CN100379865C - 用于产生cd8t细胞免疫应答的试剂盒及其用途 - Google Patents

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Abstract

公开了产生抗疟疾和其他抗原诸如病毒和肿瘤抗原的CD8T细胞免疫应答接种的新方法和试剂。也公开了新型的接种方案，该方案使用一种引发组合物和一种促进组合物，该促进组合物包括携带至少一个也存在于引发组合物中的CD8T细胞表位的非复制或复制受损伤的痘病毒载体。

Description

用于产生CD8T细胞免疫应答的试剂盒及其用途
本发明涉及用不同的引发和促进剂组合物作为CD8+T细胞表位的来源，产生针对靶抗原的保护性CD8+T细胞免疫应答。
引言
疫苗学中的一个普遍问题是不能通过免疫反应产生高水平的CD8T细胞。该问题妨碍开发抗包括疟疾等几种疾病的疫苗。
恶性疟原虫(Plasmodium falciparum)疟疾每年引起数以亿计的疟疾感染者并且导致1-2百万人死亡。因此开发抗疟疾的有效疫苗是全球公共健康优先要考虑的项目。在过去20多年中，大量的免疫学研究确认了来自疟原虫的疫苗抗原和宿主中存在的可能保护免受感染和患病的免疫学机制。然而，尽管有此进展，仍没有在试验领域中表现为有效的抗疟疾感染的接种方法。
已被确认的主要问题是在接种的个体中为免受感染和患病诱导足够强免疫应答的方法。因此，尽管已知许多疟疾抗原可用于抗疟疾的接种，问题是如何传递由免疫系统的细胞识别的上述抗原或称之为表位的它们的片段，形成诱导足够强的特殊类型免疫应答的方式。
多年来已知通过用大剂量照射过的来自蚊子叮咬得到的疟疾子孢子免疫接种，可能对个体有保护作用。尽管这是大量接种不完全实用的方法，但该方法提供一种模型，用于分析介导子孢子感染保护性免疫的免疫应答(Nardin和Nussenzweig 1993)。
在近10年或更长的时间中，大量的研究表明抗恶性疟原虫疾病早期前红细胞阶段的主要保护性免疫应答是由CD8+ve型的T淋巴细胞(CD8+T细胞)所介导的。在小鼠疾病感染模型中显示上述细胞直接介导保护作用(Nardin和Nussenzweig 1993)。在天然与疾病接触的个体和用照射过的子孢子免疫接种的志愿者中，也已鉴定出了这些细胞(Hill等，1991；Aidoo等，1995，Wizel等，1995)。还有许多非直接的证据表明上述CD8+T细胞在人类抗疟疾感染和患病中起保护作用(Lalvani等，1994)。
CD8+T细胞可能有不止一个方面的功能。众所周知的功能是杀死或裂解含有MHC I类分子肽抗原的靶细胞。因此这些细胞常定名为杀伤性T淋巴细胞(CTL)。然而，另一个功能，也许在疟疾感染中起更大保护作用有关的是CD8+T细胞能分泌干扰素γ(IFN-γ)。因此分析裂解活性和IFN-γ释放在测定CD8+T细胞免疫应答中具有双重价值。在疟疾中，产生该疾病的任何症状之前，这些CD8+ve细胞能通过杀死疟疾感染早期肝内阶段的寄生虫而起保护作用(Seguin等，1994)。
致死性人类疟疾的病因恶性疟原虫感染有限数量的宿主物种：人类、黑猩猩和一些新世界(New World)猴类的物种。最好的非人类疟疾模型是黑猩猩，因为该物种与人类亲缘关系近并且不象猴宿主那样，它可以连续观察肝感染阶段(Thomas等，1994)。由于黑猩猩昂贵且来源有限，大多数疟疾研究在小鼠中进行，用啮齿类疟原虫伯氏疟原虫(P.berghei)或约氏疟原虫(P.yoelii)。后二种模型已进行了彻底的研究，表明在该2种模型中CD8+ve淋巴细胞在抗子孢子激发的保护性免疫中起关键作用。
以前的研究已估计到各种各样的方法诱导CD8+T细胞抗疟疾的应答。几种这些方法显示在啮齿类模型中，抗疟疾感染的某些水平CD8+T细胞应答和部分保护作用(如Li等，1993；Sedegah等，1994；Lanar等，1996)。然而，过去未见对用亚单位疫苗免疫接种而诱导足够高水平的CD8+T淋巴细胞，以有效地保护对抗疟疾子孢子感染的有效方法的描述。
近年来通过改变用于传递抗原的载体探索对潜在的疫苗产生的改善免疫应答。有证据显示用2种不同的载体作为引发和促进剂连续施用，在某些情况下可改善抗体的应答。各种引发和促进的组合已在不同的潜在疫苗方案中进行了试验。
Leong等(疫苗1995，327-331)描述首先用表达流感血细胞凝集素(HA)抗原的DNA给小鼠免疫接种然后用表达HA的重组禽痘病毒载体的方法。在后续的促进阶段获得增强的抗体应答。
Richmond等(病毒学1997，230：265-274)描述用DNA引发法和重组痘苗病毒促进法企图提高抗HIV-1env的中和抗体。用该引发促进方案仅观察到低水平的抗体应答，该结果令人失望。
Fuller等(疫苗1997，15：924-926和免疫细胞生物学1997，75：389-396)描述了用复制性重组痘苗病毒作为促进剂免疫接种，增强了对猕猴DNA免疫接种的抗体应答。不过，这不能转变成大大降低病毒负载的增强保护效能，也不能在DNA引发和促进的动物中看到减少CD4 T细胞丢失。
Hodge等(疫苗1997，15：759-768)描述用在重组的禽痘病毒(ALVAC)中表达的人癌胚抗原(CEA)、诱导在小鼠模型中对癌症的增殖性T淋巴细胞应答。作者用重组CEA能复制的Wyeth或WR株的痘苗病毒引发免疫应答，然后用重组CEA的ALVAC促进该应答。这导致T细胞增殖增加，但如果与3种野生型重组免疫接种(100％保护)相比较不能增强保护效能，3种重组ALVAC-CEA免疫接种(70％保护)或WR引发然后2种ALVAC-CEA免疫接种(63％保护)。
因而一些异源性引发-促进组合研究发现，在动物模型中抗体和淋巴增殖应答的某种程度增强，但对保护效能没有明显影响。在这些研究中没有测定CD8 T细胞。有限地增强抗体应答可能简单地反映如下事实：针对引发免疫原的抗体总是降低用相同的免疫原进行第2次免疫接种的免疫原性，而用不同的载体促进将部分克服该问题。预计这种机制不受免疫接种的顺序明显影响。
异源性引发促进免疫接种方案可能影响CD8 T细胞应答的证据由Li等(1993)提供。他们描述通过施用2种活病毒载体，重组复制流感病毒接着用编码疟疾表位的重组复制痘苗病毒，在小鼠中诱导抗疟疾子孢子激发的部分保护效能。免疫接种的相反顺序导致所有保护性效能的丧失，作者认为这种痘苗肝细胞感染有关，导致CTL在肝中定位以保护抗疟疾寄生虫的肝细胞阶段。
Rodrigues等(免疫学杂志1994，4636-4648)描述用重复剂量的表达疟疾环孢子(CS)蛋白的显性免疫B细胞表位的重组流感病毒免疫接种小鼠，接着用重组痘苗病毒促进剂。在促进剂中使用野生型痘苗病毒株和减毒但能复制的痘苗病毒株产生非常相似水平的部分保护作用。然而减毒但能复制的病毒株与野生型痘苗病毒株相比较，轻微减少引发CD8 T细胞的免疫原性。
Murata等(细胞免疫学1996，173：96-107)报道用复制性重组流感病毒引发然后用痘苗病毒复制株促进增强了CD8 T细胞的应答，表明在更早期的二项研究中观察到的部分保护作用起因于该增强的CD8T细胞诱导。
因此综合这三项研究提供了证据，用复制性重组痘苗病毒的促进剂免疫接种可以增强由复制性重组流感病毒引发的某种程度的CD8 T细胞诱导。然而，从它们潜在的应用角度考虑，对这些发现有2种限制因素。首先，所诱导的免疫原性仅足以获得抗疟疾的部分保护作用而甚至这依赖于用不常见的复制性重组流感病毒引发的免疫接种的高度免疫原性。其次，因为用这些复制性病毒作免疫原的潜在及文献记载的副作用，这些重组载体不能作为疫苗用于一般人群。
修饰过的痘苗病毒Ankara(MVA)是一种在大多数细胞类型包括正常人组织中不复制的痘苗病毒株。MVA由在鸡胚成纤维细胞(CEF)中连续传代＞500次衍生而来，该病毒来源于土耳其Ankara一匹马中皮疹损伤得到(Mayr等，1975)。研究表明它是复制受损而仍能诱导抗兽医疱疹病毒感染的保护性免疫(Mayr 1976)。在根除天花战役的最后阶段，MVA被用作人疫苗，通过皮内、皮下和肌内途径在德国南部给＞120,000的受试者施用。未记录到明显的副作用，尽管是故意对诸如患湿疹的高风险组接种疫苗(Mayr等，1978；Stickl等，1974；Mahnel等，1994；)。MVA的安全性反映了在动物模型中病毒的无毒害性，这些动物包括照射过的小鼠和颅内施用后的新生小鼠。MVA的非复制作用与鸡尿囊绒毛膜的增殖性白斑的产生、非鸟类细胞的流产性感染和存在总计大约30kb的6个基因组缺失有关(Meyer等，1991)。MVA的无毒害性部分归结于缺失影响宿主范围基因K1L和C7L，尽管有限的病毒复制仍在人TK-143细胞和非洲绿猴CV-1细胞中发生(Altenburger等，1989)。恢复K1L基因仅部分恢复MVA的宿主范围(Sutter等，1994)。宿主范围限制似乎在病毒颗粒成熟过程中出现，在人HeLa细胞中用电子显微镜仅观察到未成熟的病毒颗粒(Sutter等，1992)。在病毒复制中的晚期阻断不能防止在MVA中重组基因的有效表达。已证实表达流感核蛋白、流感血细胞凝集素和SIV蛋白的重组MVA在动物模型中具有免疫原性并且提供不同程度的保护作用，尽管这种作用绝不能单独归因于CD8+T淋巴细胞(Sutter等，1994；Hirsch等，1995；Hirsch等，1996)。因为安全性和免疫原性的这些特性，重组的MVA被认为是一种有希望的人疫苗候选者(Moss等，1995)。含有编码外来抗原DNA的重组MVA在US 5,185,146专利中有描述(Altenburger)。
痘病毒为逃避宿主免疫应答进化出的策略包括产生起肿瘤坏死因子、IL-1β、干扰素(IFN)-α/β和IFN-γ的可溶性受体作用的分泌蛋白，一般来说这些蛋白具有的序列与细胞因子受体的细胞外结构域相似(Symons等，1995；Alcami等，1995；Alcami等，1992)。最近描述该性质的受体是趋化因子受体(Graham等，1997)。这些病毒受体一般抑制或破坏合适的宿主免疫应答，并且它们的存在和增加的致病原性相关。IL-1β受体是一个例外，它的存在减弱宿主的热应答并增强面对感染时的宿主存活率(Alcami等，1996)。我们已经发现MVA缺乏针对干扰素γ、干扰素αβ、肿瘤坏死因子和CC趋化因子的功能性细胞因子受体，可是的确拥有潜在有益的IL-1β受体。MVA是唯一熟知的拥有该细胞因子受体特征的痘苗病毒株，理论上使其比其他痘病毒更安全和更具免疫原性。另一种熟知的称为NYVAC的复制损伤和安全的痘苗病毒株在Tartaglia等(病毒学1992，188：217-232)的文章中详细描述。
很长时间以来已意识到活病毒作为重组疫苗的载体拥有某些吸引人的特征，包括对外来抗原的高容量和相当好的对细胞免疫应答的免疫原性(Ellis 1988，制造疫苗的新技术，选自疫苗一书。编著者：Plotkin SA和Mortimer E A.W B Saunders，Philadelphia，568页；Woodrow G C.1977，新产生的疫苗一书，第二版。编著者：Levine M M，Woodrow GC，Kaper J B，Cobon G，33页)。这导致设法以各种方式减弱上述活载体的病毒性，包括降低它们的复制能力(Tartaglia J等，1992病毒学，188：217-232)。然而上述在复制方面的降低也降低由病毒产生的抗原数量，因而可预期降低疫苗免疫原性。确实以前的研究显示减弱复制性痘苗病毒株导致在抗体应答方面某种基本降低(Lee M S等，1992病毒学杂志66：2617-2630)。相似地，在狂犬病的研究中发现非复制性禽痘病毒载体比复制性野生型痘苗病毒株更少的针对抗体产生的免疫原性和更少的保护作用(Taylor J等，1991疫苗9：190-193)。
目前已发现非复制性和复制受损的痘病毒株提供的载体能对引发的CTL应答极其良好的促进效应。显然，该效应比由野生型痘病毒引起的促进效应明显要强。该效应可用疟疾和其他抗原如病毒和肿瘤抗原观察到，并且其保护作用在小鼠和非人的灵长类激发实验中显示。用该新型的免疫方案观察到对子孢子的激发完全而不是部分的保护作用。
本发明的目的是鉴别一种有效的抗疟疾免疫方法。本发明的进一步目的是鉴别抗CD8+T细胞应答起保护作用的其他疾病的免疫方法。上述疾病包括但不局限于由HIV病毒、单纯疱疹病毒、带状疱疹病毒、丙肝病毒、乙肝病毒、流感病毒、EB病毒、麻疹病毒、登革病毒和HTLV-1；由细菌结核分支杆菌和李斯特菌类和由原生动物寄生虫弓形虫和锥虫及某些类型的癌症如黑色素瘤、乳腺癌和结肠癌所引起的感染和患病。
我们在此描述一种新的产生非常高水平CD8+T细胞的免疫方法并且发现能诱导抗伯氏疟原虫子孢子激发的前所未有的完全保护作用。在更高等的灵长类中也检测了相同的方法，也发现在该物种中高度的免疫原性，并且发现诱导抗恶性疟原虫激发的部分保护作用。诱导保护性免疫应答也在2种另外的病毒感染和癌症的小鼠模型中说明。
我们进一步显示在该描述的新型免疫方案也在产生抗HIV表位的强CD8+T细胞应答中有效。大量的证据显示所产生的上述CD8+T细胞应答预计在抗该病毒感染和患病的预防或治疗免疫中具有价值(Gallimore等1995；Ada 1996)。我们阐明用来自2种微生物HIV和疟疾序列的表位串，可产生抗来自HIV和疟疾表位的强CD8+T细胞应答。成功产生抗HIV和疟疾表位并且也抗流感和肿瘤表位的增强免疫原性表明该新型的免疫方案一般对许多感染性病原性有效，并且对产生强CD8+T细胞应答可能具有价值的非感染性疾病也有效。
本发明令人惊奇的特征是发现在引发和尤其是促进CD8+T细胞应答中的非常高效能的非复制性药剂。一般而言，由活的复制性病毒载体诱导的CD8+T细胞免疫原性过去发现比非复制性药剂或复制损伤的载体更高。这可从能在宿主中复制的药剂产生更大量的抗原估计出来。然而在此我们发现用非复制性载体观察到最大的免疫原性和保护效能，这是令人吃惊的。后者拥有免疫接种的附加优点，因为它们一般比复制性载体更安全地用于人类。
本发明在一个方面提供一种试剂盒，以产生抗至少一种靶抗原的保护性CD8+T细胞免疫应答，该试剂盒包括：
(i)一种引发组合物，包括来源于一种或多种靶抗原的CD8+T细胞表位，和药用可接受的载体一起使用；和
(ii)一种促进组合物，包括来源于一种或多种靶抗原的CD8+T细胞表位，包括至少一种CD8+T细胞表位与引发组合物的CD8+T细胞表位相同，其中CD8+T细胞表位的来源是非复制性或复制受损的重组痘病毒载体，和药用可接受的载体一起使用；
