Cl，Br)或对硝基苯酚)，或
Figure A20058002522200622
或
Figure A20058002522200623
且
C，m，X，PAG，n和o如通式III所述。
在另一方面，所述修饰部分可具有通式：
Figure A20058002522200624
(通式IX)
其中R是H，C(O)OH或活化部分，例如C(O)X″(其中X″是卤化物(例如，Cl，Br)或对-硝基苯酚)，或
Figure A20058002522200625
且
X’是
且
C，m，PAG，n，和X如通式IV所述。
在另一方面，所述修饰部分可具有通式：
Figure A20058002522200631
(通式X)
其中R3是-OH，-C(O)OH或活化部分，例如
且
R1和R2都是独立选择的并且是上述通式I，II，III或IV中的任意一种。
8.8.2制备寡聚修饰部分的方法
本发明还提供了若干制备在此所公开所述修饰部分的方法。提供了制备具有如下通式的化合物的方法：
(通式XI)
其中C，m，X，PAG，和n如通式I所述。这一方法可被描述成在碱和溶剂存在的条件下，将通式为：
Cm-X-PAGn-OH
的化合物与通式为：
的化合物(需要注意可以用其他的离去基团，例如其他的卤化物来替代Cl)发生反应从而产生如下通式的化合物的步骤：
Figure A20058002522200641
将所述产物与通式为：
Cm-X-PAGn-OH
的化合物在Lewis酸和溶剂存在的条件下反应产生了：
Figure A20058002522200642
其中C，m，X，PAG和n如通式I所定义。Cl可以被其他卤素代替，例如Br。例如，所述碱可进一步被限定为NaH，而所述溶剂被进一步限定为四氢呋喃。用于本发明中的Lewis酸可进一步被限定为BF3OEt2。
本发明的其他方法同样公开了制备通式为：
Figure A20058002522200643
(通式XII)
的化合物的方法，其中C，m，X，PAG和n如通式I所定义。这一方法还可进一步限定为包括将如下产物与对硝基氯甲酸酯或二琥珀酰亚胺基碳酸酯发生反应的步骤：
Figure A20058002522200644
其中C，m，X，PAG和n如上所定义。
本发明的又一实施方案提供了制备通式为：
Figure A20058002522200651
化合物的方法，其中PAG，n，X和o如通式II定义。本方法还可进一步被描述为在溶剂中将通式为：
Figure A20058002522200652
的化合物(需要注意可以用其他的离去基团，例如其他的卤化物来替代Cl)，其中o如通式I定义，与通式为：
HO-PAGn-X
的化合物反应，其中X是-NH或-OH，从而生成通式为：
Figure A20058002522200653
化合物的步骤，其中PAG，n，X和o如通式II所述。
本发明还提供了制备通式为：
Figure A20058002522200654
(通式XIII)
化合物的方法，其中PAG，n，X和o如通式II所述。本发明还可被描述为包含活化通式为：
Figure A20058002522200661
产物的步骤，其中PAG，n，X和o如通式II定义，使用了活化制剂，例如二琥珀酰亚胺基碳酸酯，对硝基氯甲酸酯，碳酰氯和N-羟基琥珀酰亚胺。
本发明的又一实施方案提供了制备通式为：
(通式XIV)
化合物的方法，其中C，m，X，PAG，n和o如通式III定义。本方法还可被描述为在存在碱和溶剂的条件下，将在此鉴定的如通式III的所述产物与通式为：
Figure A20058002522200663
的化合物发生反应的步骤，其中o如通式III定义。在本方法的优选实施方案中，所述碱是K2CO3，而所述溶剂是水溶性和/或有机溶剂。
此外，本发明还提供了制备通式为：
(通式XV)
化合物的方法，其中C，m，PAG，n和o如通式III定义。本方法一般还包括将如上述制备通式XIV方法制备的化合物，与诸如N-羟基琥珀酰亚胺的活化剂发生反应。
9.实施例
以下实施例都包括于本发明的说明性示例中。可使用被证实能够以最佳实施方式实施本发明的技术和方法术语来描述以下实施例的某些方面。根据本公开和在本发明相关领域普通技术人员的普通技术水平，本领域所属技术人员应该理解以下实施例仅旨在进行说明，且可在不偏离本发明范围的条件下对其进行多种变化，修饰和改变。
9.1 PEG-烷基修饰部分(碳酸2，5-二氧-吡咯烷-1-基酯2-[2-(2-{2-[2-(2-十六烷氧基-乙氧基)-乙氧基]-乙氧基}-乙氧基)-乙氧基]-乙基酯(II))的活化
将六乙二醇单十六烷基醚，I(0.202g，0.4mmol)溶解于乙腈(5mL)并加入二琥珀酰亚胺基碳酸酯(DSC，0.157g，0.6mmol)。然后逐滴加入三乙胺(0.12g，1.2mmol)，10分钟之后所述反应混合物变澄清。室温下将反应搅拌过夜。在搅拌约16小时之后，将粗反应物蒸干，然后溶解于饱和NaHCO3(10mL)中，经乙酸乙酯(2×20mL)洗涤，MgSO4干燥，然后蒸干。通过柱层析(二氧化硅，EtOAc/甲醇，10∶1)对粗反应混合物进行纯化，从而产生0.258g(81％)的油状题述化合物II。ESI MS：m/e 648.84(M+H)+。
Figure A20058002522200681
9.2支链PEG胺修饰部分(碳酸2，5-二氧-吡咯烷-1-基酯2-[2-(2-己基-癸酰氨基)-乙氧基]-乙基酯(IV))的合成
在30分钟内将亚硫酰氯(5.5gm，46.6mmol)逐滴加入2-己基-癸酸I(10gm，38.9mmol)的在100mL四氯化碳溶液中。在加入完成之后，将所述反应混合物回流3小时。反应完成后，通过蒸馏将四氯化碳去除并将所述反应混合物浓缩得到粗酰氯。通过分馏对粗酰氯进行纯化得到澄清的液体II(10.1gm，91％)。ESI MS：m/e 275.87(M+H)+。
在30分钟内，向冷却的2-(2-氨基-乙氧基)-乙醇(575g，5.47mmol)的10ml二氯甲烷溶液中，逐滴加入2-己基-癸酰氯II(750mg，2.74mmol)。加入完成之后，将反应混合物的温度升高至25℃。在室温将反应搅拌过夜。搅拌约20小时后，用1N HCl酸化粗反应物并用10ml H2O稀释。然后用二氯甲烷提取所述反应混合物。然后用1N HCl，水洗涤有机相，MgSO4干燥，过滤和浓缩。用快速色谱法(二氧化硅，梯度洗脱：2-5％甲醇的CHCl3溶液)纯化粗产物，得到902mg(96％)的米色固体的单分散化合物III。ESI MS：m/e 344.54(M+H)+。
将单分散的支链C16-PEG2 III(200mg，0.58mmol)溶解于乙腈(5mL)和二琥珀酰亚胺基碳酸酯(DSC，0.224g，0.87mmol)中。然后逐滴加入三乙胺(0.118g，1.17mmol)，10分钟后反应混合物变为澄清。在室温将反应搅拌过夜。搅拌后约16小时，将粗反应物蒸干并溶解于饱和NaHCO3(10mL)中，乙酸乙酯洗涤(2×20mL)，MgSO4干燥并和蒸干。通过柱层析(二氧化硅，EtOAc/甲醇，10∶1)纯化残留物得到0.206g(74％)油状的IV(0.206g，74％产率)。ESI MS：m/e 485.63(M+H)+。
Figure A20058002522200691
9.3 PEG-烷基修饰部分(16-(2-{2-[2-(2-{2-[2-(2-甲氧基-乙氧基)-乙氧基]-乙氧基}-乙氧基)-乙氧基]-乙氧基}-乙氧基)-十六烷酸2，5-二氧-吡咯烷-1-基酯)的合成与活化
向单分散16-溴-十六酸(15.3g，45mmol)的乙醇溶液(300mL)中加入H2SO4(1.5mL，31.25mmol)并将所述反应搅拌48小时。用水洗涤促反应混合物并用二氯甲烷(2×300mL)进行提取。用H2O(300mL)，饱和NaHCO3(2×300mL)，H2O(300mL)洗涤有机相，MgSO4干燥并蒸干，得到米色的固体II(16.03g，98％产率)。
向单分散七乙二醇单甲基醚(8.51g，25mmol)的THF(250mL)溶液中加入叔丁氧钾(3.1g，27.5mmol，少量加入约30分钟)。然后将反应混合物搅拌1小时，然后逐滴加入溶解于THF(90mL)中的II(10g，27.5mol)，将反应混合物搅拌过夜。将粗反应混合物过滤通过硅藻土(用CH2Cl2洗涤，～200mL)并蒸干得到油。用快速色谱法(二氧化硅，梯度洗脱：2-5％溶于CHCl3的甲醇)纯化粗油得到澄清的黄色油IV，2.48g(16％)。
向单分散化合物IV(2.22g，3.56mmol)的油中加入IN NaOH(50.0mL)，25mL甲醇，25mL乙醇并将所述反应混合物搅拌24小时。将所得粗反应混合物浓缩，酸化(pH～2)，用NaCl饱和并用CH2Cl2(3×75mL)洗涤。合并有机相，用饱和NaCl洗涤，MgSO4干燥并蒸干，得到白色固体的单分散化合物V。采用快速色谱法(二氧化硅，乙酸乙酯)纯化所述粗固体得到V，858mg(40％)。
将单分散mPEG7-C16-酸V(324mg，544mmol)溶解于15ml无水二氯甲烷，然后加入溶解于无水二氯甲烷的N-羟基琥珀酰亚胺(94mg，816mmol)和1-乙基-3-(3′-二甲基氨基丙基)碳二亚胺HCl(EDCI HCl，156mg，816mmol)。将反应搅拌24小时，然后用1N HCl，水洗涤，MgSO4干燥，过滤并浓缩。采用快速色谱法(二氧化硅，梯度洗脱：2-5％甲醇的CHCl3溶液)纯化粗产物，得到单分散活化的澄清的油，MPEG7-C16 VI(290mg，77％)。
Figure A20058002522200711
9.4 PEG-烷基修饰部分(12-(2-{2-[2-(2-{2-[2-(2-甲氧基-乙氧基)-乙氧基]-乙氧基}-乙氧基)-乙氧基]-乙氧基}-乙氧基)-十二酸2，5-二氧-吡咯烷-1-基酯)的活化
将单分散mPEG7-C12-酸I(500mg，0.78mmol)溶解于20ml无水二氯甲烷，然后加入和溶解于无水二氯甲烷的N-羟基琥珀酰亚胺(160mg，1.39mmol)和1-乙基-3-(3′-二甲基氨基丙基)碳二亚胺HCl(EDCI HCl，233mg，1.390mmol)。将反应搅拌24小时，然后用1N HCl，水洗，MgSO4干燥，过滤并浓缩。使用快速色谱法(二氧化硅，梯度洗脱：2-5％甲醇的CHCl3溶液)纯化粗产物得到单分散活化的澄清油，MPEG7-C16 VI(370mg，62％)。
Figure A20058002522200721
9.5 PEG修饰部分(碳酸2，5-二氧-吡咯烷-1-基酯2-甲氧基-乙基酯)的合成
将单分散的支链MPEG1 I(200mg，2.63mmol)溶解于乙腈(20mL)并加入二琥珀酰亚胺基碳酸酯(DSC，II，1.00g，3.94mmol)。然后逐滴加入三乙胺(0.399g，3.94mmol)，10分钟后反应混合物变为澄清。在室温将反应搅拌过夜。搅拌后约16h，将粗反应物蒸干并随后溶解于饱和NaHCO3(20mL)，用乙酸乙酯洗涤(2×50mL)，MgSO4干燥并蒸干。柱层析(二氧化硅，EtOAc/MeOH，10∶1)得到了固体III(0.346g，60％产率)。ESI MS：m/e 218.09(M+H)+。
Figure A20058002522200731
9.6可水解微PAG化修饰部分(己酸2-(2，5-二氧-吡咯烷-1-基氧基羰基氧基)-乙基酯)的合成
将单分散的支链C6-PEG1 I(100mg，0.625mmol)溶解于乙腈(10mL)并加入二琥珀酰亚胺基碳酸酯(DSC，II，0.240g，0.936mmol)。然后逐滴加入三乙胺(0.095g，0.936mmol)，10分钟后反应混合物变为澄清。在室温将反应搅拌过夜。搅拌后约16h，将粗反应物蒸干然后溶解于饱和NaHCO3(10mL)，用乙酸乙酯洗涤(2×20mL)，MgSO4干燥并蒸干。柱层析(二氧化硅，EtOAc/MeOH，10∶1)得到米色固体III(0.146g，78％产率)。ESI MS：m/e 302.29(M+H)+。
Figure A20058002522200732
9.7直链mPEG修饰部分(碳酸2，5-二氧-吡咯烷-1-基酯2-(2-甲氧基-乙氧基)-乙基酯)的合成
将单分散的支链MPEG2 I(470mg，3.91mmol)溶解于乙腈(20mL)并加入二琥珀酰亚胺基碳酸酯(DSC，II，1.50g，5.87mmol)。然后逐滴加入三乙胺(0.594g，5.87mmol)，10分钟后反应混合物变为澄清。在室温将反应搅拌过夜。搅拌后约16h，将粗反应物蒸干然后溶解于饱和NaHCO3(20mL)，用乙酸乙酯洗涤(2×50mL)，MgSO4干燥并蒸干。柱层析(二氧化硅，EtOAc/MeOH，10∶1)得到了固体III(0..632g，62％产率)。ESI MS：m/e 262.23(M+H)+。
Figure A20058002522200741
9.8可水解微PAG化修饰部分(十二酸2-[2-(2，5-二氧-吡咯烷-1-基氧基羰基氧基)-乙氧基]-乙基酯)的合成
将单分散的支链C12-PEG2 I(200mg，0.69mmol)溶解于乙腈(10mL)并加入二琥珀酰亚胺基碳酸酯(DSC，II，0.265g，1.035mmol)。然后逐滴加入三乙胺(0.104g，1.035mmol)，10分钟后反应混合物变为澄清。在室温将反应搅拌过夜。搅拌后约16h，将粗反应物蒸干然后溶解于饱和NaHCO3(10mL)，用乙酸乙酯洗涤(2×20mL)，MgSO4干燥并蒸干。柱层析法(二氧化硅，EtOAc/MeOH，10∶1)得到油III(0.247g，83％产率)。ESI MS：m/e 430.50(M+H)+。
Figure A20058002522200751
9.9直链PEG修饰部分(碳酸2，5-二氧-吡咯烷-1-基酯2-[2-(2-甲氧基-乙氧基)-乙氧基]-乙基酯)的合成
将单分散的支链MPEG3 I(200mg，1.21mmol)溶解于乙腈(20mL)并加入二琥珀酰亚胺基碳酸酯(DSC，II，0.468g，1.82mmol)。然后逐滴加入三乙胺(0.184g，1.82mmol)，10分钟后反应混合物变为澄清。在室温将反应搅拌过夜。搅拌后约16h，将粗反应物蒸干然后溶解于饱和NaHCO3(20mL)，用乙酸乙酯洗涤(2×50mL)，MgSO4干燥并蒸干。柱层析(二氧化硅，EtOAc/MeOH，10∶1)得到固体III(0.206g，55％产率)。ESI MS：m/e 306.11(M+H)+。
9.10可水解微PAG化修饰部分(己酸2-{2-[2-(2，5-二氧-吡咯烷-1-基氧基羰基氧基)-乙氧基]-乙氧基}-乙基酯)的合成
将单分散的支链C6-PEG3 I(200mg，0.80mmol)溶解于乙腈(20mL)并加入二琥珀酰亚胺基碳酸酯(DSC，II，0.309g，1.209mmol)。然后逐滴加入三乙胺(0.122g，1.209mmol)，10分钟后反应混合物变为澄清。在室温将反应搅拌过夜。搅拌后约16h，将粗反应物蒸干然后溶解于饱和NaHCO3(10mL)，用乙酸乙酯洗涤(2×20mL)，MgSO4干燥并蒸干。柱层析(二氧化硅，EtOAc/MeOH，10∶1)得到油III(0.203g，64％产率)。ESI MS：m/e 390.40(M+H)+。
Figure A20058002522200761
9.11苄基消除可水解寡聚物(6-{2-[2-(2-{2-[2-(2-甲氧基-乙氧基)-乙氧基]-乙氧基}-乙氧基)-乙氧基]-乙氧基}-己酸4-(4-硝基-苯氧羰基氧基甲基)-苯基酯)的合成
将叔丁氧钾(3.64g，32.4mmol)溶解于250mL THF。加入溶解于10mL THF的MPEG6醇(9.58g，32.3mmol)。将所述溶液搅拌2小时。将从商业可获得乙基6-羟基-己酸酯制备的甲磺酸盐(7.0g，29.4mmol)溶解于15mL THF并加入到PEG溶液。在室温将反应搅拌过夜。用25mLMeOH对所述反应进行淬灭并通过短衬垫硅藻土进行过滤。将滤液真空浓缩并通过快速色谱法(EtOAc/2％MeOH)纯化残渣得到3.19g(25％)I。ESI MS：m/e 461.07(M+Na)+。
为了水解所述乙基酯，用35mL 1N NaOH处理1.1g(2.51mmol)I。6小时后，原来浑浊的混合物变为澄清，黄色的溶液。用NaCl饱和所述混合物并用浓缩的HCl酸化直至pH为2。用100mL CH2Cl2对溶液进行提取。用Na2SO4干燥有机相，过滤并真空浓缩得到0.80g(78％)羧酸II。ESI MS：m/e 411.07(M+H)+，433.10(M+Na)+。
将羧酸III(0.80g，1.95mmol)溶解于16mL CH2Cl2并放置于N2中。像所述溶液中加入0.486g(2.5mmol)EDC和0.288g(2.5mmol)N-羟基琥珀酰亚胺(NHS)。5小时后，再加入0.2g EDC和0.12g NHS驱动反应完成。当TLC指示没有未反应羧酸残留时，用60mL CH2Cl2稀释所述混合物并用冷的1N HCl(1×100mL)，冷水(2×100mL)和盐水(3×100mL)进行洗涤。用Na2SO4干燥有机相，过滤并真空浓缩得到0.71g(71％)III。ESI MS：m/e 508.17(M+H)+，530.07(M+Na)+。
将4-羟基苯甲醇(2.93g，3.6mmol)和2.98g(24.4mmol)DMAP溶解于120mL干燥的CH2Cl2中。将化合物III(1.2g，(2.37mmol)溶解于另外40mL CH2Cl2中并加入。在室温将反应搅拌过夜。用1N HCl(2×200mL)和盐水(2×200mL)洗涤所述混合物。用Na2SO4干燥有机相，过滤并蒸干。通过快速色谱法(二氧化硅，EtOAc/10％MeOH)纯化所述残渣得到0.701g(58％)寡聚物IV。ESI MS：539.10 m/e(M+Na)+。
将寡聚物IV(0.562g，1.09mmol)溶解于15mL干燥的CH2Cl2中。向所述溶液中加入0.23mL(1.64mmol)TEA和0.329g(1.64mmol)对-硝基-苯基氯甲酸酯。在室温下将所述反应搅拌过夜。然后再用15mL CH2Cl2稀释所述混合物，用15mL 1N HCl洗涤然后再用15mL水洗涤。MgSO4干燥有机相，过滤并浓缩至干燥。使用快速色谱法(二氧化硅，梯度洗脱：3/1 EtOAc/己烷-EtOAc)纯化粗产物得到504mg(74％)活化的寡聚物。ESI MS：m/e 682.72(M+H)+，704.72(M+Na)+。
9.12芳基氨基甲酸酯可水解修饰部分(碳酸4-(6-{2-[2-(2-{2-[2-(2-甲氧基-乙氧基)-乙氧基]-乙氧基}-乙氧基)-乙氧基]-乙氧基}-己氧基)-苯基酯4-硝基-苯基酯)的合成
将MPEG6醇(10.0g，33.7mmol)溶解于40mL干燥的CH2Cl2并在冰浴中将所得溶液冷却至0℃。加入TEA(5.64mL，40.5mmol)，然后逐滴加入3.13mL(40.5mmol)甲基磺酰氯。在0℃将所述反应搅拌30分钟，然后从冰浴移开，使其升至室温且搅拌过夜。用更多CH2Cl2稀释所述反应混合物并用饱和NaHCO3和水洗涤。MgSO4干燥有机相，过滤并真空浓缩得到12.4g(98％)MPEG6甲磺酸盐，I。
从6.311g二醇(53.41mmol)和180mL干燥的THF制备了1，6-己二醇溶液。将所述溶液冷却至0℃并放置于N2气氛下。向该溶液中加入叔丁氧钾(5.996g，53.41mmol)并将所得混合物搅拌1小时。向该混合物中加入溶于30mL THF的I(10.0g，26.7mmol)。将全部溶液在0℃搅拌30分钟，然后升至室温并搅拌过夜。将反应混合物过滤通过硅藻土。用CH2Cl2洗涤所述硅藻土并将合并的滤液真空浓缩。将残渣重新溶解于CH2Cl2并用水洗涤，用Na2SO4干燥有机相，过滤并蒸干。通过快速色谱法(二氧化硅，CHCl3/10％MeOH)纯化。通过制备TLC(EtOAc/10％MeOH)进一步纯化某些产物。合并的产量是3.923g(37％)II。
