CA2274741A1 - Utilisation d'un compose possedant une affinite pour le recepteur mitochondrial des benzodiazepines en therapie du cancer - Google Patents

Abstract

La présente invention concerne notamment un produit de combinaison comprenant au moins un composé possédant une affinité pour le récepteur mitochondrial des benzodiazépines, et au moins un agent inducteur de l'apoptose pour une utilisation simultanée, séparée ou étalée dans le temps, destiné au traitement du cancer. Un autre aspect de la présente invention porte sur l'utilisation dudit composé et/ou dudit produit de combinaison pour la fabrication d'un médicament notamment destiné à faciliter l'induction de l'apoptose.

Description

UTILISATION D'UN COMPOSE POSSÉDANT UNE AFFINITÉ POUR LE
RÉCEPTEUR MITOCHONDRIAL DES BENZODIAZEPINES
EN THÉRAPIE DU CANCER.
La présente invention concerne notamment un produit de combinaison comprenant au moins un composé possédant une afFnité pour le récepteur mitochondrial des benzodiazépines, et au moins un agent inducteur de l'apoptose pour une utilisation simultanée, séparée ou étalée dans le temps, destiné au traitement du cancer.
Un autre aspect de la présente invention porte sur l'utilisation dudit composé et/ou dudit produit de combinaison pour la fabrication d'un médicament destiné à faciliter L'induction de l'apoptose.
Les méthodes utilisées actuellement dans le traitement des cancers sont ~5 principalement la radiothérapie et la chimiothérapie. Ces techniques consistent à
éradiquer les cellules tumorales identifiées par le biais d'irradiations localisées ou par le biais d'inducteurs pharmacologiques de la mort cellulaire. Cependant, ces approches thérapeutiques ne sont pas spécifiques aux seules cellules tumorales. En etiet, les tissus avoisinants sont également éradiqués et une toxicité très élevée est constatée.
2o Considérant que les programmes naturels de la mort cellulaire (ou apoptose) et de la sénescence ne fonctionnent plus chez les cellules tumorales, une approche pour traiter le cancer pourrait résider dans le rétablissement de ces programmes.
De manière générale, l'apoptose se caractérise par trois phases : Une phase 25 d'initiation où les dit~'érents stimuli de mort empruntent des voies dites "privées" pour converger vers une phase efiectrice commune, qui conduit in fine à la phase dc dégradation caractérisée par les manifestations biochimiques caractéristiques dc la mort cellulaire. La phase et~èctrice est mise en aeuvre par le pore de transition dc pC1'llleablllte 1111tOChOlldr181e, véritable senseur de la mort cellulaire puisque ses 3o conformations ouvertes ou fermées déterminent le sol-t des cellules. Ces dif~ërentes

2 conformations peuvent être induites par de nombreux ligands des composants de ce pore de transition de perméabilité.
Le pore de transition de perméabilité mitochondriale, communément appelé
mega-canal ou canal à multiples conductances, participe dans la régulation du niveau de calcium dans la matrice, du pH, et du potentiel transmembranaire (~~I'm) dans les mitochondries. Ce pore (PT) fonctionne donc comme un canal dépendant de Ca2+, du voltage, du pH et du potentiel redox avec plusieurs niveaux de conductances et peu de sélectivité aux ions (Zoratti et al 1995, Kinnally et al 1996, Bernardi et al 1996, et to Ichas et al 1997). Récemment, il a été mis en évidence que l'ouverture du pore PT, qui est régulée par Bcl-2, est un événement critique dans le processus conduisant à
l'apoptose (Kroemer et al 1997a et 1997b). L'ouverture du pore PT permet la dissipation du potentiel transmembranaire interne mitochondrial ((0'l'~,), ce qui a pour conséquence de perturber l'intégrité de la membrane extérieure conduisant à la libération dcs protéines intermembranaires de la mitochondrie (Zamzami et al 1996, Susin et al 1997a, Kantrow et al 1997, et Ellerby et al 1997). En effet, la libération des protéines intramembranaires, telles que le cytochrome c, et/ou la dissipation du ~~i',"
sont les éléments communs de la phase précoce de l'apoptose (Kroemer et al 1997a et 1997b, Liu et al 1996, Kluck et al 1997, Yang 1997, et Susin et al 1997b). En fonction 2o du système expérimental et du type cellulaire, une augmentation du volume de la matrice cause soit une perturbation physique de la membrane mitrochondriale externe puis la dissipation du ~'i'm {Kluck et al 1997, Yang et al 1997, et Vander Heiden et al 1997), soit une perturbation de la membrane externe et la dissipation du ~'Y", de la membrane interne de manière simultanée (Zamzami et al 1996 et Susin et al 1996 a).
Sur le plan théorique, les auteurs, mentionnés supra, ont postulé que l'augmentation du volume de la matrice, qui précède la réduction du D'l'",, pourrait être contrôlée par l'ouverture du pore P'T. Dans ce sens, le pore l'T peut aussi bien opérer à un niveau de conductance faible et réversible (ce qui causerait une entrée d'ions et d'eau à l'intérieur de la matrice mitochondriale), qu'à un niveau de conductance élevée et irréversible (ce qui conduirait à la perturbation du ~~I'm).

3 Le pore PT est un complexe multiprotéique formé au site de contact entre les membranes internes et externes mitochondriales. On observe une co-localisation du pore I'T et de foncoprotéine Bcl-2 (De Jong et al 1994), La composition moléculaire s exacte de ce pore reste une énigme. Cependant, on sait que des protéines du cytosol (hexokinase), de la membrane externe (récepteur mitochondrial des benzodiazépines [rnBzR], la porine mitochondriale, communément appelée canal à anion voltage dépendent), l'espace intermembranaire (créatine kinase), la membrane interne (adénine nucléotide translocateur, ANT) et la matrice (cyclophiline D) sont impliquées dans la formation du pore PT etlou dans sa régulation (Zoratti et al, 1995, Beutner et al 1996, McEnery 1992, Kinnally et al 1993, 0'Gorman 1997). Le pore PT est régulé par de multiples effècteurs endogènes, ce qui est en accord avec sont architecture composite complexe. Parmi ces effecteurs, on trouve les ions locaux et le gradient de pI-i, l'ADP/ATP, le NADPH, et les molécules impliquées dans la transduction du signal ~ 5 apoptotique telles que Ca2+ ou des espèces réactives à l'oxygène. Ainsi, certaines des sous-unités du pore PT pourraient constituer des cibles pharmacologiques servant à
moduler l'apoptose.
Des composés appartenant à la famille des isoquinoline carboxamides ont été
2o décrit dans US 4,801,595 comme étant utile pour le traitement de l'hypertension.
Dans cet famille, PK 11195 ( 1-(2-chlorophényl)-N-méthyl-N-( 1-méthylpropyl)-3-isoquinoline carboxamide) est connu comme étant un ligand antagoniste prototypique du récepteur périphérique des benzodiazépines mBzR (Ripond et al 1991 et Joseph-Liauzun et al 1997). Plus particulièrement, WO 93/11771 concerne l'utilisation de 25 molécules tells que I'K 11 195 pour le traitement des maladies du système nerveux central, notamment Ics traumatismes.
Or, de manière surprenante, certains composés possédant une alïinité pour le récepteur mitochondrial des benzodiazépines permettent l'ouverture du pore de _so transition de perméabilité mitochondriale, et les expériences, qui ont conduit à la

4 présente invention, démontrent que PK11195 et les composés de formule II, III, IV, et V décrits ci-après permettent notamment de faciliter la mort cellulaire.
Actuellement la cancérothérapie consiste en l'utilisation de la radiothérapie, de la chimiothérapie, ou de leur combinaison. Ces deux méthodes possèdent des eiïèts secondaires néfastes très mal supportés par les patients. Ainsi l'utilisation d'agents pharmacologiques, visant à augmenter la susceptibilité des cellules tumorales à
l'induction de l'apoptose, est très avantageuse. En effet, elle permet l'utilisation de doses moins fortes de produits de chimio- ou radiothérapie, ce qui minimise leurs lo effets secondaires. Les composants ayant une forte affinité pour les sous-unités du pore PT, évoquées supra, sont l'objet de la présente invention car ils permettent de faciliter l'apoptose et donc d'utiliser des doses inférieures de produits à
fort ef~èts secondaires. Cela permet également d'améliorer l'efficacité de certains traitements.
~5 Ainsi, aucun document de l'art antérieur ne divulgue, ni ne suggère la présente invention telle que décrite ci-dessous.
Description de l'invention 2o Ainsi, la présente invention concerne un produit de combinaison comprenant au moins un composé possédant une a~nité sur le récepteur mitochondrial des benzodiazépines, et au moins un agent inducteur de l'apoptose pour une utilisation simultanée, séparée ou étalée dans le temps, destiné au traitement du cancer.
Le terme cancer est utilisé dans un sens large qui regroupe toute néoplasie (par 25 exemple les cancers, les sarcomes, les lyrnphomes et les leucémies).
I_cdit composé est sélectionné parmi plusieurs familles de molécules possédant une atlinité sur Ic récepteur mitochondrial (périphérique) des benzodiazépines, de préférence parmi les familles de formule générale I, 11, 111, IV, et V
décrites infra.

~ Dans la famille des isoquinolines on choisit en particulier les molécules de formule générale I
I

R~
~N~
w ~, N R 2 Rs

5 Dans laquelle Rl est un groupe alkyl inférieur de Cl-C6 ramifié ou linéaire, R2 est un groupe alkyl inférieur de Cl-C6 ramifié ou linéaire, R3 est un atome d'halogène tel que Cl, F, Br, I, et R4 est un atome d'hydrogène ou d'halogène, lo les groupes R1, R2, R3, R4 étant choisit indépendamment les uns des autres.
De manière avantageuse, ledit composé est le PK11195 (disponible dans le commerce chez SIGMA sous la référence C 0424) répondant à la formule suivante : 1-(2-chlorophényl)-N-méthyl-N-(1-méthylpropyl)-3-isoquinoline carboxamide.
IS
~CH3 ~~ , N H
y , N C I-I~
I C~ PK 11195

6 Ce composé a été décrit dans Ferry A.,1989, Fund. Clin. I'harmacol., 3, 383 et dans Uoble A. et al, 1985, Eur. J. Pharmacol., 119, 153.
~On choisit en particulier les molécules représentées par la formule II. Leurs formules et leurs procédés de préparation sont décrits dans EP 210 084A1, incorporé par référence dans la description.
~o II
V X-(CH2)n-(CH-R)m-CO-NR~R2 ~A
W B"
z dans laquelle A représente un atome d'azote ou un groupe CH, B représente un atome d'azote ou un groupe CH, V et W, identiques ou différents, représentent des atomes d'hydrogène ou d'halogène (fluor, chlore, brome), des groupes alkyle ou alcoxy comportant 1 à 3 atomes de carbone, des groupes vitro ou trifluorométhyle, Z est fixé en position ortho ou para par rapport à B et représente un radical phényle, thiényle, pyridyle, ou phényle substitué parun ou deux substituants pris parmi les 2o atomes d'halogène, les groupes alkyle et alcoxy comportant I à 4 atomes de carbone, les groupes trifluorométhyle ou vitro, la chaïne -X-(CHZ)"(CHR)"; CONR,RZ est fixée en position ortho ou para par rapport a 13, It représente un atome d'hydrog~ne ou un groupe alkylc: comportant I à 3 ato~t~cs de carbone, R, et RZ identiques ou dit~~rents, représentent un groupe alkyle linéaire ou ramitié
comportant 1 à 6 atomes de carbone, cycloalkyle comportant 3 à 6 atomes de carbone,

