CA2445731A1 - Method and nucleic acids for the differentiation of prostate tumors - Google Patents

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Abstract

The present invention relates to chemically modified genomic sequences, to oligonucleotides and/or PNA-oligomers for detecting the cytosine methylation state of genomic DNA, as well as to a method for ascertaining genetic and/or epigenetic parameters of genes for use in characterisation, classification, differentiation, diagnosis and therapy of prostate lesions.

Description

DEMANDE OU BREVET VOLUMINEUX
LA PRESENTE PARTIE DE CETTE DEMANDE OU CE BREVET COMPREND
PLUS D'UN TOME.

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Method and nucleic acids for the differentiation of prostate tumors Field of the Invention The levels of observation that have been studied by the methodological developments of re-cent years in molecular biology, are the genes themselves, the translation of these genes into RNA, and the resulting proteins. The question of which gene is switched on at which point in the course of the development of an individual, and how the activation and inhibition of spe-cific genes in specific cells and tissues are controlled is correlatable to the degree and charac-ter of the methylation of the genes or of the genome. In this respect, pathogenic conditions may manifest themselves in a changed methylation pattern of individual genes or of the ge-nome.
The present invention relates to nucleic acids, oligonucleotides, PNA-oligomers, and to a method for characterisation, classification, differentiation, and/or diagnosis of prostate le-sions, or the predisposition to prostate cancer, by analysis of the genetic and/or epigenetic parameters of genomic DNA and, in particular, with the cytosine methylation status thereof.
Prior Art Prostate cancer is a significant health care problem in Western countries with an incidence of 180 per 100 000 in the U.S. in 1999 (Cancer J Clin 1999;49:8). Different screening strategies are employed to improve early detection, including determination of levels of prostate spe-cific antigen and digital rectal examination. If a prostate carcinoma is suspected in a patient, diagnosis of cancer is confirmed or excluded by the histological and cytological analysis of biopsy samples for features associated with malignant transformation.
Particularly early stages of prostate carcinoma axe often difficult to distinguish from benign hyperplasia of the prostate by routine histological examination even if an adequate biopsy is obtained (McNeal JE et al., Hum Pathol 2001, 32:441-6). Furthermore, small or otherwise insufficient biopsy samples sometimes impede routine analysis.
Molecular markers offer the advantage that even samples of very small sizes and samples whose tissue architecture has not been maintained can be analyzed quite samples whose tissue architecture has not been maintained can be analyzed quite efficiently. Within the last decade numerous genes have been shown to be differen-tially expressed between benign hyperplastic prostate tumors and different grades of prostate cancer. However, no single marker has been shown to be sufficient for the distinction between the two lesions so far. High-dimensional mRNA based ap-proaches have recently been shown to be able to provide a better means to distin-guish between different tumor types and benign and malignant lesions.
Application as a routine diagnostic tool in a clinical environment is however impeded by the ex-treme instability of mRNA, the rapidly occurring expression changes following certain triggers (e.g. sample collection), and, most importantly, the large amount of mRNA
needed for analysis (Lipshutz, R. J. et al., Nature Genetics 21:20-24, 1999;
Bowtell, D. D. L. Nature genetics suppl. 21:25-32, 1999), which often cannot be obtained from a routine biopsy.
Aberrant DNA methylation within CpG islands is common in human malignancies leading to abrogation or overexpression of a broad spectrum of genes (Jones, P.A.
Cancer Res 65:2463-2467, 1996). Abnormal methylation has also been shown to occur in CpG rich regulatory elements in intronic and coding parts of genes for cer-tain tumours (Chan, M.F., et al., Curr Top Microbiol Immunol 249:75-86,2000).
Highly characteristic DNA methylation patterns could also be shown for breast cancer cell lines (Huang, T. H.-M., et al., Hum Mol Genet 8:459-470, 1999).
5-methylcytosine is the most frequent covalent base modification in the DNA of eukaryotic cells. It plays a role, for example, in the regulation of the transcription, in genetic imprinting, and in tumorigenesis. Therefore, the identification of 5-methylcytosine as a component of genetic information is of considerable interest.
However, 5-methylcytosine positions cannot be identified by sequencing since 5-methylcytosine has the same base pairing behavior as cytosine. Moreover, the epi-genetic information carried by 5-methylcytosine is completely lost during PCR
ampli-fication.
A relatively new and currently the most frequently used method for analyzing DNA for 5-methylcytosine is based upon the specific reaction of bisulfate with cytosine which, upon sub-sequent alkaline hydrolysis, is converted to uracil which corresponds to thymidine in its base pairing behavior. However, S-methylcytosine remains unmodified under these conditions.
Consequently, the original DNA is converted in such a manner that methylcytosine, which originally could not be distinguished from cytosine by its hybridization behavior, can now be detected as the only remaining cytosine using "normal" molecular biological techniques, for example, by amplification and hybridization or sequencing. All of these techniques axe based on base pairing which can now be fully exploited. In terms of sensitivity, the prior art is de-fined by a method which encloses the DNA to be analyzed in an agarose matrix, thus pre-venting the diffusion and renaturation of the DNA (bisulfate only reacts with single-stranded DNA), and which replaces all precipitation and purification steps with fast dialysis (Olek A, Oswald J, Walter J. A modified and improved method for bisulphate based cytosine methyla-tion analysis. Nucleic Acids Res. 1996 Dec 15;24(24):5064-6). Using this method, it is possi-ble to analyze individual cells, which illustrates the potential of the method. However, cur-rently only individual regions of a length of up to approximately 3000 base pairs are analyzed, a global analysis of cells for thousands of possible methylation events is not possible. How-ever, this method cannot reliably analyze very small fragments from small saanple quantities either. These are lost through the matrix in spite of the diffusion protection.
An overview of the further known methods of detecting S-methylcytosine may be gathered from the following review article: Rein, T., DePamphilis, M. L., Zorbas, H., Nucleic Acids Res. 1998, 26, 22SS.
To date, barring few exceptions (e.g., Zeschnigk M, Lich C, Buiting K, Doerfler W, Horsthemke B. A single-tube PCR test for the diagnosis of Angelman and Prader-Willi syn-drome based on allelic methylation differences at the SNRPN locus. Eur J Hum Genet. 1997 Mar-Apr;S(2):94-8) the bisulfate technique is only used in research. Always, however, short, specific fragments of a known gene are amplified subsequent to a bisulfate treatment and ei-ther completely sequenced (Olek A, Walter J. The pre-implantation ontogeny of the H19 methylation imprint. Nat Genet. 1997 Nov;l7(3):275-6) or individual cytosine positions are detected by a primer extension reaction (Gonzalgo ML, Jones PA. Rapid quantitation of methylation differences at specific sites using methylation-sensitive single nucleotide primer extension (Ms-SNuPE). Nucleic Acids Res. 1997 Jun 1S;2S(12):2529-31, WO Patent 9500669) or by enzymatic digestion (Xiong Z, Laird PW. COBRA: a sensitive and quantita-tive DNA methylation assay. Nucleic Acids Res. 1997 Jun 1S;2S(12):2532-4). In addition, detection by hybridization has also been described (Olek et al., WO 99/28498).
Further publications dealing with the use of the bisulfate technique for methylation detection in individual genes are: Grigg G, Clark S. Sequencing 5-methylcytosine residues in genomic DNA. Bioessays. 1994 Jun;l6(6):431-6, 431; Zeschnigk M, Schmitz B, Dittrich B, Buiting K, Horsthemke B, Doerfler W. Imprinted segments in the human genome: different DNA meth-ylation patterns in the Prader-Willi/Angelman syndrome region as determined by the genomic sequencing method. Hum Mol Genet. 1997 Mar;6(3):387-95; Feil R, Charlton J, Bird AP, Walter J, Reik W. Methylation analysis on individual chromosomes: improved protocol for bisulphate genomac sequencing. Nucleic Acids Res. 1994 Feb 25;22(4):695-6;
Martin V, Ribieras S, Song-Wang X, Rio MC, Dame R. Genomic sequencing indicates a correlation between DNA hypomethylation in the 5' region of the pS2 gene and its expression in human breast cancer cell lines. Gene. 1995 May 19;157(1-2):261-4; WO 97/46705, WO

and WO 97/45560.
An overview of the Prior Art an oligomer array manufacturing can be gathered from a special edition of Nature Genetics (Nature Genetics Supplement, Volume 21, January 1999), pub-lashed in January 1999, and from the literature cited therein.
Fluorescently labeled probes are often used for the scanning of immobilized DNA arrays. The simple attachment of Cy3 and Cy5 dyes to the 5'-OH of the specific probe are particularly suitable for fluorescence labels. The detection of the fluorescence of the hybridized probes may be carried out, for example via a confocal microscope. Cy3 and Cy5 dyes, besides many others, are commercially available.
Matrix Assisted Laser Desorption Ionization Mass Spectrometry (MALDI-TOF) is a very efficient development for the analysis of biomolecules (Karas M, Hillenkamp F.
Laser de-sorption ionization of proteins with molecular masses exceeding 10,000 daltons. Anal Chem.
1988 Oct 15;60(20):2299-301). An analyte is embedded in a light-absorbing matrix. The ma-trix is evaporated by a short laser pulse thus transporting the analyte molecule into the vapor phase in an unfragmented manner. The analyte is ionized by collisions with matrix molecules.
An applied voltage accelerates the ions into a field-free flight tube. Due to their different masses, the ions are accelerated at different rates. Smaller ions reach the detector sooner than bigger ones.
MALDI-TOF spectrometry is excellently suited to the analysis of peptides and proteins. The analysis of nucleic acids is somewhat more difficult (Gut T G, Beck S. DNA and Matrix As-sisted Laser Desorption Ionization Mass Spectrometry. Current Innovations and Future Trends. 1995, 1; 147-57). The sensitivity to nucleic acids is approximately 100 times worse than to peptides and decreases disproportionally with increasing fragment size. For nucleic acids having a multiply negatively charged backbone, the ionization process via the matrix is considerably less efficient. In MALDI-TOF spectrometry, the selection of the matrix plays an eminently important role. For the desorption of peptides, several very efficient matrixes have been found which produce a very fme crystallization. There are now several responsive ma-trixes for DNA, however, the difference in sensitivity has not been reduced.
The difference in sensitivity can be reduced by chemically modifying the DNA in such a manner that it be-comes more similar to a peptide. Phosphorothioate nucleic acids in which the usual phos-phates of the backbone are substituted with thiophosphates can be converted into a charge-neutral DNA using simple alkylation chemistry (Gut IG, Beck S. A procedure for selective DNA alkylation and detection by mass spectrometry. Nucleic Acids Res. 1995 Apr 25;23(8):1367-73). The coupling of a charge tag to this modified DNA results in an increase in sensitivity to the same level as that found for peptides. A further advantage of charge tag-ging is the increased stability of the analysis against impurities which make the detection of unmodified substrates considerably more difficult.
Genomic DNA is obtained from DNA of cell, tissue or other test samples using standard methods. This standard methodology is found in references such as Fritsch and Maniatis eds., Molecular Cloning: A Laboratory Manual, 1989.
Description The disclosed invention provides a method and nucleic acids for the differentiation of prostate tumors. It discloses a means of distinguishing benign prostate hyperplasia from prostate car-cinoma. This provides a means for the early detection and treatment of prostate cancer. Fur-thermore, the disclosed invention presents improvements over the state of the art in that cur-rent methods of prostate lesion differential diagnosis require the provision of a sample of suf ficient size for histological and cytological examination. The method according to the present invention can be used for classification of minute samples.
The invention provides the chemically moduied genomic DNA, as well as oligonucleotides and/or PNA-oligomers for detecting cytosine methylations, as well as a method which is par-ticularly suitable for the classification, differentiation and/or diagnosis of prostate tumors, or the predisposition to prostate cancer. The present invention is based on the discovery that ge-netic and epigenetic parameters and, in particular, the cytosine methylation patterns of geno-mic DNA are particularly suitable for classification, differentiation and/or diagnosis of pros-tate tumors, in particular for use in differential diagnosis of prostate cancer.
This objective is achieved according to the present invention using a nucleic acid containing a sequence of at least 18 bases in length of the chemically pretreated genomic DNA according to one of Seq. ID No.l through Seq. ID No.112.
The chemically modified nucleic acid could heretofore not be connected with the ascertain-ment of disease relevant genetic and epigenetic parameters.
The object of the present invention is further achieved by an oligonucleotide or oligomer for detecting the cytosine methylation state in chemically pretreated DNA, containing at least one base sequence having a length of at least 13 nucleotides which hybridizes to a chemically pretreated genomic DNA according to Seq. ID No.l through Seq. ID No.112. The oligomer probes according to the present invention constitute important and effective tools which, for the first time, make it possible to ascertain specific genetic and epigenetic parameters of car-cinomas, in particular, for use in differential diagnosis of prostate tumors and for diagnosis of predisposition to prostate carcinomas, The base sequence of the oligomers preferably contains at least one CpG dinucleotide. The probes may also exist in the form of a PNA
(peptide nu-cleic acid) which has particularly preferred pairing properties. Particularly preferred are oli-gonucleotides according to the present invention in which the cytosine of the CpG dinucleo-tide is the 5~ - 9th nucleotide from the 5'-end of the 13-mer; in the case of PNA-oligomers, it is preferred for the cytosine of the CpG dinucleotide to be the 4th - 6~
nucleotide from the 5'-end of the 9-mer.
The oligomers according to the present invention are normally used in so called "sets" which contain at least one oligomer for each of the CpG dinucleotides of the sequences of Seq. ID
No.l through Seq. ID No.l 12 . Preferred is a set which contains at least one oligomer for each of the CpG dinucleotides from one of Seq. ID No.l through Seq. ID No.l 12.