将II(3.923g，9.89mmol)溶解于16mL干燥的CH2Cl2并将所得溶液冷却至0℃并置于N2气氛下。加入三乙胺(1.65mL，11.9mmol)然后逐滴加入0.92mL(11.9mmol)甲基磺酰氯。在0℃将所述反应再搅拌30分钟，然后升至室温并搅拌过夜。用更多CH2Cl2稀释所述反应混合物并用饱和NaHCO3和水进行洗涤。用Mg2SO4干燥有机相，过滤并真空浓缩得到4.25g(91％)甲磺酸盐III。
在含有50mL干燥的THF的烧瓶中，溶解5.001g(24.97mmol)4-苄氧基苯酚。加入叔丁氧钾(1.202g，9.989mmol)，将所得混合物在室温和惰性气体条件下搅拌1小时。加入溶于20mL THF中的3.950g(8.324mmol)III。18小时后，用10mL MeOH淬灭整个混合物，并通过短衬垫硅藻土进行过滤。将滤液真空浓缩并通过快速色谱法(二氧化硅，EtOAc/MeOH 20∶1)纯化残渣得到1.584g(33％)化合物IV。ESIMS：m/e 579.16(M+H)+，601.14(M+Na)+。
将化合物IV(0.683g，1.18mmol)溶解于20mL MeOH中。向所述溶液中加入溶于MeOH的136mg 5％Pd/C浆液。将整个混合物放置于H2的条件下并搅拌至TLC确认全部起始材料都已被消耗。然后将混合物过滤通过硅藻土并将所述滤液蒸干得到412mg(71％)V。ESI MS：m/e511.09(M+Na)+。
将寡聚物V(0.605g，1.09mmol)溶解于15mL干燥的CH2Cl2。向所述溶液中加入0.23mL(1.64mmol)TEA和0.329g(1.64mmol)对硝基-苯基氯甲酸酯。在室温下将所述反应搅拌过夜。然后再用15mLCH2Cl2稀释所述混合物并用15mL 1N HCl洗涤然后再用15mL水洗涤。MgSO4干燥所述有机相，过滤并浓缩至干燥。通过快速色谱法(二氧化硅，梯度洗脱：3/1 EtOAc/己烷-EtOAc)纯化粗产物得到491mg(75％)活化的寡聚物。ESI MS：m/e 654.71(M+H)+，675.71(M+Na)+。
Figure A20058002522200801
9.13活化寡聚部分的方法
本实施例描述了如下的方法，通过该方法可以活化寡聚部分。
9.13.1方法I-使用DSC进行活化
将烷基-PEG-OH，I(0.4mmol，1eq.)溶解于乙腈(5mL)并加入二琥珀酰亚氨基碳酸酯(DSC，0.6mmol，1.5eq.)。然后逐滴加入三乙胺(1.2mmol，1.5eq.)，10分钟后反应混合物变为澄清。在室温将反应搅拌过夜。搅拌约16h后，将粗反应物蒸干然后溶解于饱和NaHCO3(10mL)，用乙酸乙酯洗涤(2×20mL)，MgSO4干燥并蒸干。柱层析(二氧化硅，EtOAc/MeOH，10∶1)得到活化的寡聚物II。
Figure A20058002522200811
9.13.2方法II：使用NHS进行活化
将MPEG-烷基酸I(0.544mmol，1.0eq.)溶解于15mL无水二氯甲烷，然后加入溶解于无水二氯甲烷的N-羟基琥珀酰亚胺(0.816mmol，1.5eq.)和1-乙基-3-(3′-二甲基氨基丙基)碳二亚胺HCl(EDCI·HCl，0.816mmol，1.5eq.)。将反应搅拌数小时，然后用1N HCl，水洗涤，MgSO4干燥，过滤并浓缩。采用快速色谱法(二氧化硅，梯度洗脱：2-5％甲醇的CHCl3溶液)纯化粗产物获得活化的MPEG-烷基酸II。
9.14具有支链(6-[2-(2-{2-[2-(2-甲氧基-乙氧基)-乙氧基]-乙氧基}-乙氧基)-1-(2-{2-[2-(2-甲氧基-乙氧基)-乙氧基]-乙氧基}-乙氧基甲基)-乙氧基羰基氨基]-己酸2，5-二氧-吡咯烷-1-基酯)修饰部分的合成
Figure A20058002522200813
1.将四乙二醇单甲基醚(14.0g，67mmol)溶解于四氢呋喃(90mL)，逐部分地加入NaH(1.77g，74mmol)并将所述反应搅拌2小时。然后逐滴加入表氯醇(26.3mL，0.34mol)并在室温将所述反应搅拌48小时。将粗反应混合物过滤通过硅藻土并用CH2Cl2洗涤(250mL)。用H2O(2×250mL)洗涤滤液，MgSO4干燥，蒸干。柱层析(二氧化硅，乙酸乙酯)得到澄清的油1(10.15g，57％产率)。
Figure A20058002522200821
2.将四乙二醇单甲基醚(7.96g，0.038mol)和1(10.1，0.038mol)溶解于CH2Cl2(100mL)并加入BF3OEt2(0.48mL，0.0038mol)。在室温将反应搅拌过夜。用CH2Cl2(200mL)稀释粗产物，用饱和NaHCO3(300mL)，H2O(300mL)洗涤，MgSO4干燥，蒸干。柱层析法(二氧化硅，乙酸乙酯/MeOH，10∶1)得到澄清的油2(4.5g，25％产率)。
Figure A20058002522200822
3.将4-硝基氯甲酸酯(2.87g，14.3mmol)和2(4.5g，9.5mmol)溶解于CH2Cl2(45mL)中。搅拌10分钟后，加入TEA(2.1mL，15mmol)并在室温将反应搅拌过夜。用CH2Cl2(130mL)稀释粗反应物，用1MHCl(175mL)，H2O(175mL)洗涤，MgSO4干燥，蒸干。柱层析(二氧化硅，乙酸乙酯/MeOH，15∶1)得到黄色的油3(2.38g，40％产率)。
Figure A20058002522200831
4.将6-氨基己酸(0.126g，0.96mmol)和K2CO3(0.221g，1.6mmol)溶解于H2O(DI，5mL)。然后将3(0.5g，0.8mmol)溶解于THF(0.7mL)并逐滴加入。在室温将反应搅拌过夜。用H2O(20mL)稀释粗反应物，用HCl酸化至pH～1，用CH2Cl2洗涤(2×25mL)，MgSO4干燥有机相，并蒸干。柱层析(二氧化硅，CHCl3/MeOH，15∶1)得到澄清的油4(0.428g，85％产率)。
Figure A20058002522200832
5.使用方法II进行活化：4(0.40g，0.64mmol)，N-羟基琥珀酰亚胺(0.088g，0.77mmol)，EDCI(0.160g，0.83mmol)和CH2Cl2(5mL)。柱层析(二氧化硅，乙酸乙酯/MeOH，10∶1)得到澄清的油5(0.320g，69％产率)。
9.15直链PEG-烷基修饰部分(碳酸2，5-二氧-吡咯烷-1-基酯2-{2-[2-(2-{2-[2～(2-己氧基-乙氧基)-乙氧基]-乙氧基}-乙氧基)-乙氧基]-乙氧基}-乙基酯)的合成
1.将三乙二醇(30g，0.2mol)溶解于NaOH(8g溶于8mL H2O)溶液并搅拌10分钟。加入苄基氯(7mL，0.062mol)并将所述反应混合物加热至100℃并搅拌过夜。用饱和NaCl(500mL)稀释粗反应物用CH2Cl2洗涤(2×400mL)，MgSO4干燥有机相，并蒸干。柱层析(二氧化硅，乙酸乙酯与乙酸乙酯/MeOH，10∶1)得到黄色油1(9.87g，67％产率)。
Figure A20058002522200841
2.向1(9.87g，0.041mol)的CH2Cl2(50mL)溶液中加入TEA(7.1mL，0.054mol)。然后将所述溶液在冰浴中冷却至0℃，然后逐滴加入溶解于CH2Cl2(10mL)中的甲磺酰氯(3.9mL，0.049mol)。将所述反应在0℃搅拌0.5小时，然后室温搅拌4小时。将粗反应物过滤通过硅藻土，用CH2Cl2洗涤(100mL)，用饱和NaHCO3(150mL)，H2O(150mL)洗涤滤液，MgSO4干燥，蒸干得到黄色油2(11.06g，85％产率)。
Figure A20058002522200842
3.将四乙二醇(7.32g，0.038mol)溶解于四氢呋喃(140mL)，并在0.5小时内逐部分加入NaH，再将所述反应搅拌1小时。然后将2(6.0g，0.019mol)溶解于CH2Cl2(20mL)并逐滴加入且在室温将反应物搅拌过夜。将粗反应物过滤通过硅藻土，用CH2Cl2洗涤并蒸干。将所得油溶解于CH2Cl2(150mL)，用H2O(150mL)，饱和NaHCO3(150mL)，H2O(150mL)洗涤，MgSO4干燥并蒸干。柱层析(二氧化硅，乙酸乙酯/MeOH，10∶1)得到黄色的油3(3.83g，49％产率)。
Figure A20058002522200843
4.以制备2相同的方式：己醇(6.2mL，0.05mol)，甲磺酰氯(4.6mL，0.058mol)，TEA(8.6mL，0.065mol)和CH2Cl2(60mL)得到了黄色的油4(7.8g，86％产率)。
Figure A20058002522200851
5.向3(5.45g，0.13mol)的四氢呋喃(160mL)溶液中加入叔丁氧钾(1.60g，0.0144mol)并将所述反应搅拌1.5小时。然后逐滴加入溶解于四氢呋喃(20mL)的4(2.59g，0.0144mol)，并将反应搅拌过夜。将粗反应物过滤通过硅藻土，用CH2Cl2洗涤(100mL)，并蒸干。将所得油溶解于乙酸乙酯(150mL)，H2O(2×150mL)洗涤，MgSO4干燥并蒸干。柱层析(二氧化硅，乙酸乙酯)得到黄色油5(2.40g，36％产率)。
6.向5(2.4g，4.8mmol)的乙酸乙酯(16mL)溶液中加入以10wt％(1.0g)存在于活性炭上的钯，并用隔膜将反应容器封闭。然后通过针向所述隔膜中插入含有H2的气球，并将反应物在室温搅拌过夜。将粗反应混合物过滤通过硅藻土，乙酸乙酯洗涤并蒸干得到澄清的油6(1.61g，82％产率)。
7.将光气(phoshene)溶液(15mL，20％光气溶于甲苯)冷却至-10℃并逐滴加入溶解于甲苯(5mL)的6(1.60g，3.9mmol)。将反应在-10℃搅拌0.5小时，然后在室温搅拌4小时。光气和甲苯随后被馏出，将所得油真空干燥得到黄色油7。
Figure A20058002522200861
8.使用方法II进行活化：7(1.65g，0.79mmol)，N-羟基琥珀酰亚胺(0.437g，3.8mmol)，TEA(2.7mL，3.8mmol)和CH2Cl2(10mL)。柱层析法(二氧化硅，乙酸乙酯/MeOH，15∶1)得到澄清的油8(1.06g，57％产率)。
9.16支链烷基-PEG-烷基(6-[2-(2-{2-[2-(2-庚氧基-乙氧基)-乙氧基]-乙氧基}-乙氧基)-1-(2-{2-[2-(2-庚氧基-乙氧基)-乙氧基]-乙氧基}-乙氧基甲基)-乙氧基羰基氨基]-己酸2，5-二氧-吡咯烷-1-基酯)的合成
Figure A20058002522200862
1.以实施例9.15相同的方式进行制备：己醇(18mL，0.15mol)，甲磺酰氯(12.3mL，0.16mol)，TEA(25mL，0.18mol)和CH2Cl2(180mL)得到了黄色的油1(23.1g，85％产率)。
Figure A20058002522200863
2.将四乙二醇(50.5g，0.26mol)溶解于四氢呋喃(350mL)，在0.5小时内逐部分加入叔丁氧钾(29.2g，0.26mol)。将反应再搅拌1小时，然后加入溶解于THF(50mL)的1(23.0g，0.13mol)。在室温将反应搅拌过夜。将粗反应物过滤通过硅藻土，用CH2Cl2洗涤并蒸干。将所得油溶解于CH2Cl2(300mL)，H2O(2×300mL)洗涤，MgSO4干燥并蒸干。柱层析法(二氧化硅，乙酸乙酯)得到澄清的油2(18.51g，51％产率)。
Figure A20058002522200871
3.向2(10.0g，36mmol)的四氢呋喃(60mL)溶液中逐部分加入NaH(0.95g，40mmol)，并将反应搅拌0.5小时。逐滴加入表氯醇(14.1mL，0.34mol)，将反应在室温搅拌48小时。将粗反应混合物过滤通过硅藻土，用CH2Cl2洗涤并蒸干。将所得油溶解于CH2Cl2(200mL)，用饱和NaCl(200mL)，饱和NaHCO3(200mL)，H2O(200mL)洗涤，MgSO4干燥并蒸干。柱层析(二氧化硅，乙酸乙酯/己烷，10∶1)得到澄清的油3(5.46g，45％产率)。
Figure A20058002522200872
4.向2(4.54g，16mmol)和3(5.46，16mmol)的CH2Cl2(50mL)溶液中加入BF3OEt2(0.48mL，0.0038mol)。在室温将反应搅拌过夜。用CH2Cl2(50mL)稀释粗反应物，饱和NaHCO3(100mL)，H2O(100mL)洗涤，MgSO4干燥并蒸干。柱层析法(二氧化硅，乙酸乙酯与乙酸乙酯/MeOH，10∶1)得到澄清的油4(2.40g，24％产率)。
5.将4-硝基氯甲酸酯(1.18g，5.8mmol)和4(2.4g，3.9mmol)溶解于CH2Cl2(25mL)。搅拌10分钟后，加入TEA(0.89mL，6.4mmol)，并将反应在室温搅拌过夜。用CH2Cl2(75mL)稀释粗反应物，用1MHCl(100mL)，H2O(100mL)洗涤，MgSO4干燥并蒸干。柱层析法(二氧化硅，乙酸乙酯)得到黄色的油5(1.04g，34％产率)。
Figure A20058002522200881
6.将6-氨基己酸(0.157g，1.2mmol)和K2CO3(0.276g，2.0mmol)溶解于H2O(DI，8mL)。然后将5(0.80g，1.0mmol)溶解于THF(1.0mL)并逐滴加入。当3加入和乙醇(2mL)加入时产生油滴并在室温将反应搅拌过夜。用H2O(30mL)稀释粗反应产物，用HCl酸化至pH～1，用CH2Cl2洗涤(2×35mL)，MgSO4干燥有机相，并蒸干。柱层析法(二氧化硅，乙酸乙酯/MeOH，20∶1)得到澄清的油6(0.720g，46％yield)。
Figure A20058002522200882
7.使用方法II进行活化：6(0.356g，0.46mmol)，N-羟基琥珀酰亚胺(0.063g，0.55mmol)，EDCI(0.115g，0.6mmol)和CH2Cl2(3mL)。柱层析法(二氧化硅，乙酸乙酯)得到澄清的油7(0.180g，45％产率)。
9.17己酸2-[2-(2-{2-[2-[6-(2，5-二氧-吡咯烷-1-基氧基羰基氧基)-己基氨甲酰氧基]-3-(2-{2-[2-(2-己酰氧基-乙氧基)-乙氧基]-乙氧基}-乙氧基)-丙氧基]-乙氧基}-乙氧基)-乙氧基]-乙基酯
1.以实施例9.15相同的方式制备：四乙二醇(58.27g，0.3mol)，NaOH溶液(12g溶于12mL H2O中)，苄基氯(10.6mL，0.092mol)。柱层析法(二氧化硅，乙酸乙酯)得到黄色的油1(16.8g，64％产率)。
2.以实施例9.14相同的方式制备：1(9.6g，34mmol)，NaH(0.898g，37mmol)，四氢呋喃(50mL)，表氯醇(13.2mL，0.17mol)。柱层析法(二氧化硅，乙酸乙酯)得到澄清的油2(6.78g，58％产率)。
Figure A20058002522200893
3.以实施例9.14相同的方式制备：四乙二醇(4.85g，20mmol)，2(6.78g，25mmol)，BF3OEt(0.25mL，2.0mmol)，CH2Cl2(75mL)。柱层析法(二氧化硅，CHCl3/MeOH，20∶1)得到澄清的油3(2.85g，27％产率)。
Figure A20058002522200901
4.向3(2.80g，5.2mmol)的CH2Cl2(20mL)溶液中加入TEA(0.8mL，5.7mmol)并将溶液冷却至0℃。然后逐滴加入己酰氯(0.73mL，5.2mmol)。将反应在0℃搅拌0.5小时，然后室温搅拌过夜。用CH2Cl2(80mL)稀释粗反应物，用H2O(100mL)，饱和NaHCO3(100mL)，H2O(100mL)洗涤，MgSO4干燥并蒸干。柱层析法(二氧化硅，乙酸乙酯/MeOH，15∶1)得到黄色油4(1.95g，59％产率)。
Figure A20058002522200902
5.向4(1.94g，3.1mmol)的乙酸乙酯(20mL)中加入钯(1.60g，5wt％在活性炭上)。将所述反应封闭并在H2中搅拌过夜。将粗反应混合物过滤通过硅藻土，乙酸乙酯洗涤，蒸干得到澄清的油6(1.09g，65％产率)。
Figure A20058002522200903
6.向5(1.09g，2.0mmol)的CH2Cl2(14mL)溶液中加入TEA(0.31mL，2.2mmol)，并将溶液冷却至0℃。然后逐滴加入己酰氯(0.28mL，2.0mmol)。将反应在0℃搅拌0.5小时，然后室温搅拌过夜。用CH2Cl2(86mL)稀释粗反应物，用H2O(100mL)，饱和NaHCO3(100mL)，H2O(100mL)洗涤，MgSO4干燥并蒸干。柱层析法(二氧化硅，乙酸乙酯/MeOH，15∶1)得到微黄色油6(0.698g，55％产率)。
Figure A20058002522200911
7.以实施例9.14相同的方式制备：4-硝基氯甲酸酯(0.332g，1.65mmol)，6(0.698g，1.1mmol)，TEA(0.28mL，2.0mmol)，CH2Cl2(7mL)。柱层析法(二氧化硅，乙酸乙酯)得到黄色油7(0.688g，78％产率)。
Figure A20058002522200912
8.以实施例9.14相同的方式制备：6-氨基-1-己醇(0.142g，1.2mmol)，7(0.488g，0.6mmol)，TEA(0.12mL，0.9mmol)，CH2Cl2(5mL)。柱层析法(二氧化硅，乙酸乙酯/MeOH，15∶1)得到澄清的油8(0.30g，65％产率)。
9.使用方法I进行活化：N，N′-二琥珀酰亚胺基碳酸酯(0.118g，0.46mmol)，8(0.30g，0.38mmol)，TEA(80μL，0.57mmol)，乙腈(4mL)。洗涤得到澄清的油9(0.344g，90％产率)。
9.18 6-{2-(2-{2-[2-(2-己氧基-乙氧基)-乙氧基]-乙氧基}-乙氧基)-1-[6-(2-{2-[2-(2-甲氧基-乙氧基)-乙氧基]-乙氧基}-乙氧基)-己氧基甲基]-乙氧基羰基氨基}-己酸2，5-二氧-吡咯烷-1-基酯
1.以实施例9.15相同的方式制备：四乙二醇单甲基醚(25g，0.12mol)，TEA(19.5mL，0.14mol)，甲磺酰氯(10.0mL，0.13mol)，CH2Cl2(100mL)得到黄色油1(31.35g，91％产率)。
Figure A20058002522200923
2.将1，6-己二醇(7.93g，0.084mol)溶解于四氢呋喃(200mL)。在0.5小时内逐部分地加入叔丁氧钾(10.37g，0.092mol)，再搅拌1小时。然后将1(12.0g，0.042mol)溶解于四氢呋喃(40mL)并通过滴加漏斗逐滴加入并在室温下将反应搅拌过夜。将粗反应物过滤通过硅藻土，用CH2Cl2洗涤并蒸干。将所得油溶解于CH2Cl2(300mL)，H2O(2×300mL)洗涤，MgSO4干燥，蒸干。柱层析法(二氧化硅，乙酸乙酯)得到澄清的油2(5.09g，39％产率)。
Figure A20058002522200931
3.向2(5.0g，16mmol)的四氢呋喃(35mL)溶液中逐部分地加入NaH(0.422g，17.6mmol)并将反应搅拌2小时。然后逐滴加入表氯醇(6.3mL，8.0mmol)，并将反应在室温搅拌48小时。将粗反应混合物过滤通过硅藻土并用CH2Cl2洗涤。将所得油溶解于CH2Cl2(125mL)，用H2O(125mL)，饱和NaHCO3(125mL)，H2O(125mL)洗涤，MgSO4干燥并蒸干。柱层析法(二氧化硅，乙酸乙酯/MeOH，20∶1)得到澄清的油3(2.00g，34％产率)。
Figure A20058002522200932
4.以实施例9.14相同的方式制备：2(1.34g，4.8mmol)，3(1.75g，4.8mmol)，BF3OEt2(0.06mL，0.48mmol)，CH2Cl2(30mL)。柱层析法(二氧化硅，乙酸乙酯/MeOH，20∶1)得到澄清的油4(1.05g，34％产率)。
Figure A20058002522200933