条件是如果在(i)中表位的来源是病毒载体，(ii)中的病毒载体来源于不同的病毒。
在另一方面本发明提供一种产生抗至少一种靶抗原的保护性CD8+T细胞免疫应答的方法，该方法包括根据本发明施用至少一种剂量的组分(i)，接着施用至少一种剂量的该试剂盒的组分(ii)。
优选地，根据本发明方法(i)中的CD8+T细胞表位的来源是一种非病毒载体或非复制性或复制损伤的病毒载体，尽管也可用复制性病毒载体。
优选地，在(i)中CD8+T细胞表位的来源不是一种痘病毒载体，这样使引发剂和促进剂之间存在极小的交叉反应性。
在本发明的一个优选实施方案中，引发组合物的CD8+T细胞表位的来源是一种核酸，可以是DNA或RNA，尤其是重组的DNA质粒。DNA或RNA可以包装在例如溶酶体中，或自由的形式存在。
在本发明的另一个优选实施方案中，引发组合物中的CD8+T细胞表位的来源是存在于重组CD8+T细胞表位串或在靶抗原中的肽、多肽、蛋白、聚蛋白或包括二种或多种CD8+T细胞表位的颗粒。聚蛋白包括二种或多种可能相同或优选地不同连接在一起的蛋白。在本实施方案中特别优选的是重组蛋白颗粒如Ty病毒样颗粒(VLP)(Burns等，分子生物技术1994，1：137-145)。
优选地，促进组合物中的CD8+T细胞表位的来源是诸如MVA或NYVAC的痘苗病毒载体。最优选的是修饰过的ankara病毒(MVA)或衍生于该病毒的痘苗株。可选用的痘苗载体包括禽痘病毒载体如禽痘病毒或金丝雀痘病毒载体。特别适用的禽痘病毒载体是熟知的ALVAC金丝雀痘病毒病毒株(可从Kanapox购得)和衍生于此的病毒株。
禽痘病毒携带大量的异源遗传信息。用于痘苗对病毒载体的其他要求包括良好的免疫原性和安全性。MVA是一种具有良好的安全性记录的复制受损的痘苗病毒株。在大多数细胞类型和正常人组织中，MVA不复制；在少数的诸如BHK 21细胞的转化细胞类型中观察到MVA的有限复制。由本发明描述的目前结果显示，当用DNA质粒、重组Ty-VLP或重组腺病毒引发后施用促进组合物时，重组的MVA和其他非复制或复制受损的病毒株在产生保护性CD8+T细胞应答方面，比常规的重组痘苗载体惊人地和明显地好。
很明显，来源于MVA的痘苗病毒株或具有MVA特征使MVA特别适合用于疫苗而独立开发的病毒株，也将适用于本发明的用途。
含有插入表位串的MVA(在实施例中描述的MVA-HM)保藏在欧洲动物细胞培养物保藏中心，CAMR，Salisbury，Wiltshire SP4 0JG，英国，登记号V97060511，保藏时间1997年6月5日。
在此所用的术语“非复制”或“复制受损”意味着在大多数正常哺乳动物细胞或正常人细胞中不能有任何明显的复制延伸。非复制或复制受损的病毒可能天然(即它们可能从天然环境中分离)或如通过体外育种或遗传操作，如缺失对复制起关键作用的基因的人工方法得到。一般来说所述的病毒生长在一种或少数细胞类型中，如CEF细胞适于MVA。
病毒的复制一般用2种方法测定：1)DNA合成和2)病毒滴度。更准确而言，在此所用和把其用于痘病毒的术语“非复制或复制受损”意味着病毒符合一种或二种下列的标准：
1)与痘苗病毒哥本哈根株相比，在MRC与细胞(人细胞系)中DNA合成表现为1log(10倍)的降低；
2)与痘苗病毒哥本哈根株相比较，在HELA细胞(人细胞系)中病毒滴度表现为2log的降低。
落入该限定范围的痘病毒实施例为MVA、NYVAC和禽痘病毒，而在该限定范围之外的病毒为减毒的痘苗病毒株M7。
根据本发明另外的用于引发组合物的优选病毒载体包括遗传上残缺致使非复制或复制受损的各种不同的病毒。上述病毒例如包括非复制的腺病毒如E1缺失突变体。遗传残缺的病毒产生非复制或复制受损的载体在文献中已有大量描述(如McLean等，1994)。
其他用于引发组合物中合适的病毒载体是基于疱疹病毒和Venezuelan马脑炎病毒(VEE)(Davies等，1996)，用于引发的合适细菌载体包括重组BCG和重组沙门氏苗和用质粒DNA转化的沙门氏菌(Darji A等，1997细胞91：765-775)。
另外的用于引发组合物的合适非病毒载体包括带有脂质尾的肽如熟知的脂肽，与载体蛋白融合的肽如KLH(要么作为融合蛋白或通过化学连接)，含有佐剂的完整抗原和其他相似的系统。诸如QS 21或SBAS 2的佐剂(Stoute J A等，1997新英格兰医学杂志226：86-91)可和蛋白、肽或核酸一起使用，以增强诱导T细胞应答。这些系统有时称为“免疫原”而不是“载体”，在本发明中从它们携带相关的CD8+T细胞表位的意义上说它们是载体。
没有理由为什么引发和促进组合物不应该一致，因为它们两者可含有如上述(i)中定义的CD8+T细胞表位的引发来源物和如上述(ii)中定义的CD8+T细胞表位的促进来源物。能用作引发剂和促进剂的单一制剂将简化施用方法。重要的事情是该引发剂含有至少上述(i)中定义的表位引发来源物和促进剂含有至少上述(ii)中定义的表位促进来源物。
存在于引发和促进组合物中或由它们编码的CD8+T细胞表位可用各种不同的形式提供，如一个或二个或多个表位的重组串，或天然靶抗原的形式或上述二者的组合。对许多不同的疾病来说，已经鉴定了CD8+T细胞表位并能在文献中找到。有可能设计表位串，以产生抗任何所选的含有上述表位的抗原的CD8+T细胞应答。有利地，在多个表位的串中的表位在没有间隔序列的情况下连接在一起，结果能避免非必需的核酸和/或氨基酸材料。除了CD8+T细胞表位，包括由T辅助细胞识别的一个或多个表位可能是优选的，以增强由表位串产生的免疫应答。特别合适的T辅助细胞表位是那些在不同的HLA型个体中活化的种类，例如来源于破伤风(大多数个体已经引发抗此疾病)的T辅助细胞表位。3种T辅助细胞表位的有用组合已用在本发明描述的实施例中。包括刺激B细胞应答和抗体产生的B细胞表位也可能是有用的。
所述的引发和促进组合物可能包括佐剂，这是有利的。尤其是，包括DNA质粒载体的引发组合物也可包括粒细胞巨噬细胞-集落刺激因子(GM-CSF)或编码该因子的质粒用作佐剂；以多肽形式使用GM-CSF可观察到有利的效应。
在此所述的组合物可用作治疗或预防的疫苗。是否预防或治疗免疫更合适的方案通常依赖于疾病的性质。例如，可预期癌症可以治疗免疫而是确诊之前使用，而抗疟疾的疫苗是优选的，尽管用作预防免疫为非必需的。
根据本发明的组合物可经各种不同的途径施用。某些途径对某些组合物是有益的，由于导致产生更有效的应答，或较少的可能诱导副作用，或施用更容易些。本发明显示在金粒上或作为粉末用基因枪输送是有效的。
进一步方面，本发明提供：
一种产生抗病原或肿瘤的保护性CD8+T细胞免疫应答的方法，该方法包括施用至少一种剂量的编码一种病原或癌症的CD8+T细胞表位或抗原的重组DNA质粒，然后施用至少一种剂量的编码相同表位或抗原的非复制或复制受损的重组痘病毒；
一种产生抗病原或肿瘤的保护性CD8+T细胞免疫应答的方法，该方法包括施用至少一种剂量的包含至少一种病原或癌症的表位或抗原的重组蛋白或颗粒，然后施用至少一种剂量的编码相同表位或抗原的重组MVA载体；
重组的非复制或复制受损的痘病毒载体在制备促进CD8+T细胞免疫应答中的药物的用途；
MVA载体在制备促进CD8+T细胞免疫应答的药物中的用途；
一种促进抗至少一种靶抗原或表位的引发的CD8+T细胞应答的药物，包括靶抗原一种或多种CD8+T细胞表位的来源，其中CD8+T细胞表位的来源是非复制或复制受损的重组痘病毒载体，和药用可接受的载体一起使用；以及
在本发明中所述的引发和/或促进组合物，特别适于用基因枪输送的形式出现；和包括通过基因枪的方法输送组合物的免疫方法。
由本发明提供的还有：在此描述的表位串，包括包含在表1和表2中所列的氨基酸序列的表位串；编码该表位串的重组DNA质粒；包含表位串的重组Ty-VLPs；编码恶性疟原虫抗原TRAP的重组DNA质粒或非复制或复制受损的重组痘病毒；和包含完整或基本完整的蛋白抗原如TRAP及在序列中二个或多个表位的串如来源于疟疾的CTL表位的重组多肽。
制剂和免疫方法举例
制剂1
引发组合物：DNA质粒1mg/ml溶在PBS中
促进组合物：重组MVA，108ffu在PBS中
方法：在0和3周肌内施用2个剂量的1mg引发组合物，接着在6和9周真皮内施用2个剂量的促进剂。
制剂2
引发组合物：Ty-VLP 500μg在PBS中
促进组合物：MVA，108ffu在PBS中
方法：在0和3周肌内施用2个剂量的引发组合物，然后在6和9周施用2个剂量的促进剂。对于肿瘤治疗，作为最有效的途径之一MVA静脉内给入。
制剂3
引发组合物：蛋白500μg+佐剂(QS-21)
促进组合物：重组MVA，108ffu在PBS中
方法：在0和3周施用2个剂量的引发组合物而在6和9周同上施用2个剂量的促进剂感染量。
制剂4
引发组合物：腺病毒载体，109pfu在PBS中
促进组合物：重组MVA，108ffu在PBS中
方法：在0和3周真皮内施用1个或2个剂量的引发组合物以及在6和9周同上施用2个剂量的促进剂感染量。
以上剂量和方法可随优化的保护作用而变化。所给的剂量如在1-8周的间隔而不是2周间隔。
本发明将在下列实施例中进一步描述。
实施例
实施例1
材料和方法
产生表位串
疟疾表位串制自系列的盒，每个盒编码在表1所示的3个表位，在盒的每个末端具有限制性酶位点。每个盒由4个合成的寡核苷酸共用退火而构建，连接到克隆载体中然后测序检查无错误导入。然后按要求将单个盒连接在一起。C盒的3′末端的BamHI位点与A盒的5′末端BglII位点融合，使2个盒之间失去2个限制性酶位点并且编码2个氨基酸间隔子(GS)。然后以相同的方法把盒B、D和H连接到串上。含有CABDHFE较长的串也按相同的方法构建。
表1.疟疾(M)串的CTL表位
Figure C9880806300171
表1  包括在疟疾表位串中的序列。每个盒由如上所示的表位组成，按顺序显示，在盒中表位之间不具有额外的序列。BglII位点被加在5′末端而BamHI位点加在3′末端，结果在表位串的盒之间，BamHI/BglII连接编码GS。所有表位来源于恶性疟原虫抗原(pb 9除外(伯氏疟原虫)，BCG(结核分支杆菌)和TT(破伤风))。在表中所示的氨基酸和DNA序列具有按顺序出现的SEQ ID NOS.1～40。
图1显示用于表达具有疟疾表位盒CABDHFE的Ty-VLP的构建体。CTL表位来自恶性疟原虫STARP(富含苏氨酸和天冬酰胺的孢子蛋白)(st)、LSA-1(肝阶段抗原1)(1s)、CSP(环孢子蛋白)(cp)、TRAP(血小板反应蛋白相关的粘着蛋白)(tr)、LSA-3(肝阶段抗原3)(la)和Exp-1(外排蛋白1)(ex)。辅助表位来自恶性疟原虫CS蛋白、分支结核杆菌38kd抗原和破伤风类毒类。NANP是来自CS的抗体表位而AM来自恶性疟原虫TRAP的粘着基序(Muller等，1993)。完整串的长度如在表1所示为229个氨基酸，具有的氨基酸序列：
MINAYLDKLISKYEDEISYIPSAEKIGSKPNDKSLYKPKDELDYKPIV
QYDNFGSASKNKEKALIIGIAGGLALLMNPNDPNRNVGSHLGNVK
YLVKSLYDEHILLMDCSGSIGSDPNANPNVDPNANPNVQVHFQPLP
PAVVKLQFIKANSKFIGITEGSYLNKIQNSLMEKLKELEKATSVLA
GLGSNANPNANPNANPNANPDEWSPCSVTCGKGTRSRKREGSGK
[SEQ ID NO：41]。
HIV表位串也由退火寡核苷酸法合成。最后HIV和疟疾表位串通过在HIV表位3′末端的BamHI位点连接到盒CAB 5′末端的BglII位点，融合形成HM串(表2)。
表2  HIV/SIV表位串的CTL表位
 表位   限制性   来源
 YLKDQQLLERYLKDQQLEITPIGLAPPPIPVGEIYGEIYKRWIIKRWIILGLNKIILGLNKIVRLGLNKIVRMYYNLTMKCRRGPGRAFVTIGRAFVTIGK   A24，B8B14Mamu-B＊01B35B8B＊2705A33Bw62Mamu-A＊02A2，H-2DdB＊2705   HIV-1gp41HIV-1gp41SIV envHIV-1p24HIV-1p24HIV-1p24HIV-1p24HIV-1p24SIV envHIV-1gp 120HIV-1gp 120
 TPYDINQMLCTPYDINQMRPQVPLRPMTYQVPLRPMTYKVPLRPMTYAVDLSHFLKDLSHFLKEKFLKEKGGLILKEPVHGVILKEPVHGVYHPDIVIYQYVIYQYMDDL   B53Mamu-A＊01B51A＊0301，A11B35A11A＊0301B8A＊0201Bw62B35A＊0201   HIV＝2gagSIV gagHIV-1nefHIV-1nefHIV-1nefHIV-1nefHIV-1nefHIV-1nefHIV-1polHIV-1polHIV-1polHIV-1pol
表2  来自HIV或SIV的表位序列含在H表位串中并如图2所示装配。在表中的氨基酸拥有按顺序出现的SEQ ID NOS：42～64。
图2显示H、M和HM蛋白的图解性略图。在图中代表多肽蛋白的条形类型表示序列的来源(见表1和2)。各个表位和它们的MHC限制性的部位已在蛋白的上下标明。Pb是唯一来源于伯氏疟原虫的蛋白。所有在M蛋白中的其他表位起源于恶性疟原虫蛋白：cs-环孢子蛋白，st-STARP、Is-LSA-1和tr-TRAP、BCG-结核分支杆菌的38kDa蛋白；TT-破伤风毒素。
对于抗肿瘤的疫苗，与疟疾和HIV表位串相似产生了含有CTL表位的表位串。在所公布的该肿瘤表位串中，鼠CTL表位被融合在一起以制造具有下列氨基酸序列的肿瘤表位串：
MLPYLGWLVF-AQHPNAELL-KHYLFRNL-SPSYVYHQF-
IPNPLLGLD[SEQ ID NO：65]。在此所示的CTL表位融合在一起。导入了第一个氨基酸甲硫氨酸以启动翻译。
Ty病毒样颗粒(VLPs)
含有盒CABDH的表位串导入到酵母表达载体中，以形成C-末端框内与TyA蛋白融合。当TyA或TyA融合蛋白从该载体在酵母中表达中，该蛋白自发地形成病毒样颗粒，该颗粒能通过蔗糖梯度离心从酵母的细胞质中纯化。用这种方法制备重组的Ty-VLPs，并针对PBS透析以在注射前移去蔗糖(参见Layton等，1996)。