_7_ Moreover, the present invention makes available a set of at least two oligonucleotides which can be used as so-called "primer oligonucleotides" for amplifying DNA
sequences of one of Seq. ID No.l through Seq. ID No.l 12 , or segments thereof.
In the case of the sets of oligonucleotides according to the present invention, it is preferred that at least one oligonucleotide is bound to a solid phase. It is further preferred that all the oligonucleotides of one set are bound to a solid phase.
The present invention moreover relates to a set of at least 10 n (oligonucleotides and/or PNA-oligomers) used for detecting the cytosine methylation state in chemically pretreated genomic DNA (Seq. ID No.l through Seq. ID No.112). These probes enable classification, differentia-tion and/or diagnosis of genetic and epigenetic parameters of tumors, which are particularly useful in differential diagnosis of prostate cancer. Furthermore, the probes enable the diagno-sis of predisposition to prostate cancer. The set of oligomers may also be used for detecting single nucleotide polymorphisms (SNPs) in chemically pretreated genomic DNA
according to one of Seq. ID No.l through Seq. ID No.112.
According to the present invention, it is preferred that an arrangement of different oligonu-cleotides and/or PNA-oligomers (a so-called "array") made available by the present invention is present in a manner that it is likewise bound to a solid phase. This array of difFerent oligo-nucleotide- and/or PNA-oligomer sequences can be characterized in that it is arranged on the solid phase in the form of a rectangular or hexagonal lattice. The solid phase surface is pref erably composed of silicon, glass, polystyrene, aluminum, steel, iron, copper, nickel, silver, or gold. However, nitrocellulose as well as plastics such as nylon which can exist in the form of pellets or also as resin matrices are possible as well.
Therefore, a further subject matter of the present invention is a method for manufacturing an array fixed to a carrier material for the classification, differentiation and/or diagnosis of pros-tate tumors, in particular, differential diagnosis of prostate cancer, in which method at least one oligomer according to the present invention is coupled to a solid phase.
Methods for manufacturing such arrays are known, for example, from LTS Patent 5,744,305 by means of solid-phase chemistry and photolabile protecting groups.

_$_ A further subject matter of the present invention relates to a DNA chip for the classification, differentiation and/or diagnosis of prostate tumors, in particular, differential diagnosis of prostate cancer. Furthermore the DNA chip enables the diagnosis of predisposition to prostate carcinomas. The DNA chip contains at least one nucleic acid according to the present inven-tion. DNA clops are known, for example, for US Patent 5,837,832.
Moreover, a subject matter of the present invention is a kit which may be composed, for ex-ample, of a bisulfate-containing reagent, a set of primer oligonucleotides containing at least two oligonucleotides whose sequences in each case correspond or are complementary to an 18 base long segment of the base sequences specified in the appendix (Seq. ID
No.l through Seq.
ID No.112), oligonucleotides and/or PNA-oligomers as well as instructions for carrying out and evaluating the described method. However, a kit along the lines of the present invention can also contain only part of the aforementioned components.
The present invention also makes available a method for ascertaining genetic and/or epige-netic parameters of genomic DNA. The method is for use in the classification, differentiation and/or diagnosis of prostate tumors, in particular for the differential diagnosis of prostate can-cer and diagnosis of predisposition to prostate cancer. The method enables the analysis of cytosine methylations and single nucleotide polymorphisms, including the following steps:
In the first step of the method the genomic DNA sample must be isolated from tissue or cel-lular sources. Such sources may include cell lines, histological slides, body fluids, for exam-ple blood, sputum, faeces, urine, cerebrospinal fluid, lymphatic fluid tissue embedded in par-affin; for example, prostate or lymphatic tissue. Extraction may be by means that are standard to one skilled in the art, these include the use of detergent lysates, sonification and vortexing with glass beads. Once the nucleic acids have been extracted the genomic double stranded DNA is used in the analysis.
In a preferred embodiment the DNA may be cleaved prior to the chemical treatment, this may be any means standard in the state of the art, in particular with restriction endonucleases.
In the second step of the method, the genomic DNA sample is chemically treated in such a manner that cytosine bases which are unmethylated at the 5'-position are converted to uracil, thymine, or another base which is dissimilar to cytosine in terms of hybridization behavior.
This will be understood as 'chemical pretreatment' hereinafter.
The above described treatment of genomic DNA is preferably carried out with bisulfate (sul-fite, disulfite) and subsequent alkaline hydrolysis which results in a conversion of non-methylated cytosine nucleobases to uracil or to another base which is dissimilar to cytosine in terms of base pairing behavior.
Fragments of the chemically pretreated DNA are amplified, using sets of primer oligonucleo-tides according to the present invention, and a, preferably heat-stable polymerase. Because of statistical and practical considerations, preferably more than ten different fragments having a length of 100 - 2000 base pairs are amplified. The amplification of several DNA segments can be carried out simultaneously in one and the same reaction vessel. Usually, the amplification is carried out by means of a polymerase chain reaction (PCR).
In a preferred embodiment of the method, the set of primer oligonucleotides includes at least two olignonucleotides whose sequences are each reverse complementary or identical to an at least 18 base-pair long segment of the base sequences specified in the appendix (Seq. ID No.l through Seq. ID No.112). The primer oligonucleotides are preferably characterized in that they do not contain any CpG dinucleotides. In a particularly preferred embodiment of the method, the sequence of said primer oligonucleotides are designed so as to selectively anneal to and amplify, only the prostate specific DNA of interest, thereby minimizing the amplifica-tion of background or non relevant DNA. In the context of the present invention, background DNA is taken to mean genomic DNA which does not have a relevant tissue specific methyla-tion pattern, in this case the relevant tissue being prostate and prostate carcinoma tissue. Ex-amples of such primers, used in Example 2, are contained in Table 1.
According to the present invention, it is preferred that at least one primer oligonucleotide is bonded to a solid phase during amplification. The different oligonucleotide and/or PNA-oligomer sequences can be arranged on a plane solid phase in the form of a rectangular or hexagonal lattice, the solid phase surface preferably being composed of silicon, glass, poly-styrene, aluminum, steel, iron, copper, nickel, silver, or gold, it being possible for other mate-rials such as nitrocellulose or plastics to be used as well.