5.以实施例9.14相同的方式制备：4-硝基氯甲酸酯(0.464g，2.3mmol)，4(1.0g，9.5mmol)，TEA(2.1mL，1.55mmol)，CH2Cl2(10mL)。柱层析法(二氧化硅，乙酸乙酯与乙酸乙酯/MeOH，20∶1)得到黄色油(0.663g，53％产率)。
Figure A20058002522200941
6.以实施例9.14相同的方式制备：6-氨基己酸(0.054g，0.41mmol)，5(0.277g，0.34mmol)，K2CO3(0.094g，0.068mmol)，H2O(DI，5mL)得到澄清的油6(0.268g，96％产率)。
Figure A20058002522200942
7.使用方法II进行活化：6(0.268g，0.34mmol)，N-羟基琥珀酰亚胺(0.047g，0.41mmol)，EDCI(0.084g，0.44mmol)和CH2Cl2(4mL)。柱层析法(二氧化硅，乙酸乙酯/MeOH，15∶1)得到澄清的油7(0.178g，58％产率)。
9.19多支链寡聚物的合成
Figure A20058002522200943
1.如实施例9.14进行制备。
Figure A20058002522200951
2.将二盐酸L-赖氨酸乙基酯(0.32g，1.3mmol)和1(1.71g，2.7mmol)溶解于DMF(30mL)中并加入TEA(0.90mL，6.5mmol)。在室温将反应混合物搅拌过夜。将粗反应物蒸干，溶解于CH2Cl2(30mL)，用1MHCl(30mL)，H2O(30mL)洗涤，MgSO4干燥并蒸干。柱层析法(二氧化硅，CHCl3/MeOH，25∶1)得到澄清的油2(1.O1g，66％产率)。
3.将溶解于1M NaOH(10mL)的2(1.0g，0.85mmol)在室温搅拌6小时。用饱和NaCl(50mL)稀释粗反应物，酸化至pH～2，用CH2Cl2洗涤(2×50mL)，MgSO4干燥，蒸干得到澄清的油3(0.724g，74％产率)。
4.使用方法II进行活化：3(0.070g，0.61mmol)，N-羟基琥珀酰亚胺(0.091g，0.79mmol)，EDCI(0.182g，0.95mmol)和CH2Cl2(7mL)。柱层析法(二氧化硅，CHCl3/MeOH，20∶1)得到澄清的油4(0.480g，63％产率)。
9.20糖-PEG-烷基修饰部分2，2-二甲基-丙酸4，5-二-(2，2-二甲基-丙酰氧基)-6-(2，2-二甲基-丙酰氧基甲基)-3-{6-[2-(2-{2-[2-(2，5-二氧-吡咯烷-1-基氧基羰基氧基)-乙氧基]-乙氧基}-乙氧基)-乙氧基]-己酰氨基}-四氢-吡喃-2-基酯)的制备
Figure A20058002522200961
1.以实施例9.15相同的方式制备：乙基6-羟基己酸酯(8.0g，0.05mol)，甲磺酰氯(4.6mL，0.06mol)，TEA(10mL，0.072mol)和CH2Cl2(32mL)得到了黄色油1(11.15g，93％产率)。
2.将四乙二醇(19.1g，0.098mol)溶解于四氢呋喃(190mL)并在0.5小时内逐部分加入NaH(1.69g，0.071mol)。将反应再搅拌1小时，然后加入溶解于四氢呋喃(10mL)的1(23.0g，0.13mol)。在室温将反应搅拌过夜。将粗反应物过滤通过硅藻土，用CH2Cl2洗涤并蒸干。将所得油溶解于CH2Cl2(200mL)，用饱和NaCl(200mL)，H2O(200mL)洗涤，MgSO4干燥并蒸干。柱层析法(二氧化硅，乙酸乙酯/MeOH，25∶1)得到澄清的油2(1.60g，10％产率)。
Figure A20058002522200963
3.将溶解于1M NaOH(6mL)的2(1.60g，4.7mmol)溶液在室温搅拌2小时。用饱和NaCl(24mL)稀释粗反应物，酸化至pH～2，用CH2Cl2洗涤(2×30mL)，MgSO4干燥，蒸干得到澄清的油3(1.08g，73％产率)。
4.将2，3，4，6-四-O-新戊酰-β-D-半乳糖苷吡喃糖苷胺(galactospyranosylamine)(0.836g，1.6mmol)和3(0.50g，1.6mmol)溶解于CH2Cl2(8mL)。然后加入EDCI(0.368g，1.92mmol)并在室温将反应搅拌过夜。搅拌过夜后，反应并不完全，因此加入EDCI(0.368g，1.92mmol)并在室温将反应搅拌过夜。用CH2Cl2(22mL)稀释粗反应物，用1M HCl(30mL)，H2O(30mL)，饱和NaCl(30mL)洗涤，MgSO4干燥并蒸干。柱层析法(二氧化硅，乙酸乙酯/MeOH)得到粘油4(0.397g，31％产率)。
5.使用方法I进行活化：4(0.397g，0.50mmol)，N-羟基琥珀酰亚胺(0.063g，0.60mmol)，TEA(0.10mL，0.75mmol)和乙腈(4mL)。柱层析法(二氧化硅，乙酸乙酯)得到粘油5(0.256g，56％产率)。
9.21可水解，非水解和PEG化的促尿钠排泄轭合物
本实施例旨在证明本发明提供可采用包括几乎各种寡聚部分，尤其是非水解性寡聚物、微PAG化寡聚物和可水解寡聚物的部分进行修饰的促尿钠排泄化合物轭合物的应用。
可以在所述肽的不同位置利用不同的寡聚物合成本发明的hBNP。具有多种性状(对受体的激动剂活性，对蛋白水解的抗性，和口服生物利用率)组合的所述轭合物可成为更深入体内检测中的首选候选物。
从签订了肽合成合同的公司获得了天然hBNP。用于轭合的两性寡聚物来自于某一批寡聚物和来自于特别针对与hBNP的轭合而设计和合成的寡聚物。所述轭合遵循于如图2所示的三层次轭合策略。首选对1类化合物进行检测。因为与1类寡聚物的广泛轭合减弱了活性，因此测定具有2类寡聚物的三-和四-轭合物。因为2类寡聚物并非同样高效，因此可对两种原药轭合物(3类寡聚物)进行评定。
第一类轭合物是非水解的。对于这类轭合物，所剂量给药的药物物质(即，所述轭合物)是作为受体发挥作用的物质。换言之，所述寡聚物及其与所述肽的连接从给药时间直到清除时间都保持完整。这些寡聚物一般都由烷基部分和PEG部分构成。为了使得所述寡聚物将所述轭合物变为可口服和对蛋白水解具有抗性的效果最大化，可以对所述烷基和PEG部分部分的长度进行改变并对其顺序进行调换。也可对轭合程度进行处理。属于该第一类的有一些能够提供轭合物的寡聚物，以及在Ekwuribe的美国专利第5,359,030号；Ekwuribe的美国专利第5,438,040号；Ekwuribe的美国专利第5,681,811号；Ekwuribe的美国专利第6,191,105号；申请日为1999年12月31日的的美国申请第09/474,915号；申请日为1999年12月13日的的美国申请第09/459,443号；以及申请日为2001年6月4日的美国申请第09/873,797号中所描述的提供了这些轭合物的方法，在此将其全文引入作为参考。
第二类轭合物是微PAG化的。对这类轭合位而言，一旦所述轭合物处于血流中，所述寡聚物的烷基部分就被剪切掉。当轭合是在与受体，NPR-A发生结合所必需的促尿钠排泄肽区域内进行时，这些轭合物是尤其有用的。在这种情况下，第一类寡聚物对稳定性和递送是有益的，但对活性却是有害的。第二类轭合物降低或消除了这一问题。所述两性寡聚物在通过了消化道之后依然保持完整，并增强了在上十二指肠的吸收。一旦进入循环，所述烷基部分就被剪切掉。因此，当其到达所述受体时，较小的寡聚物与循环肽连接。在一些实施方案中，空间位阻的减少引起受体活性的加强。属于这种第二类的一些能够提供轭合物的寡聚物，以及提供这种轭合物的方法描述在Ekwuribe的美国专利第6,309,633号以及申请日为2001年12月19日的美国申请第10/018,879号中，在此将其全文引入作为参考。
第三类轭合物是完全可水解的。对这类轭合物而言，一旦所述轭合物被吸收，整个寡聚物就被剪切掉。与第二类轭合物相类似，当轭合发生在结合所必需的区域内时，这些轭合物是尤其有用的。然而，在所述微PAG化轭合物依然不能保留足够活性的情况时，第三类轭合物可以完全地避免所述寡聚物干扰与受体结合的可能性。在这种情况下，所述轭合物在通过消化道之后依然保持完整。一旦所述轭合物被吸收，所述寡聚物就被剪切，然后将天然肽释放至循环中。
hBNP的轭合。可以使用N-羟基琥珀酰亚胺，一种肽化学中的常用活化基团来活化两性寡聚物(C6PEG7)的羧基。一旦活化之后，所述寡聚物就可在水溶性或DMSO溶液中与所述肽相连接。hBNP有四个轭合位点：3个Lys残基和其N末端。根据改变反应的化学计量学，可以对轭合程度(单轭合，二轭合等)进行控制。通过改变反应条件也可以改变产物分布情况。通过活性分析发现了轭合的优选位点，也可通过改变化学计量学和反应条件获得所希望轭合物的优选合成。
PEG-烷基寡聚物的选择。通过改变烷烃(疏水性)和PEG(亲水性)成分的相对长度，可以改善所述轭合物的两亲性和溶液结构。PEG部分在溶液中具有很强的挠性并且对酶的抗性具有重要作用。所述烷基部分可增强在消化道中的吸收和/或影响与细胞膜的相互作用。当所述靶位是细胞表面的膜结合蛋白，例如NPR-A时，后一个特征是特别重要的。因此，对寡聚物的选择可以确定轭合物在酶稳定性和口服生物利用率方面的有效性。
hBNP轭合物的纯化。可使用由异丙醇/水(0.1％三氟乙酸)制成的溶剂梯度系统在制备HPLC柱(C-18)上纯化所述反应混合物。将溶剂蒸发并冷冻干燥得到干燥的产物。通过反相HPLC和质谱来确定轭合物的纯度。
9.21.1 1类寡聚物：非水解的
已合成了超过30种采用非水解寡聚物(1类)的轭合物。对这类轭合物而言，所给药的药物物质是作为受体发挥作用的物质。换言之，所述寡聚物及其与所述肽的连接从给药时间直到清除时间都保持完整。肽作图实验说明了在hBNP上与所述寡聚物结合的位点。通过改变加入至所述反应中的寡聚物量，可将产物分布变得不对称。所形成的主要单轭合物是在Lys3轭合的；主要的二轭合物具有在Lys3和Lys4连接的寡聚物。改变反应条件，可形成单独产物的三轭合物和/或四轭合物。三轭合物的特征是在Lys3，Lys14和Lys27具有寡聚物连接。四轭合物在N末端加上了第四个连接。最开始可将全部获得的单-，二-，三-和四轭合物进行分离，在体外测定活性。根据活性数据，当使用1类寡聚物时，就集中在Lys3单轭合物。
9.2 1.2 2类寡聚物：微PEG化的
因为Lys14和Lys27位于(或邻近)BNP的结合部分，这些位点的微PEG轭合能够使所述肽更加完全地轭合并依然保持活性，根据这一理论，合成了采用微PEG化(2类)的8种轭合物。所述两性寡聚物在通过消化道后依然保持完整，并增强了在十二指肠的吸收。一旦进入循环，所述烷基部分就被剪切掉。因此，当其到达所述受体时，较小的寡聚物与循环肽连接。可以在剪切所述烷基基团之前和之后合成这类三-和四-轭合物。即使当所述烷基被剪切之后，在三个或四个位点上与BNP连接的小PEG单位对活性依然是有害的(数据在下一部分中显示)，尽管这些轭合物保持了治疗显著的活性程度。
9.21.3 3类寡聚物：可水解的寡聚物
合成了8种采用完全可水解寡聚物(3类)的轭合物。对这类轭合物而言，其在通过消化道之后依然保持完整。一旦所述轭合物被吸收，所述寡聚物就被剪切掉，在循环中释放出了天然肽。与第二类寡聚物相类似，当轭合发生在结合所必需的区域内时，这些轭合物是尤其有用的。然而，在所述微PEG化轭合物未能保持其活性的情况下，第三类轭合物完全避免了所述寡聚物干扰受体结合的可能性。从这类寡聚物可制备单-，二-，三-和四-轭合物。三-和四-轭合物是更不稳定的。对这两种轭合物进行了测定。
可使用由异丙醇/水(0.1％三氟乙酸)制成的溶剂梯度系统在制备HPLC柱(C-18)上纯化所述反应混合物。将溶剂蒸发并冷冻干燥从而提供了呈干燥粉末的所述轭合物。通过反相HPLC和质谱来确定轭合物的纯度。
在所述分析中对天然BNP进行测定，从而提供了针对于天然和野生型hBNP肽的活性的测定。所采用的天然hBNP是1-32氨基酸序列的肽SPKMVQGSGCFGRKMDRISSSSGLGCKVLRRH，(SEQ ID NO：98)，其中C10和C26由二硫键相连成键。在表1中提供了29种所述构建体的结果和结构。测定了BNP轭合物的EC50和Emax，并将这些值与在相同实验条件下获得的天然肽测定值进行比较。这些数据与没有寡聚部分天然BNP(1-32氨基酸)的比较如表1所示。其结果说明包括有1类修饰部分Lys3(BNP-002)的BNP单轭合物，以及在Lys14或Lys27包括有2类修饰部分的BNP单轭合物是优选的。
单-1，单-2，单-3和单-4是BNP的单轭合物，并以其从HPLC中洗脱出来的顺序进行标记。在下表中，单-1 BNP是如下的BNP肽轭合物：其包括了在Lys-3 BNP残基上显示的修饰部分(寡聚物结构)。单-2和单-3共同从HPLC中洗脱出来，其是Lys-14和Lys-27的混合物。二轭合物通常是从HPLC一起洗脱出来的混合物。主要的二轭合物是Lys3/Lys14和Lys3/Lys27。主要的三轭合物是在Lys3，Lys14和Lys27轭合的。鉴定为“单-4”的产物包括在所述BNP肽N末端的修饰部分(寡聚物)。“单-1”包括在所述BNP肽Lys3的修饰部分。“单-2”产物包括在所述BNP肽Lys14上，或在所述BNP肽Lys27上轭合的修饰部分(寡聚物)。结果参见图6a-d所示的表。
9.22促尿钠排泄肽候选物-尿扩张素，树眼镜蛇促尿钠排泄肽(DNP)和犬促尿钠排泄肽
可以预期本发明的轭合技术可被应用于多种不同的促尿钠排泄肽和这些肽的类似物，从而构建出任意数量具有生物学活性的不同促尿钠排泄肽轭合物实施方案，在这些实施方案中，所述轭合物保留了药理学活性，增强了细胞膜渗透性，和/或蛋白酶抗性。除了本说明书中几个实施例所描述的hBNP，这些候选肽还包括了部分列举如下的从以下生物等价肽/蛋白质组合中制备和/或分离出来的肽，肽片段和全肽，以及多种构建体肽。本发明的范围还包括了在本发明实施方案制剂中的这些构建体及其保守性取代构建体，以及如本发明所述在治疗充血性心力衰竭中具有至少一个修饰部分以轭合形式存在的含有这些构建体的药物制剂。这些肽具有适合修饰轭合部分的结构
1.尿扩张素(在N末端具有4个额外残基的hANP)
TAPRSLRRSSCFGGRMDRIGAQSGLGCNSFX1Y(SEQ ID NO：99)
氨基酸T限定了修饰部分轭合位点。在上述序列中，X1是赖氨酸或者是除精氨酸之外的氨基酸。当X1是赖氨酸时，可以提供另一个修饰部分轭合位点。
2.犬促尿钠排泄肽(犬NP)
犬促尿钠排泄肽具有生产轭合物的天然优势。在其环结构上不存在轭合位点。轭合位点仅存在于N-和C-末端。这些特征使得轭合能够不丧失活性。其还导致了产物的更小分布，具有更高的产量且更容易纯化。
SPX1MMHX2GGCFGRRLDRIGSLSGLGCNVLRX3Y(SEQ.ID.NO：100)
X1，X2和X3的氨基酸位点是修饰部分轭合位点。在这种中性肽中，全部3种肽可用于具有修饰部分的轭合。其环区域定义为氨基酸10(C)-氨基酸26(C)。可以预期，在位点3，14或27上的任意2种或全部3种氨基酸都可以被除Lys之外的残基，如Arg所取代。
3.树眼镜蛇促尿钠排泄肽(DNP)
EVX1YDPCFGHX2IDRINHVSNLGCPSLRDPRPNAPSTSA(SEQ ID NO.101)
X1和X2的氨基酸位点是修饰部分轭合位点。在本实施例中，X1和X2都是氨基酸Lys。在一些实施方案中，X1是Arg或X2是Arg。N末端同样也是轭合位点。优选地，当X1是精氨酸时，X2是Arg(或除赖氨酸之外的氨基酸)。任意地，所述肽可在N末端包括另一个轭合位点。
4.C-型促尿钠排泄肽(CNP)
GLSK1GCFGLK2LDRIGSMSGLGC(SEQ ID NO.：)
K1和K2的氨基酸位点是修饰部分轭合位点。在本实施例中，K1和K2都是氨基酸Lys。然而，所述肽的类似物可包括在该肽这些位点的任意一个或两个上用Arg(R)代替Lys。任意地，所述肽可在N末端包括另一个轭合位点。
5.ANP(人)(大鼠)(猪)
SLRRSSCFGGRXDRIGAQSGLGCNSFRY(SEQ ID NO.：103)
在这个实施例中，X是Met(M)或Ile(I)，且其中在所述N末端有一个修饰部分轭合位点，或R变为K从而提供了一个修饰部分位点。
9.23对人促尿钠排泄肽受体A(NPR-A)的激动剂活性
BNP的血管舒张，促尿钠排泄和利尿性质归因于第二信使，环GMP(cGMP)。cGMP的产生是由鸟苷酸环化酶完成的，鸟苷酸环化酶是当BNP结合于内皮细胞表面的促尿钠排泄肽受体A(NPR-A)时活化的。还对具有非水解(1类)或微PEG化(2类)寡聚物的轭合物在人动脉内皮细胞(HAEC)中刺激cGMP产生的能力进行了测定。对微PEG化基团而言，可对具有和不具有烷基部分连接的轭合物进行检测。在本分析中未对具有完全可水解的寡聚物(3类)的轭合物进行测定，因为所述化合物在循环中最终释放的是天然肽。
采用非水解(1类)寡聚物的三-和四-轭合物活性较低。因此，制备病测定了采用微PEG化的(2类)寡聚物的三-和四-轭合物。从这些2类寡聚物产生的体外数据如表2所示。
表2：采用2类寡聚物的hBNP轭合物体外活性
  hBNP或hBNP轭合物   轭合程度     平均EC50(nm)   平均Emax(％)
  天然hBNP   无     236(+/-)120   100
  BN-007   三     ＞10,000   ＜20
  BN-008   四     ＞10,000   ＜20
  BN-010   四     ＞10,000   ＜20
  BN-013   四     ＞10,000   ＜20
  BN-014   三     ＞10,000   26.5
  BN-015   四     ＞10,000   ＜20
  BN-016   四     ＞10,000   24.6
  BN-018   四     ＞10,000   ＜20
图3所示为使用1类寡聚物的多种Lys-3轭合物的活性曲线。表2中的4种轭合物具有与以BNP肽的天然形式所得活性最接近的平均Emax和平均EC50(表3)并采用其他分析对其进行进一步分析。
表3：hBNP轭合物的体外活性
    化合物     平均EC50(nm)     平均Emax(％)     N
    天然hBNP     236(+/-)120     100     25
    BN-002     387(+/-)171     102     5
    BN-021     355(+/-)140     90     5
    BN-022     364(+/-)99     79     5
    BN-024     296(+/-)172     87     6
从Clonetics购买初级HAEC进行cGMP筛选。在实验前一天将细胞接种入12孔板内。在实验当天，用0.5mM IBMX在37℃对细胞预孵育10分钟从而抑制磷酸二酯酶。向所述细胞中加入测试化合物，在37℃再保持1小时，通过裂解细胞中止孵育来测定cGMP。使用基于ELISA的cGMP试剂盒测定cGMP产生(CatchPoint-cyclic GMPFluorescent Assay Kit，catalog #R8074，Molecular Devices Corp，Sunnyvale，CA)。该试剂盒通过在96孔模式中的竞争性免疫分析来测定cGMP。向包被的微孔板中加入细胞裂解物，然后再建如抗-cGMP抗体和辣根过氧化酶(HPR)-cGMP轭合物。将微孔板在室温孵育2小时，然后洗涤4次。加入底物溶液并对每个小孔的荧光强度进行定量。荧光信号的强度随着cGMP水平的增高而降低。在每个实验中将天然hBNP作为阳性对照。
9.24 BNP轭合物及其升高的对蛋白酶的抗性
在存在多种蛋白酶，例如胰蛋白酶和糜蛋白酶的情况下对在体外具有活性的促尿钠排泄化合物进行活性测定。可通过在存在胰蛋白酶和糜蛋白酶情况下，所述化合物轭合物的半衰期来测定轭合于蛋白酶的这些化合物的稳定性。因此，在这些分析中的若干轭合物都具有比天然hBNP更长的半衰期。例如，参见图4。
在37℃将轭合物与酶孵育2-120分钟。通过加入1∶1的1％三氟乙酸(TFA)∶异丙醇淬灭溶液中止消化。在每个实验中都将hBNP轭合物的消化与天然hBNP的消化进行比较。通过HPLC对每个样本中残留的母体化合物量进行定量。