7 phényle, phénylalkyle ou cycloalkylalkyle dont la partie alkyle comporte 1 à 3 atomes de carbone et la partie cycloalkyle comporte 3 à 6 atomes de carbone, alcènyle comportant 3 à 6 atomes de carbone à condition due la double liaison ne soit pas située en position l, 2 par rapport à l'atome d'azote, a R, et R2 peuvent également former ensemble avec l'atome d'azote auquel ils sont rattachés un cycle pyrrolidine, pipéridine, morpholine ou thiomorpholine, X représente un groupe CH-R3, N-R.~, SO, S02 ou un atome d'oxygène ou de soufre, Rj représente un atome d'hydrogène ou un groupe alkyle comportant 1 à 3 atomes de carbone, lu R., représente un groupe alkyle comportant 1 à 3 atomes de carbone, m est égal à 0 ou 1, n est égal à 0, 1 ou 2, étant entendu que lorsque X représente un groupe SO, S02 ou N-R.,, la somme m + n est au moins égale à l, étant entendu que lorsque A et B représentent chacun un atome ~5 d'azote et Z est en position para par rapport à B, X ne peut pas représenter le groupe CH-R~, étant entendu que lorsque A représente un groupe CH, B représente un atome d'azote, Z est en position ortho par rapport à B, X représente un atome d'oxygène et R représente un atome d'hydrogène, le somme m+n est différente de I et à
l'exception du N,N-diméthylcarbamate de phényl-2 quinolyle-4.
2o autrement dit, les composés de formule (II) répondent à l'une des formules (IIa) ou (IIb)

8 X-(CH2)n-(CH-R)m-CO-NR~R2 V
~A
W B Z (II)a z V
~A
W B X-(CH2)n-(CH-R)m-CO-NR~R2 (IIb) dans lesquelles A, B, V, W, X, Z, R, R,, R2, n et m ont les significations mentionnées ci-dessus.
Ces composés se lient aux récepteurs des benzodiazépines du type périphérique (EP
210 084A1 page 11, ligne 9-10). Au titre de composés particulièrement intéressants, on peut notamment citer ceux décrits de page 11 ligne 25 à la page 13 ligne 21 de CP
210 084A1.
~ On choisit en particulier les molécules représentées par la formule III ci-dessous.
Leurs formules et leurs procédés de préparation sont décrits dans EP 248 734B
1, incorporé par référence dans la description.
ITI
CO-N~R~
X~

Hf Dans laquelle R, et R,' identiques ou ditiérents représentent des groupes alkyle à
chaîne linéaire ou ramifiée de C1-C4, cycloalkyle dont la partie alkyle comporte 1 à 3

9 atomes de carbone et la partie cycloalkyle comporte 3 à 6 atomes de carbone ou phényle, R, et It,' peuvent aussi former avec l'atome d'azote auquel ils sont rattachés un cycle pipéridine.
Ar représente un radical phényle, thiényle ou phényle substitué par un ou deux substituants choisis parmi les atomes d'halogène (fluor, chlore, brome), les groupes alkyle ou alcoxy comportant 1 à 4 atomes de carbone, nitro ou trifluorophényle, représente un des enchaW ements suivants cs, c, ~o, c, o Ces composés de formule III sont des ligands du récepteur périphérique (mitochondriale) des benzodiazépines (EP 248 734B 1 page 4 lignes 4G-54).
~ On choisit en particulier ceux appartenant à la formule IV ci-dessous. Leurs formules et leurs procédés de préparation sont décrits dans EP 112 77GB1, incorporé
5 par référence dans la description.
R~

v ~A Z
Y
IV

lo Dans laquelle R, est un groupe alkyle linéaire ou ramifié de CI-C6, un broupe phényle, un groupe cycloalkyle possédant de C3-C6, un groupe phénylalkyle ou cycloalkyle dans lequel le radical alkyle contient de C1-C3, ou un groupe ~ Ç R4 Dans lequel R; et R., sont des atomes d'hydrogène ou des groupes alkyle et R5 est un groupe alkényle ou alkynyle, la somme des atomes de carbone dans R3, R4, et RS
étant comprise entre 2 et 5, RZ est un groupe alkyle linéaire ou ramifié de C1-C6 , un groupe phenylalkyle ou lu cycloalkyle dans lequel le radical alkyl contient de Cl-C3, un groupe ~Ç R4 Dans lequel R~, R.,, et Rs sont définis comme ci-dessus, ou un groupe -n(H2C) N-H
15 Dans lequel n est 0, I, 2 ou 3, Rl et R2 pouvant former ensemble avec l'atome d'azote auquel ils sont rattachés un radical hétérocycle à 5, G ou 7 chaînons pouvant contenir un autre hétéroatome choisi parmi l'azote ct l'oxygène ct pouvant porter un ou deux substituants choisis parmi les groupes alkyle de CI-C3, hydroxy, oxo, hydroxyalkyle, diméthylaminoalkyle dont la partie alkyle est de Cl-C3, 2u Z est un groupe phényle, pyridyle, thienyle, 2-thiazolyle ou un groupe phényle substitué par un ou deux substituants choisis parmi les atomes d'halogène, les broupes alkyle, alkoxy, alkylthio en Cl-C3, le groupe trifluorométhyle, et le groupe nitro, X et Y sont identiques ou différents et sont des atomes d'hydrogène, halogène, des groupes alkyle ou alkoxy de C1-C3, des groupes vitro ou trifluorométhyle, A et B sont indépendamment l'un de l'autre des atomes d'azote ou des groupes CI-l, s Ou tout stéréoisomère de formule IV.
Parmi ces composés, ceux décrits dans les exemples 8, 10, 15-17, 18, 19-22, 37, 39, 43, et 51 de EP 112 776B 1 possèdent une affinité particulièrement élevée pour le récepteur mitochondriale des benzodiazépines (EP I 12 7768 1 page 21 ).
io ~On choisit en particulier les molécules de formule V. Leurs formules et leurs procédés de préparation sont décrit dans EP 094 271 B 1, incorporé par référence dans la description.
IS
V
B~ CO-N~ R~
I ~ ~R
~A 2 ~r ?e~ Dans laquelle, R, et Rx représentent indépcndarnrnent un troupe alkyle de C1-C6 linéaire ou ramifié, un groupe cycloalkyle de C3-C7, un groupe phénylalkyle ou cycloalkyle dont la partie alkyle est de C I-C3 ; Rr et R2 peuvent représenter également un groupe alcényle ou alcynyle de C2-C6 à condition que la double ou la triple liaison ne soit pas située en 2à position 1-2 par rapport à l'atome d'azote ; R, et R2 peuvent représenter un groupe de formule -R3-Z -R4 dans laquelle R3 est un groupe alkylène linéaire ou ramifié
de C2-C6 à condition qu'au moins deux atomes de carbone séparent l'atome d'azote du groupe Z ; R4 représente un groupe alkyle de CI-C4 et Z l'atome d'oxygène , de soufre ou le groupe N-R5, Rs représentant l'atome d'hydrogène ou un groupe alkyle de CI-C3 ; R1 et R2 peuvent former avec l'atome d'azote auquel ils sont rattachés un hétérocycle comprenant éventuellement un second hétéroatome.
Ar représente un groupe phényle, pyridyle, ou thienyle ou un groupe phényle substitué
par un ou deux substituants pris parmi les atomes d'halogène, les poupes alkyle, alcoxy et alkylthio de C1-C4, le groupe trifluorométhyle et le groupe vitro ;
A et B
I o sont indépendamment N ou CH.
a Représente l'enchaînement X
Y
Ou, lorsque A est N et B représente CH, l'un des enchaînements suivants S
C, C, S
IS
X, Y représente indépendamment l'atome d'hydrogène , halogène, un groupe alkyle ou alkoxy comprenant de Cl-C3, le troupe vitro ou trilluorométhyle.
Les propriétés pharmacologiques de ces composés sont décrits à la page I 1 colonne 2u 20 et à la page 12 colonne 21 de EP 094 271 B 1. On note la bonne affinité
pour le récepteur mitochondriale des benzodiazépines particulièrement pour les molécules des exemples I, 10, 16, 2S, 32, 35, et 47 de EP 094 271B1.
On désigne par agent inducteur de l'apoptose toute substance qui directement ou indirectement affecte la viabilité d'une cellule.
Ledit agent inducteur de l'apoptose de la présente invention peut être sélectionné
notamment parmi les agents qui endommagent l'ADN, les ligands du récepteur aux glucocorticoïdes, ou parmi les seconds messagers pro-apoptotiques.
Ces agents peuvent également être sélectionnés parmi ceux couramment employés dans le traitement du cancer. Ainsi, ledit second messager pro-apoptotique est sélectionné parmi les dérivés des glucocorticoïdes, parmi les agents alkylants tels que les moutardes à l'azote, par exemple la cyclophosphamide, les complexes de Platine, par exemple la cisplatine, les dérivés de l'éthylène-imine, de diméthane sulfonoxy-alkanes, les dérivés de la pipérazine, ~5 parmi les inhibiteurs des topoisomérases tels que les inhibiteurs de la topoisomérase-II, par exemple les anthracyclines, l'epipodophyllotoxine tel que l'étoposide, les inhibiteurs de la topoisomérase-I, par exemple les dérivés de la camptothecine, parmi les antimétabolites tels que les antifolates, par exemple le méthotrexate, les antipurines, par exemple la 6-mercaptopurine, les antipyrimidiques, par exemple la S-fluorouracile, 2o parmi les antimitotiques tels que les vinca-alcaloïdes, les taxoïdes tel que le taxol, taxotere, et parmi les cytolytiques divers tels que la bléomycine, la dacarbazine, l'hydroxycarbamide, l'asparaginase, la mitoguazone, la plicamycine.
Ces agents antinéoplastiques sont décrits dans Actualité Pharmaceutiques n°302 (Oct 1992) pages 38 à 39 et 41 à 43 incorporées dans la description par référence.
Uc préférCnce, on choisit ledit agent inducteur de l'apopcose parmi les radiations gamma, l'étoposide, la doxorubicine, la dexamethasone, la céramide telle que la ceramide C8, la lonidamine.