The fragments obtained by means of the amplification can carry a directly or indirectly de-tectable label. Preferred axe labels in the form of fluorescence labels, radionuclides, or detach-able molecule fragments having a typical mass which can be detected in a mass spectrometer, it being preferred that the fragments that are produced have a single positive or negative net charge for better detectability in the mass spectrometer. The detection may be carried out and visualized by means of matrix assisted laser desorption/ionization mass spectrometry (MALDI) or using electron spray mass spectrometry (ESI).
The amplificates obtained in the second step of the method are subsequently hybridized to an array or a set of oligonucleotides and/or PNA probes. In this context, the hybridization takes place in the manner described in the following. The set of probes used during the hybridiza-tion is preferably composed of at least 10 oligonucleotides or PNA-oligomers.
In the process, the amplificates serve as probes which hybridize to oligonucleotides previously bonded to a solid phase. The non-hybridized fragments are subsequently removed. Said oligonucleotides contain at least one base sequence having a length of 13 nucleotides which is reverse com-plementary or identical to a segment of the base sequences specified in the appendix, the segment containing at least one CpG dinucleotide. The cytosine of the CpG
dinucleotide is the 5th to 9th nucleotide from the 5'-end of the 13-mer. One oligonucleotide exists for each CpG dinucleotide. Said PNA-oligomers contain at least one base sequence having a length of 9 nucleotides which is reverse complementary or identical to a segment of the base sequences specified in the appendix, the segment containing at least one CpG
dinucleotide. The cytosine of the CpG dinucleotide is the 4th to 6th nucleotide seen from the 5'-end of the 9-mer. Pref erably one oligonucleotide exists for each CpG dinucleotide.
In the fifth step of the method, the non-hybridized amplificates are removed.
In the final step of the method, the hybridized amplificates are detected. In this context, it is preferred that labels attached to the amplificates are identifiable at each position of the solid phase at which an oligonucleotide sequence is located.
According to the present invention, it is preferred that the labels of the amplificates are fluo-rescence labels, radionuclides, or detachable molecule fragments having a typical mass which can be detected in a mass spectrometer. The mass spectrometer is preferred for the detection of the amplificates, fragments of the amplificates or of probes which are complementary to the amplificates, it being possible for the detection to be carried out and visualized by means of matrix assisted laser desorption/ionization mass spectrometry (MALDI) or using electron spray mass spectrometry (ESI). The produced fragments may have a single positive or nega-tive net charge for better detectability in the mass spectrometer.
The aforementioned method is preferably used for ascertaining genetic and/or epigenetic pa-rameters of genomic DNA.
The oligomers according to the present invention or arrays thereof as well as a kit according to the present invention are intended to be used for the classification, differentiation and/or diagnosis of prostate tumors. More preferably for the differential diagnosis of prostate tumors, or diagnosis of predisposition to prostate cancer. According to the present invention, the method is preferably used for classification, differentiation and/or diagnosis of important ge-netic and/or epigenetic parameters within genornic DNA, in particular for use in differential diagnosis of prostate tumors and predisposition to prostate cancer.
The method according to the present invention is used, for example, for classification, differ-entiation and/or diagnosis of prostate tumors.
The nucleic acids according to the present invention of Seq. TD No.l through Seq. ID No.l 12 can be used for classification, differentiation and/or diagnosis of genetic and/or epigenetic parameters of genomic DNA, in particular for use in differential diagnosis of prostate tumors.
The present invention moreover relates to a method for manufacturing a diagnostic reagent and/or therapeutic agent for classification, differentiation and/or diagnosis of prostate tumours and cancer by analyzing methylation patterns of genomic DNA. More preferrably for use in differential diagnosis of prostate tumors. The diagnostic reagent and/or therapeutic agent be-ing characterized in that at least one nucleic acid according to the present invention (sequence IDs 1 through 112) is used for manufacturing it, preferably together with suitable additives and auxiliary agents.
A further subject matter of the present invention relates to a diagnostic reagent and/or thera-peutic agent for prostate cancer by analyzing methylation patterns of genomic DNA, in par-ticular for use in differential diagnosis of prostate tumors, or diagnosis of the predisposition to prostate cancer, the diagnostic reagent and/or therapeutic agent containing at least one nucleic -12_ acid according to the present invention (sequence 1Ds 1 through 112), preferably together with suitable additives and auxiliary agents.
The present invention moreover relates to the diagnosis and/or prognosis of events which are disadvantageous to patients or individuals in which important genetic and/or epigenetic pa-rameters within genomic DNA, said parameters obtained by means of the present invention may be compared to another set of genetic and/or epigenetic parameters, the differences serving as the basis for a diagnosis and/or prognosis of events which are disadvantageous to patients or individuals.
In the context of the present invention the term "hybridization" is to be understood as a bond of an oligonucleotide to a completely complementary sequence along the lines of the Watson-Crick base pairings in the sample DNA, forming a duplex structure.
The term "functional variants" denotes all DNA sequences which are complementary to a DNA sequence, and which hybridize to the reference sequence under stringent conditions.
In the context of the present invention, "genetic parameters" are mutations and polymor-phisms of genomic DNA and sequences further required for their regulation. To be designated as mutations are, in particular, insertions, deletions, point mutations, inversions and polymor-phisms and, particularly preferred, SNPs (single nucleotide polymorphisms).
In the context of the present invention, "epigenetic parameters" are, in particular, cytosine methylations and further chemical modifications of DNA bases of genomic DNA
and se-quences further required for their regulation. Further epigenetic parameters include, for exam-ple, the acetylation of histones which, cannot be directly analyzed using the described method but which, in turn, correlates with the DNA methylation.
In the following, the present invention will be explained in greater detail on the basis of the sequences and examples with respect to the attached drawing without being limited thereto.
Description of figure Figure 1 Figure 1 shows the separation of benign prostate hyperplasia (1 ) and prostate carci-noma (2). High probability of methylation corresponds to red, uncertainty to black and low probability to green. The labels on the left side of the plot are gene and CpG
identifiers. The labels on the right side give the significance (p-value) of the differ-ence between the means of the two groups. Each row corresponds to a single CpG
and each column to the methylation levels of one sample. CpGs are ordered ac-cording to their contribution to the distinction to the difFerential diagnosis of the two lesions with increasing contribution from top to bottom.
Seq. ID No.1 trough Seq. ID No.112 Sequences having odd sequence numbers (e.g., Seq. ID No. l, 3, 5, ...) exhibit in each case sequences of chemically pretreated genomic DNAs. Sequences having even sequence num-bers (e.g., Seq. ID No. 2, 4, 6, ...) exhibit in each case the sequences of the chemically pre-treated genomic DNAs which are complementary to the preceding sequences (e.g., the com-plementary sequence to Seq. ID No.l is Seq. ID No.2, the complementary sequence to Seq.
ID No.3 is Seq. ID No.4, etc.), Seg. ID No.113 trough Sea. ID No.116 Seq. ID No.113 trough Seq. ID No.116 show sequences of oligonucleotides used in Example 1.
The following example relates to a fragment of a gene, in this case, TGF-alpha in which a specific CG-position is analyzed for its methylation status.
Example 1: Methylation analysis of the gene TGF-alpha:
The following example relates to a fragment of the gene TGF-alpha in which a specific CG-position is to be analyzed for methylation.
In the first step, a genomic sequence is treated using bisulfite (hydrogen sulfite, disulfite) in such a manner that all cytosines which are not methylated at the 5-position of the base are modified in such a manner that a different base is substituted with regard to the base pairing behavior while the cytosines methylated at the 5-position remain unchanged.
If bisulfate solution is used for the reaction, then an addition takes place at the non-methylated cytosine bases. Moreover, a denaturating reagent or solvent as well as a radical interceptor must be present. A subsequent alkaline hydrolysis then gives rise to the conversion of non-methylated cytosine nucleobases to uracil. The chemically converted DNA is then used for the detection of methylated cytosines. In the second method step, the treated DNA sample is diluted with water or an aqueous solution. Preferably, the DNA is subsequently desulfonated.
In the third step of the method, the DNA sample is amplified in a polymerase chain reaction, preferably using a heat-resistant DNA polymerase. In the present case, cytosines of the gene TGF-alpha are analyzed. To this end, a defined fragment having a length of 531 by is ampli-fied with the specific primer oligonucleotides GGTTTGTTTGGGAGGTAAG (Sequence ID
113) and CCCCCTAAAAACACAAA,A (Sequence ID No. 114). This amplifcate serves as a sample which hybridizes to an oligonucleotide previously bound to a solid phase, forming a duplex structure, for example GTTTTTTTCGTTTTAGAG (Sequence ID No. 115), the cyto-sine to be detected being located at position 188 of the amplificate. The detection of the hy-bridization product is based on Cy3 and Cy5 fluorescently labelled primer oligonucleotides which have been used for the amplification. A hybridization reaction of the amplified DNA
with the oligonucleotide takes place only if a methylated cytosine was present at this location in the bisulfate-treated DNA. Thus, the methylation status of the specific cytosine to be ana-lyzed is inferred from the hybridization product.
In order to verify the methylation status of the position, a sample of the amplificate is further hybridized to another oligonucleotide previously bonded to a solid phase. Said olignonucleo-tide is identical to the oligonucleotide previously used to analyze the methylation status of the sample, with the exception of the position in question. At the position to be analysed said oli-gonucleotide comprises a thymine base as opposed to a cytosine ' base i.e GTTTTTTTTGTTTTAGAG (Sequence ID No. 116). Therefore, the hybridisation reaction only takes place if an unmethylated cytosine was present at the position to be analysed.
Example 2: Differentiation of prostate tumors In order to relate the methylation patterns to a specific tumour type, it is initially required to analyze the DNA methylation patterns of two groups of patients with alternative forms of a tumor, in this case one group of benign prostate hyperplasia and another group of prostate carcinoma. These analyses were carried out, analogously to Example 1. The results obtained in this manner are stored in a database and the CpG dinucleotides which are methylated dif ferently between the two groups are identified. This can be carried out by determining indi-vidual CpG methylation rates as can be done, for example, by sequencing, which is a rela-tively imprecise method of quantifying methylation at a specific CpG, or else, in a very pre cise manner, by a methylation-sensitive "primer extension reaction". In a particularly pre-ferred variant the methylation status of hundreds or thousands of CpGs may be analysed on an oligomer array. It is also possible for the patterns to be compared, for example, by clustering analyses which can be carried out, for example, by a computer.
All clinical specimens were obtained at time of surgery, i.e. in a routine clinical situation (Santourlidis, S., Prostate 39:166-174, 1999, Florl, A.R., Br. J. Cancer 80:1312-1321, 1999).
A panel of genomic fragments from 56 different genes (listed in Table 1) were bisulphite treated according to Example 1 and amplified by PCR. The genomic DNA was amplified us-ing the primer pairs listed in Table 1. However, as will be obvious to one skilled in the art, it is also possible to use other primers that amplify the genomic in an adequate manner, the de-sign of such primers will be obvious to one skilled in the art. However the primer pairs as listed in Table 1 are particularly preferred. Optimal results were obtained by including at least 8 CpG dinucleotides, the most informative CpG positions for this discrimination being lo-Gated within the TGF-alpha and POMC genes. Most other CpGs of the panel showed different methylation patterns between the two phenotypes, too. The results prove that methylation fingerprints are capable of providing differential diagnosis of solid malignant tumours and could therefore be applied in a large number clinical situations. Figure 1 shows the applica-tion of the described method to distinguish benign prostate hyperplasia from prostate carci-noma.
Table 1 List of genes and primer oligonucleotides according to Example 2 ame Genbank rimer 1 rimer 2 Entry o. (internet address:

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<120> Method and nucleic acids for the differentiation of prostate tumors <160> 116 <210> 1 <211> 3953 <212> DNA
<213> Artificial Sequence <220>
<223> chemically treated genomic DNA (Homo Sapiens) <400> 1 agtaggagggtaggagagaattttgtatagttggttacggtgttttatttaagggtttaa60 tttggggttttattataaaagttgtagtaaaattgttaaaaataggaattattgggggtg120 ggggttttgttttttttgtttagttattattttttttttttaatttttattttggtttat180 attacgtgtttttagaagaaacgttttgagtaggggttggtatgagattgtttttttttt240 taggatttatttttttttatgattaggttggtgattttttttttagggtgttagtgttat300 ttattgagtagatgtttggtaggtgtttgttatgtgttagatttagtaggggatagagtt360 ttttcgatatagatggattagtatgtttggatataaattgtgaaaggagttgttaatttt420 tttgtgtaaaatttatttttgcggttatcgttaatatttttatatatgttagggtattta480 gggttaggatttggtaattttgtttaggagtagtcgttttggagatttttaagacgaggg540 aaagaaatgggtggaaataggggtttatattgtgggtttcgtagttattaaatagtttaa600 ttcgtggttattgagtgttttgaataatgtttggttggattttgagtttgagtgtgttat660 taatttagtttgttattgtcgttgttgttgttatgtatttttttattagttttgtttaga720 aagattttttttttttttaaaatattagtaaagggggtttagattagtttaagttaaata780 ttttgtaataaa'atggagtagttattttggtgaataagtatatttagaaaaggaaattgt840 ttgtttggtaagatgttgtttaatagtattttttattttgatgtttcgtagtttttgagt900 taggaaattgagaagtttttgattagattgtaaaggttgtaggtttcgtaagggtgtaag960 gttatttttaaagaattagaagttaggtttttcgatttttatttttgttagcgttaaata1020 gtaatcgttgaaggatgtagggtagttgtgagttgtagtttttttataggtaaaaattat1080 aagggtaaaatttggtttttagttttatag'ggatattttaagttgtgaaagtgttttggt1140 tataaagaattgcgtaaatgttaaatattaggtttagttataataattattttagtaata1200 aattaaagagaagggtgaaa,tattggta~agtattttggagtttaattagtaagtttttga1260 gattttttta.tgtgttgattgggataaattttattttttaaaagaaaagacgtttttttg1320 gttcgagatatttgtgagttgttttagtaggggattagttatttttttattttttaaagt1380 tatagatagttgggatggttaagtaggtagtttaggttgatggtttattaaggttatttt1440 tttgtttatatagttttatagatatttggggttattttagttttagaaaagatgttttat1500 attttagtaattgtaagttaaggataagtagagagatgtgggattgttgtttttatgttt1560 gttgtagaagttgaggttttagatttgataaagtaagtgtagtgggaataagggaatata1620 ttattagaaattgggattttagaaaatagaatagttattgtttattaagtgttaggtatt1680 tttttaatagttttgtatatatgtttaaagtttatgtttaaaacgatataaatttattat1740 tttatagttatggaggatagaagtttaaaatgggttatattgggttaaaattatggtggt1800 agtagagttgtgtttttggaggttgtagggaaaaatattttgtttt-ttttagtttttagg1860 gaagggttgtttatgttttttagtttatggtttttttttagtagttacgagtttgatttt1920 tattgttatttttatatttttttttttgattttgaggttattgttttttttttgtataat1980 taaggatttttgtgatgataatgggtttatttggagaatttaggttaattattttatttt2040 taggtttttaattatattagtaaaatttttttttgttatggaaggtagtaaagttatagg2100 ttttagggatgaggttgtggatatttttggggagcgttattttgtttgttatatagtaat27.60 ttttgttataatttagggcgatggtatattttattattatttttaattagaaattgatgt2220 gtggggaggtgatgtattataatttatttagggttaggtagttggatttgaatttgtttg2280 atttttagatttgaggttttttggttttagaattttttttgaagtgaaaggtatgaggtc2340 gattattttttgatttggtaaatagagatgttagtttggtttttagtgttagggagtttt2400 ttggagtgatggtatagggtatatttttgttttgtattttaagtttagagattgggtttt2460 aggtttagttttttttttaattttttgagagatgatagtttttgggtaaagtttttttgt2520 gttttttagtttttttatttgtgagatggtggtatggggagaggttggagtgatgttata2580 gttttttttagtttgtattataggttttaggatttaggttttattagtaatttgttgggg2640 gaggtttggg ttttttagga gaaatttgat aagaLgg~gt tgtaaatatt aacggatata 2700 tagtatttta tatttatagg ttgttttagg ggtttttaat aattttgatt atttttgttt 2760 tattttgtag atagaaaatc gaggtttaga gagattatat aatttgttta cgattttttt 2820 ttagtaagat ggaggttaag tgaaatgaga aagtaggttt tttgttattt tttttgttta 2880 gaggttttttttttatattagggttttttaagggzLgagatttagttatatttgtgcgtg2940 attaaatataagtgtgaataatgtaaagggagacgtttttaatttaaggggttttaattt3000 tgtaatgtaattttgagattatgtttttttttgttaaagttttttttttttgaagtgatg3060 gttattgtagatggtgagggttttttggaggcggataatatttttatatgataaaattaa3120 aagttggtagtttcgaattgatttttggagtgttttgaaatgtaagaggttttcgaaatt3180 ttagtttgggagttacggagggtttttttttttttttaggtttattagtttgggaggttt3240 ggagagaggtttggaggatttgttggggattaaagaagagtattggtgggaggatagggc3300 gggggaagggggaggggagtgaagtagtttttttggaatgttggtggtgggggaggtagt3360 ttttttggtggaggagttttagcgttttttttttttttttttttgttaatataatggata3420 atggtaattgtttatatatttttatggaggggaaggggatgagtgtagggaatttcgatt3480 ttattcgggagatttgtaagtttgtagatatttttttttcgtttttattgaatttttgat3540 ttttgttttgtagttttcgtagtttgttgtttgtttattttatttgtttagttttaggga3600 tagagttgatttttgaatttttaagttttatattgttaggattagtgagtagtaataggg3660 tcggggttgggtttattagttttttagtttagattttggttgtagatataaataggtttt3720 gtaagagttggttgtttagagattgcgagaaggaggtgcgttttgttgtttgtttcggtt3780 attttggttttttagtttaaggtttaggttttgttttaggtcgggtttttgggtatttga3840 ggttttttttcgttttgtgtttttttttttatttggttgtaatgagtgggggagtacggg3900 gtttttgtatgttgaaggtattttatttagttaggtttttttttttttttagg 3953 <210>