9.25 BNP轭合物及其口服生物利用率
在大鼠中，对在体外具有活性的轭合物测定了其口服生物利用率。通过强饲向胃肠道给药所述轭合物，并使用可获得的放射免疫分析方法测定了血流中hBNP轭合物的存在。用于hBNP检测的抗体是特异性的；与大鼠BNP的交叉反应活性低于1％。因此，由内源大鼠BNP引起的交叉反应性和干扰不在考虑范围之内。
使用体重约250g的成年，雄性大鼠来测定hBNP和hBNP轭合物的口服生物利用率。将大鼠固定过夜并随意提供饮水(除了在给药前2小时至给药后1小时之间不给水)。
给药前，将大鼠称重并通过体重分为给药组，使得每个给药组的重量大约相同。每个时间点使用5只大鼠。以2.5mg/kg剂量以液体脂肪酸制剂的形式给药轭合物。在给药后5，15，30和60分钟采集血液样本。收集所有给药实验的中枢静脉血并离心。将血浆样本冷冻于-80℃进行分析。
使用特异性针对于血浆中人BNP定量测定的商业化免疫放射计量分析(IRMA)(SHIONORIATM BNP，Catalog # 127024，Shionogi & Co.，Ltd，Osaka，Japan)来测定hBNP轭合物的血浆浓度。从给药的大鼠中抽取血液放入EDTA包被的塑料聚乙烯对苯二甲酸盐，(PET)血液收集管中，并在冷冻(2-8℃)离心机中1600-2000x离心5分钟。将样本保存于塑料管保存于-80℃的无霜冰箱中直至使用。用500μL样本进行IRMA。向具有200μL 125I-BNP试剂和一个抗-BNP抗体包被珠子的管中加入100μL所述样本。将每个管进行漩涡振荡并在孵育时停止振荡，在2-8℃条件下保持18-22小时。然后对所述管进行吹吸并用2.0mL洗涤溶液(缓冲溶液+0.05％NaN3)洗涤然后再次吹吸。重复洗涤过程并吸出管中的内容。通过γ计数器测定每个管中剩余的放射活性。放射活性与样本中hBNP和hBNP轭合物的浓度成正比。为了正确定量hBNP轭合物样本并允许在hBNP轭合物与天然分子之间存在抗体识别差异，浓度是根据从适当hBNP轭合物得到的标准曲线进行测定的。
在给药5分钟之后，在大鼠中给药的四种轭合物在循环中全部可以检测到(图5)。这四种轭合物是BNP-002，BN-021，BN-022和BN-024。
9.26在肽结构上二轭合物，单轭合物和三轭合物聚合物修饰的制备
本实施例旨在证明本发明在构建选择的多轭合形式生物活性肽中的应用。例如，本说明书描述了人促尿钠排泄肽，hBNP的单轭合物，二轭合物和三轭合物形式。
轭合于hBNP的方法：
通过用于与hBNP轭合的相同方法对寡聚物进行连接。区别在于可以加入更多的活化寡聚物(1-10种等价物；优选为3-5种等价物)。
赖氨酸存在于序列的末端。在蛋白酶存在的条件下，假定多个轭合位点会提供更高的稳定性。环内缺乏轭合位点对于在NPR-A结合基序上进行结合是有利的。
9.27hBNP两性聚合物轭合物的合成
通过使用不同尺寸和化学组成的两性寡聚物，可以改变肽轭合物，例如hBNP轭合物的吸收和分配性质。轭合物筛选可用来确定哪一种轭合物保留了天然肽的活性并表现出对酶的抗性。具有所希望性状组合(例如，对受体的激动剂活性，对蛋白水解的抗性和口服生物利用率)的轭合物可称为更广泛体内检测的首要候选物。
9.27.1轭合于BNP的一般程序
单轭合物hBNP使用的位点是Lys3或Lys14，或Lys27，或所述肽的N末端。
方法I：单轭合物的制备
将hBNP(1当量)溶解于DMSO(1ml/35mg h-BNP)中。将活化的寡聚物(1.1当量)溶解于最小量的THF中，并加入h-BNP的DMSO溶液中。用HPLC监测所述反应。通过取50μL所述反应并将其稀释入500μL含有0.1％TFA的H2O中，制备适于HPLC监测的样本。反应进行45分钟。如果反应没有立即纯化，则将其冷冻直至再次进行纯化之时。
方法II：多轭合物的制备
将hBNP(1当量)溶解于DMSO(1ml/35mg h-BNP)中。一旦h-BNP溶解，加入TEA(120当量)并将溶液搅拌5分钟。然后将活化寡聚物(对二轭合物而言为2.2当量，对三轭合物而言为4当量，对四轭合物而言为5当量)溶解于最少量THF中，并加入至h-BNP的DMSO溶液中。用HPLC监测所述反应。通过取50μL所述反应并将其稀释入500μL含有0.1％TFA的H2O中，制备适于HPLC监测的样本。反应进行45分钟。如果反应没有立即纯化，则将其冷冻直至再次进行纯化之时。
二轭合物hBNP使用的位点是hBNP上的Lys3，和Lys14，或Lys3和Lys27。
二轭合物hBNP使用的位点是Lys3，Lys14和Lys27。
9.28促尿钠排泄化合物类似物
本实施例旨在证明本发明所提供多种具有生物活性的BNP-类肽及其肽片段在实施本发明时的应用。这些变体形式，或类似物的特征在于存在一个或多个突变的氨基酸替代了对应天然肽/蛋白的天然存在的氨基酸。
1.hBNP-环区域单独的类似物
CFGRXMDRISSSSGLGC-(SEQ ID NO.1)
其中X是除了Lys的氨基酸，或X为Arg或Gly。
2.hBNP-3Arg的类似物或除了Lys的氨基酸
-SPRMVQGSG-CFGRKMDRISSSSGLGC-X2-(SEQ ID NO.104)
其中X2是长度为1-10的氨基酸，优选为1-6氨基酸。在一些实施方案中，X2是KVLRRH(SEQ ID NO.105)，KVLRR(SEQ ID NO.1045，KVLR(SEQ ID NO.106)，KVL，KV，K，RVLRRH(SEQ ID NO.16)，RVLRR(SEQ ID NO.16)，RVLR(SEQ ID NO.17)，RVL，RV或R。
3.hBNP-3突变位点的类似物；3Arg，14Arg，27Arg
SPX1MVQGSG-CFGRX2MDRISSSSGLGC-X3VLRRH(SEQ ID NO.107)
其中X1是Lys或除了Lys的其他氨基酸，X2是除了Lys的其他氨基酸，X3是Lys或除了Lys的其他氨基酸。在一些实施方案中，X1，X2和X3是独立的Arg或Gly。在其他实施方案中，X1是Lys，X2和X3是独立的Arg或Gly。在优选实施方案中，X1，X2和X3中的至少一个是Lys。
4.hBNP-14和27Arg的类似物，具有一个末端修饰位点，X1。
X1SPKMVQGSG-CFGRX2MDRISSSSGLGC-X3VLRRH-(SEQ ID NO.108)
其中X1是C末端修饰位点(Ser)；且其中X2和X3是除了Lys之外的其他氨基酸。在一些实施方案中，X2和X3是独立的Arg或Gly。在其他实施方案中，X2是Arg且X3是Lys。
5.hBNP-14Arg的类似物
(在全部片段中，其中一个或两个末端都缩短至环)
X1---CFGRRMDRISSSSGLGC-X2(SEQ ID NO.109)
其中X1的长度为1-10个氨基酸，优选为1-9个氨基酸，且其中X2的长度为1-10个氨基酸，优选为1-6个氨基酸。X1可包括SPKMVQGSGC(SEQ ID NO.110)，PKMVQGSGC(SEQ ID NO.111)，KMVQGSGC(SEQ ID NO.112)，MVQGSGC(SEQ ID NO.113)，VQGSGC(SEQ ID NO.114)，QGSGC(SEQ ID NO.115)，GSGC(SEQ IDNO.116)，SGC，GC，C，SPK，SPKM(SEQ ID NO.117)，SPKMV(SEQID NO.118)，SPKMVQ(SEQ ID NO.119)，SPKMVQ(SEQ ID NO.119)，KMVQ(SEQ ID NO.120)，KMV，KMVQG(SEQ ID NO.121)，KMVQGS(SEQ ID NO.122)，KMVQGSG(SEQ ID NO.123)或KMVQGSGC(SEQ ID NO.112)。X2可包括KVLRRH(SEQ ID NO.105)，KVLRR(SEQ ID NO.105)，KVLR(SEQ ID NO.106)，KVL，KV，K，RVLRRH(SEQ ID NO.16)，RVLRR(SEQ ID NO.16)，RVLR(SEQ ID NO.17)，RVL，RV或R。
6.hBNP-1-29-3Arg的类似物或除了Lys的其他氨基酸
SPX1MVQGSG-CFGRKMDRISSSSGLGC-KVL(SEQ ID NO.124)
其中X1是Arg，或除了Lys的其他氨基酸。
7.hBNP-1-26-3Arg的类似物或除了Lys的其他氨基酸
SPX1MVQGSG-CFGRKMDRISSSSGLGC(SEQ ID NO.125)
其中X1是Arg，Gly，或除了Lys的其他氨基酸。
8.hBNP-缩短的C-末端Lys14Arg，27Arg，或除了Lys的其他氨基酸的类似物
X1-CFGRRMDRISSSSGLGC-RVLRRH(SEQ ID NO：126)
其中X1的长度为1-10个氨基酸，优选为1-9个氨基酸。X1可包括SPKMVQGSGC(SEQ ID NO.110)，PKMVQGSGC(SEQ ID NO.111)，KMVQGSGC(SEQ ID NO.112)，MVQGSGC(SEQ ID NO.113)，VQGSGC(SEQ ID NO.114)，QGSGC(SEQ ID NO.115)，GSGC(SEQ IDNO.116)，SGC，GC或C。
9.hBNP-Lys14Arg的类似物或除了Lys的其他氨基酸
-CFGRX1MDRIX2GLGC-(SEQ.ID.NO.127)
其中，X1是Arg或除了Lys之外的其他氨基酸，且X2的长度为1-4个氨基酸。在一些实施方案中，X2是SSSS(SEQ ID NO.3)，SSS，SS，S，KSSS(SEQ ID NO.4)，KSS或KS。
1O.hBNP-Arg30Lys类似物或类似电荷的其他等价氨基酸
SPKMVQGSGCFGRKMDRISSSSGLGCKVRX1RH(SEQ ID NO.128)
其中，X1是Lys或除了Arg之外的其他氨基酸。
11.hBNP-27Arg或除了Lys的其他氨基酸的类似物
SPKMVQGSGCFGRKMDRISSSSGLGCX1VLRRH(SEQ ID NO.129)
其中，X1是Arg或除了Lys之外的其他氨基酸。
12.hBNP的延伸形式
-SPKMVQGSG-CFGRKMDRISSSSGLGC-KVLRRH-X2(SEQ IDNO.130)
X2是Lys，Cys，或Lys+Xaan，其中n为1-100，1-50或1-10，且Xaan是独立选择的任意氨基酸，或氨基酸组，或未知的氨基酸。
13.hBNP突变体类似物的缺失
-CFGRX1MDRIX2GLGC-(SEQ ID NO.131)
其中，X1是Arg或除了Lys之外的其他氨基酸，且其中X2的长度为1-4个氨基酸，例如SSSS(SEQ ID NO.13)，SSS，SS，S，KSSS(SEQID NO.4)，KSS或KS。
14.hBNP类似物-受体特异性
SPZ1MVQGSG-CFGRZ2MDRISSSSX1X2X3C(SEQ ID NO.132)
其中，Z1是精氨酸或除了赖氨酸之外的其他氨基酸，且其中Z2是精氨酸或除了赖氨酸之外的其他氨基酸，其中X1是Gly Met Leu，Phe，Ile或其保守的取代物，其中X2是Leu，Trp，Tyr或Phe或其保守的取代物，且其中X3是Gly，Arg或其保守的取代物。在这种类似物的其他实施方案中，Z1是赖氨酸且Z2是精氨酸或除了赖氨酸之外的其他氨基酸。
15.ANP类似物
KCFKGKNDRX1KX2QSGLX3C-NSFKY(SEQ ID NO.133)
其中X1是T，a，R，H，P，E；
其中X2是K，N-甲基，Arg，S，D或P；
其中X3是Arg，K，Y，F，S，P，Orn，Har，Har，对脒基苯基Ala，I，除了Gly或Try的具有正电荷的其他氨基酸。
9.26为生产BNP轭合物的天然BNP和BNP原肽和原肽的重组生产方法
口服给药方式需要大量的BNP肽供给。由于与供给BNP相关的合成方法成本较高且供给量有限，对于制备所述轭合BNP肽而言重组技术是优选的。在此描述了为生产所述轭合物而供给肽的重组技术。
9.26.1重组技术的选择
目的在于选择一种高表达的重组技术，其能够表达无需糖基化的小蛋白(＞10,000K)，且具有容易分离的以可溶形式分泌的肽。
使用了基于E-coli的表达系统(Seilhamer等人的美国专利第5,114,923号，在此将其全文引用作为参考)，来生产适用于核准药物Natrecor_的大量BNP。E-coli细菌系统的使用是公知的，且在过去多年中被广泛地应用于单链蛋白的重组生产产业中。E-coli系统是用于实验室的较简单的系统。现已开发了许多新的E-coli系统，其具有较高的细胞密度来提供较高的蛋白表达产量。然而，一般而言，基于E-coli系统的使用存在有局限，因为其具有以不溶形式将蛋白分泌成为包含体的趋势，并且可被不适当地折叠(在半胱氨酸氨基酸残基之间的不适当二硫键)。这些局限通常导致了高成本较好的，和昂贵的下游处理步骤将所述蛋白从包含体中分离出来，并将不适当折叠的蛋白重新折叠成其天然状态。
9.27原蛋白(原-BNP)序列的构建体
所述促尿钠排泄化合物可以是在序列上具有两个或更多促尿钠排泄化合物单位的肽并可在所述促尿钠排泄化合物单位之间任意地包括间隔物，且所述构建体还可任意地在所述促尿钠排泄化合物的任意一个末端或两个末端包括引导序列和/或延伸序列。例如，在对肽没有限制的条件下，对任意特定的构建体而言，所述多肽可具有以下结构：
NP-[NP]n；
NP-[间隔物-NP]n；
引导物-NP-[NP]n；
引导物-NP-[间隔物-NP]n；
引导物-[间隔物-NP]n；
引导物-[间隔物-NP]n-延长物；
引导物-NP-[间隔物-NP]n-延长物；
其中，n可以是，例如，1，2，3，4，5，6，7，8，9或10；NP是促尿钠排泄肽或促尿钠排泄肽类似物：
  9.29原-BNP
  本发明还提供了原-X-肽，其中X是促尿钠排泄肽。可将适于BNP的所述原-X-肽设计成与Pro部分一样携带有引导肽，且其可通过酶切位点连接于BNP序列。可对基因序列进行设计，使其能够在选定的重组技术中编码如原-BNP肽的肽表达。可对原-部分进行选择从而使得对来自发酵的方案进行更有效的纯化。原-BNP肽可与寡聚物在表达后轭合，且随后通过选定的酶对所述原部分进行剪切，动员(mobilized)或固定，从而提供了通过常规色谱方法更容易纯化获得较高产率的BNP轭合物。在原部分和BNP序列之间可包括特异性的酶切位点，从而使得所述原部分可被酶切从而产生所述BNP序列。
9.29.1原-BNP模式合成
可采用具有BNP序列和其他特异性氨基酸的合成原-BNP模型对所述原-BNP构建体进行评估。所述合成模型可与寡聚物轭合并容易受到特异性酶的剪切从而监控BNP-寡聚物轭合物的产生。
9.29.2原-BNP模式合成
引导序列(原部分)可包括根据所述合成模型得到的具有特异性酶切序列的小肽。可在引导/间隔序列中插入其他具有功能的氨基酸序列从而允许简单的原-BNP蛋白纯化。引导序列还可作为原-部分在轭合过程中保护N-末端不受到不希望的修饰，并在特异性的酶处理过程后被剪切。还可以向所述引导肽序列中引入其他特征从而允许其可作为原-BNP或原-BNP寡聚物轭合物被简单分离出来。所述引导肽可连接于所述BNP序列的C-末端。所述引导肽可被设计成允许公知融合蛋白的连接。
9.29.3原-BNP的表达
可以在BNP的N-末端或/和C-末端提供具有功能的特异性引导序列，其可适于插入选定重组技术的表达基因序列或表达盒中。还可以将公知融合蛋白的表达序列(参见Gaken等人，2000，将其全文引用作为教导相关融合蛋白的参考)插入某个所述构建体的表达基因中。使用已经建立的技术，可对所述细胞中成功转化的基因进行监测。将阳性的转基因分离物或细胞分离出来并进行生长，以评价所设计蛋白的表达情况。对所表达的蛋白进行纯化和测序。然后对纯化的原-BNP构建体进行评价。对选定的细胞系进行表征并选择以用作未来使用。
9.29.4用胰蛋白酶和羧肽酶-B剪切间隔物和His标记的引导肽来构建原-五肽BNP-1
根据通式：引导物-NP-[间隔物-NP]n，可提供原五肽BNP-1全长的编码序列，其中：
间隔物是：Arg-Arg-Asp-Ala-Glu-Asp-Pro-Arg(SEQ ID NO.78)，
引导物是：Glu-Gly-Asp-Arg-Arg(SEQ ID NO.79)，
延伸物是：(His)6-Glu-Gly-Asp-Arg-Arg(SEQ ID NO.80)；
NP是hBNP。
在这一实施方案中，可以使用胰蛋白酶和羧肽酶B酶混合物释放所述NP或NP轭合物。
(a)质粒构建
采用标准的分子生物学技术，构建了表达原-五肽BNP1[(His)6-Glu-Gly-Asp-Arg-Arg.]-BNP-Arg-Arg-Asp-Ala-Glu-Asp-BNP-Arg-Arg-Asp-Ala-Glu-Asp-BNP-Arg-Arg-Asp-Ala-Glu-Asp-BNP-Arg-Arg-Asp-Ala-Glu-Asp-BNP]氨基酸序列(SEQ ID NO.134)的载体。所述质粒对于所使用的宿主细胞(例如，E coli)进行了密码子优化。
可将编码这一肽序列的DNA片段进行人工拼接，从引导物序列之后开始，并以His标签的3’端/BNP序列的5’端的顺序加入剪接位点。可使用标准技术从聚丙烯酰胺凝胶中纯化出所述序列的cDNA。通过限制性酶分析验证了质粒的结构。
(b)表达和细胞回收
使用足以生产出所述原-多肽的营养物质来培养表达原-五肽BNP-1的E-coli细胞。通过细胞破坏，然后离心，切线过滤(tangentialfiltration)/超滤，匀浆和包含体增溶从细胞中回收(His)6标记的原-五BNP。
(c)通过亲和层析从溶解的包含体中分离原-五肽BNP-1
制备HiTrp螯合(Ni2+)HP柱(Amersham Bioscience)，并用10倍柱体积的蒸馏水洗涤柱子，从而去除保留的溶液，并用金属离子溶液(NiSO4，0.1M)进行装填，然后用蒸馏水去除未结合的离子。将包含体溶解之后的滤液上样至上述柱子中，用10倍体积的结合缓冲液(20mM磷酸缓冲液，pH7.4，含有0.5M氯化钠和20mM咪唑)洗涤所述柱子。使用线性梯度的10倍柱体积洗脱缓冲液(20mM磷酸钠，pH7.4，含有0.5M氯化钠和0.5M咪唑)对所述柱子进行洗脱，然后再用2倍柱体积的洗脱缓冲液100％地进行洗脱。这个方法可以通过将Ni2+亲和性地螯合于所述柱子从细胞回收样本的其他成分中纯化出(His)6标记的五肽。通过RP-HPLC方法分析所述五肽的纯度＞30％。
(d)纯化和分析
然后通过C-18制备性HPLC将所述五肽纯化至纯度＞75％。通过ES/MS分析对纯化的五肽进行分析，并提供了预测原-五肽BNP-1分子量的M+1离子峰。对所述材料的微型序列测定被用来确证所述多肽的氨基酸序列。
9.29.5从原-五肽BNP-1制备多个单位的Lys-3 BNP轭合物
(a)五肽的轭合
将原-五肽BNP-1(3.20×10-4mmol)溶解于5mL DMSO中。向该溶液中加入45μL三乙胺。在向所述溶液中加入溶解于乙醇的活化PEG7-己基寡聚物(19.6×10-4mmol)之前，将所述溶液搅拌5分钟。在所述反应进行使得HPLC分析表明所述原-肽已被消耗(或所述原-肽的浓度不再降低)之后，通过加入0.5mL 50％水溶性乙酸溶液猝灭所述反应。然后对所述反应混合物进行处理并交换入100mM Tris-HCl缓冲液，pH7.6中。预期这一混合物中的主要成分会在每个BNP单位的Lys3上与肽轭合。
(b)酶混合物对寡聚物-轭合原-五肽BNP-1和轭合的BNP单位的剪切
通过HPLC测定来自于实施例2(a)产物混合物的Tris-HCl溶液等分物来确定其中的肽浓度。在pH7.6的100mM Tris-HCl缓冲液中制备胰蛋白酶(TPCK处理的；来自牛胰腺)溶液。在pH7.6的100mM Tris-HCl缓冲液中制备羧肽酶B(来自猪胰腺)溶液。