Certains desdits agents anticancéreux, sont plus particulièrement décrits dans US
5,260,327 qui concerne l'utilisation de la lonidamine pour traiter les métastases, dans JO 5017353 qui porte l'utilisation de la lonidamine en association avec d'autres agents anticancéreux, et dans EP 2911 S I , qui décrit l'utilisation des dérivés de la phlorizinc.
Ces documents sont incorporés dans la description par référence.
Le produit selon la présente invention peut également contenir un vecteur viral qui possède un gène qui code pour un enzyme qui permet d'activer les composés et/ou les agents susmentionnés, par exemple la thymidine kinase. Dans la famille de EP
415731, to on trouve de nombreux brevets portant sur l'utilisation de gènes suicides activés dans des tissus spécifiques. Parmi ces documents, incorporés dans la description par référence, on trouve : EP 494776, EP 690129, EP 657540, et EP 657541 qui concernent notamment la fabrication d'un médicament comprenant un vecteur qui possède un gène capable de catalyser le passage d'une pro-drogue en substance active.
~5 Plus particulièrement, EP 657539 a pour objet l'utilisation du gène de la thymidine kinase avec une spécificité cellulaires pour le traitement du cancer.
De mëme, le produit de la présente invention peut comporter en outre un ou plusieurs véhicules pharmaceutiquement acceptables.
Dans un autre aspect, la présente invention porte sur l'utilisation du produit précédemment décrit pour la fabrication d'un médicament destiné au traitement du cancer. En particulier, ledit médicament est destiné à induire la mort des cellules tumorales et/ou à faciliter l'apoptose.
L,a présente invention vise également l'utilisation d'un composé possédant une affinité
sur le récepteur mitochondrial des benzodiazépines pour la fabrication d'un médicament destiné au traitement du cancer, notamment pour faciliter l'induction de l'apoptose. De préférence on peut choisit d'utiliser un composé de la famille répondant à l'une des formules générales I, II, III, IV, et V décrit ci-dessus, de préférence un composé sélectionné parmi les molécules suivantes I-(2-chlorophényl)-N-méthyl-N-(1-méthylpropyl)-3-isoquinoline carboxamide (PK 1 1195), 5 N,N-diéthylcarbamate de phényl-3 naphtyle-1, N,N-diéthyl a-méthyl phényl-2 quinazoline-4 propanamide, N-méthyl N-phényl phényl-2 quinazoline-4 propanamide, N,N-diéthyl (nitro-4 phényl)-2 quinazoline-4 propanamide, N,N-diéthyl [(phényl-2 trifluorométhyl-8 quinolinyl-4) oxy]-2 propanamide, to N,N-diéthyl (méthoxy-3 phényl)-2 quinazoline-4 propanamide, N,N-diéthyl phényl-3 isoquinoléine-1 propanamide, N-méthyl N-(méthyl-1 propyl) phényl-7 benzo[b]thiophènecarboxamide-5, N,N-diéthyl phényl-3 naphtalènecarboxamide-1, Et N-méthyl N[méthyl-1 propyl] (chloro-2 phényl)-1 isoquinoléinecarboxamide-3, t5 pour la fabrication d'un tel médicament.
Bcl-2 est le représentant prototypique de la famille des oncogènes inhibiteurs de l'apoptose qui contribue à la fois à la genèse du cancer et qui est responsable des diffcultés pour éradiquer les tumeurs. La plupart des effets cytoprotecteurs de Bcl-2 2o peut être attribué à ses capacités à protéger l'intégrité des membranes mitochondriales (Boise et al 1997, Reed et al 1997). On a montré que bel-2 stabilise les membranes mitrochondriales dans différents modèles d'apoptose (Zamzarni et al 1995, et I~CCaUdFilrl Ct al 1997). Cependant, il semble que Bcl-2 ne parvienne pas à
inhiber l'apoptose dans certains cas, notamment l'apoptose induite par diamide et par activation de la caspase (Yasuhara et al 1997, Strasser et al 1995, et i-iuang et al 1997). L'efiet de Bcl-2 est également surmonté par un traitement avec un taxoïde, tel que le paclitaxel (taxol), un agent qui permet l'hyperphosphorylation de Bcl-2 (Haldar et al 1995 et 1996), et qui favorise l'ouverture du pore PT (Evtodienki et al 1996).

Ainsi, la présente invention propose une alternative pour surmonter la chimio-ou radiorésistance observée par la médiation par Bcl-2. Le traitement des cellules par un ligand de mBzR, rend la cytoprotection par Bcl-2 largement obsolète. ll existe une quasi-staechiométrie entre l'expression de Bcl-2 et celle de mBzR au moins en ce qui concerne les lignées cellulaires lymphoïdes (Carayon et al 1996). En outre, Bcl-2 protège les mitochondries isolées contre l'ouverture du pore PT induit par de faibles doses de protoporphyrine IX, un ligand de mBzR, et cette inhibition est supprimée par de fortes doses de protoporphyr-ine IX (Marchetti et al 1996a). Ceci suggère qu'une lU interaction fonctionnelle existe entre Bcl-2 et mBzR. En revanche, la protection contre l'ouverture du pore PT, contrôlée par Bcl-2, n'est pas surmontée par des doses croissantes des autres agents cibles du pore PT tels que l'atractyloside, un ligand du translocateur de l'adénine. Puisque la fixation de mBzR ne provoque pas de régulation négative de l'expression de Bcl-2 (Carayon et al 1996), il apparaît donc probable que ~ 5 des changements de conformation provenant de la fixation de PK 11 I 95 dans le complexe composé par mBzR et le pore PT at~ecte indirectement la stabilité de la membrane mictochondriale et surmonte ainsi la fonction anti-apoptotique de Bcl-2. En conséquence la fixation d'un composé possédant une affinité sur le récepteur mitochondrial des benzodiazépines, appartenant aux familles I, II, III, IV, et V, en ~o particulier le PK11195, représente une stratégie intéressante notamment pour vaincre la résistance à la chimiothérapie et à la radiothérapie.
Pour la suite de la description on se référera à la légende des figures présentées ci-dessous.
Lc~ envie l~i~;ure 1 . Synergisnte entre l'K11195 et Irl cérstmide pour l'induction de l'apoptose des thyrnocytes.

Les thymocytes ont été cultivés pendant 4 heures en présence de céramide CH
(25 y M), de diazépame ( 100 ~M), et/ou de PK 11195 ( 100 ~M).
Le graphique A représente le niveau d'apoptose avec en abscisse la perturbation du D
'Y", (déterminé par DiOC~) et en ordonnée la génération d'anion superoxide (déterminé
avec HE).
Le graphique B représente le niveau d'apoptose avec en abscisse l'exposition de la phosphatidylsérine à la surface de la membrane plasmique (mesuré avec FITC-annexine V) et en ordonnée la viabilité cellulaire (exclusion du bromure d'éthydium) (EthBr). Les nombres désignent les pourcentages de cellules trouvées dans chaque lU quadrant.
Figure 2 : l'KI 1195 facilite l'induction de l'apoptose dans les cellules T

dc la leucémie rüguë.
Les cellules ont cté cultivées avec 10 yM d'étoposide, 1 yM de dexaméthasone (DEX), de RU24858, de RU38486, et/ou avec 75 ~M de PK1 I 195 pendant soit 12 heures, soit 24 heures. Ce graphique représente la détermination de la fréquence de DiOCd (3)'°'" (HE->Eth)'°'", de Di0C6 (3)'~'' (HE->Eth)'"8" et des cellules hypoploïdes telles que décrites dans les exemples. Les astérisques indiquent une amélioration 2o sensible et significatif (p<0,01) de l'induction de l'apoptose par PK11195 comparée aux cultures contrôles (cultivées en l'absence de PK11195).
rigure 3 : PK11195 s'oppose rl la cytoprotection obtenue hnr la médiation dc Bcl-2 dans les hybridomes de cellules T.
La lignée cellulaire des hybridomes dc cellules T 284.11 transfectées de manière stable avec un vecteur SFFV.néo contenant 1e gène humain I3cl-2 (graphique B) ou contenant seulement le gène de résistance à la néomycine (néo) (graphique A) ont été
cultivées pendant 12 heures en présence de dexaméthasone ( 1 yM), de PK 11 195 (SO y 3o M) ou de diazépame (50 y.M), et les caractères associés à l'apoptose, mentionnés supra, ont été déterminés. Les nombres dans les cercles en noir indiquent la fréquence des cellules sous-diploïdes. L'effet synergique de PKI 1195 + DEX est très significatif (p<0,01 ) comparé aux contrôles (traitement avec DEX ou PK 11195 seulement).
Des résultats similaires ont été obtenus lorsque l'on remplace la dexaméthasone par S l'étoposide comme inducteur de l'apoptose.
rigure 4 : PK11195 améliore la susceptibilité à l'apoptose dans les cellules B
WEHI 231 leucémiques qui surexpriment Bcl-2.
lo Les cellules WEHI 231, soit transfectées avec le vecteur néomycine contrôle (néo, graphique A), soit transfectées par un vecteur contenant le gène Bcl-2 humain (graphique B) ont été traitées par irradiation y, avec la doxorubicine (doxo), la cyclosporine A (CsA), seule ou en combinaison avec PK11195 (40 ~M) ou avec diazépame (40 ~M). Ces graphiques montrent la détermination par cytométrie de flux ~5 des paramètres de l'apoptose indiqués. Les astérisques montrent un effet significatif (p<0,001) de PK11195.
PK11195 fs~cilitc l'induction de l'apoptose par une variété de stimuli.
20 PK 1 I 195 est le ligand antagoniste prototypique du récepteur mitochondrial des benzodiazépines mBzR (Ripond et al 1991 et Joseph-Liauzun et al 1997).
Jusqu'aux doses de 50 à 100 ~tM, PK11195 ne montre pas d'effet toxique sur divers types cellulaires comprenant notamment les thymocytes (voir figure 1), la cellule T

de la leucémie aiguë (voir figure 2), les hybridomes des cellules T 2B4.11 (voir figure 25 3), et les cellules B WEI-11231 leucémiques (voir figure 4). Les résultats des expériences menées lors de la présente invention démontrent que le céramide C8, qui par lUl-Illl.nle rl'ItldUlt pas l'apoptose des thyrnocytcs (à une dose de 25 yM), devient apoptogénique en présence de PK 1 1195. En revanche, le diazépame, un agoniste agissant sur le récepteur central mitochondrial des benzodiazépines ne possède aucun 3o efièt important apoptogénique (voir figures l, 3 et 4). Parmi les diftërents ligands de mBzR qui ont été testés, PK11195 apparaît comme étant le plus efficace des co-inducteurs de l'apoptose (effcacité relative : PK11195 supérieur à 4'-chlordiazépame >
diazépame > Ro-5-4864), ce résultat corrèle avec le potentiel antagoniste de ces composés sur le récepteur mBzR (Zisterer et al 1997).
Les eflèts synergiques observés avec PK11195 s'étendent à une variété de différents inducteurs de l'apoptose, notamment avec l'inhibiteur de la topoisomérase 11 (étoposide, voir figure 2), irradiation y (voir figure 4), l'agent intercalant doxorubicine (voir figure 4), et en ce qui concerne les cellules WEHI231, la cyclosporine A
(voir (bure 4). En outre, PK11195 (mais pas le diazépame), facilite l'induction de l'apoptose par les agonistes du récepteur glucocorticoïde (qui comprennent la dexaméthasone et le RU24858, (voir figure 2). En revanche, aucun effet n'a été mis en évidence lors de l'utilisation de RU38486 et de PK11195 simultanément.
Ainsi PK11195 facilite l'induction de l'apoptose en réponse à une très large variété de substances et dans de nombreux types cellulaires différents, notamment dans les lignées cellulaires primaires et transformées d'origine humaine et mucine (voir figures 2 à 4).
PK11195 f:~citite l'induction des changements mitochondris~ux et post-mitochondrianx associés avec l's~poptose 2o Le synergisme entre PK 11195 et plusieurs agents pro-apoptotiques s'étend pour tout ce qui caractérise le phénomène de l'apoptose. Ces phénomènes comprennent la perte précoce du potentiel transmembranaire mitochondrial (mesuré à
l'aide du colorant Di0C6(3) sensible au potentiel), l'augmentation de la génération d'espèces réactives à l'oxygène (mesuré par la conversion d'hydroéthidine en éthidine catalysée par les anions superoxides (voir figures 1 à 4), l'exposition éradique des résidues phosphatidylsérines à la surface de la membrane plasmique mesurée à
l'aide l'annexine V conjuguée à FITC (voir figure 1 ), et la fragmentation de l'ADN
nucléaire (hypoploïdie déterminée par la coloration à l'iodure de propidium des cellules fixées dans l'éthanol (voir figures 1 à 4). Les techniques expérimentales, évoquées supra, sont ZO
décrites plus en détail dans Marchetti et al, 1996a, Kroemer et al, 1997a et 1997b, et Zazami et al, 1996, incorporées dans la présente description par référence.
l'K11195 permet de surmonter l'inhibition de l'apoptose contrôlée pnr 13c1-2 dans plusieurs lignées cellul:~ircs différentes.
Bcl-2 possède des effets cytoprotecteurs grâce à son large spectre d'action (Kroemer et al 1997b, et Decaudain et al 1997). Ainsi, la surexpression de Bcl-empêche de manière très significative la perturbation de ~'I'm, la production d'anions to superoxides, et l'apoptose nucléaire induite par la dexaméthasone dans les hybridomes de cellules T (voir fil;ure 3). Le traitement simultané avec PK11195 et un abent apoptogénique montre un effet hyperadditif facilitant l'apoptose même en présence de Bcl-2. Ainsi, PK11195 permet de restaurer l'induction de l'apoptose dans les cellules surexprimant Bcl-2 au moins partiellement. Cet effet a été observé dans deux types IS cellulaires différents appelés hybridomes de cellules T 2B4.11 (voir figure 3B) et les cellules B WEHI231 leucémiques (voir figure 4B).
PK11195 permet de surmonter la protection conférée par Bcl-2 contre les glucocorticoïdes (voir figure 3B), contre l'irradiation y, la doxorubicine, la 2o cyclosporine A (voir figure 4B), et fétoposide. Cet effet est également observé au niveau du mitochondrion, du potentiel redox cellulaire, et du noyaux (voir figures 3 et 4). Ainsi, la présente invention concerne une nouvelle stratégie pour améliorer la susceptibilité des cellules par l'induction de fapoptose. Les composés de la famille des isoquinoline carboxamides, en particulier un ligand antagoniste spécifique du récepteur 25 mitochondrial au benzodiazépine (PK11195), facilite l'induction de perturbation de 0'f ," par divers effecteurs apoptotiques, notamment l'endommagement de l'ADN
(irradiation Y, étoposide, doxorubicine), la fixation de ligands sur le récepteur glucocorticoïde (dexaméthasone, RU24858), et les second messagers pro-apoptotiques du type céramide, tel que la céramide C8. De manière concomitante, les .so composés de la famille isoquinoline carboxamide améliore l'induction des signaux classiques de l'apoptose telle que l'exposition de la phosphatidylsérine à la surface des cellules et la fragmentation de l'ADN nucléaire. I1 a été démontré due le récepteur rnitochondrial au benzodiazépine interagit avec de nombreuses protéines impliquées dans la formation et/ou dans la régulation du pore PT (McEnery et al 1992 et Kinnally et al 1993). En outre, le PK11195 facilite l'ouverture du pore PT induit par un facteur de nécrose de tumeurs (TNF-a) dans les cellules L929 (Pastorino et al 1996).
Dans ce modèle, TNF induit la nécrose (Schulze-Osthoff et al 1994) et l'induction de la nécrose est améliorée par PK11195. En revanche, la présente invention montre que permet de faciliter l'induction de l'apoptose, ce dui corrèle avec l'induction de la lo dissipation de 0'~'m contrôlée par le pore PT. Ces résultats suggèrent que l'ouverture du pore PT pourrait être l'étape limitante de n'importe quelle mort cellulaire (apoptose et nécrose), (Kroemer et al 1997a), et que les événement post-mitochondriaux se terminent par l'activation des enzymes cataboliques (caspases, protéases autres due les caspases, et nucléases) et/ou que la disponibilité d'ATP extramitochondrial dirige la ~5 modalité de la mort cellulaire (Hirsch et al 1997, Leist et al 1997, et Nicotera et al 1997).
Ainsi, les résultats des expériences, mises en oeuvre lors de la présente invention, démontrent la forte association entre les mitochondries, le potentiel redox, 20 la membrane plasmique et les caractéristiques de l'apoptose, et démontrent que PK11195 agit sur une cible mitochondriale afin de faciliter l'induction de fapoptose.
Cette nouvelle propriété des composés de la famille des isoduinoline carboxamides représente une opportunité pour vaincre la résistance à la chimiothérapie et à
la radiothérapie et notamment pour faciliter l'induction de la mort cellulaire.
t~,xcm~~le 1 : Cctlules et cultures cellulaires Les lignées cellulaires des hybridomes de thymocytes provenant de souris Balb/c pées de 4 à 6 semaines et des cellules T 2B4. I 1 ont été transfectées avec le vecteur SFFV.néo contenant le gène humain bel-2 ou seulement le gène de résistance à
la néomycine (néo) (Green et al 1994). Les cellules B WEHI231 leucémiques ont été