<211>

<212>
DNA

<213>
Artificial Sequence <220>

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<211>

<212>
DNA

<213>
Artificial Sequence <220>

<223> DNA (Homo chemically Sapiens) treated genomic <400>

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<211>

<212>
DNA

<213>
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<223> DNA (Homosapiens) chemically treated genomic <400> 6 tttagtgtaaaagtatttttaaaaatttgatttttaataaagtttttataaaatttataa60 gtttaaataaatgttagtttagtgtgattaaagtattggtgaaaatgttaattatatata120 aagtattttgtttaaaatgttaaatgggaaagtagtttttgatatatgtgaaaatttttt180 atatagtttttagtatatagtaaatattcgtatatttttaaaatgtagtttgtattttat240 tattattgttttttgagact attttttattttttagttttaagcgatttt300 ggtttattgt tagtttttcgagtagttgggattataggggtgcgttatttttattaggttaattttttat360 atttttagtagagacggggttttattatgttggttaggttggtttcgaatttttgatttt420 aagtgatttattcgttttggttttttaaagtgttagaattataggcgtgagtatcgtatt480 cggtttattttttttttttttttgggatagggttttatttttgttatttaggtcggagtg540 tagtggtttaattacggtttattatagtttcgattttttgggtttaggtgatttttttat600 tttagtttttttagtaggtgggattataggagtgcgttatttggttaggttaatttttgt660 atttattttttttatagagataggattttattatattgtttagattgggtagtaaataaa720 tatatatttattgggtagtaaatatatatatatatatatattttttttttttttttgaga780 cggagttttattttgttatttaagttggagtgtaggggtacgattttggtttattgtaat840 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<213> Artificial Sequence <220>
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<213> Artificial Sequence <220>
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<213> Artificial Sequence <220>
<223> chemically treated genomic DNA Homo Sapiens) <400> 11 aaaaaaaaaaaaaaaaaaattagaaaattaaaaaattaggtcgggtgtagtggtttatgt60 ttgtaattttagtattttgggaggtcgaggtgggtagattatttgaggttaggagtttaa120 gattagtttggttaataaggtaaaattttatttttattaaaaatataaaaattagttggg180 cgtggtggtattcgtttgtggttttagttatttaggaggttgaggcgggagaatcgtttg240 aatttaggaggcggaggttgtagtgattttagatcgtattattgtattttaatttgggcg300 atatagcgag attttatttt aaaaaaaaaa aaaaaaatta gttaggcgtg atggtatata 360 tttttatttt taattatttg ggagggtgag gtgggaggat cgtatttgag tttgataggt 420 tgaggttgta gtgagttgtg attatgttat tgtattgtat ttttgttggg gtgatagtaa 480 WO 02/103042 ~9 PCT/EP02/06605 gattttgttttaaaaaaaaaaaaaaaaaaagtttgattgttttagattta 54Q
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<213> Artificial Sequence <220>
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<212>
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<213>
Artificial Sequence <220>

<223> DNA (Homosapiens) chemically treated genomic <400>

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<223> DNA (HomoSapiens) chemically treated genomic <400>

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<211>

<212>
DNA

<213>
Artificial Sequence <220>

<223> DNA (Homo chemically sapiens) treated genomic <400> 16 gttagaaaaagaatagtgttagtaaagtttaagttttttttttttgtttttggtattttt60 tttttttttatattcggttttttaattacgggagaattcggaattatttttttttaaagt120 aatttaaattttgaagtatttttttttagtttttttaatttatattttagtttttttttt180 ttgaagttaaatattttttggggttttattatttgaaagaagttaatagatattttgatt240 tattagttcgatttatatttttggagttttcgaaggttagggtttttttttttttgtgtt300 aatttcggtagggatttcgatttaggttttttattaatataagtttttgtatgattttta360 cgttttttttaagggtttttaagtttattatttttaagtaagaatcgggttttttttttt420 tttacgggttgggggcgattgttaggttttttttatcggaatttatatatttttttttcg480 ttttttaggttatttttttttttttcgtgtcggatttggtcgttttttttttcgttttta540 tattaaagttcggagattttatgtgtcgtttttagcgataagggattcggagtagcgacg600 attttagatttatcggttggacggggattaggattggggtggggtagggaagttgttatt660 tttagggaacggcggcgatcgttatagcgtaggtcgcggattcgatcgcggtaggcgaag720 tggggtggggggagtggaaattagggagggtggggaagagggtaatacgtaagcgttaag780 ggttaggtgtcgcggtggatgtcgggatacggagttttcggtagagaaagaaattggtta840 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<213> Artificial Sequence <220>
<223> chemically treated genomic DNA (Homo Sapiens) <400> 17 atatttggtgatttttgtatttgatggattagttggtattatttagattgatgaattggt60 ttatttgattttgtagcgttttttatttaggaatttagggtaagaagatagttttgattt120 tttatgattttattttcgattattaggattcgtggtttattggtttttttaattaagttg180 tttttaaaaattttgattttcgaatgtttggggagattgatttgagtaataataaaattt240 cgtttttttgtatagttggttgtgtatgaattattttttttttattttaattgtttagtt300 ttgatgaattagttttgtttaggtagcgggtaaggtgaattttttgggaggttataaatt360 ttttttttatgattgtaagttattattgagtattttaaaagtaggtggagttgataaatt420 gatagtttaggtttggtagttatagattatttttgttttaaatgggtattattgttattt480 gaataaattgtgaataaggtatatttttttgattgaatatagaaatgagtggaatagttt540 ataagttgttttgtttaatgatagttattagttataagtggttatttagatttaaataaa600 agttaaataaaatttttttagttatattgtaattaagtatttttatttttttaagagata660 gtttaatgatttttaaaaaattttttttttttttttttttttttttattttttttttagt720 tttttagaaatgtaattgtagttttttattttttttttattagatattttttatggggta780 ggtttatttaattatgtgtttagaagttttagagaggaatttttatttatcgggaggttg840 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<213> Artificial Sequence <220>
<223> chemically treated genomic DNA (Homo sapiens) <400> 18 attgtataagaagtaaaatataaaaaaatgattatatagaagtataaaataaatatgtta60 atgaatatagatatattcgaggatttaataattttattttaatagaaatgaatgtatata120 tatattaaagggtatatatagaaatgatatttagatagttttaaattggaaataatttaa180 tgtttattaatagtaaaatggataaattatagtatatataaataatagaatattatattg240 taatgaaaaagaatttttgttatatataaaaatggatgaattgtataagtaagttgggta300 atataattaaaaattttattttttggggagtcggggatagagtttcgtttcgttatttag360 gttggaatgtagtggtatgatttcggtttattgtaatttttatttgttgggtttaagtaa420 tttttttgttttagttttttaagtagtcgggattataggtatgcgttattatgttcggtt480 aattttttgtatttttagtagagacggggttttattatgttgattaggttggtttcgaat540 ttttgattttgtgatttatttgtttcggttttttaaagtgttgggattataggtatgagt600 tatcgtgttcggataaaatttaaaaaatatatattggttggttaaattagttggaatttg660 gtaggtatttagaggaagttaaagataaaaaagtttagtttttatatagagattataggg720 tagagtttaagtgtatatgttgggggaataaatgtatttttttaattagatgaggaatat780 tttgggatgtagttatatagagttattgagaattcggtaggagatagggtttggtggtgt840 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<213> Artificial Sequence <220>
<223> chemically treated genomic DNA (Homo Sapiens) <400> 19 ggattatttgagtttgggaagttgaggttgtagtgagttaaggttacgttattgtatttt60 ggattgggtaatagagttagattttgttttaaaaaaaagaaaaattttatggttttgttt120 atattatttatttgattttatatgttgtttattttttttattaaaatttttagtttatta180 attatagtttttttataattaatatttcgatgtgataatgttttagtttaattattgtgg240 ttataatagaatgttataaattgggtgatttataaataaaagaagttgatttaggttgat300 ttagaggttggggagtttaagagtttggtgttagtatttgatgagtgtttttttgtttta360 ttataatatgggagagggtattacgtgtgaagagagtttatttttataatatagttattt420 ttataagaattaatttatcgttatgagagttatgtgaatttatttatgaggatagcgggt480 taagtttttaatatatggatttttcggggatatatttaaattatagtagttagttgtaac540 gttcgtgttatgttttattttggttttgatgtttgtgtagtttttttaaattgcgttttt600 gttttttagtgtgttttgtaatgtggaaatgatatattgggtaagaggagttgtagtaaa660 gaggtttttagtgacgtagtgataagttgtggggagagggagtgttgtatagttttgtcg720 tatgttatagttttttagtgagtttgtgtttttggattgtgaattttatgtttgtttttt780 agtttttttagttttttagatggtatagaattgttggaggggggtggagttgtatatttt840 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<213> Artificial Sequence <220>
<223> chemically treated genomic DNA (Homo sapiens) <400> 21 gtcggtttcgggggtcgacgatttttcgggtaggcgacgtgttttgtttaggttttattt60 ttcgcgttcgtaaaacggggtggataacgtagtttaaggtagagtcgcgttaaggttttt120 cgttgtcgtcgggttttggcggtttgatcgggtttggggttcgagcgtgttttcgggttt180 gggggggtcgtcgcgatggattcgttggtagcgttttaggatcgtttggtggagtagttg240 ttgtcgtcgcggatttaggtttagaggcggtttaaggtgcgtgtgtggagagggcggaac300 gtgggtttgtgatttcgcgggtttcgggattcggtatggggttttcgttttcgcgcgtta360 cggttcgttagcgtttaggtttagttttttttttcgtagcggtttcgtaggttcgcggtt420 ttacggtggggcgacgtgttttgtttaggttttattttacgcgattttaaaacgcggcgg480 agaatgcggtcgtgggatttttttaggggttttaagggtttgcgggggttgggcgtttgg540 gcgcgcgggcgggggaggttcggcgtcgcggtttataaataggcgttgtttcgttatcgt600 cgttgtcgtcgttttcgcggttggattcgggttaggtggggtttttcgttttttggtatt660 tttcggaggggtgagtgtcgaggtttttagttttttcggtttatggagggttttgagtgt720 gttttaggggttttaattttgttgttttttgttcgaggagggaggatatcgtttgtgttt780 gttgcggtttgatatttttttacggaataaatatagtgtcggtttttgtagagttttttt840 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<212>
DNA