腺病毒
具有缺失的E1基因复制缺陷的重组腺病毒被用于本研究中(McGrory等，1988)。该腺病毒在CMV IE启动子的控制下表达大肠杆菌β-半乳糖苷酶。用于免疫接种，107 pfu病毒真皮内施用到耳垂内。
肽
购自遗传学研究公司(美国)的肽，以10mg/ml溶解在DMSO(Sigma)中并进一步用PBS稀释到1mg/ml。在此所述的用于本实验含有CTL表位的肽在表3中列出。
表3  CTL肽表位的序列
 序列 抗原  MHC限制性
 LPYLGWLVFSYIPSAEKIRGPGRAFVTITRHPARIGLTYQRTRALVSDYEGRLIASNENMETMINVAFNRFL P1A肿瘤抗原伯氏疟原虫CSPHIV gag大肠杆菌β-半乳糖苷酶流感A病毒NP流感A病毒NP流感A病毒NP恶性疟原虫TRAP  L<sup>d</sup>K<sup>d</sup>D<sup>d</sup>L<sup>d</sup>K<sup>d</sup>K<sup>k</sup>D<sup>b</sup>K<sup>b</sup>
在表3中的氨基酸序列为SEQ ID NOS：66～73，在表中它们按顺序出现。
质粒DNA构建体
许多不同的载体用于构建DNA疫苗。质粒pTH含有具有内含子A的CMVIE启动子，接着是一个多连接子，以允许导入抗原编码序列和牛生长激素转录终止序列。该质粒携带有氨苄青霉素抗性基因并且能在大肠杆菌而不是哺乳动物细胞中复制。该质粒用于制取表达下列每一种抗原的DNA疫苗：伯氏疟原虫TRAP、伯氏疟原虫CS、恶性疟原虫TRAP、恶性疟原虫LSA-1(仅C末端的278个氨基酸)、含有盒CABDH的表位串和HM表位串(HIV表位后接盒CAB)。除了抗生素抗性基因外，质粒pSG2和pTH相似。在pSG2中，pTH的氨苄青霉素抗性基因已被卡那霉素抗性基因所取代。用pSG2制取表达下列抗原的DNA疫苗：伯氏疟原虫PbCSP、小鼠肿瘤表位串、含有盒CABDH的表位串和HM表位串。质粒V1J-NP在CMVIE启动子的控制下表达流感病毒核蛋白。质粒CMV-TRAP和CMV-LSA-1与pTH.TRAP和pTH.LSA-1相似，但不含有CMV启动子的内含子A。质粒RSV.TRAP和RSV.LSA-1含有RSV启动子，SV 40转录终止序列并且是四环素抗性。为诱导β-半乳糖苷酶特异的CTL，用质粒pcDNA3/His/LacZ(Invitrogen)。所有DNA疫苗用Qiagen质粒纯化柱从大肠杆菌DH5α株中制备。
重组痘苗病毒的产生
首先把抗原序列克隆到具有病毒启动子的穿梭载体如质粒pSC11中而制得重组的MVAs(Chakrabarti等，1985；Morrison等，1989)。伯氏疟原虫CS和恶性疟原虫TRAP、流感病毒核蛋白及HM和小鼠肿瘤表位多表位串每一个用P7.5启动子表达(Mackett等，1984)，而伯氏疟原虫TRAP用合成的强启动子表达(SSP；Carroll等，1995)。然后用穿梭载体pSC11或pMCO3转化用野生型的MVA感染过的细胞，结果位于启动子侧翼的病毒序列、抗原编码序列和标记基因能和MVA结合，而产生重组体。重组病毒表达标记基因(β-葡糖醛酸酶或β-半乳糖苷酶)，可以使鉴别含有重组病毒的斑点。在用于免疫前对重组体重复进行斑点纯化。重组的NYVAC-PbCSP痘苗病毒以前已描述(Lanar等，1996)。野生型或编码PbCSP的重组痘苗病毒西式保存(WR)株前已描述(Satchidanandam等，1991)。
细胞和培养基
鼠细胞和EB病毒转化的黑猩猩和猕猴B细胞(BCL)培养在添加10％热灭活的胎中血清(FCS)的RPMI中。脾细胞在含有10％FCS、2mM谷氨酰胺、50U/ml青霉素、50μM 2-巯基乙醇和10mMHepes pH 7.2(Gibco，英国)的MEM培养基中，用所示的肽(终浓度1μg/ml)重新刺激。
动物
所示的6-8周龄的小鼠品系购自Harlan Olac(Shaws农场，Blackthorn，英国)。在位于荷兰Rijswick的灵长类生物医学研究中心研究黑猩猩H1和H2。在牛津大学研究猕猴。
免疫接种
质粒DNA给小鼠免疫接种在麻醉下把DNA肌内免疫接种到胫骨肌中进行。有时小鼠肌肉在免疫接种前5-9天按Davis等(1993)所述的方法，用50μl 1mM的心脏毒素(Latoxan，法国)预处理，但没有发现上述预处理组或未预处理组对免疫原性或保护效能有任何明显的影响。MVA免疫小鼠可通过肌内(i.m.)、静脉内(进入尾侧静脉)(i.v.)、真皮内(i.d.)、腹膜内(i.p.)或皮下(s.c.)免疫法进行。质粒DNA和MVA免疫接种黑猩猩H1和H2在麻醉状态下由腿肌肉的肌内免疫法进行。对这些黑猩猩的免疫接种，质粒DNA和作为佐剂的15微克人GM-CSF共同施用。给黑猩猩施用重组MVA按兽医管理法肌内接种进行。重组人GM-CSF购自Sandoz(Camberley，英国)。对于用基因枪进行质粒DNA免疫，DNA被沉淀到金颗粒上。至于真皮内输送，用了2种不同类型的基因枪，Acell和牛津生物科学装置(PowerJect药业公司，牛津，英国)。
ELISPOT分析
用所示的肽表位和由Miyahara等(1993)所述的ELISPOT分析法，没有用体外重新刺激的情况下确定在免疫过的小鼠脾中的CD8+T细胞。简言之，96孔硝酸纤维素板(Miliscreen MAHA，Millipore，Bedford，英国)用在50μl磷酸盐缓冲液(PBS)中的15μg/ml抗小鼠干扰素-γ的单克隆抗体R4(EACC)包被。在4℃温育过夜后，包被孔用PBS洗一次，然后在室温下用100μl含10％FCS的RPMI封闭。来自免疫过的小鼠的脾细胞被重新悬浮至1×107细胞/ml，重复放置到包被抗体的孔中然后系列稀释。给每孔加入肽至终浓度1μg/ml。没有肽的另外孔用作肽依赖的干扰素-γ分泌的对照。在37℃5％CO2中温育12-18小时后，克隆板用PBS和水洗6次。然后加样孔在室温下用在PBS中的1μg/ml生物素化的抗小鼠干扰素-γ单克隆抗体XMG1.2(Pharmingen，CA，美国)温育3小时。进一步用PBS洗涤后，加50μl1μg/ml的链霉亲和素碱性磷酸酶聚合体(Sigma)溶液，室温温育2小时。反应点加50μl碱性磷酸酶结合底物溶液(Biorad，Hercules，CA，美国)显色。出现反应点后，用水洗涤终止反应。反应点的数目用立体显微镜帮助下确定。
对黑猩猩外周血淋巴细胞的ELISPOT分析，用非常相似的方法采用开发作检测人CD8 T细胞的分析法和试剂(Mabtech，Stockholm)进行。
CTL分析
按Allsopp等(1996)所述的显示和培养小鼠脾细胞作效应器细胞的方法，用铬标记的靶细胞法进行CTL分析。用黑猩猩或猕猴细胞的CTL分析按Hill等(1992)所述的检测人CTL的方法进行，用EBV转化的自身黑猩猩或猕猴B细胞系作为靶细胞。
伯氏疟原虫激发
按所述的静脉内接种法(Lanar等，1996)，用在200μl RPMI中的伯氏疟原虫ANKA株的2000(BALB/c)或200(C57BL/6)子孢子激发小鼠。这些子孢子从史氏按蚊的唾液腺中解剖得到，维持在饲喂感染的小鼠后在18℃下20-25天。在激发后5-12天观察所取的吉姆沙染色的血液涂片中出现伯氏疟原虫的环形，以检测血液阶段的疟原虫感染，有感染表明免疫接种失败。
恶性疟原虫激发
用解剖自冈比亚按蚊唾液腺的20,000个恶性疟原虫NF 54株子孢子，在麻醉状态下用静脉接种法激发黑猩猩。为了检测在外周血中出现低水平的恶性疟原虫寄生虫，自激发后第5天开始，用显微镜和寄生虫培养法每天检查来自这些黑猩猩的血液样品。
P815肿瘤激发
通过静脉内接种法，用在200μl PBS中的1×105 P815细胞激发小鼠。监测这些动物的成活率。
流感病毒激发
通过鼻腔内接种，用100血细胞凝集素单位(HA)的流感病毒A/PR/8/34激发小鼠。激发后每天给小鼠称重并监测成活率。
用四聚体确定肽特异的CTL
由Mamu-A＊01-重链和β2-微球蛋白组成的四聚体复合物按Ogg等(1998)所描述的方法制得。用5′引物MamuNdel：5′-CCTGAC TCA GAC CAT ATG GGC TCT CAC TCC ATG[SEQ ID NO：74]和3′引物：5′-GTG ATA AGC TTA ACG ATG ATT CCA CACCAT TTT CTG TGC ATC CAG AAT ATG ATG CAG GGA TCC CTCCCA TCT CAG GGT GAG GGG C[SEQ ID NO：75]，从cDNA PCR扩增出编码Mamu-A＊01 MHC I型重链的无导肽细胞外部分的DNA。前者引物含有NdeI限制性位点，后者包括HindIII位点和编码生物素化酶BriA底物肽。PCR产物用NdeI和HindIII消化，然后连接到细菌表达载体pGMT7的多连接子的相同位点。编码无导肽的β2-微球蛋白的罗猴基因从cDNA克隆用PCR扩增得到，所用的引物B2MBACK：5′-TCA GAC CAT ATG TCT CGC TCC GTG GCC[SEQ ID NO：76]和B2MFOR：5′-TCA GAC AAG CTT TTA CATGTC TCG ATC CCA C[SEQ ID NO：77]，然后用相似的方法克隆到pGMT7的NdeI和HindIII位点。两条链在大肠杆菌BL-21株中表达，从包含体中纯化，在肽CTPYDINQM[SEQ ID NO：54]存在下重新折叠，用BirA酶生物素化(亲和性)然后用FPLC和monoQ离子交换柱纯化。重新折叠生物素化的MHC-肽复合体的数量用ELISA分析法估计，因此单聚合复合体首先通过敏感单克隆抗体W6/32共形成而捕获，然后用连接有碱性磷酸酶(AP)的链霉亲和素(Sigma)及针对AP的化学比色底物而检测到。加连接有藻红蛋白的链霉亲和素(ExtrAvidin；Sigma)到重新折叠生物素化的单聚体中，以MHC-肽：PE-链霉亲和素摩尔比4∶1诱导四聚复合体的形成。复合体避光贮存在4℃中。这些四聚体用于分析在免疫过的猕猴外周血淋巴细胞(PBL)中Mamu-A＊01/gag特异的CD8+T细胞的频率。
实施例2
在小鼠中免疫原性的研究
诱导抗在伯氏疟原虫和约氏疟原虫的环孢子(CS)蛋白中的表位的CTL的过去研究显示，用不同的输送系统CTL诱导水平有变化。据报道用质粒DNA(Sedegah等，1994)、由复制性痘苗病毒促进的流感病毒(Li等，1991)、腺病毒(Rodrigues等，1997)和颗粒输送系统(Schodel等，1994)具有部分保护作用。用50微克编码CS蛋白的质粒肌内免疫小鼠，经单次注射后小鼠的脾中产生中度水平的CD8+细胞和CTL活性(图3，4)。
作为比较，用全部表达伯氏疟原虫CSP的106ffu/pfu的重组痘苗病毒不同株(WR、NYVAC和MVA)静脉内注射BALB/c小鼠组(n＝5)。肽特异的CD8+T细胞频率10天后用ELISPOT分析法测定。WVA.PbCSP诱导181+/-48、而NYVAC 221+/-27和WR 94+/-19(平均数+/-标准差)肽特异CD8+T细胞。这些结果表明在引发CD8+T细胞应答中，复制受损的痘苗病毒比复制性病毒株惊人地优越。然后我们设法用同源或异源载体及质粒DNA或MVA引发诱导，以促进这些中度的CD8+T细胞应答。单独用CS重组DNA疫苗、单独重组MVA疫苗或重组MVA然后用重组DNA经2次免疫后观察到低水平的CD8+T细胞(图3)。用重组MVA促进DNA引发的免疫应答，观察到非常更高水平的CD8+T细胞。在第2次实验中每组用10只小鼠，确证了DNA/MVA序列增强免疫原性：DNA/MVA 856+/-201；MVA/DNA168+/-72；MVA/MVA 345+/-90；DNA/DNA 92+/-46。因此用编码CS蛋白的重组质粒第一次免疫接着用重组MVA病毒第二次免疫的次序，免疫后产生最高水平的CD8+T淋巴细胞应答。
图3显示用不同的免疫方案后，疟疾CD8 T细胞ELISPOT的数据。结果以每百万脾细胞的肽特异T细胞数表示。如在X轴所示用PbCSP质粒DNA或PbCSP-MVA病毒或二者的组合免疫小鼠，以2周间隔为次，对bp9疟疾表位特异的脾细胞数在最后一次免疫后2周测定。每一个代表单个小鼠中测定的形成反应点的细胞数(SFCs)。用质粒DNA引发和用重组MVA病毒促进诱导最高水平的CD8+T细胞。这比相反的免疫次序(MVA/DNA)、2次DNA免疫(DNA/DNA)或2次MVA免疫(MVA/MVA)更有免疫原性。它也比同时给DNA和MVA免疫(DNA+MVA 2w)、1次DNA免疫(DNA 4w)或较早或较晚时间点1次MVA免疫(MVA 2w和MVA 4w)更有免疫原性。
图4显示用编码相同抗原的质粒DNA引发后，基本上通过重组MVA免疫促进的疟疾CD8 T细胞ELISPOT和CTL水平。A和C.用γ-干扰素ELISPOT分析法测定在BALB/c小鼠中的CD8+T细胞应答，该法用来自伯氏疟原虫CSP的Kd限制性肽SYIPSAEKI[SEQ ID NO：67]和来自大肠杆菌β-半乳糖苷酶的Ld限制性肽TPHPARIGL[SEQID NO：69]计数值用对数标尺表示。B和D.用常规51Cr释放分析法，用相同的肽(1μg/ml)体外重新刺激6天后，在效应细胞：靶细胞比率为100∶1时也测定来自相同小鼠的脾细胞。
用表达伯氏疟原虫CSP和TRAP、单独PbCSP、包括伯氏疟原虫CTL表位的疟疾表位盒(标记为pTH.M)或β-半乳糖苷酶的质粒DNA免疫小鼠。1次DNA免疫后23天测定在小鼠中的ELISPOT和CTL水平，结果分别在A和B显示。相同的分析用接受额外的1×107ffu表达相同抗原的重组MVA的动物、初次免疫后2周进行。在这些动物中ELISPOT和CTL水平分别在C和D显示。每一条表示来自单个动物的数据。
也进行研究包含串联排列的HIV和疟疾表位的表位串的免疫原性。用该表位，当用DNA疫苗免疫，接着用重组MVA疫苗免疫时，再次产生最高水平的CD8+T细胞和CTL(表4，图5)。
表4  用ELISPOT分析法确定不同的DNA/MVA组合的免疫原性
第一次免疫    第二次免疫   HIV表位      疟疾表位