transfectées avec le gène humain bcl-2 ou avec un vecteur néo contrôle (Cuende et al 1993) et les cellules T CEM-C7.H2 humaines de la leucémie lymphoblastique (Strasser-Wozak, 1995) ont été cultivées dans RPMI 1640 contenant 10% FCS, des antibiotiques, et la L-glutamine.
Exemple 2 : Induction de l'~noptose Les cellules susmentionnées (S-10 x lOs/ml) ont été cultivées en présence de la quantité indiquée du PK11195, de la diazépame (Sigma), de la dexaméthazone (1 ~tM, Sigma), de RU248S8 (l~tM, Roussel Uclafj, de l'antagoniste RU38486 du récepteur to glucocorticoïde (llrM, Roussel Uclafj, de la doxorubicine (l~g/ml, Pharmacia), de l'étoposide ( 10 yM/ml, Sigma), de la cytosine arabinoside ( 10 yg/ml, Upjohn), de la cyclosporine A (10 yM, Sandoz), de la céramide C8 (2S yM, Biomol, Plymouth Meeting, PA), ou du traitement par irradiation y ( 10 Gy). Après les intervalles indiqués, on a récupéré les cellules, et on a testé les caractéristiques associées à
1 S l'apoptose.
Exemple 3 : Quantification des narrimètres associés ~ l'anoptose par cYtométrie de il«x.
En suivant les protocoles publiés (Marchetti et al 1996b, Zamzami et al 1995, 2o Kroemer et al 1997c), les fluorochromes suivants ont été utilisés afin de déterminer les différents changements associés à l'apoptose - 3,3' dihexyloxacarbocyanine iodide (Di0C6, 20nM, Bernadi et al 1996) pour la détermination de ~'I'", - hydroéthidine (HE, 4 yM) pour la détermination la génération d'anion superoxyde 25 - Annexine V conjuguée avec FITC (lyg/ml, Nexins Research, I-ioeven, The Nctherlands) pour la détermination de l'exposition dc la phosphatidylsérine (PS) sur la membrane plasmique externe.
- Iodure de propidium (Pl) pour la coloration des cellules perrnéabilisées à
l'éthanol afin de déterminer la fréquence des cellules hypoploïdes.

Toutes les expériences ont été réalisées au moins trois fois et conduisent à
des résultats similaires. Les résultats typiques obtenus sont montrés aux différentes figures.
La signification statistidue des résultats a été calculée en utilisant le test de student.
Exemple 4: Procédé de nrénaration de N,N-diéthylc:~rbam:~te de nhénYl3 nanhtvle-1.
On chauffe au reflux pendant 4 heures, 3,15 g de phényl-3 naphtol-1, 1,95 g de chlorure de N,N-diéthyl carbamoyle, 1,45 g de triéthylamine et 0,035 g de diméthylamino-4 pyridine dans 37 cm3 de tétrahydrofuranne. On ajoute 0,4 g de to chlorure de N,N-diéthylcarbamoyle, chauffe encore 2 heures puis refroidit à
température ambiante (environ 20°C), élimine le précipité par filtration et évapore le filtrat sous pression réduite. Le résidu obtenu est chromatographié sur du gel de silice en utilisant comme éluant un mélange cyclohexane-acétate d'éthyle (80-20 en volume).
Après recristallisation du résidu dans un mélange éther isopropylique-éther de pétrole (1-1 en volume), on isole 2,94 g de N,N-diéthylcarbamate de phényl-3 naphtyle-fondant à 74°C (EP 210084A1, exemple 63, page 61, lignes 19-31).
Exemple 5 : Procédé de nréns~ration de N,N-diéthy! a méthyl nhényl 2 nuinazoline-4 nron~n~mide 2o On ajoute, sous azote, 3 g de carbonyldümidazole à une suspension de 2,67 g d'acide a-méthyl phényl-2 quinazoline-4 propanoïque dans 30 cm3 de tétrahydrofuranne anhydre. Après 2 heures d'agitation, on ajoute 6 cm3 de diéthylamine et agite encore 4 heures. On ajoute 150 cm3 d'eau et 100 cm3 d'acétate d'éthyle. On décante, extrait la phase aqueuse avec 2 fois 100 cm3 d'acétate d'éthyle, sèche la phase organique sur du sulfate de magnésium et l'évapore à sec. On chromatographie le résidu sur du gel de silice, une premiére fois avec un mélange cyclohexane-acétate d'éthyle (1-1 en volume), puis une deuxième fois avec un mélange cyclohexane-acétate d'éthyle (8-2 en volume).
Après recristallisation dans de l'éther isopropylique on obtient 1 g de N,N-diéthyl a 3o méthyl phényl-2 quinazoline-4 propanamide fondant à 124°C.