<213>
Artificial Sequence <220>

<223> DNA (Homosapiens) chemically treated genomic <400>

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<213> Artificial Sequence <220>
<223> chemically treated genomic DNA (Homo sapiens) <400> 25 ttatggaaggaaatgagattagttagcgagttgatatagaataaggtagtttaaaataaa60 tttttttaaaaatacgaagaatagatattgaagggaagaggtgtttgtaaagattaagaa120 agtatatttggagatggtatttttttaaagttaaagttattaagtgtttaagtgttttaa180 ggagggtaagattattaataaggatttagtatagtagagtaatttgagtggtaatacggg240 atattgggaatataaatttgttaagaaaattagtaggaatgagttataggatagtaattg300 gtaaggatttaataattttttttttaatgtacgtattttaattatatttattgttataat360 aggattagtaataattatatttatttaaaaaaaaaaagattgttatgtagttatagaatt420 atttaatatagaaaatagtaaaatatattttttttttttttttttttttttttttttttt480 ataaataagattagtttatagtaaattttttatagttaagggttaatttaaaatttttgg540 tttatattttttttttatttaatgattatatgatgtaaattaattttattaatattttaa600 gtaaaatatattggaattttataaaatgtataagattttaatatttaaggaattggggtt660 agaaagtagaagtggtttttaggttttttagttttttttttaagtaataaagttttgttg720 tgaatatttaaagttattgggaaattatcggtagatttttttgtttttttttttcggttt780 tttattatgttgtttttttagatatgtaagtttattttattaattaaaattttagtttga840 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<213> Artificial Sequence <220>
<223> chemically treated genomic DNA (Homo sapiens) <400> 27 ttttgtatatttgtattttatataataatattttgtgtaatttttttttaaatgtagaat60 attgatattggagaatgttttttatatattttaagtgaaaaaggagtaaaaattatataa120 tgtattattttatttttttaataaaatgtaaatgtgtatagtaaagatatagaggtgtta180 tagtgttagggaaaaggggtgtaagattagtgtttgttttttattttttgttttgtttat240 aaattttttatattaaaaatataaattttaaatgaaaataatggaataaatataaatttt300 tattttataattaattaaaatgatagtaattgaattttttaaagttttaaatttattaaa360 atgggagaaatggatgatagtattagcgtttgaaaggtggaaagtggagggacggtgggt420 agattatttggttgatttaagaaaattgaattttaggttagttgagatttatgttgattt480 atagaattttaagaatgtttaggaattgggagaagattaaggatattagaagagaagggg540 gtgaaaataaggaaagttgttgaaatttagtttaagaaatagttagatatttatttttgt600 ttattaaagtcgagtgatttttttgtagtagggtttttttcggataggatatttggatta660 agaaatattagatatagtagagggcggtcgaaatatgttgaaattaggaatagttaatag720 atgttgaggtttttattttagttttttttttatttttgttgttggaatgttggagatagg780 gagaattttttttgcgcgagttgatttgtttgttaaaaaaacgataaagaaattgttata840 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<212>
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29 <211> 6894 <212> DNA
<213> Artificial Sequence <220>
<223> chemically treated genomic DNA (Homo Sapiens) <400> 29 gatagtttttattattagaatttagagtttaggagtatagttttatattggtttttttta60 aagtttggattataggattgttttttagaaaagtttgaaagtttttggtaaatagtattt120 agttatttagttttttttttttagtttttttttagaagagtaattcgagaaaatatttag180 tagcgtagaggaaagcggtatagtgttgttaatttatttttagtaagatttacggaattt240 taaaaatatagtttatgggttttaggacgtttgtagttttgttgtttaaaggttttttgt300 agtattaattttttttttaaattataagtggtgtttataggttttgttgttttttaaatt360 ttagagagatttttttttaaatgaaatttagagaatagaaagatttaaaattattttgat420 ttggttagatatagaggtttaagattgttaagttattttgtgtttatttttttattaaag480 ttattaaaatttttttattaaatgaatatttatggaagcgttaagattaattatttttgg540 agttaaatagattttgatttaaattttagttgtgtaatataaagtttgtgggattttaga600 tcggttttttggtttttgggttttaattttttaggggtgagttagattaggggtgagtta660 gagagaataggatttttttgtattgttaataagaggattaaaatgagatttattatgtat720 agtataggatataagattagttggtatataataagaatttaatatataatagagtttttt780 ttttatttttggagtttttaaaaaatataaaaattatatatattttttttggttaaagat840 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<213> Artificial Sequence <220>

<223> chemically treated genomic DNA (Homo Sapiens) <400> 30 atattttttttttttttttttttttttttttttgtttgtttttgtttttttttttttatt60 ttttaaaatatatgttggggttttttttttgtatttttatattgtaatatatatagtttg120 gttatagtttttttaaatagtgataatttttatttggtttttatgtatttttatatggga180 attaaatggattaaatttttatttttttttttgaaatgtatgtttataaagtatgaggaa240 atgtaataggaaagggttttaaggttagtgggatattgagtgagtaaagaagattaatag300 agaaggtttatttattattggaaattcgaagttcgttatttgatatttatagtttatatt360 tagtttattttttgaaattgaggtggtattaatatattagattaatagggagaaagagga420 gggtggagattttatatggttgtgggagatagataaatttagttgtagtaatgtattttt480 tttaatttattattggtttatagagattttatattttttgtttggagtcgtatgtttagg540 tatttaatttttggaaattggttgtaatggtttttatttggaaaggttattttagaattg600 gtttgttagatgtttataggaaagtaagtttttgttttagtttaaagtttttgaattttt660 attgttgttttattagattggtgtaaaagtaattgtaatttttggttattgaaagtaatg720 gtaaaaattttaattatttttgtatttatttaatattttgtattttattttttttttatt780 atatcgttttatttgtttagttataaagttaagaggttgtttttataataagattgttta840 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<213> Artificial Sequence <220>
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<213> Artificial Sequence <220>
<223> chemically treated genomic DNA (Homo Sapiens) <220>
<221> unsure <222> (4779) <400> 35 agtggtataaatatggtttattgtagtttttattttttgggattaagtaattttttagtt60 ttagttttttgagtagttgagatgatagttgtttatcgttatgtttagtaaattttttta120 ttttttgtaaagatacgattttattatgttggttaggttggttttgaatttttgggttta180 cgcgatttatttgttttagtttttaaagtgttgggattataggtttgagttatggtgttc240 ggttatatttatggatttaattgtttttgga.attaatatcgtgtaggaaaggagtaggat300 tgagtagaaaaagttgaattaaatgtagttatagtaaatgttttagttttcggattttaa360 gggagttttggtgttaggagagttttttagagtagttttattttgagttttgtatttgtt420 agttagtgtagacggatttggtgagaggtagttttttttagttgaaggtaatttttggaa480 agggatttagttgataggtgttgataagtaatgcgtttagtagttgaggaaatgagtatt540 ttagttttgaagagtggtgtgttttttggtatgttgggatggttggttgtgttagtggag600 atgggggtggtgggtagaatgaagggaatattattgtaaaagttttttattttttattta660 tatttatttatttatttattttttaagataaggtttaattttgatgttcgggttggagtg720 ttggaatgtaatgatattattatagtttattgtagttttgattttttgggtttaagcgat780 ttttttattttagttttttaagtaattggaattataggtatatgttattatgtttagtta840 attaaaaaaaaaaattttgtagagatgaggtttcgttatgttgtttagggtggtttggaa900 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<212>
DNA

<213>
Artificial Sequence <220>

<223> DNA (HomoSapiens) chemically treated genomic <220>

<221>
unsure <222>
(1493) <400> 36 tattttaaatatttttaatgaaagtttttttgttaattaggagagagttaaaaataatta60 taaatattagtagaatgattcgttttaggattatattttagttggttttgttttgttgtc120 ggtggttttgaagtagttttttattttttttttattttttttttttttattttttaatat180 ttttattcgagaatgtattatatttttagatcgttggtaaaaaaaaaaggggggggggaa240 gagattgtaattattaaggaaggggaaggtattttagaattacggtttttattgtaaacg300 gtaataaaaaaaaaaggtagtttgtgttattaggatatgggggacgacgttgtagggtat360 tataaagatgtgtagtgagtgtgtatttgaagttttcggggtaggatgagacgatggagt420 agaaagtaagaaaatttgtgttttttttgtttttttttgtttttttttttttaggagagg480 aagttgaagaaattgggggaggggcggaatgttatcgtttttttatagagggtatataag540 ataggttttagggttcgttcgtttttagttaggagggttacggagggaagaggaagagag600 aatttttaaacgttatttatttttgtttaaaaataaaagtaagggggtaattattaaatt660 tagatggcgcgtttttaaaggcgtttttaggttatttatttttatttttaagcggaaggg720 ttgggataaaggggatggagggtcggaggttggttagggataaggttttatttttcgatt780 taggagggaaagggtgtttaagtttttagttgtttttttttattttttatttttcgtttt840 ggttatttttatttatttttttttttttttttttttttttttttttttttttttagagtt900 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<211>

<212>
DNA

<213>
Artificial Sequence <220>

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<213> Artificial Sequence <220>
<223> chemically treated genomic DNA (Homo sapiens) <400> 38 tttgtagaagtaaataagattggtgggatttttgtaaggagtaaaataatgttggttatt60 tattaggaaggattttgagttaatattaataatatatttttttgtggagttaaaggtatt120 ttaaggatagtagtaatgttgagaaaggaggtgtgtagtatagcggtggtataagttgtg180 ataaggaggagggaatggtgggtaaattgtgattatttttttgttattttttatttaaac240 gagatttttaaaaaggttaaggttggaagttattttggggattgtttggtttagtttttt300 ttatgagagatgggaaaattgaagtttaaagaga.gataattattttaatgtttatgataa360 ggtaaggttaagtttttaatagagaatttttttattttattatattaagttgtagtttta420 atatgtaagattttaggagtgaaagtaatttgggaaaaacggaggattttgaaatttttg480 tttaagatggttttttttttttttattttattaggattttattatttttttgaaatttta540 ttttttatgaatattaggttgatagaaaagtaaataaaattattggttaatttaggtagt600 atttcgagtagtttgatttgatgttttgtatataaattattttggtgattattattattt660 agattttagtaattttggagagtttcgtttttaaagtagattttagttttttgaaatttg720 gtttattttttggatacgttacgtgttagatgttttgttttttagagtttttaaatgtgg780 tttgaaatggtaggatttgaagaggatgtagatgtggaggggaaagagattagaagggaa840 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<213> Artificial Sequence <220>
<223> chemically treated genomic DNA (Homo Sapiens) <220>

-1~2-<221> unsure <222> (2545) <400> 39 gttttatgatttaattattttttaatatttttttttattaagattattatattggtgatt 60 gggttttgatatatagatttggggagaatataaatatttatattatagtatttattaatt 120 tatttagttattttattgttaggtatttatttagaaaaaatgaaaatatatgtttatata 180 aagatttgtataatatttttatagtagttttatttataatattaaaaaaattggaaataa 240 tttagatatttatttatagttaaatggataaataaattatagtatataaataaaaagaat 300 aaaaagaattaattattgatatatattataatttagttgaattttaaaataattatgttg 360 agtgagagaaattaaatgaaaaaaagatatattatattatatataattttaagaaataaa 420 atttaatttatttggtatttagatttttatttttatattagttttaaataaaaagtttta 480 aatttttttggataaatggttgattttacgattggggtaggaaatatataagatgagttt 540 gatgagtttgtagtattttgtaatattagaaagtaggaaagtttatatatatatatatat 600 atatataatatagagagtgggttaaggagtataagagttaattgaaaaagtttttagtgt 660 taaaaattggaaaaatttgagtaataaagtatttatgaatttatataaagaaaagattga 720 ataaagaagtaaatgggggagaagaagtaaattttttttatagaattttaaataaattat 780 gtagatattttattttaaaggagggttagtataattttttatttttttatatttttttaa 840 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<211>

<212>
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<213>
Artificial Sequence <220>