DNA-HM        DNA-HM       56±26       4±4
MVA-HM        MVA-HM       786±334     238±106
MVA-HM        DNA-HM       306±78      58±18
DNA-HM        MVA-HM       1000±487    748±446
无            DNA-HM       70±60       100±10
无            MVA-HM       422±128     212±94
表4  显示用所示的质粒DNA和MVA不同免疫方案后，进行ELISPOT分析法测定针对HIV和疟疾表位的特异CD8+T细胞水平的结果。数字为每百万脾细胞中形成反应点的细胞。HM表位串在图2说明。在所有情况下用BALB/c小鼠。疟疾表位为pb 9，在图2和3所示。HIV表位是RGPGRAFVTI[SEQ ID NO：51]。免疫的剂量为50μg质粒DNA或107噬菌斑形成单位的重组MVA。所有免疫在肌内进行。在所有情况下第1次和第2次免疫的间隔时间为14～21天。
表5显示使用质粒DNA和重组MVA通过各种免疫方案，在BALB/c小鼠中诱导对疟疾和HIV表位的CTL应答。按表3相应所述的方法肌内免疫小鼠。对疟疾和HIV两种表位来说，只有用质粒DNA引发和重组MVA促进后观察到高水平的CTL(在效应细胞/靶细胞之比为25∶1时特异裂解＞30％)。在本实验所用的抗原是HIV-疟疾表位串。重组的MVA标记为MVA.HM而表达该表位串的质粒DNA标记为pTH.HM。显示了在各种效应细胞与靶细胞比率的特异裂解水平。这些结果用2种肽pb 9和RGPGRAFVTI[SEQ ID NO：51]体外重新刺激脾细胞5天后测定。
Allsopp等(1996)报道比较诱导CTL的多种输送系统。重组的Ty病毒样颗粒(Ty-VLPs)和脂质尾巴的疟疾肽两者给出良好的CTL诱导率，但Ty-VLPs更好因为对于良好的CTL诱导率它们仅需要单一的免疫剂量。然而，正如本发明所示，甚至2个剂量的Ty颗粒不能诱导明显的抗子孢子激发的保护作用(表7，第一行)。用编码伯氏疟原虫环孢子蛋白的修饰过的重组痘苗Ankara病毒免疫也产生良好水平的CTL。然而，通过用Ty-VLP第1次免疫接着用MVA CS疫苗第2次免疫，可获得更高水平的CD8+T细胞应答(表5)。
表5  由ELISPOT和CTL分析法确定的各种Ty-VLP/MVA组合的免疫原性
第1次免疫    第2次免疫    ELISPOT数    ％特异裂解
Ty-CABDH     Ty-CABDH     75           15
MVA.PbCSP    MVA.PbCSP    38           35
Ty-CABDH     MVA.PbCSP    225          42
Ty-CABDH     MVA.HM       1930         未做
表5  用所示的Ty＝VLPs和重组MVA病毒不同免疫方案接种后，进行ELISPOT和CTL分析而测定对疟疾表位pb 9特异的CD8+T细胞水平的结果。CTL和ELISPOT数据来自不同实验。根据未重新刺激的细胞测定ELISPOT水平(每百万淋巴细胞的反应点数)，而用pb 9肽体外重新刺激5-7天的细胞，以效应细胞与靶细胞之比40∶1测定CTL活性，结果以特异裂解表示。2种数据代表3只小鼠的平均水平。在所有情况下用BALB/c小鼠。免疫剂量为50μg Ty-VLP或107ffu(转化灶形成单位)的重组MVA。所有免疫接种为肌肉内。第1次和第2次免疫的时间间隔为14～21天。MVA.HM包括盒CAB。
通过基因枪输送DNA引发免疫应答和用重组MVA促进免疫原性和激发
研究了应用基因枪真皮内输送质粒DNA，因而引发免疫应答及用重组MVA促进。用下列的方案免疫BALB/c小鼠组。
I)以2周间隔用pTH.PbCSP(每次免疫4mg)进行3次基因枪免疫
II)2次基因枪免疫，接着2周后静脉注射MVA
III)一次肌内DNA免疫，接着2周后静脉注射MVA
3种免疫方案的免疫原性用ELISPOT分析法分析。用2次基因枪免疫接着静脉注射MVA促进和肌内DNA注射接着静脉注射MVA，观察到最高频率的特异T细胞(图6)。
图6显示用不同的免疫方案接种后进行ELISPOT分析所测定的特异CD8+T细胞水平的结果。如所示的方法免疫BALB/c小鼠组(n＝3)(g.g.＝基因枪)。所有免疫时间为14天。最后一次免疫后2周进行ELISPOT分析。
在不同小鼠品系中对相同抗原的CTL诱导
为说明如上所述用2种CTL表位，来源于伯氏疟原虫CSP的SYIPSAEKI[SEQ ID NO：67]和来源于HIV的RGPGRAFVTI[SEQID NO：68]在BALB/c小鼠中产生的促进效应是否普遍现象的问题，进行了2组实验。在5种近交的小鼠品系中研究对流感病毒核蛋白的CTL应答。在第一次实验中研究了3种来源于流感病毒核蛋白的文献发表的鼠CTL表位(见表3)。用3种不同H-2单倍型，BALB/c和DBA/2(H-2d)、C57BL/6和129(H-2b)、CBA/J(H-2k)的小鼠。一组动物以2周间隔用编码流感病毒核蛋白的质粒V1J-NP免疫2次。另一组相同的动物用V1J-NP引发，2周后用106 ffu表达流感病毒NP的MVA.NP静脉内促进。在单个小鼠中的CTL水平用51Cr-释放分析法，用肽重新刺激的脾细胞测定。如图7中所示，在所有分析过的小鼠品系中，DNA引发/MVA促进免疫方案诱导较高水平的裂解并且超过2次DNA注射的效果。
图7显示在不同的小鼠品系中抗流感病毒NP的CTL应答。不同品系的小鼠以2周间隔用编码流感病毒核蛋白的DNA疫苗V1J-NP免疫2次(空心圆)，或者用相同的DNA疫苗引发然后2周后用表达流感病毒核蛋白的重组MVA促进(实心圆)。最后一次免疫后2周，用各种肽(表3)体外重新刺激脾细胞。CTL活性用标准51Cr-释放测定法用MHC I型匹配的靶细胞测定。
在不同小鼠品系中对不同抗原的CTL诱导
用不同的抗原和不同的近交小鼠品系，进一步研究MVA促进对质粒DNA引发的免疫应答的影响。不同品系的小鼠用2种DNA免疫法用不同的抗原免疫并且和DNA/MVA免疫法相比较所用的抗原是大肠杆菌-半乳糖苷酶、疟疾/HIV表位串、鼠肿瘤表位串和恶性疟原虫TRAP。与2次DNA免疫相比较，在所有试验的不同小鼠品系和抗原组合中，DNA引发/MVA促进方案诱导更高水平的CTL(图8)。
图8显示在不同近交小鼠品系中诱导的抗不同抗原的CTL应答。小鼠以2周间隔用2次DNA疫苗免疫法免疫(空心圆)，或者用DNA疫苗引发2周后，用表达相同抗原的重组MVA促进(实心圆)。所用的品系和抗原为：在A中，C57BL/6，疟原虫TRAP；在B中，DBA/2，大肠杆菌β-半乳糖苷酶；在C中，BALB/c，抗疟疾肽(pb 9)CTL活性的HM表位串；在D中，DBA/2，抗pb 9 CTL活性的HM表位串；在E中，BALB/c，抗HIV肽CTL活性的HM表位串；在F中，DBA/2，抗HIV肽CTL活性的HM表位串；在G中，BALB/c，抗衍生于P1A的肽CTL活性的肿瘤表位串。肽表位的序列在表3显示。每一条曲线显示各个小鼠的数据。
子孢子能有效地引发能由MVA促进的免疫应答
生活在疟疾流行区的人群不断地接触疟原虫的侵入。在这些天然接触过的个体中发现低水平的疟疾特异CTL。为说明低水平子孢子诱导CTL应答是否能通过MVA促进的问题，BALB/c小鼠被照射过的伯氏疟原虫子孢子(预防疟疾感染)免疫，然后用MVA促进。最后一次免疫后2周，重新刺激脾细胞，然后测定裂解活性。用50或300+500个子孢子2次注射诱导非常低或无法检测的裂解水平。用MVA促进诱导高水平的肽特异CTL。单独MVA仅诱导中度的裂解水平(图9)。
图9显示子孢子引发的CTL应答基本上被MVA所促进。在A中，用2种低剂量(50+50)照射过的子孢子免疫小鼠。在B中，用2种高剂量(300+500)的子孢子免疫；在D中，低剂量子孢子引发后用MVA.PbCSP促进的小鼠；在E中用高剂量子孢子引发。在C中显示用MVA.PbCSP免疫后的CTL应答。
重组的腺病毒作为引发剂
用质粒DNA和重组Ty-VLP作为引发剂实例说明引发-促进免疫方案。在此提供用非复制性腺病毒作为引发剂的一个实施例。用表达大肠杆菌β-半乳糖苷酶(Adeno-GAL)的复制缺陷重组腺病毒。BALB/c小鼠组用质粒DNA接着用MVA免疫或先用腺病毒接着用MVA免疫。所用的所有输送系统编码大肠杆菌β-半乳糖苷酶。用质粒DNA或腺病毒引发然后用MVA促进的CTL应答诱导相似水平的CTL(图10)。
图10显示用质粒DNA或重组腺病毒引发，然后用MVA促进的CTL应答。BALB/c小鼠组(n＝3)用质粒DNA A或表达β-半乳糖苷酶的重组腺病毒B引发。质粒DNA肌内施用，MVA静脉内施用而腺病毒真皮内施用。最后一次免疫后2周用肽TPHPARIGL[SEQ ID NO：69]重新刺激脾细胞。CTL活性用肽标记P815细胞测定。
DNA引发痘苗病毒促进方案的免疫原性依赖于所用的痘苗病毒株的复制能力
用不同的重组痘苗病毒株检验引发促进策略，以确定其复制能力有差异的不同病毒株是否在可能促进DNA引发的CTL应答有差异。与用相同剂量的能复制的WR痘苗病毒促发后的CTL应答相比较，用复制缺陷的重组痘苗病毒如MVA和NYVAC促进导致诱导更强的CTL应答(图11)。
图11显示在BALB/c小鼠中用质粒DNA引发接着用不同的重组痘苗病毒促进的CTL应答。所述的动物用pTH.PbCSP 50μg/鼠肌内注射引发，2周后用不同的表达PbCSP的重组痘苗病毒株(每小鼠静脉内注射106pfu)促进。不同的重组痘苗病毒株在A为MVA；在B为NYVAC而在C为WR。在进一步的实验中发现复制受损的痘苗病毒株比复制性病毒株的优越性。BALB/c小鼠组(n＝6)用50μg/动物的pSG2.PbCSP(肌内注射)引发，10天后用106ffu/pfu的表达PbCSP的重组MVA、NYVAC和WR静脉内注射促进。用ELISPOT分析法确定肽特异的CD8+T细胞的频率。该频率为：MVA 1103+/-438，NYVAC 826+/-249和WR 468+/-135。因此用CTL和ELISPOT两种分析法作为CD8 T细胞免疫原的测定法，观察到与能复制的病毒株相比复制受损的痘苗病毒株惊奇的基本上较强的免疫原性。
应用重组的金丝雀或禽痘病毒促进CD8+T细胞应答
用过去所描述过的穿梭载体(Taylor等，病毒学1992，187：321-328和Taylor等，疫苗1988，6：504-508)，制得重组的金丝雀痘病毒(rCPV)或禽痘病毒(rFVP)。针对这些穿梭载体的策略是以痘苗病毒特异的启动子在前插入编码目的蛋白的基因，所述的启动子位于包括来源于CPV或FPV基因组序列的2个侧翼之间。选择这些侧翼序列是为了避免插入到必需的病毒基因中。在允许的鸟类细胞系即原代鸡胚成纤维细胞中，通过体内重组产生重组的CPV或FPV。用禽痘病毒或金丝雀痘病毒能表达任何抗原或表位串的蛋白序列。重组的CPV或FPV的特征为，用抗原特异的抗体或包括进入重组基因的抗体表位表达目的蛋白。重组的病毒生长在原代CEF中。按材料和方法中所述的方法，用质粒DNA引发免疫应答。该质粒DNA引发的免疫应答用107ffu/pfu的rCPV或rFPV静脉内、真皮内或肌内接种促进。监测CD8+T细胞应答并按本发明所述的方法进行激发。
实施例3
在小鼠中研究疟疾激发
为估测诱导CD8+T细胞应答水平的保护性效能，用2000或200个伯氏疟原虫子孢子经静脉内注射免疫激发BALB/c或C57BL/6小鼠。这导致由子孢子对肝细胞的感染。然而，在足够强的抗肝内寄生虫的T淋巴细胞应答存在下，没有活的寄生虫能离开肝脏并且也检测不到血液阶段的寄生虫。因此，激发后5-12天通过显微镜评价来自激发小鼠血涂片的寄生虫。
用分别编码伯氏疟原虫的CS蛋白和TRAP抗原的2种质粒DNAs混合物2次免疫过的BALB/c小鼠，不能保护抵抗子孢子激发。用编码相同的2种抗原的重组MVA病毒混合物2次免疫过的小鼠不能保护抵抗子孢子激发。第一次用2种MVAs和第二次用2种重组质粒免疫的小鼠也不能保护抵抗子孢子激发。然而，第一次用2种质粒DNAs和第二次用2种重组的MVA病毒免疫的全部15只小鼠完全抗子孢子激发(表6A和B)。
为评价所观察到的保护作用是否由于对CS抗原或对TRAP或对二者抗原的免疫应答，于是各自用每种抗原免疫各组小鼠(表6B)。第一次用CS质粒DNA和第2次用CS MVA病毒免疫的所有10只小鼠完全保护抵抗子孢子激发。第一次用TRAP质粒DNA疫苗和第二次用TRAP MVA病毒免疫的16只小鼠，其中14只保护抵抗子孢子激发。因此，当采用上述的免疫方案时，单独的CS抗原就有完全保护性而用相同的方案TRAP抗原基本上有保护性。
在诱导CD8+T淋巴细胞应答水平和所观察到的保护作用之间的良好相关性，强烈暗示CD8+应答是所观察到的保护作用的可靠原因。在以前过继转移实验中已经阐明，抗伯氏疟原虫CS蛋白中主要CD8+T细胞表位的CD8+T淋巴细胞克隆能保护抵抗子孢子激发。为确定所诱导的保护作用是否确实由针对该表位的CD8+T细胞所介导，我们于是采用质粒DNA和编码来自伯氏疟原虫仅9个氨基酸序列作为部分表位串的重组MVA(表6B)。(所有其他表位来源于不是伯氏疟原虫的微生物)。第一次用编码上述表位串的质粒和第二次用也编码具有伯氏疟原虫CTL表位的表位串的重组MVA免疫的10只小鼠，引起完全免受子孢子激发的保护作用。因此，所诱导的保护免疫应答应该是CTL应答，该应答靶向所述的九肽序列。
表6  用不同的DNA和MVA疫苗组合得到的小鼠激发实验的结果
第1次免疫    第2次免疫      感染数/激发数％保护作用
A.     所用的抗原：PbCSP+PbTRAP
DNA    DNA    5/5      0％
MVA    MVA    9/10     10％
DNA    MVA    0/5      100％
MVA    DNA    5/5      0％
用β-半乳糖苷酶免疫的对照小鼠
DNA    DNA    5/5    0％
MVA    MVA    5/5    0％
DNA    MVA    5/5    0％
MVA    DNA    5/5    0％
B.