L'acide oc-méthyl phényl-2 quinazoline-4 propanoïque est préparé selon le procédé
suivant On porte 3 heures à 90°C un mélange de 15 g de méthyl-4 phényl-2 quinazoline, de 13,3 g de N-bromosuccinimide et de 1,65 g de peroxyde de benzoyle s dans 1 SO cm3 de tétrachlorure de carbone. On filtre, évapore le filtrat et chromatographie le résidu sur du gel de silice avec un mélange cyclohexane-acétate d'éthyle (9-1 en volume) comme éluant. On obtient 11 g de bromométhyl-4 phényl-quinazoline fondant à 110°C.
A 4 g d'hydrure de sodium à 80 % dans l'huile et 60 cm3 de tétrahydrofuranne m anhydre, sous azote, on ajoute une solution de 23 g de méthylmalonate de diéthyle dans 100 cm3 de tétrahydrofuranne anhydre. Après 1 heure d'agitation, on ajoute une solution de 9,9 g de bromométhyl-4 phényl-2 quinazoline dans 100 cm3 de tétrahydrofuranne anhydre et agite encore 2 heures à la température ambiante (20°C
environ). On ajoute 100 cm3 d'eau et extrait avec 3 fois 100 cm3 d'acétate d'éthyle.
15 On sèche la phase organique sur du sulfate de magnésium puis l'évapore à
sec sous pression réduite. On reprend le résidu dans 100 cm3 d'acide chlorhydrique concentré
et 100 cm3 d'acide acétique et porte l'ensemble à 110°C pendant 24 heures. Après refroidissement, on filtre le précipité, le lave à l'eau puis à l'éther isopropylique. Après séchage on obtient 4 g d'acide a-méthyl phényl-2 quinazoline-4 propanoïque fondant à
2u 180°C (EP 210084A1, exemple 7, page 20, linges 6-14).
La méthyl-4 phényl-2 quinazoline peut être obtenue selon W.L.F.
ARMAREGO, Fused pyrimidines, quinazolines Part. I, p. 39, Intersciences Publishers (1967), incorporé dans la description par référence.
25 rxcrnnle G : Procédé dc t~r~nnrntion dc N-rnéthyl N-phénol phénol-2 quinrryolinc-4 t~ronsmamidc.
On opère comme à l'exemple S à partir de 1,95 g d'acide phényl-2 quinazoline-4 propanoïque, de 1,36 g de carbonyldümidazole et de 3 cm3 de N-méthylaniline dans 40 cm3 de tétrahydrofuranne anhydre. Après purification par chromatographie sur du u gel de silice avec l'acétate d'éthyle comme éluant et recristallisation dans un mélange acétate d'éthyle-éther isopropylique (1-5 en volume), on obtient 0,63 g de N-méthyl N-phényl phényl-2 quinazoline-4 propanamide fondant à 116°C.
L'acide phényl-2 quinazoline-4 propanoïque est préparé selon le procédé
suivant Sous azote, on place 5,4 g d'hydrure de sodium à 80 % dans l'huile avec 250 5 cm3 de tétrahydrofuranne anhydre puis, en refroidissant vers 5°C on ajoute 25,6 g de malonate de diéthyle. Lorsque le dégagement d'hydrogène a cessé, on ajoute une solution de 23,9 g de bromométhyl-4 phényl-2 quinazoline dans 100 cm3 de tétrahydrofuranne anhydre. Après 1 heure d'agitation à la température ambiante (20°C
environ), on ajoute 25 cm3 d'acide acétique, évapore le solvant sous pression réduite et reprend le résidu dans 150 cm3 d'acide chlorhydrique concentré et 150 cm3 d'acide acétique. On porte l'ensemble à 120°C pendant I S heures, évapore de nouveau, ajoute 200 cm3 d'eau, 150 cm3 d'éther éthylique et alcalinise à pH I1 avec une lessive d'hydroxyde de sodium. On décante la phase organique et lave la solution aqueuse avec 2 fois 100 cm3 d'éther éthylique. On ajuste la phase aqueuse à pH 4 et l'extrait t s avec 2 fois 100 cm3 d'acétate d'éthyle. On sèche la phase organique sur du sulfate de magnésium et l'évapore à sec sous pression réduite. On cristallise le résidu dans l'acétate d'éthyle. On obtient 9 g d'acide phényl-2 quinazoline-4 propanoïque fondant à 159°C (EP 210084A1, exemple 8 ; page 21, L15 à p.22, 1.1 l ensemble p.20, 1.6-14).
Exemple 7 Procédé de nrénoration de N,N-diéthyl (vitro-4 nhényl)-2 2o ctuinsrzoline-4 nron:rnamide.
On opère comme à l'exemple 5 à partir de 1,35 g d'acide (vitro-4 phényl)-2 quinazoline-4 propanoïque, de 0,82 g de carbonyldümidazole et de 0,9 cm3 de diéthylamine dans 20 cm3 de tétrahydrofuranne anhydre. Après chromatographie sur du gel de silice avec l'acétate d'éthyle comme éluant et recristallisation dans l'acétate 2i d'c;thyle, on obtient 0,35 g de N,N-diéthyl (vitro-4 phényl)-2 quinazoline-propanamidc fondant à 168°C.
L'acide (vitro-4 phényl)-2 quinazoline-4 propanoïque est préparé selon le procédé
suivant (EP 210084A1, exemple 11 ; p.23,1.20-p.24,1.24 ensemble p.20, 1,6-14) On porte au reflux pendant 3 heures un mélange de 3,34 g d'acide para-nitrobenzoïque et de 20 cm3 de chlorure de thionyle. On élimine l'excès de chlorure de thionyle par évaporation sous pression réduite et on ajoute au produit résiduel 20 cm3 de chloroforme, 5,5 cm3 de triéthylamine et 2,21 g d'(amino-2 benzoyl)-3 propionate d'éthyle. On agite à la température ambiante (environ 20°C) pendant 2 heures. On élimine le solvant sous pression réduite, reprend le résidu dans 50 cm3 d'acétate d'éthyle, filtre et concentre le filtrat à sec. Le produit résiduel est mis en contact avec 20 g d'acétate d'ammonium et porté à 150°C pendant 6 heures. Après refroidissement, on ajoute 250 cm3 d'eau et extrait avec 4 fois 100 cm3 d'acétate d'éthyle. On lave la phase organique avec 2 fois 100 cm3 d'une solution d'hydroxyde de sodium N et cm3 d'eau. On sèche la phase organique sur du sulfate de magnésium, la filtre et l'évapore à sec sous pression réduite. On obtient 2,8 g de produit que l'on met en contact avec 50 cm3 d'éthanol et 2,5 cm3 d'une solution concentrée d'hydroxyde de sodium. Après 30 minutes à la température ambiante, on élimine l'éthanol par t5 évaporation sous pression réduite et ajoute 200 cm3 d'eau. On lave la phase aqueuse avec 3 fois 50 cm3 d'éther éthylique, on l'acidifie à pH I et filtre le précipité formé.
Après lavage à l'eau, au chlorure de méthylène et séchage, on obtient 1,4 g d'acide (nitro-4 phényl)-2 quinazoline-4 propanoïque dont le spectre de RMN du proton dans le diméthylsulfoxyde deutérié a les caractéristiques suivantes 2o Ar-CH2 8 : 3,7 ppm -~2-COOH 8 : 3 ppm H aromatiques en méta du N02 8 : 8,4 ppm H aromatiques en ortho du N02 S : 8,9 ppm Autres H aromatiques de 7,7 à 8,4 ppm 2.5 I:xemnle 8 : Procédé dc t~r~t~nrntion de N,N-diéthyl f(t~llén~l-2 tritluorométhyl-8 nuinolinyl-4) oxyj-2 t~ropansrmidç.
On porte , 9 heures, à ébullition un mélange de 6 g de phényl-2 trifluorométhyl-8 quinolinol-4, de 4,76 g de N,N-diéthyl bromo-2 propanamide et de 6 g de carbonate de potassium dans 400 cm3 de métylcétone. Après refroidissement, on filtre et évapore le filtrat à sec sous pression réduite. On extrait le résidu avec un mélange cyclohexane-acétate d'éthyle (par exemple 7-3 en volume) à
60°C, filtre l'insoluble et évapore le filtrat sous pression réduite. On chromatographie le solide résiduel sur du bel de silice avec un mélange cyclohexane-acétate d'éthyle (par exemple 7-3 en volume) comme éluant. Après recristallisation du résidu dans un mélange acétate d'éthyle-éther isopropylique (1-4 en volume), on isole 3 g de N,N-diéthyl [(phényl-2 trifluorométhyl-8 quinolinyl-4) oxy]-2 propanamide fondant à
146°C.
to La phényl-2 trifluorométhyl-8 hydroxy-4 quinoléine peut être préparé par action à 140 °C de benzoylacétate d'éthyle (0,12 mole) sur la trifluorométhyl-2 aniline (0,12 mole) cn présence d'acide polyphosphoriqu (86 g). Elle présente un point de fusion égal à
136°C ; (EP 210084A1, exemple 84 ; p.72, 1.28 à p.73, 1.9 ensemble p.55, I.1-)4).
Excrnnlc 9 : Procédé de nrénaration dc N,N-diéthyl ~méthoxy-3 nhényl)-2 IS nuinnxolinc-4 prot~nn:rmide.
Un mélange de 1,2 g de (méthoxy-3 phényl)-2 quinazoline-4 propionate d'éthyle et de 30 em3 de diéthylamine est chauffé à 250°C pendant 40 heures. Après refroidissement, l'excès de diéthylamine est évaporé. Le résidu est chromatographié
sur du gel de silice avec un mélange cyclohexane-acétate d'éthyle (1-1 en volume) 2o comme éluant. Le produit récupéré est recristallisé dans de l'éther isopropylique. On obtient 0,36 g de N,N-diéthyl (méthoxy-3 phényl)-2 quinazoline-4 propanamide qui fond à 87°C.
Le (méthoxy-3 phényl)-2 quinazoline-4 propionate d'éthyle est préparé selon le procédé suivant 25 On agite 17 heures à la température ambiante (20°C environ) 26,7 g d'acide (amino-2 benzoyl)-3 propionique et 25 cm3 d'acide sulfurique concentré dans 250 cm3 d'éthanol absolu. On évapore l'éthanol sous pression réduite, ajoute 200 cm3 d'eau, 200 cm3 d'acétate d'éthyle et du carbonate de potassium jusqu'à pH 8.
On filtre, décante et réextrait la phase aqueuse avec 2 fois 100 cm3 d'acctate d'cthyle. La phase organique est séchée sur sulfate de magnésium, filtrce et évaporée u sec sous pression réduite. On obtient 24,8 g d'(amino-2 bcn-royl)-3 propionatc d'éthyle sous fàrmc d'Iwilc. Lc spectre RMN du proton, dans lc clrloroforrne dcutéric présente Ics caractéristiques suivantes Chl2- .hl, b : 1,2 ppm .I-Ii-COOC~f-Is ô : 2,8ppm ~Z-Cf-I3 b : 4,2 ppm 1-16 b : 7,9 ppm Ar-CO-~2- b : 3,3 ppm 1-fa ô : 7,3 ppm NHi b : 5,7 ppm Hl et Hs b : 6,7 ppm to A 2,21 g d'(amino-2 benzoyl)-3 propionate d'éthyle et 4,2 cm3 de triéthylamine dans 25 cm3 de chloroforme on ajoute, à 5°C, 2,81 crn3 de chlorure de méthoxy-3 bcnzoylc. On laisse 1 heure à la température ambiante (cnvrion 20°C), ajoute 25 cm3 d'eau et décante. On cvapore la phase organique sous pression réduite et reprend !e résidu avec 17 g d'acétate d'ammonium. On porte l'ensemble à
100°C
IS pendant 7 heures puis évapore l'acide acétique formé sous pression réduite.
On verse le résidu sur 100 cm3 d'eau et extrait la phase aqueuse avec 3 fois 50 crn3 d'acétate d'cthylc. On sèche la phase aqueuse sur sulfate de magnésium, la filtre ct l'évapore à
sec sous pression réduite. On chromatographie le produit résiduel sur du gel de silice avec un mélange cyclohexane-acétate d'éthyle (1-1 en volume) comme éluant.
Après 2tt recristallisation dans l'éthanol on obtient 1,5 g de (rttcthoxy-3 phényl)-2 quinazoline-4 propionate d'éthyle fondant n 70°C ; (CP 210084A1, exemple 2 ; p.14, 1.1 I-19 ensemble p.13,1.33-p.14, 1.10 ).
L'acide (amino-2 bcnzoyl)-3 propioniquc peut ctrc préparé selon D.L.
R1VE'I"I' ct coll., trust. J. Chcm., 24, 2717 (1971), incorporel dans la description par 25 rélërcncc.
hxcmplc 10 : l'rocéclé tlc prétotr:Uion dc N,N-cfictltyl ttltéayl-3 ivo~ninolEirrc-1 prottan:nnicic.