<223> DNA (Homosapiens) chemically treated genomic <400> 43 ttttagttttttatagttttttgatttttttttttttgattttttatatttttttttttt60 tattttttttttgtttttgttaattattattattttatttttattaatattattaagtgt120 atttgtttgagtatttttgggtgtttgatttaggatttttttaggggtatttttgttggg180 gtaatttttttagtttttagaagggtatggttgtgtggttgagattgttgaggaaagtag240 taaagataggaggatagaattgaatgtaaagttattttgtttttaagtacgtttaatgga300 atggttttatagtagttgcgtttaattttgtgggtattgttattgtattttgtcgtttag360 gaagtttataaattatataatgttttttacgtggtagttatttggtggttttgagtttta420 gagattttgatttagtattttgattaggatatggagttgtttggattattagtggaatat480 taatttttatattttaatattgggttttagagttattttgtgaaattttttttggaaagg540 aaagatttgagttttaattttaattttaatgtgtattttaaacgtaggtttgagagttgg600 gggatggtagatgttaagtagaaggttagattaatttttggataatattggtaacgaaaa660 ttacgtaggtagttgagaataaagtaaatgttttttatttttttttatttcgtttattat720 gttggtgatgaaaattgtaaaaatgagtttagtataaggttttttatttttttttttggt780 aagagataaggaatatattaatagttaaggttttagagggagttgatatttagataatag840 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<213> Artificial Sequence <220>
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<213> Artificial Sequence <220>
<223> chemically treated genomic DNA (Homo sapiens) <400> 45 ttaaggagga aggatttata attgatttcg ttgtttttta ttagtgttaa aatagattag 60 tttagtgatg tttaagtgga tacgatttag aagcgagacg taaagaggtt aaatacgggt 120 aaatcgtacg taaaattttg atattattgt aatacgttcg tggggtgggg gtggtaagag 180 tgttttagta tcgtagtttc ggcgtagatc ggaatttcgt agttattttg gtggtttcgt 240 ggtgggaaag acgcgtttta gcgaatcggt cgcgttattt tcggagtacg ttgggaatta 300 cggtaggtta gggcgtaaag agagtagtcg ggcggzzzzL tggtgttatt tgttggtttt 360 tcgtgtgtgg taagtattgt cgttttttcg ttgattattt gttgggttat tgtcgagaat 420 tacggttggg gtgagaattg tggtttggcg ttatttttta gtgagggtta ttttggtgtt 480 cggaaagggcgttgggttattagtatattgzLacgagzgggagtaggagttttgtagtcg540 gatatcgtggattttgtttttgtttttttcgttttggttgtgtggttttttataggttat600 ttaatttttttggggttaagttgttttatttgtgaagtggggattatagtatttatgtta660 tgagagcgtttgaggagatgataggatgtatgagaaatgttttgttttttaaataaatgt720 tggttttattattgttcgtttttttttgtttttttgttttttgatgttgtttttgtttgt780 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<2l3> Artificial Sequence <220>
<223> chemically treated genomic DNA (Homo sapiens) <400> 46 gttgatttaaagataaattagatttaaaattagatttttattggaaattataagaattta 60 ataagaaagtttttagtgtaagttatttggaatattattagttttttgttatgttatgtt 120 taaatttttttaaaaaataataaataaaaatagtgtttgtttttttatttaagtggttta 180 attaggttaattttttgtttttttttttgggttgggttttgatagtgttatttttttcgg 240 ttttttaaagtttaagttaggttttatttaggatggttggtgattttattacgttagttt 300 tttttggataatagattatgtgatttaaatgaatttatgatattatttcgcgggtcgtta 360 ataattttaattaatataaagttgtagagtgaaatattatggtttttttttatttttttt 420 gtgagtaaaggaggttgaagggggtataatttaagtttacggaaatatgaatttggtcgg 480 ttatattaataagataaaagggtcggtagtttttatatttatttttatggaaggtgtatt 540 tttatatttattttgataaaatacggtttttcgaatttttcgttgaggtgttttttttag 600 ttttttttaaagtttacgggtacgttgcgggtcgcgagtttgagtagggtcgcggttttg 660 tttttttggattcggtttaattgttcggtatttagcggcgaggagggcggcgttttaggt 720 tttttttgtttagtcggggtttttttggttgggatggtttgtaagtggttttcgtagagg 780 cggtttaagagttgtagcggtttttttttaggcgttcgtagttttcggtttaatttttac 840 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<211>

<212>
DNA

<213> icial Artif Sequence <220>

<223> cally DNA (Homosapiens) chemi treated genomic <400> 47 attgtttaagacggaaagattttaagattgtgtgattttttttttttttttttttttttt60 tttttttttataggtgtagaataattttttttttttttttcgtggtttttttttttttta120 ttttttttttttgttgtttgtaaagttgaatttggggttaggagttttaattgtaatttt180 agattggaattttagatggtgcgtttaggattggaagtaatttttagtttattaatttta240 tgggtttacgtatttgttttggttacggtttggtttttatttttattgtggtattaatgt300 agaataaattgagatatattttttatataattagttttagaatttaaaaagatttacggt360 ataataatagaggtagtgtcgcggaatttttttattgaggattttcggggagttcgggga420 ttatttcgcggtggtattagaatagacgagtaattttagcggttttaggtattgcgaatt480 gggggagagggggaaattttgtatcgtattcggtagtatttaacggtttcgggtttttag540 atagggttagcgaggagagttaggatagtaagtggggattggttaaaaaaaatcgattta600 attttgaaatgattagaagaagttgggagtagttattataaagttttttttttgtttttt660 tttttttttaattgaaggaatgacgttgaaatttttatcgttagcgcggggttgggaatt720 attttaaatatttgttttgtagtttcgagtgggtagatttcgaagagttggagtcggcgg780 ggaggggaggaatagttgttgggttgttttgcgcgtggggttcggggcgcgggtttcggg840 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<213> Artificial Sequence <220>
<223> chemically treated genomic DNA (Homo Sapiens) <400> 48 tttgcgggagcggcggagagaagtatagtgttagcggtgttttcgtaagacggggtagtg60 ggtttgaattagttacgggcggggggggtgtgcgttgaatttcgtattcggatttttagc120 ggaggagaatttagttttataagtttttaggattttcggtaggaagacggtttaagtttt180 tggatgtgattttgggataggtttttttatttttttttgattaaaatttttatttcgttt240 ttttttaatttatttatgtcgtagttttttacggtttttgtcgtttttgtagcgaatttt300 tggtaaattaagtataaaattcgttgtttgatcgatagagaaggttgtttattttttaaa360 aataaattgtagttttttcgtaggagtagcgcgggtaagcgaaatgaatttgttgggtta420 atttcgcgttgatttcgagttgtaaattaggggttcgcgtattaatttttattaattatt480 cggagttagttaaatggtttggttttaaaaatgggaagagtaattatcgagtaatgttat540 ttgtttggggttattcgatttgatattatgatatttaagggaaagttggtgagggggaaa600 ataagggttttttttagttgggtttttagatggcgattttgcgttttttttttttttttt660 tttatgggatttattttgcgtttaggggttcgattttgattattgttgtaggagttaatt720 tttttattttttaggttggataattaattttttttagagtgtgtttgatattgtattttt780 ttttttttttatggtagtgtttcggttttttgttttagtttttttttagggaaattttag840 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<213> Artificial Sequence <220>
<223> chemically treated genomic DNA (Homo sapiens) <400> 50 tttagaataaaatagaaggggaaagtcgacgtgagcgagtaggtttcggatataggtggg60 gcgagtttttagtgtcgtatgtagtagtgaagagaaacgattttgttacggatattttat120 tttaaatgttttttattttggatgaaaggttttttttttttttttttaggtatttcgtag180 cgtagtgtttgttttttttattttgtcgttgcgttttcgttatttttttagtattatttg240 tttgaaagggggtttgttataaatatttttgacgtttgcgttgacgtaggcgtcgtttcg300 gagtttttagaatgaattcgttttttattaatgaaattgttttatatattcgttcgttgt360 attttttttttttatttttttttcgtgttttaggttgtcgggggaggggggattgtcgtt420 ttttgttattttttcggagaagttaggttttagttagcgagtttgtgtttgggatacgtt480 tgttttagttaatgttagagattcgttttggagtgtagattagaggttgtttagaacgaa540 tttgtttttcgaagggggaattaatttttattatggtaagcgtgcgtgcgtttagagtaa600 gtttcgagttttcgagtcggtatcgtttcggttacggtagtttttttttaggtataaggg660 agttttttatttatttattggagcgtttcgttcggtgttttttttttcgcgattttaagt720 tttcggtttcgcggcgacgggaagttagttttatttgcgcgttgataggcgagtttatgt780 tggagaaggagtttgcgggtgagtggtagtaagagaggttattttcggtcggggacgcgt840 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<213> Artificial Sequence <220>
<223> chemically treated genomic DNA (Homo sapi.ens) <400> 51 gggggtattgagtaatatatttagattaataatattttataagtgtgagtattattgatt60 taaatttttttgttggttgtgttttgtgtttatgtttgttttatatttattttttttaga120 gttgttttttttagagttttagtaatttttatttttttaaatttttttagttatgggaag180 gattagtaggtgttagtggatttaaaagaattttagatttgttgagatttttgatttttg240 gtgtttagattaattagtaaatagtttaattaaacggtttgtttttatggttaatataat300 tttgaattggtggttatttagattaagtttattttgtttttgagacggaattttgttttt360 gtcgtttaggttggagtgtagtggtgcgattttggtttattgtaatttttgttttttggg420 tttaagggatttttttgttttagttttttaagtagttgggattataggtatttattatta480 ttttcgattaatttttgtatttttagtagagatagggttttgttatgttggttaggttgg540 ttttaaattt cgattttaga tgatttgttt atct~cagttt ttttaagtgt tgggattgta 600 ggtgtgagtt atcgcgttta gttaaagttt agtttgtata agaaggtttt ttttgttatg 660 ttataggatt tttgagttta ttaaatagat tttaatgttt tgagatttta cgtatttttt 720 taaaatgaagtatttaaattgttagtgtttgtttttttgtttggtttttttgatgtattg780 atttggtttgttagtgtgatgaaaaatatggttgagttttattgttttattgtaattagt840 aggattgtttagaagtttaatttttttaagagatgaagatttgagtttatgtagttggtt900 gttttttaaaaatatttggttatttgggatatattttgaattaattttttggttatttta960 tgtgattaaaagtgttagttttttttgtttttagtatatttttttgtttgggaagtggaa1020 gggatgaaatttttatatttttttttgatgatatagaaaggagtatatatttatatttta1080 tgaatagatatgtaattatagaagaaatagtttaacggtcgggcgcggtggtttatattt1140 gtaattttagtattttgggaggtcgaggtgggtggattacgaggttaggagtttaagatt1200 agtttgtttaagatagtgaaatttcgtttttattaaaaatataaaaaattagtcgggaac1260 ggtggtaggcgtttgtaattttagttatttaggaggttgaggtaggagaatcgtttgaat1320 tcggagggtggaggttgtagtgagtcgagattacgttattgtattttagtttgggcgata1380 tagtgagattttattttaaaaaaaaaaaaaaaagtataattatatgattatttatattgt1440 tttatatattaaattagtagtaatttgttttttatatagtaaataaaaataaattagtag1500 taataaatatattttttttgtgttatagttagtatttggtgaattttgtatttttttttt1560 ttttaaagtgttgaatttataggtttttataaggtaagtttatattattaattaattttg1620 tttttttttttgatgttaaaattgttttttaggagttgattaggtttatttttttgtttt1680 ttaagtattatttttagaatatttttgaaagtatttttgttttttggtaataatatttat1740 attttatttattttttgtttttaaatatatatttagttaattttaggttttttttaatgg1800 agtagttatttatttatttaatatacgttgggtgttttttttgtgttatatattgttttg1860 gtttttggggatagagtaggaaataaaaaaaaataaaatttgtttttatatagttgatat1920 tttagttaggggagataaataataaataaatgaatgatgtagtatgttagatgttgatag1980 tgttatggagaaagtatattatggagattagaagtattatttgtaatggaatagttatga2040 ttttaagaagaatggttgattggatgtgaagtgtgagagagaggagtttaggtttttggt2100 tgagtaattggagggatggagttgttattatttgagatggagaagttaggggaggagtag2160 atttggaggggaaggttaggaatttagtttggaatttgttaagtatgaggtatttattaa2220 atattgaagtggatttttagaagatgttattaaaattagttaagtttaggagagagtttt2280 gggttagaaataaaaatgtgggagatattggtatatatatgggtttatattatttttttt2340 tttaatttaatattttattttattgttttttgtttttttaatagtatttagttttattta2400 ttttttaaattgatttttatattgatagtataataaaatttatattttttattatattaa2460 gattttgtgtgatttaatttttttttattttttggattttgttttaggttattttttttt2520 tttatttaatttttaatattttgattttattgttttttaaatagttttttgttgtttttt2580 gttttttttgtggaaaaggtttttttattgtttaattattaggtatttttcgattttttt2640 ttattttttatttttgagaaaggttttttttgattttttatattaattaggatttttttg2700 ggcgagatttgatttaaattggtttagagaaaaggagttaattgattggtttatgtaatt2760 taattttttttttttgttgtaatttttttttggtttttattttatttaaggttaaagtta2820 gggtttttattatggttttgtaggttttatatagtttgttttttttattatttttttgat2880 tttattttttatattttttttttatttatttttttttagttagagtggtttttttgttgt2940 attttaaatatgttaggtatatttttattttagtgtttttgtgtttgttgttttttgtgt3000 gtggaatatattttttatatagttatattatttaaaatttattgtttttaagtttttatt3060 taaatgttttttcgtgaagttatttttgagttttttttaaaattgtagttttttattttt3120 gtattttttattgttttttatttttaatttttgttattgtagttagaattatttgatata3180 tagtttttattttattggttttttgttatgtttttttttataagaatttgaagtttatta3240 ggtcgggagttttgtttgttgtgtttgttgttattttttagtgtttaaaattgtttggta3300 tatagtaggtatttaataatttttgaattagtgaaaattagatggtggtttggtattttt3360 atataggaatgagttaggtggaaattatttaggatataagtagattttgaagtgataagg3420 aagggttattataattatgtggggtttattttgtttttttttgttttttttttttaggtt3480 tagtaatagttttattaaggattttatgaatattaaagtttatatttatatgttgttaga3540 ggtgagagtagtttattttattattagattttgtgtttagggtggtgatttgaagaagga3600 agagagcgaaagaagggaaggattatttttttttttaaattggagttaagggagggaggt3660 tagagtaagtttgggggcgtaatttagatttagtttttgtttaattttttttgttttttt3720 ttttaggggtttagagaattataaggtttgtagaattttttagagaagttttattattga3780 ttttttttttttatttttagatattaaagagtttgaatgtttttgagttatatggttttt3840 ttttttttttataaattttgttagttgttacgggggtttgtttttagggtataaagttat3900 tgagagatttagagatttagtttttttgtggaatttttaaaatgttttagtagttttgtt3960 tttagtttgttgtttggtagtatttgttagttgattttatgtattgtttttttttttgtt4020 attttggtaatttgggttttttattttatttttttttttatttttttttttagacgttat4080=