DNA(CSP+TRAP)  MVA(CSP+TRAP)      0/10      100％
DNA(CSP)       MVA(CSP)           0/10      100％
DNA(TRAP)      MVA(TRAP)          2/16      88％
DNA(表位)      MVA(表位)          0/11      100％
DNA(β-gal)    MVA(β-gal)        6/7       14％
无             无                 9/10      10％
表6  所示的用质粒DNA和MVA的不同免疫方案进行2次激发实验的结果(A和B)。免疫的剂量为50μg的质粒DNA或106ffu的重组MVA。在所有情况下，第1次免疫和第2次免疫的时间间隔为14～21天。在最后一次免疫后18-29天通过静脉注射2000个伯氏疟原虫的子孢子进行激发，然后在激发后5、8和10天评价血涂片。CSP和TRAP表示为完全的伯氏疟原虫抗原而‘表位’表示在表1所示的仅含有单一伯氏疟原虫Kd-限制性九肽CTL表位的表位盒。注意在实验B中，单独用表位串免疫产生100％保护作用。
用编码pb 9的重组Ty-VLPs 2次免疫过的小鼠完全对感染敏感。相似地，用编码整个CS蛋白的重组MVA 2次免疫过的小鼠完全对感染敏感。然而，用Ty-VLP免疫一次接着用重组的MVA免疫一次的小鼠，当用表达全长的CS蛋白的MVA促进时显示为降低85％的疟疾发生率，而当用表达包括pb 9的HM表位串的MVA促进时降低95％的疟疾发生率(表7)。
表7  用Ty-VLPs和MVA的不同免疫方案得到的激发实验结果
第1次免疫    第2次免疫    感染数/激发数  ％保护作用
Ty-CABDHFE   Ty-CABDHFE   7/8            13％
Ty-CABDH     MVA.PbCSP    2/13           85％
Ty-CABDHFE   MVA-NP       5/5            0％
MVA.PbCSP    MVA.PbCSP    6/6            0％
MVA.HM       Ty-CABDHFE   14/14          0％
Ty-CABDHFE   MVA.HM       1/21           95％
无           MVA.HM       8/8            0％
无           无           11/12          9％
表7  所示的用Ty-VLPs和MVA的不同免疫方案得到的激发实验结果。在所有情况下用BALB/c小鼠。静脉内施用50μg Ty-VLP或107ffu的重组MVA进行免疫。在所有的情况下，第1次和第2次免疫的时间间隔为14～21天。最后一次免疫后18-29天通过静脉注射2000个伯氏疟原虫子孢子进行激发，激发后5、8和10天评价血涂片。CSP表示完全的伯氏疟原虫抗原。Ty-VLPs携带在表1所述的表位盒CABDH或CABDHFE。MVA.HM包括盒CAB。
为确定所观察到的用重组MVA促进的增强免疫原性和保护效能是否对该特殊的痘苗病毒株是唯一的或可由其他重组痘苗病毒承担，进行了下列的实验。小鼠用编码伯氏疟原虫CS蛋白的DNA疫苗免疫，然后用(i)编码该抗原的重组MVA；(ii)编码相同抗原的重组野生型痘苗病毒(西方保存株)(Satchidanandam等，1991)或(iii)编码相同疟疾抗原的重组NYVAC(COPAK)病毒(Lanar等，1996)促进。用MVA重组体促进观察到最高程度的保护作用，为80％(表8)。用野生型重组痘苗病毒促进观察到非常低水平的保护作用(10％)而用NYVAC重组体促进观察到明显水平的保护作用，为60％。因此我们所描述的引发-促进方案可用任何非复制性痘苗病毒株诱导保护效能。MVA重组体和NYVAC两者比WR株重组体明显更好(每种均P＜0.05)。
表8  用不同的痘苗病毒株重组体促进的DNA的激发数据结果
第1次免疫     第2次免疫     感染数/激发数   ％保护作用
DNA-βgal.    MVA.NP        8/8             0％
DNA-CSP       MVA-CSP       2/10            80％
DNA-CSP       WR-CSP        9/10            10％
DNA-CSP       NYVAC-CSP     4/10            60％
表8  所示的用质粒DNA和各种痘苗病毒重组体的不同免疫方案得到的激发实验的结果。在所有情况下用BALB/c小鼠。免疫的剂量为50μg质粒DNA或106ffu/pfu的重组MVA或104ffu/pfu的重组野生型(WR)痘苗病毒或106ffu/pfu的重组NYVAC。由于WR株能在宿主中复制而其他病毒株不能，在本实验中用低剂量的WR。第1次和第2次免疫的间隔时间为23天。最后一次免疫后28天通过静脉注射2000个伯氏疟原虫子孢子进行激发，激发后7、9和11天评价血涂片。pbCSP表示为完全的伯氏疟原虫抗原而NP表示流感病毒的核蛋白抗原(用作对照抗原)。用表达β-半乳糖苷酶而不显疟疾抗原的质粒DNA载体第1次免疫A组小鼠。
在表8所示的进一步实验中，小鼠被编码伯氏疟原虫CS蛋白的DNA疫苗免疫，然后用(i)编码该抗原的重组MVA；(ii)编码相同抗原的重组WR痘苗病毒或(iii)编码相同疟疾抗原的重组NYVAC(COPAK)病毒促进，所有的剂量为106ffu/pfu。用重组NYVAC(80％)或重组MVA(66％)观察到高并且统计学上明显程度的保护作用。用WR重组痘苗病毒促进观察低和不明显水平的保护作用(26％)(表9)。MVA和NYVAC每一种促进比WR促进给出更明显的保护作用(分别为P＝0.03和P＝0.001)。这些数据重新强调非复制的痘病毒株是诱导高水平保护作用的较好促进剂。
表9  不同的重组痘苗病毒株对保护作用的影响
   第1次免疫DNA   第2次免疫    感染数/激发数     ％保护作用
   CSPCSPCSP   MVA.PbCSPNYVAC.PbCSPWR.PbCSP    5/152/1511/15     668026
   β-半乳糖苷酶   MVA.NP    8/8     0
表9  用质粒DNA和作为促进免疫的不能复制的痘苗重组体的不同免疫方案得到的激发实验结果。在所有情况下用BALB/c小鼠。免疫的剂量为50μg的质粒DNA或106ffu/pfu的重组MVA或重组野生型(WR)痘苗病毒或重组NYVAC。第1次和第2次免疫的间隔时间为23天。最后一次免疫后28天通过静脉注射2000个伯氏疟原虫子孢子进行激发，激发后7，9和11天评价血涂片。PbCSP表示整个伯氏疟原虫抗原而NP表示流感病毒的核蛋白抗原(用作对照抗原)。对照免疫用表达β-半乳糖苷酶的质粒DNA载体接着用MVA NP进行。
用重组MVA促进免疫应答的不同途径
重组MVA静脉内注射并不是免疫人类的优选途径，并且在大规模免疫中也不方便。因此用MVA促进的不同途径以检验其免疫原性和保护性效能。小鼠用质粒DNA肌内注射引发，2周后经下经途径：静脉内(i.v.)、皮下(s.c.)、腹膜内(i.p.)、肌肉内(i.m.)和真皮内(i.d.)，用MVA促进它们。该促进2周后用ELISPOT测定法确定肽特异的CD8+T细胞。诱导该细胞最高水平的最有效途径是i.v.和i.d.接种MVA。其它途径引起中度至弱的应答(图12)。
图12显示经不同途径的MVA促进后肽特异的CD8+T细胞的频率。结果从每一百万脾细胞的斑点形成细胞(SFC)数表示。小鼠用质粒DNA引发然后2周后经所示的途径用MVA促进。最后一次免疫后2周，用INF-γ-ELISPOT法确定对SYIPSAEKI[SEQ ID NO：67]肽特异的脾细胞数。每条代表来自单独分析的3只小鼠的SFCs平均数。
在一激发实验中经静脉内途径的促进与真皮内和肌肉内途径进行比较。真皮内途径引起高水平的保护作用(80％保护作用)。在经肌肉内途径促进的动物组中，50％的动物受到保护。用MVA静脉内施用获得完全的保护作用(表10)。
表10  MVA施用途径对保护效能的影响
第1次免疫作用DNA 第2次免疫作用MVA    感染数/激发数   ％保护作用
CSPCSPCSP表位NP CSP i.v.CSP i.d.CSP i.m.表位i.v.NP i.v.    ＊0/202/105/101/1010/10   1008050900
＊来自2次独立实验的累积数据
表10  用不同途径的MVA促进免疫的激发实验结果。动物通过肌肉内注射质粒DNA被引发，2周后用所示的重组MVA(106ffu/小鼠)经所示的途径施用。最后一次免疫后16天，用2000个伯氏疟原虫子孢子激发小鼠，激发后第8和第10天筛选血阶段的寄生物血症。
DNA引发的其他途径：用基因枪引发肽特异的CD8+T细胞
作为实例在Eisenbraun等，DNA细胞生物学1993，12：791-797和Degano等，疫苗1998，16：394-398中详细描述基因枪输送法。
到此为止描述的用质粒DNA引发免疫应答的小鼠疟疾激发实验用肌肉骨注射质粒DNA。用Biolistic装置真皮内输送DNA是另一种引发特异的CTL应答的途径。质粒DNA被包被到金颗粒上，然后用基因枪真皮内输送。单独用基因枪以2周间隔免疫小鼠组(n＝10)3次(4μg/每次免疫)，用基因枪接着用静脉内MVA.PbCSP促进免疫2次，或者用50μg pTH.PbCSP肌肉内免疫，2周后用MVA.PbCSP静脉内促进。最后一次免疫后2周，所述的动物被2000个子孢子激活，以评价每种免疫方案的保护效能。在接受2次基因枪免疫后静脉内MVA促进的组中，10只动物中有一只出现血液阶段寄生物血症(90％的保护作用)。用肌肉内DNA引发然后静脉注射MVA促进的组中观察到完全的保护作用。用基因枪免疫3次的10只动物，其中7只被感染(30％的保护作用)(表11)。
Figure C9880806300391
表11  比较不同的DNA引发途径(用基因枪真皮内输送相对于肌肉内针头注射)的激发实验结果。按所示的方法免疫BALB/c小鼠组(n＝10)。每次基因枪免疫表真皮内输送4μg的质粒DNA。对于肌肉内免疫，注射50μg的质粒DNA。最后一次免疫后20天，按以前所描述的方法激发小鼠。
保护高度敏感的C57BL/6小鼠
C57BL/6小鼠对伯氏疟原虫子孢子激发非常敏感。用DNA-MVA引发促进方案及用两种前红细胞抗原PbCSP和PbTRAP免疫C57BL/6小鼠，每只鼠用200或1000个感染性子孢子激发(200个子孢子相当于在该品系诱导感染所需的剂量2倍以上)。用200个子孢子激发的所有10只小鼠表现为使激发不起作用的免疫性。甚至用1000个子孢子激发的组中，60％的小鼠受到保护(表12)。所有首次组C57BL/6小鼠激发后被感染。
表12子孢子激发C57BL/6小鼠的保护作用
                   动物感染数/激发数     ％保护作用
1000只子孢子DNA
然后用MVA          4/10                  60
首次组             5/5                   0
200只子孢子DNA
然后用MVA          0/10                  100
首次组             5/5                   0
表12  用C57BL/6小鼠的激发实验结果。用DNA接着用MVA引发促进方案及用PbCSP和PbTRAP免疫动物。14天后按所示的方法用伯氏疟原虫子孢子激发小鼠。
实施例4
在小鼠2种进一步的疾病模型中DNA引发/MVA促进方案的保护效能
下列免疫原性研究中，在2种另外的小鼠激发模型中检测到DNA-引发MVA-促进方案的保护效能。2种激发模型是P815肿瘤模型和A型流感病毒激发模型。在2种模型系统中显示CTL介导保护作用。
P815肿瘤激发：
用DNA接着用表达肿瘤表位串或HM表位串的MVA的组合免疫DBA/2小鼠组(n＝10)。最后一次免疫后2周静脉内给予105 P815细胞激发小鼠。该激发后，定期监测小鼠出现肿瘤相关的特征和成活率。
图13显示2组小鼠的成活率。激发后60天用肿瘤表位串免疫的组中，10只小鼠其中8只仍成活。在用HM表位串免疫的组中，仅2只动物存活。该结果具有统计学显著性：2/10相对于8/10卡方＝7.2，P＝0.007。与用HM表位串免疫的组相比较，在用肿瘤表位串免疫的动物组中死亡的出现时间被延迟。
流感病毒激发：
BALB/c小鼠被用质粒DNA 3次基因枪免疫、2次肌肉内质粒DNA注射免疫、1次肌肉内DNA注射接着1次静脉内MVA.NP促进免疫、或2次基因枪免疫接着1次MVA.NP静脉内促进。质粒DNA和重组的MVA表达流感病毒核蛋白。最后一次免疫后2周鼻内用流感A/PR/8/34病毒100HA激发小鼠。激发后每天监测所述动物的成活率。
在下列动物组中观察到完全保护作用
●2次基因枪免疫接着1次MVA.NP静脉内促进。
●1次肌肉内DNA注射接着1次MVA.NP静脉内促进
●2次肌肉内DNA注射。
用基因枪3次免疫的动物组中，71％的动物成活(5/7)而与对照组相比该差异值无统计学显著性(P＞0.05)。在首发组中25％的动物存活(图14)，该组与完全保护的2组差异显著(P＜0.05)。
图14显示流感病毒激发实验的结果。按所示的方法免疫BALB/c小鼠。GG＝基因枪免疫、im＝肌肉内注射、iv＝静脉内注射。激发后每天监测动物的成活率。
在第二次实验中以10只为一组的BALB/c小鼠用单独MVA.NP静脉内免疫，用基因枪3次免疫，2次用基因枪接着一次MVA.NP静脉内促进和2次肌肉内注射V1J-NP接着一次MVA.NP促进免疫。最后一次免疫后2周，小鼠用100HA单位的流感A/PR/8/34病毒激发。
在下列动物组中观察到完全和统计学显著的保护作用：
●2次基因枪免疫接着一次MVA.NP促进。
●2次肌肉内注射MVA.NP，接着一次MVA.NP促进。
在接受一次MVA.NP静脉内注射的组中，30％的动物(10只中有3只)存活。通过基因枪用DNA疫苗免疫3次的组中，70％的动物受到保护，但该保护作用与首发组对照比较没有明显的差异。在本次激发实验中，40％(10只中有4只)的首发组动物在激发后存活。
实施例5
在非人灵长类中的免疫原性研究
在非人灵长类中引发促进方案的免疫原性和保护效能
为了显示在小鼠中观察到的DNA引发/MVA促进方案的强免疫原性转变成在灵长类中的强免疫原性，在猕猴中检测了该方案。在质粒DNA或MVA中的由来自HIV和SIV序列(图2)的CTL表位串组成的疫苗分别称为DNA.H和MVA.H。在多表位串中应用限定的CTL表位可允许在猕猴中检测对SIV特异的CTL。由于抗原肽的MHC I型的限制性，选择的猕猴为MHC I型单位型和Mamu-A＊01阳性的动物，用于所描述的实验。
用下列的免疫免疫3种动物(CYD、DI和DORIS)：
第0周    DNA(8μg，i.d.，基因枪)
第8周    DNA(8μg，i.d.，基因枪)
第17周   MVA(5×108pfu，i.d.)