On opère comme à l'exemple 9 à partir dc G,1 g dc phényl-3 isoquinoléinc-1 propionatc d'éthyle ct dc 30 cm3 de diéthylamine. Lc produit brut est purifié
au moyen dc 4 chrornatographics successives sur ciu gel de silice en utilisant un mélange cyclolrexane-acétate d'éthyle (7-3 en volume) comme Gluant. On obtient 1,4 g de N,N-diéthyl plrényl-3 isoquinoléinc-1 propanamidc fondant à 58°C.
Lc phényl-3 isoquinoléinc-1 propionatc d'éthyle est préparé selon lc procédé
suivant On porte ~ l'ébullition, 48 heures, un mélange de 21 g de méthyl-1 phényl-3 isoquinoléine, de 30,6 g de N-bromosuccinimide et de 1 g de peroxyde de benzoylc dans 730 cm3 de tétrachlorure de carbone. Après refroidissement, on filtre et cvapore tu Ie ültrat à sec sous pression réduite. On chromatographie le résidu sur du gel de silice avec un mélange toluène-méthanol (98-2 en volume) comme éluant. Après cristallisation dans l'éther isopropylique on obtient 11 5 dc bromométhyl-1 phényl-3 isoquinoléinc fondant à 84°C.
Sous azote, on place G,5 g d'hydrure de sodium à 80 % dans l'huile avec 160 crn3 de tétrahydrofirrannc, on ajoute, goutte à goutte, une solution de 34,9 g dc malonatc dc diéthylc dans 200 cm3 dc tétrahydrofuranne anhydre. Après 1 heure d'agitation ~ la température ambiante (20°C environ), on ajoute une solution dc IG,2 g dc bromornéthyl-1 phényl-3 isoquinoléine dans 200 cm3 de tétrahydrofurannc anhydre.
Après 20 heures d'agitation à 20°C on ajoute 200 cm3 d'eau ct extrait la phase 2u aqueuse ~ l'acétate d'éthyle. On sèche la phase organique et l'évapore ~
sec sous pression réduite. On chromatographie Ie produit résiduel sur du gel de silice avec un mélange cyclohexane-acétate d'éthyle (8-2 en volume) comme éluant. On récupère 1 1,5 g de produit que l'on reprend dans 1 I S cm3 d'acide clUorhydrique concentré et porte à ébullition 20 heures. On ajoute 200 cm3 d'eau, filtre 1e précipité, le lave à l'eau zs ct à l'acétone. On obtient 6,7 g d'acide plrényl-3 isoquinoléine-1 propanoïque fondant u 1 GO°C.
On agite 20 heures à 20°C, G,7 g d'acide phényl-3 isoquinoléine-1 pI'OpanOïquC CL 7 cm3 d'acide sulfurique concentré dans 70 cm3 d'éthanol. On verse la solution dans 400 cm3 d'eau et alcalinise la phase aqueuse avec une solution d'ammoniaque concentrée. On extrait avec 3 lois 100 cm3 dc chlorure de méthylène, sèclrc la plür5e oI'girlllqtrC Ct l'évapore à sec sous pression réduite. On obtient G,3 g dc plrényl-3 isoduinoléinc-l propionate d'éthyle tondant à GO°C : (Isl' 21005411, cx~mplc 4 ; p. l 7, I.G- I S cns~n~blc p. I 3,1.33-p. l4, I. l0 ).
5 La métlryl-1 phényl-3 isoquinoléinc peut être préparée selon S. COSZCZYNSICI, Rocznicki Cltcm., 38(S), 893-S ( 19G4) ; Chcnt. Abst. G2, I G
l88 a ( 19GS), incorporé dans la description par référence.
Lxemnle 11 : Yrocéclé de r~rén:vrsrtioa de N-wéthvl N-(métlr I-y 1 r~rolwl) plrényl-7 lu benzolhltlrionlrènecarboxumide-S.
A 12 cm3 de diméthylsulfoxyde sous atmosphère d'azote, on ajoute, sous agitation, 1,8 g d'hydroxyde de potassium en poudre puis 2 b de N-(méthyl-1 propyl) phényl-7 benzo(b]thiophènecarboxamide-S et enfin O,E crn3 d'iodure de méthyle.
On mite 1 heure 30 minutes à température ambiante (20°C cnvrron), verse Ie mélange IS réactionnel sur SO crn3 d'eau et GO cm3 d'acétate d'éthyle. On mite 1S
minutes, décante la phase organique, la lave à l'eau, la sèche sur sulfate de rnagnésium et l'évapore à sec sous pression réduite. Lc résidu est chromatograpltié sur du gel de silice en utilisant un mélange cyclohexane-acétate d'éthyle (50-50 en volume) comme éluant. Les fractions contenant le produit sont rassemblées, évaporées sous pression 2o réduite et reprises par un mélange d'eau et d'éther éthylique. La phase organique est décantée, lavée à l'eau, séchée sur sulfate de magnésium et évaporée sous pression réduite. Le résidu est agité 1 heure 30 minutes avec 20 cm3 d'éther de pétrole 40-60°, filtré et séché.
On isole ainsi 1,2 g dc N-méthyl N-(méthyl-1 propyl) plrényl-7 benzo[b]llrioplrène-2> carboxamidc-S fondant à I OS°C.
Le N-(méthyl- I propyl) phényl-7 benzo[b]lhiophènccarboxamide-S peut clre préparé
dc la manière suivante On chauffe à 90°C pendant 2 heures 3 g d'acide phényl-7 benzo[b]
thiophènecarboxilique-5 dans 30 cm3 de toluène et 2,6 cm3 de chlorure de thionyle.
On évapore sous pression réduite , puis on ajoute au résidu 30 cm3 de toluène et 9,94 cm~ de triéthylamine. On agite et on ajoute, boutte à l;outte 1,2 cm3 de butanamine.
On agite 1 heure à température ambiante, évapore le toluène sous pression réduite et reprend le résidu par du chlorure de méthylène et une solution aqueuse de carbonate de potassium. On agite 5 minutes, lave la phase organique par de l'eau, la sèche sur sulfate de magnésium et l'évapore sous pression réduite.
Après chromatographie du résidu sur du gel de silice en utilisant un mélange Io cyclohexane-acétate d'éthyle (SO-50 en volume), on obtient 2,35 g de N-(méthyl-1 propyl) phényl-7 benzo[b]thiophènecarboxamide-5 fondant à 195°C ; (EP
24873481, exemple 2 ; p.5, 1 39-60 ensemble exemple 1 p.5, 1. 6-37).
I!~xemnle 12 Procédé de nrénnration de N,N diéthyl phénYl 3 l5 nanhtalènecnrboxamide-1.
On chauffe au reflux pendant 1 heure 5 g d'acide phényl-3 naphtalènecarboxylique-I et 20 ml de chlorure de thionyle. On évapore le chlorure de thionyle, reprend te résidu par 100 ml de toluène et évapore à nouveau. On ajoute alors au résidu obtenu 25 ml de pyridine puis, goutte à goutte, sous agition, 4,5 ml de 2o diéthylamine. On agite 2 heures à température ambiante. Le mélange réactionnel est ensuite coulé dans 50 ml d'eau. La phase organique est décantée et la phase aqueuse est extraite par 3 fois 100 ml d'acétate d'éthyle. Les phases organiques sont rassemblées, lavées para fois 30 ml d'eau, séchées sur sulfate de magnésium et évaporées sous pression réduite.
25 Après recristallisation du résidu obtenu dans l'hexane, on obtient 3,4 g de N,N-diéthyl phényl-3 naphtalènecarboxamide-1, qui fond à 65°C ; (Irl' 112776B1, exemple 20 ;
p. I 1, 1.25-35 ensemble p.8, 1.3-14).

L'acide phényl-3 naphtalènecarboxylique-I peut être préparé selon le procédé
décrit par P.C. BADDAR et coll., J. Chem. Soc., 1959, 1009, incorporé dans la description par référence.
S Exemple 13 : Procédé de prét~ar:~tion de N-méthyl N[méthyl-1 nronyll (chloro-l~hényl)-1 isoctuinoléinecarboxamide-3.
A 1,68 g d'acide (chloro-2 phényl)-1 isoquinoléine carboxylique-3 dans 60 ml de chloroforme on ajoute 0,7 g de triéthylamine. On refroidit à 10 °C et ajoute 0,75 g de chloroformiate d'éthyle. On agite 40 mn à la température ambiante, introduit une lo solution de 0,68 g de N-méthyl butanamine-2 dans 60 ml de chloroforme et agite 4h à
la température ambiante. On évapore le milieu réactionnel sous pression réduite, reprend le résidu dans de l'acétate d'éthyle, lave la phase organique avec une solution aqueuse saturée de carbonate de sodium, la sèche sur du sulfate de magnésium et l'évapore à sec sous pression réduite. On chromatographie le résidu sur du gel de silice 15 et recristallise le produit obtenu dans du cyclohexane. On obtient 1,4 g de N-méthyl N[méthyl-1 propyl) (chloro-2 phényl)-1 isoquinoléinecarboxamide-3 fondant à
136°C , (EP 094 271 B 1 exemple 21 ; p.7, col, l 2, 1.57 - p.8, col.13, 1.2 ensemble p.6, col.9, 1.32- p.6, col.9, I.S4).
20 Exemple 14 : Activité biolo~inue L'activité biologique des composés selon la présente invention peut être mise en évidence de la façon suivante (les documents indiqués ci-dessous sont incorporés dans la description par référence) A : Methode de dosage de l'apoptose induite dans une population cellulaire.
25 four quantifier dans une population cellulaire le nombre de cellules en apoptose de par leur contenu en ADN, une méthode d'analyse par rACS (fluorescence activated cell sorting) utilisant le marquage fluorescent des cellules par 2 agents fluorescents intercalants de l'ADN a été adaptée à partir de celle décrite par Pollack A.
et Ciancio G. (Pollack A et Ciancio G.In: Flow Cytometry, Darzynkiewicz Z, Crissman HA
(eds). Academic Press, San Diego, CA, 1991, pp 19-24). Après trypsinisation, les cellules sont rincées au PBS (« Phosphate Buffer Saline commercialisé par exemple par Gibco BRL) et fixées dans 1 ml d'éthanol froid pendant 30 minutes. Elle sont ensuite rincées 2 fois dans 2 ml de PBS contenant 0,5 % de Tween 20 et resuspendues dans 1 ml de milieu de coloration ( PBS-Tween 20 0,5 % contenant 1 mg/ml de Rnase bouillie, 10 trg/ml d'iodure de Propidium et 4 ~rg/ml de DAPI-4',6-diamidino-2-phenylindole dihydrochlorure). L'analyse par FACS a lieu après excitation UV.
Les études ont eu lieu sur des populations cellulaires cultivées en plaque 6 puits Nunc à
to raison de 100 000 cellules par puits dans 2 ml de milieu complet à
l'ensemencement, les différents produits induisant ou facilitant l'apoptose étant ajoutés 36 heures après ensemencement des cellules et l'analyse par FACS étant réalisée entre 24 et 72 heures après cet ajout.
~5 B : Dosage de l'inhibition de l'activité anti-apoptotique dépendante de Bcl2 dans une lignée cellulaire surexprimant Bcl2 de manière conditionnelle.
Par les techniques de transfection stable et en utilisant des agents de sélection tels que, par exemple la néomycine, l'hygromycine, la zéocine ou la puromycine, des clones dérivés par exemple de la lignée cellulaire NCI-H1299 (obtenue auprès de l'ATCC) 2o peuvent être établis de sorte à avoir une expression conditionnelle de la protéine Bcl2 strictement dépendante de la concentration de tétracycline ou plus avantageusement d'anhydrotétracycline présente dans le milieu. Pour cela, on peut utiliser la technique décrite par Gossen et Bujard (Gossen M & Bujard H. (1992). Proc Natl Acad Sci U S
A, 89, SS47-SI ; Nucleic Acids Res 1993 Sep I 1;21(18):4411-2), avec la possibilité de 25 l'adapter tout en conservant les caractéristiques du systcmc de régulation transcriptionnelle décrite par ces auteurs. On a pu établir des clones surexprirnant la protéine Bcl2 en absence de tétracycline ou d'anhydrotétracycline dans le milieu de culture, alors qu'en présence de 0.5 mg/l d'anhydrotétracycline, la protéine n'est pas détectable par la technique de western blotting en utilisant l'anticorps anti-Bcl2, clone 124 commercialisé par la société DAKO et en utilisant le protocole décrit par Venot et al. (Venot, C., Maratrat, M., Dureuil, C., Conseiller, E., Bracco, L., and Debussche, L. 1998. EMBO J. 17:4668-4679).
En utilisant l'approche décrite ci-dessus, il a été possible de caractériser des clones qui s se sont avérés significativement moins sensibles à l'apoptose induite par une gamme de concentrations d'agents inducteurs d'apoptose en absence qu'en présence de tétracycline dans le milieu de culture, c'est-à-dire lorsqu'ils surexpriment la protéine Bcl2 plutôt que lorsqu'ils ne la surexpriment pas. Les agents inducteurs d'apoptose testés ont été par exemple l'adriamycine (10-100 pg/ml), le terbutyl-hydroperoxyde to (25-100 uM), la vincristine (0.03-0.003 pg/ml) et la camptothécine (0.01-0.1 yg/ml).
Pour quantifier l'induction d'apoptose, on peut par exemple utiliser la méthode de dosage de l'apoptose induite dans une population cellulaire décrite dans A.
Une manière possible de doser l'inhibition d'activité anti-apoptotique dans une lignée cellulaire surexprimant Bcl2 de manière conditionnelle par un traitement qui peut être l5 par exemple l'incorporation d'un composé chimique consiste à quantifier, en utilisant par exemple la méthode décrite dans A, le pourcentage d'apoptose induite dans une population de cellules issues par exemple d'un des clones décrits ci-dessus, dans les 4 situations suivantes 1) le composé chimique à évaluer est incorporé dans le milieu de culture cellulaire en 2o mëme temps qu'un agent inducteur d'apoptose tel que par exemple ceux cités ci-dessus et le clone est cultivé en absence de tétracycline ou d'anhydrotétracycline, c'est-à-dire qu'il surexprime la protéine Bcl2. Dans cette situation, on détermine la pourcentage de cellules en apoptose Pl.
2) le même agent inducteur d'apoptose que celui utilisé dans la situation 1 est 2~ incorporé seul dans le milieu de culture cellulaire et le clone est cultivé
cn absence dc tétracycline ou d'anhydrotétracycline, c'est-à-dire qu'il surexprime la protéine Bcl2.
Dans cette situation, on détermine la pourcentage de cellules en apoptose P2.
3) le composé est incorporé dans le milieu de culture cellulaire en mëme temps que le mëme agent inducteur d'apoptose que celui utilisé dans la situation 1 et le clone est cultivé en présence de tétracycline (1 ltg/ml) ou d'anhydrotétracycline (0.5 pglml), c'est-à-dire qu'il ne surexprime pas la protéine Bcl2. Dans cette situation, on détermine la pourcentage de cellules en apoptose P3.
4) le composé est incorporé dans le milieu de culture cellulaire en absence d'agent 5 inducteur d'apoptose et le clone est cultivé en présence de tétracycline (1 pglml) ou d'anhydrotétracycline (0.5 pglml), c'est-à-dire qu'il ne surexprime pas la protéine Bcl2. Dans cette situation, on détermine la pourcentage de cellules en apoptose P4.
On calcule alors le ratio R = 100 x (P1-P2)/(P3-P4). Quand R=100, l'inhibition de m l'activité anti-apoptotique liée à la surexpression de Bcl2 est de 100 % à
la concentration de composé à évaluer utilisée. Quand R= 0, le composé n'est pas inhibiteur à la concentration testée. Une série de résultats peut être obtenue à partir d'une gamme de concentration de composé à évaluer. On peut calculer mathématiquement à partir de ces résultats une concentration inhibitrice de SO
% ou l5 IC50. Plusieurs composés peuvent être comparés en fonction de leur IC50. On dira par exemple qu'un produit A est deux fois plus actif qu'un produit B si l'IC50 de A est deux fois plus faible que l'IC50 de B. Les valeurs d'IC50 peuvent varier en fonction du clone cellulaire utilisé, de la nature et de la concentration de l'inducteur d'apoptose utilisé.
C:
En utilisant la technique décrite dans B, il a été possible de déterminer des inférieures ou égales à SO 1rM pour le PK11195 et les composés issus dcs familles II, III, IVetV.
2~ Avantageusement, les composés des familles lI, 111, IV présentent des activités pouvant être au moins 5 fois meilleures que celle présentée par le PK 1195.
Préférentiellement, les composés des exemples 4 à 12 décrits plus haut présentent des activités supérieures à celles démontrées par le composé PKI 195.