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<213> Artificial Sequence <220>
<223> chemically treated genomiC DNA (Homo sapiens) <400> 52 tttggagagtaaatagttgagttgagaggttgtggatataggaggggtagaggttagcgg 60 gaggaggatttttttttttgttattttttttttatttttgtttttaaattttattattat 120 tttttaaatttttttagattaatttttagttttttagttttgtttgggatgttttttgtg 180 atgggatataatttatgggtattttaggatggtgtgaatgtattttgaatgtgaaataaa 240 tgtgaatttgtgggggttagagggtagattgtggtaggttaaatgatgttaattttgttt 300 cgtattttaattttcggaatttgtatgttatttatattatatagtagaaaggaattttgt 360 agatgaaattaaggttataaattttaagatagggagattatttttggattatttgatgaa 420 atttaatttaattatatgagttttgaaaagtagatgatggagaaagaaaggtagtttaga 480 gatgtgatgatagaagaggtaggggagatttaaaatgtgagagggatttaatttgttatt 540 gttggttttgaagatggaggaaggaggtttagaattaaggattgtgggtagttttttaaa 600 gttgggaatggttgttagttgatagatagtaaggaaatagggattttagttttataattt 660 taaggaattggattttgttaataatttgaatgagtaggaaatggatttttttttagagtt 720 tttagaaggaacgtaattttgttaatattttgattttagttgagattagtgtgggatttt 780 tgatttatagaattgtaagataataaatgtgttgttttaagtagttaaatttgtgattat 840 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<211>

<212>
DNA

<213>
Artificial Sequence <220>

<223> DNA (HomoSapiens) chemically treated genomic <400> 53 tgtttagtttagggtttgtgaatgtacgaatcgatattttgtatttagttattttggtgg60 ggaggtggagaatttttgtgtttagtttagggattgtaaatatattaattagcgttttgt120 taaaatagattattcggttttattaattagtaggatgtgggtggggttagataaaagaat180 aaaagtaggttgtttgagttagtagtggtaagttgtttgggtttttttttatattgtgga240 agttttgtttttttttgtaataaattttgttgttgtttattttttgggtttatattgttt300 ttatgagttgtaatatttattacgaaggtttgtagttttattgttgaagttaatgagatt360 acgaatttttcgggaggaatgaataatttgagacgcgttgttttaagagttgtaatattt420 atcgcgaaggtttgtagttttatttttgagttagcgagattataaatttattagaaggaa480 gaaatttcgaatatatttgaatattagaaggaataaatttcggatacgttatttttaaga540 attgtaatatttatcgcgagggtttacggttttatttttgaagttagtgagattaagaat600 ttattaatttcggatatattagttattagggaggttgaggtgaggggattatttgaattt660 aggaagtcgagggtgtagtgagtcgagattatgtcgttatattttagtttgagtgataga720 gtgagattttgtgttaaaaaaatagaataaaataaaataagaacgttgaataggttgtgt780 gttaattttgagatggagtttagatttaagaatgattttgaggtttagatttatatttaa840 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<213> Artificial Sequence <220>
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<211>

<212>
DNA

<213>
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<213> Artificial Sequence <220>
<223> chemically treated genomic DNA (Homo Sapiens) <400> 57 tatttatggttaggaataaataaaatttagttttttttttaagaaggaggaagtattaaa60 ttttaaataagagtaggaatagtatttagaaggagaaatataatattttggaaaaagtaa120 gtagaattaatatagtttatttaaatgtgagatttaaatcgtagtaataggaaatttttt180 tattaaattggaattttttttaatttttgtgtaagatttaaataattaaaatgtatttta240 atggttattgatggttttatttttttttttttttttttttttttttttttttttttttta300 aagaaatagatttgagtttttttattggagtagaaatatatgaattttttttaattattt360 aggaaattggaagtttttgggtggatatggtttttttttattgtttttttttttttatat420 tatttttagttaaaaaaattaattgtttttagtagagggatttttgttagaaatttttat480 taggtgaatttgtattgggaatttttatgtttttttagtttgtttgtgttttttaaatag540 agttgaagttgtaaataaagtggaaaaatatattttttattttaaaatttttaaaatttt600 attttttgtggaaaatataattttataatattaatttttaaaatttgtaagagttataga660 aggtgtgaaagtagttaaatagtcggtttagaaatttaaaagttaggattaacgggggat720 agaatgttttttttttaaatttaggtagggatggggagtatttttagtattagggtattt780 atggacgttataaggggaaaggatgtatttgaacggtgggggtgatttagcgatgaatcg840 ttacgttaatagtattattgttaaatttttaaatttagaggttttggtgaaaaattaaat900 cggtggtaatttttaacgtttgtagtatttgttattttatattttagtattcggagtttg960 gatagtttcgtaggtcgcgtttcggaggtagtatgagtttttattaatttatttatagtt1020 ttattgttaacggtagttagatttaggagagatttattgaaaattttttaagattttttt1080 ttaaaaataaaacgatttttatatttaatggtttatttgaaagaatatacgtaagaaatt1140 aggagattta aattaaattt attaatagga gagtttgatg atgtttaatt ttagagatta 2200 gagtttcgat tggtgaggtt tgatgaaaaa gtaaagagaa atcgtaattg tatagttaaa 1260 aatataattt ttgttatttt taaaatttta aaaatttttt atttgttttt gggaaatggg 1320 tgaaattgaaaattattaaaataattggattttttaaaaattggattgtatgagtgaaag1380 gtgtttatgagaagtcgatgatttcggattttattatttaagaggatagtatagaatagt1440 taatatgttttttgagggattaggatgttgacgtttttttttgatattcgattattacgt1500 gattgagaaaaaaaaaaaggaagttattttatgaataaaaatcggagcgtaatagtgtaa1560 taaaatattttgtatttaaaggtaataggtaggtagatgttgataaagagggttttttaa1620 aaattatgttcggatagatttttgcgaattgtatagataaataggagtagaaggtcggtt1680 atttttgtaattagcggtagtagtagtagaagtcgtagttttagaggtagtcggagagat1740 ttcggagtagagaaggcgtcgtcgattttcgcggttgtttggttcgcggtttttataaag1800 gcgggttagtcgttcgtttttttttttgttttttttttttttttttttgatttttttttt1860 tttttttaatcgtttgttttttttttcgggtggatttacggttattttgttttttcgcgt1920 tttattttatcgtttttttttttttttttttgtttttttttttgcgttttttttttttcg1980 tgttacgtttttttttggttttgcgcgtttataaatttttgagtagaatacgagtttcgg2040 taaacgagtttcgtagttttttttgttgttttcgttggtttttgcggtttttgtttagat2100 attaacgttagacggcgatgtttttcgggtggtgattttagcgtaggaatttgaagaagc2160 gttttgttcgtcgttttatttggtagtttttttggtagcgggaggagttgaagggtaagg2220 gagggaaaattttattaaagcgatcggtttattcgattgttgattttttcgtttggcgtc2280 gcgttaggggagttagtttttttttagtcgggtttggttagttattgggcgtcgggtaga2340 tgtatatatatatatttttttttaattatagtaagtaagaagtggtagggcgcgtatcgg2400 ttgtcgttaagtgttgtttaatttagggagtcggggtttcgtttcgtttttttttcggtt2460 tttagagttttttggggttggagggtgggaggttaggggcgtttttatagttgtgtgttt2520 ttttttttattttgcgtagaatgattatgtgtagcggagcgaggttggttttgttggttt2580 atgggataattatgtatagtagcgtttatagtttatttgtcgtcgtcggatttcggtttt2640 tcgggattaggtaggtgttggttgtttggtttaagtaggagttggggttttttaggtata2700 gacgtttttttacggttttttttttgtagttttttgggtttagattattagtatcgtttt2760 ttgcgttttcggtgcgttttcgttagtttcggttggatagcgggtttttattttagtcga2820 gggtttggtaggtttcgcgattgttcggacgttttttttagttttaggtagtttagggtt2880 tcgggtagagttagtgagtttttggtcgttggagaatttttttttttttaattcggttta2940 taggatgggggtagggtacggtttttagtttggttttttttatttatttttgggacgagt3000 t 3001 <210> 58 <211> 3001 <212> DNA
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<223> chemically treated genomic DNA (Homo sapiens) <400> 58 aattcgttttaagaataggtaaaagaaattaagttaggggtcgtgttttgtttttatttt60 gtgggtcgggttgggggagggggggttttttagcggttagaagtttattggttttattcg120 ggattttgagttgtttagggttgggggaggcgttcgagtagtcgcggagtttgttagatt180 ttcggttagaatggggattcgttgtttagtcgaggttggcggaggcgtatcgggggcgta240 gagggcgatgttagtagtttggatttaaaggattgtaggaaggagatcgtgaggaagcgt300 ttgtgtttggggagttttagtttttgtttgggttaggtagttagtatttatttgatttcg360 gggaatcggagttcggcggcggtaggtgagttgtagacgttgttgtgtatgattatttta420 tagattagtagggttagtttcgtttcgttatatatggttattttgcgtaggatgggaaag480 aggatatatagttgtgagaacgtttttggttttttattttttaattttaaaaagttttgg540 aagtcgggggagggacggagcgaagtttcggttttttgagttgaatagtatttggcgata600 gtcggtgcgcgttttgttattttttgtttgttatagttagaaaaaaatatatatatatgt660 atttattcggcgtttaataattagttagattcggttgaaggaaagttaatttttttgacg720 cgacgttaagcgaaagaattagtagtcgagtgagtcggtcgttttggtaagatttttttt780 tttttattttttaatttttttcgttgttaggagagttgttaggtaggacggcgggtaaag840 cgtttttttaagtttttgcgttggagttattattcgagaggtatcgtcgtttggcgttgg900 tgtttgagtagaagtcgtaggaattagcgggagtagtaggaggagttgcgggattcgttt960 gtcgaggttcgtgttttgtttaaaagtttgtagacgcgtagaattaggagggagcgtgat1020 acggagagaagggggcgtagagagagaggtagaagaaagaaagagggggcgatgaggtga1080 agcgcggaggagtaaggtggtcgtaagtttattcggaggaagaagtaggcgattaaggga1140 aagagggaaagttagaaaagaaggggaggaaggtaagggagagggcgggcggttagttcg1200 tttttgtaggagtcgcgggttaggtagtcgcgagggtcggcggcgttttttttgtttcga1260 ggttttttcggttgtttttgaagttgcggtttttgttgttgttatcgttggttatagagg1320 tgatcggttttttgtttttatttatttgtgtagttcgtaaaaatttattcgaatatggtt1380 tttggagagt tttttttgtt aatatttgtt tgtttgttgt ttttaagtat agaatatttt 1440 gttgtattgt tgcgtttcga tttttattta tgaaatgatt tttttttttt tttttttagt 1500 tacgtaatga tcgggtatta gaaaaagacg ttagtatttt agttttttaa ggaatatatt 1560 aattattttgtgttgtttttttggatgataagattcggagttatcgattttttataaata1620 ttttttatttatataatttaatttttaagaagtttaattgttttgatggtttttaatttt1680 atttattttttaaggataggtaaagaatttttagaattttgaggatgataaaagttatgt1740 ttttaattatataattacgatttttttttatttttttattaagttttattaatcggagtt1800 ttggtttttggaattaagtattattaagtttttttattaataaatttaatttagattttt1860 taattttttgcgtatgtttttttagatagattattaaatgtggaagtcgttttgttttta1920 aagggaagttttggaggatttttagtaaattttttttgagtttggttgtcgttgatagta1980 gggttatgagtagattgatgagagtttatgttgttttcggagcgcggtttgcggagttgt2040 ttagatttcgggtgttgaagtgtagggtaatagatgttataaacgttgaaaattgttatc2100 ggtttaattttttattagagtttttaaatttgaagatttggtagtagtgttattaacgtg2160 gcgatttatcgttaaattatttttatcgtttagatatattttttttttttgtagcgttta2220 taaatgttttaatgttgagaatgttttttatttttgtttggatttgaggaaaaagtattt2280 tgtttttcgttagttttggtttttggatttttagatcggttgtttggttatttttatatt2340 ttttgtggtttttatagattttaaaaattgatgttgtgaaattgtgttttttataagaag2400 tgaaattttaagaattttggggtgagaaatatgtttttttattttgtttataattttagt2460 tttgtttgggagatatagatagattgggaaagtatgagggtttttagtataagtttattt2520 gatgaaggtttttaataggaatttttttgttggaaatagttaatttttttaattgaaaat2580 gatgtgggaagaggaaagtaataagggaagattatatttatttagaggtttttaattttt2640 tgggtaattgaagaaggtttatatatttttattttagtaagagaatttaggtttattttt2700 ttaaaaaaaaaaaaaagaagaagaagaaagaaagaaagaaaatagagttattaataatta2760 ttagagtgtattttaattatttggattttatataaaaattaggggaaattttagtttagt2820 gggagggttttttgttattacgatttggattttatatttaaataagttatattagttttg2880 tttgttttttttaagatattatatttttttttttaaatgttgtttttgtttttatttgag2940 atttaatatttttttttttttaaaaaaaaaattaagttttgtttatttttggttatgaat3000 g 3001 <210>