将粗混合物(1摩尔当量)与胰蛋白酶(1.39×10-3摩尔当量)和羧肽酶B(4.56×10-4摩尔当量)反应。30分钟后，通过加入1％三氟乙酸的乙腈溶液猝灭所述反应。将该反应所得的产物混合物进行处理并通过HPLC进行分析。滞留时间(与参考标准的滞留时间相比)和质谱分析可用来确定其一致性。该反应的预期产物是Lys3己基-PEG7-轭合的BNP，Lys14己基-PEG7-寡聚物-轭合的BNP，Lys27己基-PEG7-寡聚物-轭合的BNP，二己基-PEG7-寡聚物轭合的BNP，Des Arg-His BNP和DesArg-His己基-PEG7-寡聚物轭合的(Lys3或Lys14或Lys27)BNP。这一混合物的主要成分是Lys3-己基-PEG7-轭合的BNP。
9.29.6从粗轭合混合物中纯化原-五肽BNP-1轭合物
使用反相HPLC从实施例2(b)所述的轭合反应中分离得到了各种主要的产物。使用公知用于分离肽和蛋白的商业可获得C18固定相装填柱子(1cm直径×25cm长度)，随后将其整合入HPLC系统中。用含有75％流动相A(H2O和0.1％三氟乙酸)和25％流动相B(乙腈和0.1％三氟乙酸)的混合物洗脱缓冲液平衡所述系统。将来自实施例21(a)产物混合物的Tris-HCl溶液上样至所述柱子，分离出主要的产物，并使用乙腈成分的百分数从25％增加至55％的梯度洗脱液在120分钟内进行洗脱。收集各个组分并通过HPLC分析来确定所得产物的一致性和纯度。将每种产物的共同组分合并，通过旋转蒸发去除溶剂。通过HPLC和质谱测定每个产物峰的一致性和纯度。预期的产物由3种肽单轭合物(在每个BNP单位的Lys3或Lys14或Lys27轭合)，3种肽二轭合物(在Lys3&Lys14或Lys14&Lys27或Lys27&Lys3轭合)，1种肽三轭合物(在Lys3，Lys14和Lys27轭合)，以及一种肽四轭合物(在引导肽N-末端，Lys3，Lys14和Lys27轭合)组成。
9.29.7从原-五肽BNP-1的分离的轭合物的酶混合物剪切物制备Lys3-己基-PEG7-寡聚物轭合的BNP
将使用实施例3所述方法得到的轭合物，即单轭合的Lys3-己基-PEG7-寡聚物原-五肽BNP-1溶解于100mM Tris-HCl缓冲液，pH7.6中，并采用HPLC分析所得溶液从而确定其中的肽浓度。在pH7.6的100mM Tris-HCl缓冲液中制备胰蛋白酶(TPCK处理的；来自牛胰腺)溶液。在pH7.6的100mM Tris-HCl缓冲液中制备羧肽酶B(来自猪胰腺)溶液。将粗混合物(1摩尔当量)与胰蛋白酶(1.39×10-3摩尔当量)和羧肽酶B(4.56×10-4摩尔当量)反应。30分钟后，通过加入1％三氟乙酸的乙腈溶液猝灭所述反应。将该反应所得的产物进行处理并通过HPLC进行分析。滞留时间(与参考标准的滞留时间相比)和质谱分析可用来确定其一致性。该反应的预期产物分别是各种所使用到的轭合物。例如，单轭合的Lys3-己基-PEG7-寡聚物-轭合的原-五肽BNP-1旨在提供，Lys3-己基-PEG7-寡聚物-轭合的BNP和Des Arg-His Lys3-己基-PEG7-寡聚物-轭合的BNP。
9.29.8在硼酸盐缓冲液/有机溶剂中在原-五肽BNP-1的Lys3上的位点选择性轭合
将原-五肽BNP-1(0.0195mmol)溶解于5mL的50mM硼酸中。用4N氢氧化钠溶液将该溶液调节到pH9.3，并加入1mL乙醇，并用氢氧化钠将其调节到pH10.4-10.9。向上述搅拌的溶液中加入溶解于1mL乙醇的活化甲基七乙二醇((PEG7)-己基寡聚物(7.5×0.0195mmol))。通过HPLC监测所述轭合(酰化)反应的过程，并使用4N氢氧化钠将所述pH维持在pH10.5。当反应表现出完成之后20分钟，通过加入4N盐酸将pH调至6.8猝灭所述反应。然后处理所述反应混合物并交换入pH7.6的100mM Tris-HCl缓冲液中。所述产物混合物的HPLC谱说明在原-五肽BNP-1每个BNP单位的Lys3上的轭合＞40％。
9.29.9在硼酸盐缓冲液/有机溶剂中在天然hBNP的Lys3上的位点选择性轭合
将原-五肽BNP-1(0.0195mmol)溶解于5mL的50mM硼酸中。用4N氢氧化钠溶液将该溶液调节到pH9.3，并加入1mL乙醇，并用氢氧化钠将其调节到pH10.4-10.9。向上述搅拌的溶液中加入溶解于1mL乙醇的活化甲基七乙二醇((PEG7)-己基寡聚物(7.5×0.0195mmo1))。通过HPLC监测所述轭合(酰化)反应的过程，并使用4N氢氧化钠将所述pH维持在pH10.5。当反应表现出完成之后20分钟，通过加入4N盐酸将pH调至6.8猝灭所述反应。然后处理所述反应混合物并交换入pH7.6的100mM Tris-HCl缓冲液中。所述产物混合物的HPLC谱说明在所述BNP分子Lys3上的轭合＞40％。
9.30制备性层析
在配有Waters 2487双λ吸收检测器的Waters Prep-LC系统中进行针对BN-054的反相HPLC分析和纯化。用0.1％TFA对含有DMSO和水(16ml)的反应混合物进行进一步稀释直至终体积为100ml。在制备柱上注射5次，每次20mL。柱子说明：Symmetry Prep C18 7μm柱子，19×300mm。洗脱液梯度如下表所示，其中A是溶于水的0.1％TFA(v/v)，而B是溶解于乙腈的0.1％TFA(v/v)。检测设定在220nm。
    时间     流量(毫升)     ％A     ％B
    1     0.00     8.00     90.0     10.0
    2     10.00     8.00     90.0     10.0
    3     70.00     8.00     60.0     40.0
    4     71.0     8.00     90.0     10.0
    5     80.0     8.00     90.0     10.0
    6     85.0     0.00     90.00     10.0
将各组分收集，并在配有996二极管分析检测器和柱加热器的Waters2690/5系统上进行分析层析来对BN-54的存在进行分析。在Phenomenex Luna C18(2)分析柱(5□m颗粒尺寸，300_孔径，150×2mm)上，以1.0mL/分钟的流速和60℃的柱温度对轭合物进行分析。在23分钟的洗脱液梯度是0-80％B，其中A是溶于水的0.1％TFA(v/v)，而B是溶解于乙腈的0.1％TFA(v/v)。检测设定在220nm。
收集含有BN-54的组分，旋转蒸发和冷冻干燥得到白色粉末的BN-54。对BN-54的蛋白含量和纯度进行测定并总结于如下。
下表所述为不同批次Nobex-BN054的蛋白含量：
  BN轭合物   批次#     蛋白含量(％)
  Nobex-BN054   MM-332-109-NM041101     74.8
  Nobex-BN054   MM-332-149-NM050110     73.4
  Nobex-BN054   MM-332-179-NM050214     74.4
不同批次BN054，包括相关BNP标准物的代表性色谱图都包括在图8，9和10中。这种纯化的方法可方便地适用于本发明的其他轭合物。
参考书目
在此讲下列文献全文引用：
American Heart Association(2001). 2002 Heart and Stroke Statistical Update，Dallas，TX，American Heart Association.
Anderson，W.R.，N.Ekwuribe，A.Ansari，T.M.Harris and D.Surguladze(1999).″Structure activity relationship assessment ofconjugated enkephalins in centrally mediated analgesia.″Soc.forNeuroscience，Abstracts 25((I))：180.
Association，A.H.(2001).2002 Heart and stroke statistical update.Dallas，TX，American Heart Association.
Chin，M.H.and L.Goldman(1997).″Correlates of early hospitalreadmission or death in patients with congestive heart failure.″Am JCardiol 79(12)：1640-4.
Ekwuribe，N.Conjugation-stabilized therapeutic agent compositions，delivery and diagnostic formulations comprising the same，and method ofmaking and using the same.US5681811.
Ekwuribe，N.，M.Ramaswamy，H.S.Allaudeen and J.S.Rajagopalan(1999).″Oral insulin delivery：hydrolysable amphiphilicoligomer conjugates prolong glucose reduction.″Proceed.Intl.Symp.Control Release Bioactive Materials，Abstracts：240.
Gaken et.al.，(2000)Gene Therapy，7：1979-1985.
Hussar，D.A.(2002).″New drugs of 2001.″J Am Pharm Assoc(Wash)42(2)：227-63；quiz 263-6.
Kawai，K.，K.Hata，H.Takaoka，H.Kawai and M.Yokoyama(2001).″Plasma brain natriuretic peptide as a novel therapeutic indicator inidiopathic dilated cardiomyopathy during beta-blocker therapy：a potentialof hormone-guided treatment.″Am Heart J 141(6)：925-32.
Kayser，S.R.(2002).″The use of nesiritide in the management ofacute decompensated heart failure.″Prog Cardiovasc Nurs 17(2)：89-95.
Krishnan，B.R.，M.Ramaswamy，J.S.Rajagopalan，W.R.Anderson，H.S.Allaudeen，S.Myung and N.Ekwuribe(1999).″Oral delivery ofcalcitonin by conjugation with amphiphilic oligomers.″Proceed.Intl.Symp.Control Release Bioactive Materials，Abstracts：43.
Krumholz，H.M.，Y.T.Chen，Y.Wang，V.Vaccarino，M.J.Radfordand R.I.Horwitz(2000).″Predictors of readmission among elderlysurvivors of admission with heart failure.″Am Heart J 139(1 Pt 1)：72-7.
Krumholz，H.M.，E.M.Parent，N.Tu，V.Vaccarino，Y.Wang，M.J.Radford and J.Hennen(1997).″Readmission after hospitalization forcongestive heart failure among Medicare beneficiaries.″Arch Intern Med157(1)：99-104.
Maisel，A.S.，P.Krishnaswamy，R.M.Nowak，J.McCord，J.E.Hollander，P.Due，T.Omland，A.B.Storrow，W.T.Abraham，A.H.Wu，P.Clopton，P.G.Steg，A.Westheim，C.W.Knudsen，A.Perez，R.Kazanegra，H.C.Herrmann and P.A.McCullough(2002).″Rapidmeasurement of B-type natriuretic peptide in the emergency diagnosis ofheart failure.″N Eng1 J Med 347(3)：161-7.
Massie，B.M.and N.B.Shah(1997).″Evolving trends in theepidemiologic factors of heart failure：rationale for preventive strategiesand comprehensive disease management.″Am Heart J 133(6)：703-12.
McDonagh，T.A.，S.D.Robb，D.R.Murdoch，J.J.Morton，I.Ford，C.E.Morrison，H.Tunstall-Pedoe，J.J.McMurray and H.J.Dargie(1998).″Biochemical detection of left-ventricular systolic dysfunction.″Lancet351(9095)：9-13.
McNairy，M.，N.Gardetto，P.Clopton，A.Garcia，P.Krishnaswamy，R.Kazanegra，M.Ziegler and A.S.Maisel(2002).″Stability of B-typenatriuretic peptide levels during exercise in patients with congestive heartfailure：implications for outpatient monitoring with B-type natriureticpeptide.″Am Heart J 143(3)：406-11.
Nagaya，N.，T.Nishikimi，M.Uematsu，T.Satoh，S.Kyotani，F.Sakamaki，M.Kakishita，K.Fukushima，Y.Okano，N.Nakanishi，K.Miyatake and K.Kangawa(2000).″Plasma brain natriuretic peptide as aprognostic indicator in patients with primary pulmonary hypertension.″Circulation 102(8)：865-70.
O′Connell，J.B.and M.R.Bristow(1994).″Economic impact ofheart failure in the United States：time for a different approach.″J HeartLung Transplant 13(4)：S107-12.
Packer，M.and H.M.Cohn(1999).″Consensus recommendations forthe management of chronic heart failure.On behalf of the membership ofthe advisory council to improve outcomes nationwide in heart failure.″AmJ Cardiol 83(2A)：1A-38A.
Remingtons，The Science and Practice of Pharmacy(9th Edition，1995)
Richards，A.M.，M.G.Nicholls，T.G.Yandle，C.Frampton，E.A.Espiner，J.G.Turner，R.C.Buttimore，J.G.Lainchbury，J.M.Elliott，H.Dcram，I.G.Crozier and D.W.Smyth(1998).″Plasma N-terminalpro-brain natriuretic peptide and adrenomedullin：new neurohormonalpredictors of left ventricular function and prognosis after myocardialinfarction.″Circulation 97(19)：1921-9.
Stewart，S.，J.E.Marley and J.D.Horowitz(1999).″Effects of amultidisciplinary，home-based intervention on unplanned readmissions andsurvival among patients with chronic congestive heart failure：arandomised controlled study.″Lancet 354(9184)：1077-83.
Sudoh，T.，K.Kangawa，N.Minamino and H.Matsuo(1988).″A newnatriuretic peptide in poreine brain.″Nature 332(6159)：78-81.
Sudoh，T.，et.al.，(1989)，Biophys.Res.Com.，159(3)：1427-1433.
Sudoh，T.，et.al.，(2002)，U.S.Patent Application U.S.2002/0086843A，EPO 542,863B1(1997)
Tsuchihashi，M.，H.Tsutsui，K.Kodama，F.Kasagi，S.Setoguchi，M.Mohr，T.Kubota and A.Takeshita(2001).″Medical andsocioenvironmental predictors of hospital readmission in patients withcongestive heart failure.″Am Heart J 142(4)：E7.
Yamamoto，K.，J.C.Burnett，Jr.，M.Jougasaki，R.A.Nishimura，K.R.Bailey，Y.Saito，K.Nakao and M.M.Redfield(1996).″Superiority ofbrain natriuretic peptide as a hormonal marker of ventricular systolic anddiastolic dysfunction and ventricular hypertrophy.″Hypertension 28(6)：988-94.
U.S Patent No.5,674,710-Seilhamer et.al.
U.S Patent No 6,034,231-Tanaka，et.al.
U.S Patent No 2003/0069186 A1-Burnett，Jr.，et.al.
U.S Patent No.6,492,560 B2-Wilbur et.al.
U.S Patent No 6,013,630-Shimkets，et.al.
U.S Patent No.6,586,396-Seilhamer，et.al.
U.S.Patent No.6,525,022-Lowe，et.al.
U.S.Patent No.6,028,055-Lowe，et al.
U.S.Patent No 5,114,923-Seilhamer et.al.
PCTIUS0217567