第22周   MVA(5×108pfu，i.d.)
在实验的第0、2、5、8、10、11、17、18、19、21、22、23、24和25周抽取每只动物的血液。用2种不同的方法监测动物中诱导的CTL。分离自每只动物血液的PBMC在体外用编码表位串的肽重新刺激，然后用铬释放细胞毒性分析法检测其对自体负载肽的靶细胞的能力。另外，用四聚体法对新鲜分离的PBMC染色，以测定抗原特异的CD8+T细胞。
用四聚体染色法2次基因枪免疫后检测到非常低水平的CTL(图15)。第1次MVA促进后2周，通过四聚体染色法检测到所有3种动物出现肽特异的CTL(图15)。这可从体外重新刺激后检测到的中度CTL应答反映出来(图16，第19周)。用MVA.H第2次促进诱导非常高水平的特异抗原CD8+T细胞(图15)以及也诱导非常高水平的肽特异杀伤性T细胞(图16，第23周)。
图15显示用四聚体检测SIV特异的MHC I型限制性CD8+T细胞。3只Mamu-A＊A01阳性猕猴按所示的方法用质粒DNA(基因枪)接着用MVA促进免疫。经FACS分析后确定Mamu-A＊A01/CD8双阳性T细胞的百分率。每一条代表在所示的时间点对Mamu-A＊01/gag表位特异的CD8+T细胞的百分率。CD8 T细胞的百分之一相当于大约5000/106外周血淋巴细胞。因此在这些猕猴的外周血中表位特异CD8 T细胞的水平，至少与在疟疾研究中免疫并受到保护的小鼠脾中所观察中的水平一样高。
图16显示在猕猴中DNA/MVA免疫后CTL诱导。在第18、19和23周从3种不同的猕猴(CYD、DI和DORIS)分离PBMC，然后用肽CTPYDINQM[SEQ ID NO：54]体外重新刺激。用肽CTPYDINQM[SEQ ID NO：54]重新刺激2次后，检测培养物中对肽刺激自体靶细胞的裂解活性。观察到强CTL活性。
实施例6
在黑猩猩中的免疫原性和激发研究
为了表明用质粒DNA初次免疫接着用重组MVA免疫的相似方案能在较高等的灵长类中有效地抗恶性疟原虫，用2只黑猩猩进行免疫和激发研究。黑猩猩H1接受500μg质粒的初次免疫，该质粒表达从CMV启动子开始没有内含子A的恶性疟原虫TRAP、CMV-TRAP。黑猩猩H2接受相同剂量的CMV-LSA-1，CMV-LSA-1表达恶性疟原虫LSA-1基因的C-末端部分。在接下去的2个月2只黑猩猩接受多于3次的免疫，但每次免疫接种3种质粒。H1接受前面所述的CMV-TRAP，加上pTH-TRAP，pTH-TRAP用具有内含子A的CMV启动子表达TRAP，这样可表达更高的水平。H1也接受从RSV启动子开始表达LSA-1的C末端部分的RSV-LSA-1。在第2、3和4次免疫时，H2接受CMV-LSA-1、pTH-LSA-1t RSV-TRAP。所用的剂量始终是每种质粒500μg。
接着发现RSV质粒不表达在其中含有的抗原，因此H1仅用表达TRAP的质粒免疫，而H2用表达LSA-1的质粒免疫。
在这些DNA免疫的之间和之后，在几个时间点进行细胞免疫应答的测定，在第4次DNA免疫后的3个月进行最后一次测定，但用ELISPOT分析法或用于CD8+T细胞的CTL分析法未检测到对疟疾特异的T细胞。
接着在6周时间内2只动物用3次剂量的108ffu编码恶性疟原虫TRAP抗原的重组MVA病毒免疫。在第3次MVA免疫刚开始前和之后，用整个TRAP蛋白结合到乳胶珠上的ELISPOT分析法，在2只黑猩猩中能检测到对TRAP抗原的T细胞应答。该分析法检测CD4+和CD8+T细胞应答。在2只免疫过的黑猩猩中用系列的8-11个氨基酸的短肽寻找特异的CD8+T应答。对CD8+T细胞应答的上述分析显示仅在黑猩猩H1中能检测到CD8+T细胞。这些CD8+T淋巴细胞的靶表位是来自TRAP，tr57序列KTASCGVWDEW[SEQ ID NO：78]的11个氨基酸肽。这些来自H1的CD8+T细胞具有抗用tr57肽激发的自体靶细胞和抗受重组PfTRAP-MVA病毒感染的自体靶细胞的裂解活性。最后一次MVA免疫后2个月用ELISPOT分析法，在该黑猩猩H1外周血中检测到高频率的这些特异CD8+T细胞的前体细胞，大约为500个淋巴细胞1个。很显然未用表达TRAP的质粒DNA激发过的黑猩猩H2中，没有检测到特异的CD8+T细胞应答。
第3次PfTRAP-MVA免疫后2个月，用20,000个子孢子对H1和H2进行激发，以前已经发现所用的子孢子数激发7天，在黑猩猩中产生可靠的能检测的血液阶段感染(Thomas等，1994和未发表的资料)。该激发用疟原虫NF54株进行。这一点是非常重要的，因为在质粒DNA和重组MVA中的TRAP序列来源于疟原虫T9/96株，与NF54TRAP等位基因有大量的氨基酸差异(Robson等，1990)。所以，该子孢子激发实验用异源而不是同源的寄生虫株进行。在黑猩猩H2中，用体外寄生虫培养检测法，如预期的那样子孢子激发后7天在外周血中能检测到寄生虫。然而，在H1中，来自第7天血液样品的培养物中血液阶段寄生虫的出现延迟了3天，这和抗肝阶段感染的某种免疫保护效应相一致。在过去人类中候选疟疾疫苗的研究中，已经估计到在外周血中延迟出现寄生虫与在肝中寄生虫密度的基本降低相一致(Davis等，1989)。因此首先用恶性疟原虫TRAP质粒DNA接着用通过MVA病毒表达的相同抗原免疫的黑猩猩H1显示强CD8+T淋巴细胞应答，为对异源子孢子激发某种保护作用的证据。
讨论
这些实施例说明一种新型的抗疟疾免疫方案，该方案在人疟疾感染的啮齿类模型中诱导高水平的保护性CD8+T细胞。还说明的是用亚单位疫苗抗子孢子激发的史无前例的完全保护作用(在表6中用DNA引发及含有疫苗的CS表位的MVA促进保护36只小鼠中的36只)。用DNA引发/MVA促进方案诱导的保护性免疫应答在2种另外的病毒性感染流感病毒A模型和癌症(P815肿瘤模型)的小鼠模型中阐明。对用于人类的疫苗更为重要的是，该免疫方案在灵长类中对CD8+T细胞也具有高度免疫原性。用质粒DNA和表达表位串的MVA在3只猕猴中3只诱导强SIV-gag特异CTL。所诱导的水平与SIV感染的动物中发现的水平相比拟。来自黑猩猩的研究资料显示，相同的免疫方案能在较高等的灵长类中诱导抗恶性疟原虫的CD8+T淋巴细胞应答，提供了抗恶性疟原虫子孢子激发保护作用的一些证据。
过去报道Ty-VLPs诱导良好水平的抗伯氏疟原虫啮齿类疟原虫的CD8+T细胞应答(Allsopp等，1995)，但单独该构建体没有保护作用。现在发现用重组MVA继续免疫非常明显地促进CD8+T细胞应答并且产生高水平保护作用(表7)。
过去没有估测重组MVA病毒作为疟疾疫苗的效能。单独的重组MVA没有明显的保护作用，用重组MVA引发接着用重组质粒DNA第2次免疫也没有保护作用。然而，用Ty-VLPs或质粒DNA初次免疫后用重组MVA第2次免疫产生令人印象深刻水平的保护作用。非重组MVA病毒已安全地用于数千人抗天花的痘苗接种并显现优异的安全性特征。增加该痘苗病毒株的安全性和免疫原性的分子基础已经详细的分子研究阐明(Meyer等，1991；Sutter等，1994)。
过去已试验质粒DNA用作对伯氏疟原虫啮齿类疟疾的疟疾疫苗。在某些品系中看到高水平但不完全的保护作用，但在小鼠的其他品系中甚至多次免疫后观察到很小或没有保护作用(Doolan等，1996)。尽管建议把质粒DNA用作抗恶性疟原虫的免疫方法，过去一直没有获得成功。本发明提供的证据是第一次的证据，表明质粒DNA可用于免疫方案中以诱导抗人类疟疾恶性疟原虫寄生虫的保护性免疫。
可预计与本发明阐明的免疫方案相似的免疫方案能在人类中诱导抗恶性疟原虫的保护性免疫。应该注意的是用于这些研究以在啮齿类或黑猩猩中诱导保护性免疫的5个疫苗构建体含有恶性疟原虫序列，因而能用于抗恶性疟原虫的人类免疫中。这些构建体是：1.恶性疟原虫TRAP质粒DNA疫苗，2.恶性疟原虫TRAP重组MVA病毒，3.编码多个恶性疟原虫的表位串以及单个伯氏疟原虫CTL表位的Ty-VLP，4.编码与3相同的表位串的质粒DNA，5.编码在3和4中许多疟疾表位的较长HM表位串的重组MVA。相似地，编码针对人I型分子的HIV表位的质粒DNAs和MVA能用于抗HIV感染的预防性或治疗性免疫。
这些研究提供明确的证据，用非复制性或复制受损的痘病毒作促进的新型顺序免疫方案能诱导抗疟疾寄生虫的强保护性CD8+T细胞应答。实施例明确地说明与复制性痘病毒株相比较令人惊奇的并大量增强CD8+T细胞应答和保护作用。由于没有理由相信来自疟疾寄生虫CD8+T细胞表位的免疫原性与其他抗原中CD8+T细胞表位的免疫原性有基本的差异，可预期在此所述的免疫方案可证实产生抗其他疾病的CD8+T细胞应答的有效价值。本免疫方案的关键步骤是应用非复制或复制受损的重组痘病毒促进预先存在的CTL应答。我们显示CTL应答能用不同的抗原输送体系如真皮内和肌肉内输送DNA疫苗、重组的Ty-VLP，重组的腺病毒和照射过的子孢子。这由给出的资料支持，产生抗HIV、流感病毒和肿瘤的CD8+T细胞应答。抗CD8+T细胞应答起重要作用的疾病的几个熟悉实施例如下：由HIV病毒、单纯疱疹病毒、带状疱疹、丙型肝炎病毒、乙型肝炎病毒、流感病毒、EB病毒、麻疹病毒、登革病毒和HTLV-1；由细菌结核分支杆菌和李斯特菌类；由原生动物寄生虫弓形和锥形虫引起的感染和发病。诱导抗流感A病毒的保护性CTL应答在图14说明。此外，预计在此所描述的免疫方案在抗CD8+T细胞应答起保护性作用的癌症类型免疫中具有价值。用DNA引发MVA促进方案抗肿瘤诱导的保护性CTL应答在图13显示。在人类中具体的实施例包括黑色素瘤、乳腺癌和结肠癌。
参考文献
1.Nardin EH和Nussenzweig RS.对前红细胞疟疾阶段的T细胞应答：在抗前红细胞阶段保护作用和疫苗开发中的作用。免疫学年评(1993)11：687-727。
2.Hill AVS、Allsopp，CEM，Kwiatkowski D、Anstey NM、Twumasi P、Rowe PA、Bennett S、Brewster D、McMichael AJ、Greenwood BM(1991)普通西非HLA抗原与对重度疟疾保护作用的关系。自然352：595-600。
3.Aidoo M、Lalvani A、Allsopp CEM等，诱导杀伤性T淋巴细胞抗疟疾的疫苗的保守抗原组分的鉴别。柳叶刀(1995)345：1003-1007。
4.Wizel B、Houghten RA、Parker KC、Coligan JE、ChurchP、Gordon DM、Ballou WR、Hoffman SL.照射过的孢子疫苗诱导HLA-B8限制性抗2种恶性疟原虫孢子表面蛋白2的重叠表位的杀伤性T淋巴细胞应答。实验医学杂志(1995)182：1435-45。
5.Lalvani A、Aidoo M、Allsopp CE、Plebanski M、WhittleHC、Hill AV。基于HLA途径设计诱导CTL抗恶性疟原虫的疫苗。免疫学研究(1994)145：461-8。
6.Seguin MC、Klotz FW、Schneider I、Weir JP、GoodbaryM、Slayter M、Raney JJ、Aniagolu JU、Green SJ。诱导一氧化氮合酶保护抗照射过伯氏疟原虫感染性按蚊接触的小鼠疟疾：涉及干扰素γ和CD8+T细胞。实验医学杂志(1994)180：353-8。
7.Thomas AW、Slierendregt B、Mons B、Druilhe P。在疟疾前红细胞阶段研究中的黑猩猩和支持模型。Mem.Inst.Oswaldo Cruz(1994)89增刊2：111-4。
8.Sedegah M、Hedstrom R、Hobart P、Hoffman SL。通过用编码环孢子蛋白的质粒DNA免疫抗疟疾的保护作用。美国国家科学院院报(1994)91：9866-70。
9.LiS、Rodrigues M、Rodriguez D、Rodriguez JR、EstebanM、Palese P、Nussenzweig RS、Zavala F。用重组流感病毒引发然后施用重组痘苗病毒诱导抗疟疾的CD8+T细胞介导的保护性免疫。美国国家科学院院报(1993)90：5214-8。
10.Lanar DE、Tine JA、de-Taisne C、Seguin MC、CoxWI、Winslow JP、Ware LA、Kauffman EB、Gordon D、BallouWR、Paoletti E、Sadoff JC。减毒的痘苗病毒-环孢子蛋白重组体赋予抗啮齿类疟疾的保护作用。感染和免疫(1996)64：1666-71。
11.Ogg GS、Jin X、Bonhoeffer S、Dunbar PR、NowakMA、Monard S、Segal JP、Cao Y、Rowland-Jones SL、Cerundolo等，HIV-1特异的杀伤性T淋巴细胞和质膜负载的病毒RNA的定量。科学(1998)279：2103-6。
12.Ada G.杀伤性T淋巴细胞能清除某些HIV/SIV感染吗？医用灵长类学杂志(1996)25：158-62。
13.Gallimore A、Cranage M、Cook N、Almond N、BootmanJ、Rud E、Silvera P、Dennis M、Corcoran T、Stott J等，在免疫接种过的猕猴中通过CD8+nef特异的杀伤性T细胞早期抑制SIV的复制。自然医学(1995)1：1167-73。
14.Mayr A、Hochstein-Mintzel V、Stickl H.感染(1975)33：6-14。
15.Mayr A，Zentralbl Veterinarmed B(1976)23：417-30。
16.Mayr A、Stichl H.、Muller HK、Danner K、Singer H、Zentralbl Bakteriol B(1978)167：375-90。
17.Stickl H、Hochstein-Mintzel V、Mayr A、Huber HC、Schafer H、Holzner A、Dtsch Med Wochenschr.(1974)99：23866-922。
18.Mahnel H、Mayr A、Berl Munch Tieralztl Wochenschr(1994)107：253-6。
19.Meyer H、Sutter G、Mayr A.普通病毒学杂志(1991)72：1031-8。
20.Altenburger W、Suter CP、Altenburger，J.Arch Virol.(1989)105：15-27。
21.Sutter G、Ramsey-Ewing A、Rosales R、Moss B.病毒学杂志(1994)68：4109-16。
22.Sutter G、Moss B，美国国家科学院院报(1992)89：10847-51。
23.Sutter GW、Wyatt LS、Foley PL、Bennink JR、Moss B，疫苗(1994)12：1032-40。
24.Hirsch VM、Goldstein S、Channock R，等，Channock R编著疫苗95。冷泉港实验室出版社(1995)195-200。
25.Hirsch VM、Fuerst TR、Sutter G等，病毒学杂志(1996)70：3741-52。
26.Moss B、Carroll MW、Wyatt L，等，匿名编著。疫苗：设计和生产的新型策略。Plenum出版社(1995)。
27.Symons JA、Alcami A、Smith GL，细胞(1995)81：551-60。
28.Alcami A、Smith GL，病毒学杂志(1995)69：4633-9。
29.Alcami A、Smith GL，细胞(1992)71：153-67。
30.Graham KA等，病毒学(1997)229：12-24。
31.Alcami A、Smith GL，美国国家科学院院报(1996)93：11029-34。
32.Blanchard TJ、Rowland-Jones S、Gotch F、McMichaelAJ、Smith GL，柳叶刀(1997)348：1741。
33.McLean CS、Erturk M、Jennings R、Challanain DN、Minson AC、Duncan I、Boursnell ME、Inglis SC.感染疾病杂志(1994)170(5)：1100-9。
34.Davis NL、Brown KW、Johnston RE，病毒学杂志(1996)70(6)：3781-7。
35.Layton GT、Harris SJ、Myhan J、West D、Gotch F、Hill-Perkins M、Cole JS、Meyers N、Woodrow S、French TJ、Adams SE、Kingsman AJ，用重组杂交Ty-病毒样颗粒诱导对病毒蛋白的单独和双重杀伤性T-淋巴细胞应答。免疫学(1996)87：171-8。
36.McGrory-WJ、Bautisla-DS、Graham-FL。获救早期区I突变进入感染性人类腺病毒5型的简单技术。病毒学(1988)163：614-7。
37.Rodrigues EG、Zavala F、Eichinger D、Wilson JM、TsujiM，单一免疫剂量的重组腺病毒有效地诱导CD8+T细胞介导的抗疟疾保护性免疫。免疫学杂志(1997)158：1268-74。
38.Davis HL、Michel ML、Whalen RG，基于DNA的免疫方法诱导乙型肝炎表面抗原的持续性分泌和高水平的循环抗体。人类分子遗传学(1993)2：1847-51。
39.Miyahira Y、Murata K、Rodriguez D等，用ELISPOT分析法定量抗原特异的CD8+T细胞。免疫学方法杂志(1995)18：45-54。