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<211>

<212>
DNA

<2l3>
Artificial Sequence <220>

<223> cally DNA (Homosapiens) chemi treated genomic <400> 60 tatttgatagatggtattagattttattatgagaagaaaataggtagatatgttaattat60 gatttttattaaaaggttttttttaataagtttatttagatatgttttagggattagtaa120 agttagatttttgttaagtgtaatagaaagatggatattttattttttgttagtgtagaa180 tggggttatgtatttggatagtcgttatagtagagatgttttaagggtaatttttttatt240 tatttggtttaggaagtaatatggaaggtagaagtgattgaagagttacgtataggtttt300 tttaatagaaga.atttggggttaaatgtattagttgtgtgtttttagttagttgttttag360 ttttttaatttttaattttttattaataaaatgggggaaagaagaagaatgaagaggaag420 aggagaaggaggttttaaagtttgtttgtgagtgttaatttgattttttgtgtaagtaga480 tatgtttttataatattttttttttttttttttttttttgagacggagtttcgttttgtg540 gtttaggcgggagtgtagtggcgtaatttcggtttattgtaagtttcgtttttagggttt600 acgttatttttttgttttagtttttcgagtagttgggattataggcgtttattattacgt660 tcggttaattttttttgtatttttagtagagacggggttttattatgttagttaggatgg720 tttcgattttttgatttcgtgattcgttcgtttcggttttttaaagtgttgggattataa780 gcgtgagttatcgcgttcggttttataatattttaagtgtttagtaaatttttgttatgt840 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<211>

<212>
DNA

<213>
Artificial Sequence <220>

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LA PRESENTE PARTIE DE CETTE DEMANDE OU CE BREVET COMPREND
PLUS D'UN TOME.

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VOLUME

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NOTE POUR LE TOME / VOLUME NOTE:

Claims (32)

Claims
1. A method for determining genetic and/or epigenetic parameters for the classification, differentiation and/or diagnosis of prostate tumours or the predisposition to prostate cancer by analysing cytosine methylations, characterised in that the following steps are carried out:
a) obtaining a biological sample containing genomic DNA
b) extracting the genomic DNA
c) in the genomic DNA sample, cytosine bases which are unmethylated at the 5-position are converted, by chemical treatment, to uracil or another base which is dissimilar to cytosine in terms of hybridisation behaviour; and d) amplifying at least one fragment of the chemically pretreated genomic DNA
using sets of primer oligonucleotides and a polymerase, wherein the genomic CpG sequences are located within at least one of the chemically pretreated genomic sequences according to Seq. ID No.1 to Seq. ID No.112, and sequences complementary thereto.
2. Method according to claim 1, further comprising the following steps:
e) Identification of the methylation status of one or more cytosine positions;
and f) Analysis of the methylation status of the cytosine positions by reference to one or more data sets.
3. Method according to claim 1 or 2, wherein the amplification of the fragments of the chemically pretreated genomic DNA using sets of primer oligonucleotides and a polymerase is performed in a way that the amplificates carry a detectable label.
4. Method according to any of claims 1 to 3, further comprising the steps of hybridising the amplificates to a least one or more oligonucleotide and/or PNA probe or to an array, wherein the base sequence of the oligomers includes at least one CpG dinucleotide.
5. Method according to any of claims 1 to 4, characterised in that the amplification step preferentially amplifies DNA which is of particularly interest in prostate cells, based on the specific genomic methylation status of prostate cells, as opposed to background DNA.
6. Method according to any of claims 1 to 5, characterised in that the chemical treatment is carried out by means of a solution of a bisulfite, hydrogen sulfite or disulfite.
7. Method according to any of claims 1 to 6, characterised in that more than ten different fragments having a length of 100 - 2000 base pairs are amplified.
8. Method according to any of claims 1 to 7, characterised in that the amplification of several DNA segments is carried out in one reaction vessel.
9. Method according to any of claims 1 to 8, characterised in that the polymerase is a heat-resistant DNA polymerase.
10. Method according to claim 9, characterised in that the amplification is carried out by means of the polymerase chain reaction (PCR).
11. Method according to any of claims 3 to 10, characterised in that the labels of the amplificates are fluorescence labels, radionuclides, and/or are detachable molecule fragments having a typical mass which are detected in a mass spectrometer.
12. Method according to any of claims 1 to 11, characterised in that the amplificates or fragments of the amplificates are detected in the mass spectrometer.
13. Method according to any of claims 3 to 12, characterised in that the produced fragments have a single positive or negative net charge for better detectability in the mass spectrometer.
14. Method according to any of claims 3 to 13, characterised in that detection is carried out and visualised by means of matrix assisted laser desorption/ionization mass spectrometry (MALDI) or using electron spray mass spectrometry (ESI).
15. Method according to any of claims 1 to 14, characterised in that the genomic DNA is obtained from cells or cellular components which contain DNA, sources of DNA
comprising, for example, cell lines, histological slides, biopsies, blood, lymphatic fluid, tissue embedded in paraffin; for example, prostate or lymphatic tissue and all possible combinations thereof.
16. An oligomer, in particular an oligonucleotide or peptide nucleic acid (PNA)-oligomer, said oligomer comprising in each case at least one base sequence having a length of at least 9 nucleotides which hybridises to or is identical to a chemically pretreated genomic DNA
according to one of the Seq ID Nos 1 to 112.
17. The oligomer as recited in Claim 16; wherein the base sequence includes at least one CpG
dinucleotide.
18. The oligomer as recited in Claim 17; characterised in that the cytosine of the CpG
dinucleotide is located approximately in the middle third of the oligomer.
19. A set of oligomers, comprising at least two oligomers according to any of claims 16 to 18.
20. A set of oligomers as recited in Claim 19, comprising oligomers for detecting the methylation state of all CpG dinucleotides within one of the sequences according to Seq. ID
Nos. 1 through 112, and sequences complementary thereto.
21. A set of at least two oligonucleotides as recited in Claim 19, which can be used as primer oligonucleotides for the amplification of DNA sequences of one of Seq. ID 1 through Seq. ID
112 and sequences complementary thereto and segments thereof.
22. A set of oligonucleotides as recited in Claim 21, characterised in that at least one oligonucleotide is bound to a solid phase.
23. Use of a set of oligomer probes comprising at least ten of the oligomers according to any of claims 19 through 22 for detecting the cytosine methylation state and/or single nucleotide polymorphisms (SNPs) in a chemically pretreated genomic DNA according to Seq.
ID No.1 to Seq. ID No.112 and sequences complementary thereto.
24. A method for manufacturing an arrangement of different oligomers (array) fixed to a carrier material for analysing diseases associated with the methylation state of the CpG
dinucleotides of one of the Seq. ID 1 through Seq. ID 112 and sequences complementary thereto , wherein at least one oligomer according to any of the claims 16 through 18 is coupled to a solid phase.
25. An arrangement of different oligomers (array) obtainable according to claim 24.
26. An array of different oligonucleotide- and/or PNA-oligomer sequences as recited in Claim 25, characterised in that these are arranged on a plane solid phase in the form of a rectangular or hexagonal lattice.
27. The array as recited in any of the Claims 25 or 26, characterised in that the solid phase surface is composed of silicon, glass, polystyrene, aluminium, steel, iron, copper, nickel, silver, or gold.
28. A nucleic acid comprising a sequence at least 18 bases in length of a segment of the chemically pretreated genomic DNA according to one of the sequences taken from the group of Seq. ID No.1 to Seq. ID No.112 and sequences complementary thereto.
29. A kit comprising a bisulfite (= disulfite, hydrogen sulfite) reagent as well as oligonucleotides and/or PNA-oligomers according to one of the Claims 16 through 22.
30. The kit of claim 29, wherein the additional standard methylation assay reagents are standard reagents for performing a methylation assay from the group consisting of MS-SNuPE, COBRA, and combinations thereof.
31. A DNA- and/or PNA-array for analysing prostate cell proliferative disorders, comprising at least one nucleic acid according to one of the preceding claims.
32. The use of a nucleic acid according to Claim 28, of an oligonucleotide or PNA-oligomer according to one of the Claims 16 through 18, of a kit according to Claims 29 to 30, of an array according to one of the Claims 25 through 27, of a set of oligonucleotides according to one of claims 19 through 22 for the classification, differentiation and/or diagnosis of prostate lesions or the predisposition to prostate carcinoma and/or for the therapy of prostate carcinoma.
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