Claims (58)

1.促尿钠排泄化合物轭合物，包括：
具有生物学活性的促尿钠排泄化合物，其包括：
促尿钠排泄分子NPR-A结合位点；以及
至少一个修饰部分轭合位点；以及
与所述修饰部分轭合位点连接的至少一个修饰部分；
其中所述促尿钠排泄化合物轭合物表现出了选自如下的一或者多种优点：与对应的未轭合促尿钠排泄化合物相比对酶降解增强的抗性、延长的循环半衰期，提高的生物利用率以及延长的持续药效。
2.权利要求1的促尿钠排泄化合物轭合物，其中所述促尿钠排泄化合物含有脑促尿钠排泄肽，心房促尿钠排泄肽，C-型促尿钠排泄肽或树眼镜蛇促尿钠排泄肽的肽或者生物学活性肽片段。
3.权利要求1的促尿钠排泄化合物轭合物，其中所述促尿钠排泄化合物含有天然hBNP序列，该序列具有选自Lys3Arg，Lys14Arg，Arg30Lys，Lys27Arg和Arg31Lys的一或多处突变。
4.权利要求1的促尿钠排泄化合物轭合物，其中所述促尿钠排泄化合物含有天然hBNP序列，该序列具有一或多处插入、缺失或延伸。
5.权利要求1的促尿钠排泄化合物轭合物，其中所述修饰部分具有下列通式：
其中每个C都是独立选择的并且是具有m个碳的烷基部分，且m是1，2，3，4，5，6，7，8，9，10，11，12，13，14，15，16，17，18，19或20；且
每个PAG都是独立选择的并且是具有n个亚单位的聚烷撑二醇部分，且n是1，2，3，4，5，6，7，8，9，10，11，12，13，14，15，16，17，18，19，20，21，22，23，24或25；
每个X都是独立选择的并且是连接部分。
6.权利要求5的促尿钠排泄化合物轭合物，其中所述修饰部分具有下列通式：
7.权利要求5的促尿钠排泄化合物轭合物，其中所述修饰部分具有下列通式：
8.治疗以细胞外液水平过高为特征的病症的方法，所述方法包括给需要治疗的受试者施用药物可接受量的权利要求5的促尿钠排泄化合物轭合物。
9.权利要求1的促尿钠排泄化合物轭合物，其中所述修饰部分具有下列通式：
Figure A2005800252220004C1
10.权利要求5的促尿钠排泄化合物轭合物，其中所述修饰部分具有下列通式：
11.权利要求1的促尿钠排泄化合物轭合物，其中所述修饰部分具有下列通式：
Figure A2005800252220004C3
12.权利要求5的促尿钠排泄化合物轭合物，其中所述修饰部分具有下列通式：
Figure A2005800252220004C4
13.权利要求5的促尿钠排泄化合物轭合物，其中所述修饰部分具有下列通式：
Figure A2005800252220005C1
且所述促尿钠排泄化合物是hBNP，且所述修饰部分连接在Lys3位，且所述促尿钠排泄化合物轭合物是单轭合物。
14.权利要求9的促尿钠排泄化合物轭合物，其中所述促尿钠排泄化合物是hBNP。
15.权利要求10的促尿钠排泄化合物轭合物，其中所述促尿钠排泄化合物是hBNP。
16.权利要求11的促尿钠排泄化合物轭合物，其中所述促尿钠排泄化合物是hBNP。
17.权利要求12的促尿钠排泄化合物轭合物，其中所述促尿钠排泄化合物是hBNP。
18.权利要求9的促尿钠排泄化合物轭合物，其中所述促尿钠排泄化合物是hBNP，且所述修饰部分连接在Lys3位，且所述促尿钠排泄化合物轭合物是单轭合物。
19.权利要求10的促尿钠排泄化合物轭合物，其中所述促尿钠排泄化合物是hBNP，且所述修饰部分连接在Lys3位，且所述促尿钠排泄化合物轭合物是单轭合物。
20.权利要求11的促尿钠排泄化合物轭合物，其中所述促尿钠排泄化合物是hBNP，且所述修饰部分连接在Lys3位，且所述促尿钠排泄化合物轭合物是单轭合物。
21.权利要求12的促尿钠排泄化合物轭合物，其中所述促尿钠排泄化合物是hBNP，且所述修饰部分连接在Lys3位，且所述促尿钠排泄化合物轭合物是单轭合物。
22.包含权利要求9的促尿钠排泄化合物轭合物和可药用载体的药物组合物。
23.包含权利要求10的促尿钠排泄化合物轭合物和可药用载体的药物组合物。
24.包含权利要求11的促尿钠排泄化合物轭合物和可药用载体的药物组合物。
25.包含权利要求12的促尿钠排泄化合物轭合物和可药用载体的药物组合物。
26.包含权利要求14的促尿钠排泄化合物轭合物和可药用载体的药物组合物。
27.包含权利要求15的促尿钠排泄化合物轭合物和可药用载体的药物组合物。
28.包含权利要求16的促尿钠排泄化合物轭合物和可药用载体的药物组合物。
29.包含权利要求17的促尿钠排泄化合物轭合物和可药用载体的药物组合物。
30.包含权利要求18的促尿钠排泄化合物轭合物和可药用载体的药物组合物。
31.包含权利要求19的促尿钠排泄化合物轭合物和可药用载体的药物组合物。
32.包含权利要求20的促尿钠排泄化合物轭合物和可药用载体的药物组合物。
33.包含权利要求21的促尿钠排泄化合物轭合物和可药用载体的药物组合物。
34.制备权利要求9所述促尿钠排泄化合物轭合物的方法，该方法包括将所述修饰部分化学连接于所述促尿钠排泄化合物。
35.制备权利要求10所述促尿钠排泄化合物轭合物的方法，该方法包括将所述修饰部分化学连接于所述促尿钠排泄化合物。
36.制备权利要求11所述促尿钠排泄化合物轭合物的方法，该方法包括将所述修饰部分化学连接于所述促尿钠排泄化合物。
37.制备权利要求12所述促尿钠排泄化合物轭合物的方法，该方法包括将所述修饰部分化学连接于所述促尿钠排泄化合物。
38.制备权利要求14所述促尿钠排泄化合物轭合物的方法，该方法包括将所述修饰部分化学连接于所述促尿钠排泄化合物。
39.制备权利要求15所述促尿钠排泄化合物轭合物的方法，该方法包括将所述修饰部分化学连接于所述促尿钠排泄化合物。
40.制备权利要求16所述促尿钠排泄化合物轭合物的方法，该方法包括将所述修饰部分化学连接于所述促尿钠排泄化合物。
41.制备权利要求17所述促尿钠排泄化合物轭合物的方法，该方法包括将所述修饰部分化学连接于所述促尿钠排泄化合物。
42.制备权利要求18所述促尿钠排泄化合物轭合物的方法，该方法包括将所述修饰部分化学连接于所述促尿钠排泄化合物。
43.制备权利要求19所述促尿钠排泄化合物轭合物的方法，该方法包括将所述修饰部分化学连接于所述促尿钠排泄化合物。
44.制备权利要求20所述促尿钠排泄化合物轭合物的方法，该方法包括将所述修饰部分化学连接于所述促尿钠排泄化合物。
45.制备权利要求21所述促尿钠排泄化合物轭合物的方法，该方法包括将所述修饰部分化学连接于所述促尿钠排泄化合物。
46.权利要求9所述促尿钠排泄化合物轭合物的药物纯组合物。
47.权利要求10所述促尿钠排泄化合物轭合物的药物纯组合物。
48.权利要求11所述促尿钠排泄化合物轭合物的药物纯组合物。
49.权利要求12所述促尿钠排泄化合物轭合物的药物纯组合物。
50.权利要求14所述促尿钠排泄化合物轭合物的药物纯组合物。
51.权利要求15所述促尿钠排泄化合物轭合物的药物纯组合物。
52.权利要求16所述促尿钠排泄化合物轭合物的药物纯组合物。
53.权利要求17所述促尿钠排泄化合物轭合物的药物纯组合物。
54.权利要求18所述促尿钠排泄化合物轭合物的药物纯组合物。
55.权利要求19所述促尿钠排泄化合物轭合物的药物纯组合物。
56.权利要求20所述促尿钠排泄化合物轭合物的药物纯组合物。
57.权利要求21所述促尿钠排泄化合物轭合物的药物纯组合物。
58.权利要求5的促尿钠排泄化合物轭合物，其中m是1，X是-O-，n是4，且C是-CH3。
CNA2005800252228A 2004-05-26 2005-05-26 促尿钠排泄化合物、轭合物及其用途 Pending CN101027073A (zh)