Parmi les composés de formule générale (L1), on préfère les composés suivants N,N-diéthylcarbamate de phényl-3 naphtyle-1 N,N-diéthyl a.-méthyl phényl-2 duinazoline-4 propanamide N-méthyl N-phényl phényl-2 quinazoline-4 propanamide s N,N-diéthyl (vitro-4 phényl)-2 quinazoline-4 propanamide N,N-diéthyl [(phényl-2 trifluorométhyl-8 quinolinyl-4) oxy]-2 propanamide N,N-diéthyl (méthoxy-3 phényl)-2 duinazoline-4 propanamide N,N-diéthyl phényl-3 isoquinoléine-1 propanamide P:trrni les composés de formule générale (III), on préfère 1o N-méthyl N-(rnéthyl-1 propyl) phényl-7 benzo[b]thiophènecarboxamide-S
Parmi les composés de formule générstle (IV), on préfère N,N-diéthyl phényl-3 naphtalènecarboxamide-1 Parmi les composés de formule générale (V), on préfère N-méthyl N[méthyl-1 propyl] (chloro-2 phényl)-1 isoquinoléinecarboxamide-3 ts REFERENCES
Bernardi, P., and Petronilli, V. (1996). The permeability transition pore as a mitochondrial calcium release channel; a critical appraisal. J. Bioenerg.
Biomembr. 28, 129-136.
Beutner, G., Ruck, A., Riede, B., Welte, W., and Brdiczka, D. (1996).
Complexes 1o between kinases, mitochondrial porin, and adenylate translocator in rat brain resemble the permeability (transition pore. FEBS Lett. 396, 189- 195.
Boise, L. H., and Thompson, C. B. (1997). Bcl-XL can inhibit apoptosis in cells that have undergone Fasinduced protease activation. Proc. Natl. Acad. Sci. USA 94, 3764.
Carayon, P., Portier, M,, Dussossoy, D., Bord, A., Petitpretre, G., Canat, X., Le Fur, G., and Casellas, P. (1996). Involvement of peripheral benzodiazepine receptors in the protection of hematopoietic cells against oxygen radical species. Blood 87, 3178.
Cuende, E., Alés-Martinez, J. E., Ding, L., Gonzalez-Garcia, M., Martinez-A., C., and Nunez, G. (1993). Programmed cell death by Bcl-2-dependent and -independent mechanisms in B cell lymphoma cells. EMBO J. 12, 1555- 1560.
De Jong, D., I'rins, F. A., Mason, D. Y., Reed, J. C., van Ommen, G. B., and Kluin, I'.
M. (1994). Subcellular localization of the Bcl-2 protein in malignant and normal lymphoid cell s. Cancer Res. 54 , 256-260.

Decaudin, D., Geley, S., Hirsch, T., Castedo, M., Marchetti, P., Macho, A., Kofler, R., and Kroemer, G. (1997). Bcl-2 and Bcl-XL antagonize the mitochondrial dysfunction preceding nuclear apoptosis induced by chemotherapeutic agents.
Cancer Res. 57, 62-67.
Ellerby, H. M., Martin, S. J., Ellerby, L. M., Naiem, S. S., Rabizadeh, S., Salvese, G.
S., Casiano, C. A., Cashman, N. R., Green, D. R., and Bredesen, D. E. (1997).
Establishment of a cell-free system of neuronal apoptosis: comparison of premitochondrial, mitochondrial, and postmitochondrial phases. J. Neurosci.
17, 6165 6178.
Evtodienki, Y. V., Teplova, V. V., Sidashi, S. S., Ichas, F., and Mazat, J.-P.
(1996).
Microtubule-active drags suppress the closure of the permeability transition pore in tumour mitochondria. FEBS Lett. 393, 86-88.
~5 Green, D. R., Mahboubi, A., Nishioka, W., Oja, S., Echeverri, F., Shi, Y., Glynn, J., Yang, Y., Ashwell, J., and Bissonnette, R. (1994). Promotion and inhibition of activation-induced apoptosis in T-cell hybridomas by oncogenes and related signais.
Immunol. Rev. 142, 321-342.
Haldar, S., Chintapalli, J., and Croce, C. M. (1996). Taxol induces bcl-2 phosphorylation and death of prostate cancer cells. Cancer Research 5G, 1253-1255.
1-laldar, S., Jena, N., and Croce, C. M. (1995). Inactivation of Bcl-2 by piosphorylation. Proc. Natl. Acad Sci. USA 92, 4507-4511.
I-Iirsch, T., Marchetti, P., Susin, S. A., Dallaporta, B., Zamzami, N., Marzo, I., Geuskens, M., and Kroemer, G. ( 1997). The apoptosis-necrosis paradox.
Apoptogenic proteases activated alter mitochondrial permeability transition determine the mode of 3o cell death. Oncogene 15, 1573- 1582.

I-Iortelano, S., Dallaporta, B., Zamzami, N., Hirsch, T., Susin, S. A., Marzo, 1., Bosca, L., and Kroemer, G. ( 1997). Nitric oxide induces apoptosis via trigl;erin~
mitochondrial permeability transition. FEBS Lett. 410, 373-377.
Huant, D. C. S., Cory, S., and Strasser, A. (1997). Bcl-2, Bcl-XL, and adenovirus protein E1B l9kD are functionally equivalent in their ability to inhibit cell death.
Oncogene 14, 405-414.
to Ichas, F., Jouavill, L. S., and Mazat, J.-P. (1997). Mitochondria are excitable orl;anelles capable of l;eneratin~ and conveying electric and calcium currents. Cell 89, 1 145-1153.
Joseph-Liauzun, E., Farges, R., Delmas, P., Ferrara, P., and Loison, G. ( 1997). The ~ 5 M-r 18,000 subunit of the peripheral-type benzodiazepine receptor exhibits both benzodiazepine and isoquinoline carboxamide binding sites in the absence of the voltage-dependent anion channel or of the adenine nucleotide carrier. J. Biol.
Chem.
272, 28102-28106.
2o Kantrow, S. P., and Piantadosi, C. A. (1997). Release of cytochrome c from liver mitochondria during permeability transition. Biochem. Biophys. Res. Comm. 232, G69-671.
Kinnally, K. W., Lohret, T. A., Campo, M. L., and Mannella, C. A. (199G).
25 l'crspectives on the mitochondrial multiple conductance channel. J.
Bioenerg.
Biomembr. 28, 1 1 S- I 23.
Kinnally, K. W., Zorov, D. B., Antonenko, Y. N., Snyder, S. H., McEnery, M.
W., and Tedeschi, H. (1993). Mitochondrial benzodiazepine receptor linked to inner membrane ion channels by nanomolar actions of ligands. Proc. Natl. Acad. Sci.
USA
90, 1374-1378.
Kluck, R. M., Bossy-Wetzel, E., Green, D. R., and Newmeyer, D. D. (1997). The 5 release of cytochrome c from mitochondria: a primary site for Bcl-2 regulation of apoptosis. Science 275, I 132- 1136.
Kroemer, G., Zamzami, N., and Susin, S. A. (1997x). Mitochondrial control of apoptosis. Immunol. Today 18, 44-51.
Kroemer, G. (1997b). The prolo-oncogene Bcl-2 and ils role in regulating apoptosis.
Nature Medicine 3, 614-620.
Kroemer, G., Lisardo, B., Zamzami, P., Hortelano, S., and Martinez-A., C. ( 1997c).
Detection of apoptosis and apoptosis associated alterations. "The Immunology Methods Manual" (Lefkovitz, R. Ed.); Academic Press, Chapter 14.2., pp. 1111 I-I 125.
Leist, M., Single, B., Castoldi, A. F., Kuhnle, S., and Nicotera, P. (1997).
Intracellular 2o adenosine triphosphate (ATP) concentration: a switch in the decision between apoptosis and necrosis. J. Exp. Med. 185, 1481 - 1486.
Liu, X., Kim, C. N., Yang, J., Jemmerson, R., and Wang, X. (1996). Induction of apoptotic program in cell-fee extracts: requirement for dATP and cytochrome C.
Cell 8G, 147-157.
Marchetti, P., Castedo, M., Susin, S. A., Zamzami, N., I-ürsch, T., I-Iacfiiier, A., I-lirsch, F., Geuskens, M., and Kroemer, G. (1996x). Mitochondrial permeability transition is a central coordinating event ofapoptosis. J. Exp. Med 184, 1155-1160.