40.Allsopp CEM、PlebanskiM、Gilbert S等，(1996)诱导杀伤性T淋巴细胞的多种输送系统的比较。欧洲免疫学杂志(1996)26：951-1959。
41.Rodrigues EG、Zavala F、Eichinger D、Wilson JM、TsujiM，单一免疫剂量的重组腺病毒有效地诱导CD8+T细胞介导的抗疟疾保护性免疫。免疫学杂志(1997)158：1268-74。
42.Schodel F、Wirtz R、Peterson D、Hughes J、Warren R、Sadoff J、Milich D，由携带环孢子蛋白表位的杂交乙型肝炎病毒核心颗粒激发的对疟疾的免疫。实验医学杂志(1994)180：1037-46。
43.Satchidanandam V、Zavala F、Moss B，用重组痘苗病毒表达伯氏疟原虫的环孢子蛋白的研究。分子生物化学寄生虫学(1991)48：89-99。
44.Davis JR、Murphy JR、Baqar S、Clyde DF、HerringtonDA、Levine MM，在用合成的环孢子蛋白(NANP)3免疫接种的人群中抗恶性疟原虫孢子活性的估测。热带医学和卫生皇家学会会报(1989)83：748-50。
45.Meyer，H、Sutter，G和Mayr，A(1991)在高度减毒的痘苗病毒MVA基因组中缺失作图以及缺失对毒力的影响。普通病毒学杂志72：1031-38。
46.Sutter G、Wyatt LS、Foley PL、Bennink JR、Moss B，来源于宿主范围限制和高度减毒的MVA痘苗病毒株的重组载体在小鼠中刺激对流感病毒的保护性免疫。疫苗(1994)12：1032-40。
47.Doolan DL、Sedegah M、Hedstrom RC、Hobart P、Charoenvit Y、Hoffman，SL.用多基因DNA免疫法克服抗疟疾保护作用的遗传限制：依赖于CD8+细胞、干扰素γ和一氧化氮的免疫性。实验医学杂志(1996)183：1739-46。
48.Muller HM、Reckmann I、Hollingdale MR、Bujard H、Robson KJ、Crisanti A.血小板反应蛋白相关的恶性疟原虫无名蛋白(TRAP)特异地结合到硫酸化的糖缀合物及Hep G2肝癌细胞上，表明该分子在子孢子侵入肝细胞中的作用。EMBO-J(1993)12：2881-9。
49.Chakrabarti S等，分子细胞生物学(1995)5：3403-9。
50.Morrison HG、Bauer SP、Lange JV、Esposito JJ、McCormick JB、Auperin DD.通过表达拉沙病毒的核蛋白或被膜糖蛋白的痘苗病毒重组体保护豚鼠免受拉沙热。病毒学(1989)171：179-88。
51.Mackett M等，病毒学杂志(1984)49：857-864。
52.Carroll MW和Moss BE，生物技术(1995)19：352-4。

Claims (35)

1.一种用于产生抗至少1种靶抗原的保护性CD8+T细胞免疫应答的试剂盒，该试剂盒包括：
(i)一种引发组合物，该组合物包括1种或多种靶抗原的CD8+T细胞表位的来源，和药用可接受的载体；以及
(ii)一种促进组合物，该组合物包括1种或多种靶抗原的CD8+T细胞表位的来源，包括至少1种与引发组合物的CD8+T细胞表位相同的CD8+T细胞表位，其中CD8+T细胞表位的来源是非复制或复制受损的重组痘病毒载体，与药用可接受的载体一起使用；
条件是如果(i)中表位的来源是一种病毒载体，在(ii)中的病毒载体则来源于不同的病毒。
2.根据权利要求1的试剂盒，其中在(i)中CD8+T细胞表位的来源是非病毒载体或非复制或复制受损的病毒载体。
3.根据权利要求2的试剂盒，其中(i)中CD8+T细胞表位的来源不是痘病毒载体。
4.根据权利要求3的试剂盒，其中在(i)中CD8+T细胞表位的来源是DNA或RNA。
5.根据权利要求4的试剂盒，其中在(i)中表位的来源是重组DNA质粒。
6.根据权利要求5的试剂盒，进一步包括作为(i)中佐剂的GM-CSF。
7.根据权利要求1～6中任一项的试剂盒，其中在(i)中的CD8+T细胞表位的来源编码或包括靶抗原。
8.根据权利要求4～6中任一项的试剂盒，其中在(i)中表位的来源编码单个CD8+T细胞表位或2个或多个CD8+T细胞表位的重组表位串。
9.根据权利要求1～3中任一项的试剂盒，其中在(i)中表位的来源是包含2个或多个存在于重组的CD8+T细胞表位串或靶抗原中的CD8+T细胞表位的蛋白。
10.根据权利要求9的试剂盒，其中在(i)中CD8+T细胞表位的来源是Ty病毒样颗粒。
11.根据权利要求1～3中任一项的试剂盒，其中(i)中的表位来源是重组腺病毒载体。
12.根据权利要求1～6中任一项的试剂盒，其中在(ii)中CD8+T细胞表位的来源是重组痘苗病毒载体。
13.根据权利要求12的试剂盒，其中重组痘苗病毒载体是修饰过的Ankara病毒痘苗病毒株。
14.根据权利要求12的试剂盒，其中重组痘苗病毒载体是NYVAC株。
15.根据权利要求1～6中任一项的试剂盒，其中在(ii)中CD8+T细胞表位的来源是选自金丝雀痘病毒或禽痘病毒和ALVAC的重组禽痘病毒载体。
16.根据权利要求1～6中任一项的试剂盒，其中靶抗原是病原体或肿瘤抗原。
17.根据权利要求16的试剂盒，其中靶抗原是恶性疟原虫抗原。
18.根据权利要求17的试剂盒，其中在(i)中或由(i)编码的CD8+T细胞表位包括1种或多种疟疾表位，所述表位选自表位Ls8，Cp26，Ls6，Tr42/43，Tr39，Cp6，St8，Ls50，Pb9，Tr26，Ls53，Tr29，NANP，TRAP AM，Cp39，La72，ex23，CSP，BCG，和TT。
19.根据权利要求18的试剂盒，其中在(i)中的CD8+T细胞表位包括表位Ls8，Cp26，Ls6，Tr42/43，Tr39，Cp6，St8，Ls50，Pb9，Tr26，Ls53，Tr29，NANP，TRAP AM，Cp39，La72，ex23，CSP，BCG，和TT。
20.根据权利要求16的试剂盒，其中靶抗原是HIV抗原。
21.根据权利要求20的试剂盒，其中在(i)中或由(i)编码的CD8+T细胞表位1种或多种HIV表位，所述表位选自YLKDQQLL，ERYLKDQQL，EITPIGLAP，PPIPVGEIY，GEIYKRWII，KRWIILGLNK，IILGLNKIVR，LGLNKIVRMY，YNLTMKCR，RGPGRAFVTI，GRAFVTIGK，TPYDINQML，CTPYDINQM，RPQVPLRPMTY，QVPLRPMTYK，VPLRPMTY，AVDLSHFLK，DLSHFLKEK，FLKEKGGL，ILKEPVHGV，ILKEPVHGVY，HPDMYQY，和VIYQYMDDL。
22.根据权利要求20的试剂盒，其中在(i)中或由(i)编码的CD8+T细胞表位包括表位YLKDQQLL，ERYLKDQQL，EITPIGLAP，PPIPVGEIY，GEIYKRWH，KRWHLGLNK，IILGLNKIVR，LGLNKIVRMY，YNLTMKCR，RGPGRAFVTI，GRAFVTIGK，TPYDINQML，CTPYDINQM，RPQVPLRPMTY，QVPLRPMTYK，VPLRPMTY，AVDLSHFLK，DLSHFLKEK，FLKEKGGL，ILKEPVHGV，ILKEPVHGVY，HPDIVIYQY，和VIYQYMDDL。
23.根据权利要求1～6中任一项的试剂盒，其中引发和促进组合物是相同的，都含有(i)的表位来源和(ii)的表位来源。
24.根据权利要求1～6中任一项的试剂盒，其中引发组合物和/或促进组合物被包被到金颗粒以便可用于基因枪。
25.根据权利要求1的试剂盒，其中所述引发组合物包括含有至少1种病原体或癌症的表位或抗原的重组蛋白，所述促进组合物包括编码相同表位或抗原的重组MVA载体。
26.根据权利要求25的试剂盒，其用于产生抗疟疾的保护性CD8+T细胞免疫应答。
27.根据权利要求25的试剂盒，其用于产生抗HIV的保护性CD8+T细胞免疫应答。
28.根据权利要求1-6或25-27中任一项的试剂盒，其中(ii)通过静脉内、表皮内或真皮内输送。
29.一种促进抗至少1种靶抗原的引发过的CD8+T细胞应答的药物，包括1种或多种靶抗原的CD8+T细胞表位的来源和药用可接受的载体，其中CD8+T细胞表位的来源是非复制或复制受损的重组痘病毒载体。
30.根据权利要求29的药物，其中所述的载体是MVA。
31.根据权利要求29或30的药物，其中靶抗原是疟疾抗原。
32.重组非复制或复制受损的痘病毒载体在制备促进CD8+T细胞免疫应答的药物中的用途。
33.权利要求32的用途，其中重组非复制或复制损害的痘病毒载体是MVA载体。
34.重组Ty病毒样颗粒，其包括表位串Ls8，Cp26，Ls6，Tr42/43，Tr39，Cp6，St8，Ls50，Pb9，Tr26，Ls53，Tr29，NANP，TRAP AM，Cp39，La72，ex23，CSP，BCG，和TT，其用于抗疟疾的免疫。35.编码表位串Ls8，Cp26，Ls6，Tr42/43，Tr39，Cp6，St8，Ls50，Pb9，Tr26，Ls53，Tr29，NANP，TRAP AM，Cp39，La72，ex23，CSP，BCG，和TT的重组DNA质粒或重组非复制或复制受损的痘病毒，其用于抗疟疾的免疫。
35.一种根据权利要求35的病毒，其为MVA株。
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Families Citing this family (62)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
GB0023203D0 (en) * 2000-09-21 2000-11-01 Isis Innovation Vaccination method
US20030138454A1 (en) * 1997-06-09 2003-07-24 Oxxon Pharmaccines, Ltd. Vaccination method
GB9711957D0 (en) * 1997-06-09 1997-08-06 Isis Innovation Methods and reagents for vaccination
US6534482B1 (en) * 1998-05-13 2003-03-18 Epimmune, Inc. Expression vectors for stimulating an immune response and methods of using the same
KR100731820B1 (ko) 1998-10-05 2007-06-25 파멕사 에이/에스 치료적 백신화를 위한 새로운 방법
SI1117421T1 (en) * 1998-10-05 2004-12-31 Pharamexa A/S Methods for therapeutic vaccination
US7148035B1 (en) 1998-11-18 2006-12-12 Oxford Biomedica (Uk) Limited Polypeptide
ES2246826T3 (es) * 1999-01-28 2006-03-01 Stichting Biomedical Primate Research Center Composicion y procedimiento para obtener inmunizacion especifica contra uno o mas antigenos usando diferentes vectores recombinantes.
US6682742B1 (en) 1999-05-28 2004-01-27 Gsf Forschungszentrum Fur Unwelt Und Gesundheit Gmbh Vector for integration of heterologous sequences into poxviral genomes
JP2003530307A (ja) 1999-07-06 2003-10-14 メルク・アンド・カンパニー・インコーポレーテッド ｇａｇ遺伝子保有アデノウイルスＨＩＶワクチン
DE60038971D1 (de) 1999-10-22 2008-07-03 Aventis Pasteur Verfahren zur erregung und/oder verstärkung der immunantwort gegen tumorantigene
US7993651B2 (en) 1999-12-23 2011-08-09 Medical Research Council Chimeric human immunodeficiency virus (HIV) immunogens comprising GAG P24-P17 fused to multiple cytotoxic T lymphocyte (CTL) epitopes
CN1437476A (zh) * 1999-12-28 2003-08-20 埃皮缪纳股份有限公司 优化的小基因及其编码的肽
US8623379B2 (en) 2000-03-02 2014-01-07 Emory University Compositions and methods for generating an immune response
AU1194802A (en) 2000-03-02 2001-12-11 Univ Emory DNA expression vectors and methods of use
CA2407303A1 (en) * 2000-04-28 2001-11-08 Genoveffa Franchini Improved immunogenicity using a combination of dna and vaccinia virus vector vaccines
US6733993B2 (en) 2000-09-15 2004-05-11 Merck & Co., Inc. Enhanced first generation adenovirus vaccines expressing codon optimized HIV1-gag, pol, nef and modifications
US7241742B2 (en) 2000-10-31 2007-07-10 Mgi Pharma Biologics, Inc. CYP1B1 nucleic acids and methods of use
US7445924B2 (en) 2000-11-23 2008-11-04 Bavarian Nordic A/S Modified Vaccinia Ankara virus variant and cultivation method
US7628980B2 (en) 2000-11-23 2009-12-08 Bavarian Nordic A/S Modified vaccinia virus ankara for the vaccination of neonates
CA2421151C (en) 2000-11-23 2013-07-02 Bavarian Nordic A/S Modified vaccinia ankara virus variant
PT1372710E (pt) 2001-03-08 2009-12-21 Us Gov Health & Human Serv Vam modificado que expressa os genes gag e pol do envelope de vih
GB0118532D0 (en) * 2001-07-30 2001-09-19 Isis Innovation Materials and methods relating to improved vaccination strategies
CA2467486A1 (en) 2001-11-30 2003-06-12 Isis Innovation Limited Vaccine
AU2003212985A1 (en) * 2002-02-08 2003-09-02 New York University Use of recombinant hepatitis b core particles to develop vaccines against infectious pathogens and malignancies
WO2003076598A2 (en) * 2002-03-13 2003-09-18 Merck & Co., Inc. Method of inducing an enhanced immune response against hiv
BR0309339A (pt) * 2002-04-19 2005-03-08 Bavarian Nordic As Vìrus vaccinia modificado ankara para a vacinação de neonatos
JP4654026B2 (ja) * 2002-05-20 2011-03-16 独立行政法人科学技術振興機構 Ｂｃｇワクチンとその利用
MXPA04012966A (es) 2002-09-05 2005-05-16 Bavarian Nordic As Metodo para el cultivo de celulas primarias y para la amplificacion de virus bajo condiciones libres de suero.