Applications Claiming Priority (2)

Application Number Priority Date Filing Date Title
US57443604P 2004-05-26 2004-05-26
US60/574,436 2004-05-26

Publications (1)

Publication Number Publication Date
CN101027073A true CN101027073A (zh) 2007-08-29

Family

ID=35451511

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
CNA2005800252228A Pending CN101027073A (zh) 2004-05-26 2005-05-26 促尿钠排泄化合物、轭合物及其用途

Country Status (14)

Country Link
US (3) US7648962B2 (zh)
EP (1) EP1776132A4 (zh)
JP (1) JP2008500375A (zh)
KR (1) KR20070050876A (zh)
CN (1) CN101027073A (zh)
AU (1) AU2005248860A1 (zh)
BR (1) BRPI0511588A (zh)
CA (1) CA2568363A1 (zh)
IL (1) IL179521A0 (zh)
MX (1) MXPA06013810A (zh)
NZ (1) NZ552210A (zh)
RU (1) RU2388765C2 (zh)
WO (1) WO2005116655A2 (zh)
ZA (1) ZA200610700B (zh)

Cited By (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN102260345A (zh) * 2011-05-17 2011-11-30 上海格尼生物技术有限公司 一种固相多肽合成人脑钠素的制备方法
CN108472383A (zh) * 2016-01-08 2018-08-31 阿森迪斯药物生长障碍股份有限公司 具有低npr-c结合的控制释放cnp激动剂
CN111848776A (zh) * 2020-08-31 2020-10-30 江苏璟泽生物医药有限公司 聚乙二醇修饰的rhBNP及其制备方法

Families Citing this family (50)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
GB2403533A (en) * 2003-06-30 2005-01-05 Orion Corp Atrial natriuretic peptide and brain natriuretic peptide and assays and uses thereof
ES2887039T3 (es) 2004-04-21 2021-12-21 Alexion Pharma Inc Conjugados para administración ósea y procedimiento de uso de estos para dirigir proteínas al hueso
EP1773867B1 (en) 2004-07-15 2011-01-19 The University Of Queensland Proteinaceous compounds and uses therefor
US20080207505A1 (en) * 2005-01-12 2008-08-28 James Kenneth D Bna Conjugates and Methods of Use
KR101872061B1 (ko) * 2005-12-19 2018-06-27 파마인 코포레이션 치료제를 전달하기 위한 소수성 코어 담체 조성물, 이 조성물의 제조 방법 및 그 조성물의 이용 방법
US20080064045A1 (en) 2006-09-07 2008-03-13 Huaiqin Wu Biomarker fragments for the detection of human BNP
US20080181903A1 (en) * 2006-12-21 2008-07-31 Pdl Biopharma, Inc. Conjugate of natriuretic peptide and antibody constant region
KR20080098216A (ko) * 2007-05-04 2008-11-07 한미약품 주식회사 캐리어 물질을 이용한 나트륨 배설 펩타이드 약물 결합체
ES2401741T3 (es) * 2007-05-08 2013-04-24 Abbott Laboratories Ensayo de péptido natriurético de tipo B humano que tiene una reducida reactividad cruzada con otras formas péptidicas
EP2171053B1 (en) * 2007-07-20 2014-04-23 Mayo Foundation for Medical Education and Research Natriuretic polypeptides
JP5298134B2 (ja) * 2007-11-01 2013-09-25 パーシード セラピューティクス リミテッド ライアビリティ カンパニー 免疫抑制ポリペプチドおよび核酸
CA2705603A1 (en) * 2007-11-21 2009-05-28 Biomarin Pharmaceutical Inc. Variants of c-type natriuretic peptide
US20090286329A1 (en) * 2008-05-19 2009-11-19 Abbott Laboratoires Isolated human autoantibodies to natriuretic peptides and methods and kits for detecting human autoantibodies to natriuretic peptides
US20090286256A1 (en) * 2008-05-19 2009-11-19 Abbott Laboratories Isolated human autoantibodies to natriuretic peptides and methods and kits for detecting human autoantibodies to natriuretic peptides
EP2334335A1 (en) * 2008-09-19 2011-06-22 Nektar Therapeutics Polymer conjugates of cd-np peptides
US20110171161A1 (en) 2008-09-19 2011-07-14 Nektar Therapeutics Polymer conjugates of protegrin peptides
AU2009292643B2 (en) * 2008-09-19 2016-02-18 Nektar Therapeutics Polymer conjugates of therapeutic peptides
AR078044A1 (es) 2009-05-20 2011-10-12 Biomarin Pharm Inc Variantes de peptidos natriureticos de tipo c
BR112012001491B1 (pt) 2009-07-23 2022-03-15 Igisu Co., Ltd Preparação terapêutica para tratar dermatite e uso de uma preparação terapêutica
KR20180049198A (ko) 2009-09-25 2018-05-10 샤이어 오펀 테라피즈 게엠베하 신규한 ｎｐｒ－ｂ 길항제
AR078446A1 (es) 2009-12-18 2011-11-09 Alcon Res Ltd Agonistas de npr-b. uso.
WO2012088608A1 (en) 2010-12-27 2012-07-05 Enobia Canada Limited Partnership Compositions comprising natriuretic peptides and methods of use thereof
US20120277155A1 (en) 2011-02-25 2012-11-01 Medtronic, Inc. Therapy for kidney disease and/or heart failure
CN107090028A (zh) 2011-08-30 2017-08-25 梅约医学教育与研究基金会 利钠多肽
EP2750697A4 (en) 2011-09-02 2015-03-25 Medtronic Inc CHIMERIC NATRIURETIC PEPTIDE COMPOSITIONS AND METHOD FOR THE PRODUCTION THEREOF
WO2013070741A1 (en) * 2011-11-11 2013-05-16 Mayo Foundation For Medical Education And Research Methods and materials for regulating natriuretic polypeptide function
WO2013103896A1 (en) 2012-01-06 2013-07-11 Mayo Foundation For Medical Education And Research Treating cardiovascular or renal diseases
US10052366B2 (en) 2012-05-21 2018-08-21 Alexion Pharmaceuticsl, Inc. Compositions comprising alkaline phosphatase and/or natriuretic peptide and methods of use thereof
WO2014209229A1 (en) * 2013-06-25 2014-12-31 National University Of Singapore Vasodilation peptides and uses thereof
ES2754271T3 (es) * 2013-12-17 2020-04-16 Novo Nordisk As Polipéptidos escindibles por enteroquinasa
US10822596B2 (en) 2014-07-11 2020-11-03 Alexion Pharmaceuticals, Inc. Compositions and methods for treating craniosynostosis
US10449236B2 (en) 2014-12-05 2019-10-22 Alexion Pharmaceuticals, Inc. Treating seizure with recombinant alkaline phosphatase
EP3250227A2 (en) 2015-01-28 2017-12-06 Alexion Pharmaceuticals, Inc. Methods of treating a subject with an alkaline phosphatase deficiency
TW201708247A (zh) * 2015-05-29 2017-03-01 Igisu Co Ltd 環狀胜肽及含該環狀胜肽之藥物、外用劑及化粧品
KR102644116B1 (ko) 2015-08-17 2024-03-05 알렉시온 파마슈티칼스, 인코포레이티드 알칼린 포스파타제의 제조
JP6868617B2 (ja) 2015-09-28 2021-05-12 アレクシオン ファーマシューティカルズ， インコーポレイテッド 低ホスファターゼ血症の組織非特異的アルカリホスファターゼ（ｔｎｓａｌｐ）酵素補充療法に有効な投薬計画の特定
WO2017074466A1 (en) 2015-10-30 2017-05-04 Alexion Pharmaceuticals, Inc. Methods for treating craniosynostosis in a patient
US11065306B2 (en) 2016-03-08 2021-07-20 Alexion Pharmaceuticals, Inc. Methods for treating hypophosphatasia in children
US10898549B2 (en) 2016-04-01 2021-01-26 Alexion Pharmaceuticals, Inc. Methods for treating hypophosphatasia in adolescents and adults
WO2017173413A1 (en) 2016-04-01 2017-10-05 Alexion Pharmaceuticals, Inc. Treating muscle weakness with alkaline phosphatases
US10988744B2 (en) 2016-06-06 2021-04-27 Alexion Pharmaceuticals, Inc. Method of producing alkaline phosphatase
WO2018035420A1 (en) 2016-08-18 2018-02-22 Alexion Pharmaceuticals, Inc. Methods for treating tracheobronchomalacia
EP3500592A4 (en) * 2016-08-18 2020-08-12 National University of Singapore PEPTIDES WITH VASODILATOR AND / OR DIURETIC FUNCTIONS
AU2018243320A1 (en) 2017-03-31 2019-10-10 Alexion Pharmaceuticals, Inc. Methods for treating hypophosphatasia (HPP) in adults and adolescents
RU2656188C1 (ru) * 2017-05-03 2018-06-04 Общество с ограниченной ответственностью "Анкрим" (ООО "Анкрим") Синтетическое анальгетическое средство пептидной природы и способ его применения
CN111432836A (zh) 2017-09-05 2020-07-17 转矩医疗股份有限公司 治疗性蛋白质组合物及其制备和使用方法
AU2018328208A1 (en) 2017-09-05 2020-04-23 Torque Therapeutics, Inc. Reversible linkers and use thereof
CA3094055A1 (en) * 2018-03-20 2019-09-26 Nof Corporation Branched monodispersed polyethylene glycol, intermediate and methods for producing same
JP2021519590A (ja) 2018-03-30 2021-08-12 アレクシオン ファーマシューティカルズ， インコーポレイテッド 糖タンパク質の製造
KR102022118B1 (ko) * 2019-01-07 2019-09-18 주식회사 아스트로젠 중추신경계 질환의 예방 또는 치료용 세린 유도체 화합물

Family Cites Families (50)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US4179337A (en) * 1973-07-20 1979-12-18 Davis Frank F Non-immunogenic polypeptides
DE2410789C2 (de) * 1974-03-07 1980-08-07 Hoechst Ag, 6000 Frankfurt Verfahren zum Kaltmahlen von Cellulosederivaten
US4130647A (en) * 1977-07-08 1978-12-19 Pfizer Inc. Methods for treating congestive heart failure and ischemic heart disease
WO1983000150A1 (en) * 1981-07-02 1983-01-20 Walton, Alan, G. Glycosaminoglycan drug complexes
ATE37983T1 (de) * 1982-04-22 1988-11-15 Ici Plc Mittel mit verzoegerter freigabe.
US5037741A (en) * 1986-08-18 1991-08-06 The Coca Cola Company Enzymatic method for the synthesis and separation of peptides
JP2544929B2 (ja) * 1987-06-17 1996-10-16 第一化学薬品 株式会社 新規生理活性ペプチド
US5114923A (en) * 1988-05-31 1992-05-19 California Biotechnology Inc. Recombinant techniques for production of novel natriuretic and vasodilator peptides
CA1339210C (en) * 1988-05-31 1997-08-05 John Lewicki Recombinant techniques for production of novel natriuretic and vasodilator peptides
US20020086843A1 (en) * 1989-03-01 2002-07-04 Daiichi Pure Chemicals Co., Ltd. Physiologically active polypeptide and DNA
US5342940A (en) * 1989-05-27 1994-08-30 Sumitomo Pharmaceuticals Company, Limited Polyethylene glycol derivatives, process for preparing the same
US5108568A (en) * 1989-07-07 1992-04-28 The United States Of America As Represented By The Administrator Of The National Aeronautics And Space Administration Controlled method of reducing electrophoretic mobility of macromolecules, particles or cells
US5286637A (en) * 1989-08-07 1994-02-15 Debiopharm, S.A. Biologically active drug polymer derivatives and method for preparing same
US5013556A (en) * 1989-10-20 1991-05-07 Liposome Technology, Inc. Liposomes with enhanced circulation time
IE912365A1 (en) * 1990-07-23 1992-01-29 Zeneca Ltd Continuous release pharmaceutical compositions
JP2665850B2 (ja) * 1991-11-14 1997-10-22 塩野義製薬株式会社 ｈＢＮＰのＣ端を認識するモノクロ−ナル抗体
GB9211686D0 (en) * 1992-06-03 1992-07-15 Medisinsk Innovation A S Chemical compounds
US6191105B1 (en) * 1993-05-10 2001-02-20 Protein Delivery, Inc. Hydrophilic and lipophilic balanced microemulsion formulations of free-form and/or conjugation-stabilized therapeutic agents such as insulin
US5359030A (en) * 1993-05-10 1994-10-25 Protein Delivery, Inc. Conjugation-stabilized polypeptide compositions, therapeutic delivery and diagnostic formulations comprising same, and method of making and using the same
US5681811A (en) * 1993-05-10 1997-10-28 Protein Delivery, Inc. Conjugation-stabilized therapeutic agent compositions, delivery and diagnostic formulations comprising same, and method of making and using the same
US5512459A (en) * 1993-07-20 1996-04-30 Bionebraska, Inc. Enzymatic method for modification or recombinant polypeptides
US5569794A (en) * 1994-05-24 1996-10-29 Alliedsignal Inc. Vapor phase process for producing hydroflourocarbons from perchloroethylene having a phenolic inhibitor
US6037145A (en) * 1994-09-07 2000-03-14 Suntory Limited Process for production of protein
EP0721105B1 (en) * 1994-12-09 1999-05-12 Shionogi & Co., Ltd. Sandwich immunoassay for N-peptide
US5932462A (en) 1995-01-10 1999-08-03 Shearwater Polymers, Inc. Multiarmed, monofunctional, polymer for coupling to molecules and surfaces
DK2292662T3 (da) * 1996-03-04 2014-05-05 Scios Inc ASSAY OG REAGENSER TIL KVANTIFICERING AF hBNP
US6028055A (en) * 1996-10-22 2000-02-22 Genetech, Inc. Receptor selective BNP
AU6820898A (en) 1997-04-04 1998-10-30 Novo Nordisk A/S Natriuretic peptide derivatives
US6495514B1 (en) * 1998-01-21 2002-12-17 Mercer University Method for reducing inflammation and inducing an analgesic effect and compounds thereof
EP1062229A1 (en) * 1998-03-09 2000-12-27 Zealand Pharmaceuticals A/S Pharmacologically active peptide conjugates having a reduced tendency towards enzymatic hydrolysis
US6117644A (en) * 1998-06-04 2000-09-12 Ottawa Heart Institute Research Corporation Predicting and detecting cardiac allograft rejection
US6703381B1 (en) * 1998-08-14 2004-03-09 Nobex Corporation Methods for delivery therapeutic compounds across the blood-brain barrier
PT1146896E (pt) 1999-01-26 2002-10-31 Lilly Co Eli Formulacoes monodispersas de analogo acilado e hexamerico insulina
AU765753B2 (en) 1999-05-17 2003-09-25 Conjuchem Biotechnologies Inc. Protection of endogenous therapeutic peptides from peptidase activity through conjugation to blood components
WO2000071576A2 (en) * 1999-05-24 2000-11-30 Mayo Foundation For Medical Education And Research Adenovirus vectors encoding brain natriuretic peptide
US6309633B1 (en) 1999-06-19 2001-10-30 Nobex Corporation Amphiphilic drug-oligomer conjugates with hydroyzable lipophile components and methods for making and using the same
KR100345214B1 (ko) * 1999-08-17 2002-07-25 이강춘 생체적합성 고분자가 수식된 펩타이드의 비점막 전달
US6713454B1 (en) * 1999-09-13 2004-03-30 Nobex Corporation Prodrugs of etoposide and etoposide analogs
US6541508B2 (en) * 1999-09-13 2003-04-01 Nobex Corporation Taxane prodrugs
US6638906B1 (en) * 1999-12-13 2003-10-28 Nobex Corporation Amphiphilic polymers and polypeptide conjugates comprising same
EP1642885B1 (en) * 2000-08-29 2009-11-11 Biocon Limited Use of a pharmaceutical composition containing a para-aminophenyl acetic acid derivative for treating inflammatory conditions of the gastrointestinal tract
US6867183B2 (en) * 2001-02-15 2005-03-15 Nobex Corporation Pharmaceutical compositions of insulin drug-oligomer conjugates and methods of treating diseases therewith
US20030219734A1 (en) * 2001-04-13 2003-11-27 Biosite Incorporated Polypeptides related to natriuretic peptides and methods of their identification and use
US6713452B2 (en) * 2001-06-04 2004-03-30 Nobex Corporation Mixtures of calcitonin drug-oligomer conjugates comprising polyalkylene glycol, uses thereof, and methods of making same
US6828297B2 (en) 2001-06-04 2004-12-07 Nobex Corporation Mixtures of insulin drug-oligomer conjugates comprising polyalkylene glycol, uses thereof, and methods of making same
US6858580B2 (en) * 2001-06-04 2005-02-22 Nobex Corporation Mixtures of drug-oligomer conjugates comprising polyalkylene glycol, uses thereof, and methods of making same
EP1430082B1 (en) 2001-09-07 2009-10-28 Biocon Limited Methods of synthesizing insulin polypeptide-oligomer conjugates, and proinsulin polypeptide-oligomer conjugates and methods of synthesizing same
US6770625B2 (en) * 2001-09-07 2004-08-03 Nobex Corporation Pharmaceutical compositions of calcitonin drug-oligomer conjugates and methods of treating diseases therewith
AU2003246500A1 (en) 2002-07-31 2004-02-16 Conjuchem Biotechnologies Inc. Long lasting natriuretic peptide derivatives
EP1569683B1 (en) 2002-11-26 2010-03-03 Biocon Limited Modified natriuretic compounds, conjugates, and uses thereof

Cited By (4)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN102260345A (zh) * 2011-05-17 2011-11-30 上海格尼生物技术有限公司 一种固相多肽合成人脑钠素的制备方法
CN108472383A (zh) * 2016-01-08 2018-08-31 阿森迪斯药物生长障碍股份有限公司 具有低npr-c结合的控制释放cnp激动剂
CN108472383B (zh) * 2016-01-08 2022-07-01 阿森迪斯药物生长障碍股份有限公司 具有低npr-c结合的控制释放cnp激动剂
CN111848776A (zh) * 2020-08-31 2020-10-30 江苏璟泽生物医药有限公司 聚乙二醇修饰的rhBNP及其制备方法

Also Published As

Publication number Publication date
US7648962B2 (en) 2010-01-19
BRPI0511588A (pt) 2008-01-02
WO2005116655A2 (en) 2005-12-08
NZ552210A (en) 2009-11-27
US20060074009A1 (en) 2006-04-06
EP1776132A2 (en) 2007-04-25
IL179521A0 (en) 2007-07-04
RU2388765C2 (ru) 2010-05-10
US20100216714A1 (en) 2010-08-26
ZA200610700B (en) 2008-03-26
US20060172933A1 (en) 2006-08-03
WO2005116655A3 (en) 2006-08-03
RU2006145827A (ru) 2008-07-10
KR20070050876A (ko) 2007-05-16
AU2005248860A1 (en) 2005-12-08
EP1776132A4 (en) 2009-07-01
JP2008500375A (ja) 2008-01-10
MXPA06013810A (es) 2007-07-25
CA2568363A1 (en) 2005-12-08

Similar Documents

Publication Publication Date Title
CN101027073A (zh) 促尿钠排泄化合物、轭合物及其用途
CN100558398C (zh) 修饰的钠尿化合物、缀合物及其应用
CN101389648B (zh) 肽胃泌酸调节素衍生物
CN102348715B (zh) 延伸重组多肽和包含该延伸重组多肽的组合物
US6309854B1 (en) Polynucleotides encoding ligands of the neuropeptide receptor HFGAN72
US20080207505A1 (en) Bna Conjugates and Methods of Use
US20190142904A1 (en) Acylated glp-1/glp-2 dual agonists
CN101128214A (zh) 长效glp-1化合物
WO2015196944A1 (zh) GnRH类似物-细胞毒分子缀合物、其制备方法及用途
WO2004048401A1 (ja) ペプチド及びこれを含む医薬組成物
CN106554404A (zh) 一种艾塞那肽修饰物及其用途
CN100410375C (zh) 促胃动素同系物抗体
JP2014508765A (ja) 副甲状腺ホルモン類似体、組成物およびその使用
WO2001066134A1 (fr) Agent de regulation de la secretion de prolactine contenant du rfrp
JP4306816B2 (ja) 新規生理活性物質、その製造法および用途
GB2448895A (en) GLP-1 like compounds and uses thereof
WO2023159052A2 (en) Stapled peptides, methods of making same, and uses thereof
WO2000038704A1 (fr) Utilisation d'un peptide
JP2001151799A (ja) 新規ペプチド及びそれを含有する消化管運動抑制剤
JP2000159795A (ja) ペプチド誘導体

Legal Events

Date Code Title Description
C06 Publication
PB01 Publication
C10 Entry into substantive examination
SE01 Entry into force of request for substantive examination
C02 Deemed withdrawal of patent application after publication (patent law 2001)
WD01 Invention patent application deemed withdrawn after publication

Open date: 20070829