EP1583500A4 (en) * 2002-11-13 2008-02-13 Us Navy METHODS AND COMPOSITIONS FOR INDUCING IMMUNE RESPONSES AND PROTEIN IMMUNITY BY PRIMARY IMMUNIZATION WITH ALPHAVIRUS REPLICON VACCINES
WO2004056391A1 (en) * 2002-12-20 2004-07-08 The University Of New South Wales A method of immunisation and agents useful for same
US20050175627A1 (en) * 2003-09-24 2005-08-11 Oxxon Therapeutics Ltd. HIV pharmaccines
MXPA06014769A (es) * 2004-06-17 2007-03-26 Mannkind Corp Eficiencia mejorada de la inmunoterapia al integrar metodos de diagnostico con terapeuticos.
GB2421025A (en) * 2004-12-09 2006-06-14 Oxxon Therapeutics Ltd HSV vaccination vectors
EP1890724A2 (en) * 2005-05-13 2008-02-27 Oxxon Therapeutics Limited Compositions for inducing an immune response
WO2007004231A1 (en) * 2005-07-04 2007-01-11 Pradeep Seth Hiv-1 vaccinogens with immunomodulators
FR2893254B1 (fr) 2005-11-14 2007-12-21 Biomerieux Sa Composition comprenant un vecteur synthetique colloidal bioresorbable et un vecteur viral et son utilisation prophylactique, therapeutique et diagnostique.
US9333249B2 (en) 2006-02-09 2016-05-10 Educational Foundation Jichi Medical University Recombinant baculovirus vaccine
TWI477602B (zh) 2006-02-09 2015-03-21 Educational Foundation Jichi Medical Univ Novel viral vector
JPWO2007102326A1 (ja) * 2006-03-07 2009-07-23 公立大学法人横浜市立大学 アデノウイルス５型／３５型ベクターとワクシニアウイルスｍｖａベクターとの併用による強力な免疫誘導
US8440202B2 (en) * 2006-11-09 2013-05-14 The United States Of America As Represented By The Secretary Of The Navy Induction of an immune response against dengue virus using the prime-boost approach
WO2008127307A2 (en) * 2006-11-09 2008-10-23 The United States Of America As Represented By The Secretary Of The Navy Induction of an immune response against dengue virus using prime-boost approach
GB0706914D0 (en) 2007-04-10 2007-05-16 Isis Innovation Novel adenovirus vectors
GB0706912D0 (en) * 2007-04-10 2007-05-16 Isis Innovation Novel viral vaccines
WO2009127666A2 (en) * 2008-04-15 2009-10-22 Glaxosmithkline Biologicals S.A. Method and compositions
US8691502B2 (en) 2008-10-31 2014-04-08 Tremrx, Inc. T-cell vaccination with viral vectors via mechanical epidermal disruption
US20110274723A1 (en) 2009-10-23 2011-11-10 Mannkind Corporation Cancer immunotherapy and method of treatment
CA2793772A1 (en) * 2010-03-26 2011-09-29 Emergent Product Development Gaithersburg Inc. Ectodomains of influenza matrix 2 protein, expression system, and uses thereof
GB201007207D0 (en) 2010-04-29 2010-06-16 Univ Cork Method
WO2012023033A2 (en) 2010-08-18 2012-02-23 Purdue Pharma L.P. Improved peptide immunogens
GB201018480D0 (en) 2010-11-02 2010-12-15 Oxford Biomedica Ltd Factors
US9044420B2 (en) * 2011-04-08 2015-06-02 Immune Design Corp. Immunogenic compositions and methods of using the compositions for inducing humoral and cellular immune responses
WO2014005643A1 (en) * 2012-07-05 2014-01-09 Okairos Ag Novel prime-boosting regimens involving immunogenic polypeptides encoded by polynucleotides
WO2014064534A2 (en) 2012-10-05 2014-05-01 Chrontech Pharma Ab Injection needle, device, immunogenic compositions and method of use
KR102135818B1 (ko) * 2012-10-28 2020-07-22 버베리안 노딕 에이/에스 강력한 ｔ-세포 및 항체 반응을 위한 ｐｒ13.5 프로모터
GB201221133D0 (en) 2012-11-23 2013-01-09 Epiontis Gmbh Epigenetic method for the identification of subpopulations of CD8 and T lympocytes, in particular CD8 alpha and beta T lymphocytes
US10576143B2 (en) * 2013-03-15 2020-03-03 Glaxosmithkline Biologicals Sa Poxviral vaccines
WO2014139587A1 (en) * 2013-03-15 2014-09-18 Okairòs Ag Improved poxviral vaccines
CA2951430A1 (en) 2014-06-13 2015-12-17 Glaxosmithkline Biologicals Sa Immunogenic combinations
WO2017136633A1 (en) * 2016-02-04 2017-08-10 Duke University Cell-based vaccine compositions and methods of use
US11065320B2 (en) * 2016-04-12 2021-07-20 Oxford University Innovation Limited Prime target
KR20230166145A (ko) 2017-03-15 2023-12-06 옥스포드 바이오메디카(유케이) 리미티드 방법

Citations (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
WO1996026271A1 (en) * 1995-02-22 1996-08-29 Therion Biologics Corporation Generation of human cytotoxic t-cells specific for carcinoma self-associated antigens and uses thereof

Family Cites Families (51)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US138454A (en) * 1873-04-29 Improvement in card-racks
US175365A (en) * 1876-03-28 Improvement in sheet-metal-straightening machines
US131594A (en) * 1872-09-24 Improvement in pulley-blocks
US2003A (en) * 1841-03-12 Improvement in horizontal windivhlls
US171272A (en) * 1875-12-21 Improvement in school-desks
US197349A (en) * 1877-11-20 Improvement in ore-mills
ZA754725B (en) * 1974-08-01 1976-06-30 H Stickl Preparation for the treatment of infectious diseases, method for the manufacture thereof, and its use
US5110587A (en) 1981-12-24 1992-05-05 Health Research, Incorporated Immunogenic composition comprising synthetically modified vaccinia virus
GB8405530D0 (en) * 1984-03-02 1984-04-04 Lysons R J Vaccine for swine dysentery
CA1341245C (en) 1988-01-12 2001-06-05 F. Hoffmann-La Roche Ag Recombinant vaccinia virus mva
US5225336A (en) 1989-03-08 1993-07-06 Health Research Incorporated Recombinant poxvirus host range selection system
CH682669A5 (fr) 1989-03-08 1993-10-29 Health Research Inc Virus recombinant modifié pour exprimer un produit de gènes chez un hôte, procédés et vaccin correspondants.
US5462734A (en) * 1990-11-02 1995-10-31 Wisconsin Alumni Research Foundation Bovine herpesvirus vaccine and method of using same
US5766597A (en) * 1991-03-07 1998-06-16 Virogenetics Corporation Malaria recombinant poxviruses
WO1992022641A1 (en) 1991-06-14 1992-12-23 Virogenetics Corporation Immunodeficiency virus recombinant poxvirus vaccine
BE1004877A3 (fr) 1991-05-27 1993-02-16 Solvay Virus de l'avipox recombinant, culture de cellules infectees par ce virus et vaccins pour la volaille derives de ce virus.
AU670538B2 (en) 1991-07-26 1996-07-25 Virogenetics Corporation Infectious bursal disease virus recombinant poxvirus vaccine
EP0561034B1 (en) * 1991-08-26 1999-06-09 IMMUNO Aktiengesellschaft Direct molecular cloning of a modified chordopox virus genome
US5972351A (en) * 1992-04-03 1999-10-26 Isis Innovation Limited Plasmodium falciparum MHC class I-restricted CTL epitopes derived from pre-erythrocytic stage antigens
ES2196018T3 (es) 1993-08-11 2003-12-16 Wyeth Corp Vacunas de adenovirus recombinantes.
DE4341770A1 (de) * 1993-12-08 1995-06-14 Basf Ag Verfahren zur Herstellung von Milchsäureestern
CN1180843C (zh) * 1994-07-27 2004-12-22 昆士兰医学研究所 多表位疫苗
FR2724945B1 (fr) * 1994-09-27 1996-12-27 Centre Nat Rech Scient Vecteurs viraux et utilisation en therapie genique
WO1996039178A1 (en) * 1995-06-05 1996-12-12 The Wistar Institute Of Anatomy And Biology A replication-defective adenovirus human type 5 recombinant as a vaccine carrier
EP0753581A1 (en) 1995-07-10 1997-01-15 Immuno Ag Improved recombinant eukaryotic cytoplasmic viruses, method for their production and their use as vaccines
US5741492A (en) * 1996-01-23 1998-04-21 St. Jude Children's Research Hospital Preparation and use of viral vectors for mixed envelope protein vaccines against human immunodeficiency viruses
US20010036928A1 (en) * 1996-04-22 2001-11-01 Chamberlain Ronald S. Heterologous boosting immunizations
CA2252406A1 (en) * 1996-04-22 1997-10-30 Nicholas P. Restifo Heterologous boosting immunizations
EP0951559A1 (en) * 1996-07-25 1999-10-27 Therion Biologics Corporation Recombinant pox virus for immunization against tumor-associated antigens
EP1405916A1 (en) * 1997-02-21 2004-04-07 Isis Innovation Limited Recombinant vaccinia virus incapable of expressing the A41L gene
GB0023203D0 (en) * 2000-09-21 2000-11-01 Isis Innovation Vaccination method
US20030138454A1 (en) * 1997-06-09 2003-07-24 Oxxon Pharmaccines, Ltd. Vaccination method
GB9711957D0 (en) 1997-06-09 1997-08-06 Isis Innovation Methods and reagents for vaccination
AU3289199A (en) 1998-02-11 1999-08-30 Maxygen, Inc. Antigen library immunization
US20010036929A1 (en) * 1998-09-25 2001-11-01 Arch Development Corporation. Xrcc3 is required for assembly of Rad51-complexes in vivo
JP2003530307A (ja) 1999-07-06 2003-10-14 メルク・アンド・カンパニー・インコーポレーテッド ｇａｇ遺伝子保有アデノウイルスＨＩＶワクチン
DE60016765T2 (de) 1999-08-25 2005-11-24 Merck & Co., Inc. Synthetische papillomavirus gene, welche für expression in menschlichen zellen optimiert sind
GB9922361D0 (en) 1999-09-21 1999-11-24 Isis Innovation Generating an immune response to an antigen
EP1282702B1 (en) 2000-05-10 2006-11-29 Sanofi Pasteur Limited Immunogenic polypeptides encoded by mage minigenes and uses thereof
CU23235A1 (es) 2001-02-28 2007-09-26 Ct Ingenieria Genetica Biotech POXVIRUS RECOMBINANTES PARA PROTEINAS QUIMéRICAS DEL VIRUS DE LA INMUNODEFICIENCIA HUMANA Y SU APLICACION EN LA TERAPéUTICA Y LA PREVENCION DEL SIDA
JP2002271316A (ja) * 2001-03-13 2002-09-20 Sanyo Electric Co Ltd 再生装置
CN1164331C (zh) 2001-05-23 2004-09-01 中国人民解放军第二军医大学 一种人乙型肝炎核酸疫苗
CA2467486A1 (en) * 2001-11-30 2003-06-12 Isis Innovation Limited Vaccine
US20040171272A1 (en) * 2003-02-28 2004-09-02 Applied Materials, Inc. Method of etching metallic materials to form a tapered profile
US6942373B2 (en) * 2003-03-14 2005-09-13 Fiberstars Incorporated Fiberoptic lighting system with shaped collector for efficiency
BRPI0413334A (pt) 2003-09-05 2006-10-10 Sanofi Pasteur Ltd vetores de multiantìgenos para melanoma
US20050175627A1 (en) * 2003-09-24 2005-08-11 Oxxon Therapeutics Ltd. HIV pharmaccines
JP2007534302A (ja) 2003-09-24 2007-11-29 オクソン セラピュティクス リミテッド Ｈｉｖ医薬
GB2421025A (en) 2004-12-09 2006-06-14 Oxxon Therapeutics Ltd HSV vaccination vectors
EP1890724A2 (en) 2005-05-13 2008-02-27 Oxxon Therapeutics Limited Compositions for inducing an immune response
EP1888622A1 (en) 2005-05-23 2008-02-20 Oxxon Therapeutics Ltd. Compositions for inducing an immune response against hepatitis b

Patent Citations (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
WO1996026271A1 (en) * 1995-02-22 1996-08-29 Therion Biologics Corporation Generation of human cytotoxic t-cells specific for carcinoma self-associated antigens and uses thereof

Also Published As

Publication number Publication date
EP1589108B1 (en) 2008-04-09
DE69839405D1 (de) 2008-06-05
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GB9711957D0 (en) 1997-08-06
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US20090191237A1 (en) 2009-07-30
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US7514087B2 (en) 2009-04-07
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DE69810459T3 (de) 2010-12-16
US20100119551A1 (en) 2010-05-13
US20040197349A1 (en) 2004-10-07
WO1998056919A2 (en) 1998-12-17
DE69839405T2 (de) 2009-08-20
DE69810459D1 (de) 2003-02-06
ES2189185T5 (es) 2010-09-22
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EP0979284B1 (en) 2003-01-02
US20040191272A1 (en) 2004-09-30
DE69839357D1 (de) 2008-05-21
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JP2007023044A (ja) 2007-02-01
EP1589108A2 (en) 2005-10-26
DE69839359D1 (de) 2008-05-21
US7407661B2 (en) 2008-08-05
ATE391784T1 (de) 2008-04-15
US20040213799A1 (en) 2004-10-28
EP1335023A2 (en) 2003-08-13
DE69810459T2 (de) 2003-10-23
AU8026698A (en) 1998-12-30
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ATE230437T1 (de) 2003-01-15
CA2293692C (en) 2010-04-27
US20040175365A1 (en) 2004-09-09
DK0979284T3 (da) 2003-04-22
WO1998056919A9 (en) 1999-04-08
CA2293692A1 (en) 1998-12-17
US20090324632A1 (en) 2009-12-31
AU737780B2 (en) 2001-08-30
CN1266459A (zh) 2000-09-13
EP1616954A9 (en) 2006-12-06
EP1616954B1 (en) 2008-04-09

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Gilbert et al. Ty virus-like particles, DNA vaccines and Modified Vaccinia Virus Ankara; comparisons and combinations
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