Marchetti, P., Hirsch, T., Zamzami, N., Castedo, M., Decaudin, D., Susin, S.
A., Masse, B., and Kroemer, G. (1996b). Mitochondrial permeability transition triggers lymphocyte apoptosis. J. Immunol. 157, 4830-4836.
McEnery, M. W., Snowman, A. M., Trifiletti, R. R., and Snyder, S. H. (1992).
Isolation of the mitochondrial benzodiazepine receptor: Association with the voltage-dependent anion channe! and the adenine nucleotide carrier. Proc. Natl. Acad.
Sci.
USA 89, 3170-3174.
to Nicotera, P., and Leist, M. (1997). Energy supply and the shape of death in neurons and lymphoid cells. Cell Death Diff 4, 435-442.
0'Gorman, E., Beutner, G., Dolder, M., Koretsky, A. P., Brdiczka, D., and Wallimann, T. (1997). The rote of creatine kinase in inhibition of mitochondrial pcrmeability transition. FEBS Lett. 414, 253-257.
Pastorino, J. G., Simbula, G., Yamamoto, K., Glascott, P. A. J., Rothman, R.
J., and Farber, J. L. ( 1996). The cytotoxicity of tumor necrosis factor depends on induction of the mitochondrial permeability transition. J. Biol. Chem. 271, 29792-29799.
Polyak, K., Xia, Y., Zweier, J. L., Kinzler, K. W., and Vogelstein, B. ( 1997). A mode!
for p53-induced apoptosis. Nature 389, 300-305.
Reed, J. C. (1997). Double identity for proteins of the Bcl-2 family. Nature 387, 773-77G.
Ripond, J., Mattei, M. G., Kaghad, M., Dumont, X., Guillemot, J. C., Lefi~r, G., Caput, D., and Fcrrara, P. (1991). Molecular cloning and ciromosomal localizatiou of a human peripheral type benzodiazepin receptor. Eur. J. Biochem. 2, 305-311.

Schulze-Osthof~, K., Krammer, P. H., and Droge, W. (1994). Divergent signalling via AI'O-I/Fas and the TNF receptor, two homologous molecules involved in physiolobical cell death. EMBO J. 13, 4587-4596.
Strasser, A., I-larris, A. W., Huang, D. C. S., Krammer, l'. H., and Cory, S.
( 1995).
Bcl-2 and Fas/AP0-I regulate distinct pathways to lymphocyte apoptosis. EMBO
J.
14, 6136-6147.
Strasser-Wozak, E., Hattmannstorfer, R., Hala, M., Hartmann, B. L., Fiegl, M., Geley, to S., and Kofler, R. (1995). Splice site mutation in the glucocorticoid receptor Bene causes resistance to glucocorticoid-induced apoptosis in a human acute leukemic cell lire. Cancer Res 55, 348-353.
Susin, S. A., Zamzami, N., Castedo, M., Hirsch, T., Marchetti, P., Macho, A., Daugas, E., Geuskens, M., and Kroemer, G. (1996a). Bcl-2 inhibits the mitochondrial release of an apoptogenic protease. J. Exp. Med. 184, 1331-1342.
Susin, S. A., Zamzami, N., Castedo, M., Daugas, E., Wang, H.-G., Geley, S., Fassy, F., Reed, J., and Kroemer, G. (1997b). The central executioner of apoptosis.
Multiple links between protease activation and mitochondria in Fas/Apo-l/CD95- and ceramide-induced apoptosis. J. Exp. Med 18G, 25-37.
Vander Heiden, M. G., Chandal, N. S., Williamson, E. K., Shcumacker, P. T., and 1'lrompson, C. B. ( 1997). Bcl-XL regulates the membrane potcntial and vOhl111e homcostasis of mitochondria. Ccll 91, 627-637.
Yang, J., Liu, X., Bhalla, K., Kirn, C. N., lbrado, A. M., Cai, J., l'eng, T.-I., Jones, D.
P., and Wang, X. (1997). Prevention of apoptosis by Bcl-2: release of cytochrome c ti~om mitochondria blocked. Science 275, 1129- 1 132.
_~u Yasuhara, N., Sahara, S., Kamada S, Fguchi, Y., and Tsujimato, Y. ( 1997).
Evidence against a functional site for Bcl-2 downstream of caspase cascade in preventint;
apoptosis. Onco~ene 15, 1921-1928.
Zamzami, N., Marchetti, P., Castedo, M., Decaudin, D., Macho, A., Hirsch, T., Susin, S. A., Petit, P. X., Mit;notte, B., and Kroemer, G. (1995). Sequential reduction of mitochondrial transmembrane potential and generation of reactive oxyl;en species in early programmed cell death. J. Exp. Med 182, 367-377.
1o Zamzami, N., Susin, S. A., Marchetti, P., Hirsch, T., Gourez-Monterrey, I., Castedo, M., and Kroemer, G. (1996). Mitochondrial control of nuclear apoptosis. J.
Exp. Med.
183, 1533-1544.
Zisterer, D. M., and Williams, D. C. (1997). Peripheral-type benzodiazepin receptors.
~ 5 Gen. Pharmacol. 29, 305-314.
Zoratti, M., and Szabo, 1. (1995). The mitochondrial permeability transition.
Biochem.
Biophys. Acta-Rev. Biomembranes 1241, 139-176.

Claims (16)

1. Produit de combinaison comprenant au moins un composé possédant une affinité
sur le récepteur mitochondrial des benzodiazépines, et au moins un agent inducteur de l'apoptose pour une utilisation simultanée, séparée ou étalée dans le temps, destiné au traitement du cancer.

2. Produit selon la revendication 1 caractérisé en ce que le composé est sélectionné
parmi les composés de la famille de formule générale I:

Dans laquelle R1 est un groupe alkyl inférieur de C1-C6 ramifié ou linéaire, R2 est un groupe alkyl inférieur de C1-C6 ramifié ou linéaire, R3 est art atome d'halogène tel que Cl, F, Br, I, et R4 est un atome d'hydrogène ou d'halogène, les groupes R1, R2, R3, R4 étant choisit indépendamment les uns des autres.

3. Produit selon la revendication 2 caractérisé en ce que le composé est le PK11195:
1-(2-chlorophényl)-N-méthyl-N-(1-méthylpropyl)-3-isoquinoline carboxamide.

4. Produit selon la revendication 1 caractérisé en ce due le composé est sélectionné
parmi les composés de la famille de formule générale II:
dans laquelle A représente un atome d'azote ou un groupe CH, B représente un atome d'azote ou un groupe CH, V et W, identiques ou différents, représentent des atomes d'hydrogène ou d'halogène (fluore, chlore, brome), des groupes alkyle ou alcoxy comportant 1 à 3 atomes de carbone, des groupes nitro ou trifluorométhyle, Z est fixé en position ortho ou para par rapport à B et représente un radical phényle, thiényle, pyridyle, ou phényle substitué parun ou deux substituants pris parmi les atomes d'halogène, les groupes alkyle et alcoxy comportant 1 à 4 atomes de carbone, les groupes trifluorométhyle ou nitro, la chaîne -X-(CH2)n-(CHR)m-CONR1R2 est fixée en position ortho ou para par rapport à B, R représente un atome d'hydrogène ou un groupe alkyle comportant 1 à 3 atomes de carbone, R1 et R2 identiques ou différents, représentent un groupe alkyle linéaire ou ramifié
comportant 1 à 6 atomes de carbone, cycloalkyle comportant 3 à 6 atomes de carbone, phényle, phénylalkyle ou cycloalkylalkyle dont la prtie alkyle comporte 1 à 3 atomes de carbone et la partie cycloalkyle comporte 3 à 6 atomes de carbone, alcènyle comportant 3 à 6 atomes de carbone à condition due la double liaison ne soit pas située en position 1, 2 par rapport à l'atome d'azote, R1 et R2 peuvent également former ensemble avec l'atome d'azote auquel ils sont rattachés un cycle pyrrolidine, pipéridine, morpholine ou thiomorpholine, X représente un groupe CH-R3 , N-R4, SO, SO2 ou un atome d'oxygène ou de soufre, R3 représente un atome d'hydrogène ou un groupe alkyle comportant 1 à 3 atomes de carbone, R4 représente un groupe alkyle comportant 1 à 3 atomes de carbone, m est égal à 0 ou 1, n est égal à 0, 1 ou 2, étant entendu que lorsque X représente un groupe SO, SO2 ou N-R4, la somme m +
n est au moins égale à 1, étant entendu que lorsque A et B représentent chacun un atome d'azote et Z est en position para par rapport à B, X ne peut pas représenter le groupe CH-R3, étant entendu que lorsque A représente un groupe CH, B représente un atome d'azote, Z est en position ortho par rapport à B, X représente un atome d'oxygène et R représente un atome d'hydrogène, le somme m+n est différente de 1 et à
l'exception du N,N-diméthylcarbamate de phényl-2 quinolyle-4.
autrement dit, les composés de formule (II) répondent à l'une des formules (IIa) ou (11b) dans lesquelles A, B, V, W, X, Z, R, R,, R2, n et m ont les significations mentionnées ci-dessus.

5. Produit selon la revendication 1 caractérisé en ce que le composé est sélectionné
parmi les composés de la famille de formule générale III
Dans laquelle R1 et R1' identiques ou différents représentent des groupes alkyle à
chaîne linéaire ou ramifiée de C1-C4, cycloalkyle dont la partie alkyle comporte 1 à 3 atomes de carbone et la partie cycloalkyle comporte 3 à G atomes de carbone ou phényle, R1 et R1' peuvent aussi former avec l'atome d'azote auquel ils sont rattachés un cycle pipéridine.

de carbone, nitro ou trifluorophényle, Ar représente un radical phényle, thiényle ou phényle substitué par un ou deux substituants choisis parmi les atomes d'halogène (fluor, chlore, brome), les groupes alkyle ou alcoxy comportant 1 à 4 atomes représente un des enchaînements suivants

6. Produit selon la revendication 1 caractérisé en ce que le composé est sélectionné
parmi les composés de la famille de formule générale IV

Dans laquelle R1 est un groupe alkyle linéaire ou ramifié de C1-C6, un groupe phényle, un groupe cycloalkyle possédant de C3-C6, un groupe phenylalkyle ou cycloalkyle dans lequel le radical alkyl contient de C1-C3, ou un groupe Dans lequel R3 et R4 sont des atomes d'hydrogène ou des groupes alkyle et R5 est un groupe alkényle ou alkynyle, la somme des atomes de carbone dans R3, R4, et R5 étant compris entre 2 et 5, R2 est un groupe alkyle linéaire ou ramifié de C1-C6, un groupe phenylalkyle ou cycloalkyle dans lequel le radical alkyl contient de C1-C3, un groupe Dans lequel R3, R4, et R5 sont définis comme ci-dessus, ou un groupe Dans lequel n est 0, 1, 2 ou 3, R1 et R2 pouvant former ensemble avec l'atome d'azote auquel ils sont rattachés un radical hétérocycle à 5, 6 ou 7 chaînons pouvant contenir un autre hétéroatome choisi parmi l'azote et l'oxygène et pouvant porter un ou deux substituants choisis parmi les groupes alkyle de C1-C3, hydroxy, oxo, hydroxyalkyle, diméthylaminoalkyle dont la partie alkyle est de C1-C3, Z est un groupe phényle, pyridyle, thienyle, 2-thiazolyle ou un groupe phényle substitué par un ou deux substituants choisis parmi les atomes d'halogène, les groupes alkyle, alkoxy, alkylthio en C1-C3, le groupe trifluorométhyle, et le groupe nitro, X et Y sont identiques ou différents et sont des atomes d'hydrogène, halogène, des groupes alkyle ou alkoxy de C1-C3, des groupes nitro ou trifluorométhyle, A et B sont indépendamment l'un de l'autre des atomes d'azote ou des groupes CH, Ou tout stéréoisomère de formule IV.

7. Produit selon la revendication 1 caractérisé en ce que le composé est sélectionné
parmi les composés de la famille de formule générale V:
Dans laquelle, R1 et R2 représentent indépendamment un groupe alkyle de C1-C6 linéaire ou ramifié, un groupe cycloalkyle de C3-C7, un groupe phénylalkyle ou cycloalkyle dont la partie alkyle est de C1-C3 ; R1 et R2 peuvent représenter également un groupe alcényle ou alcynyle de C2-C6 à condition que la double ou la triple liaison ne soit pas située en position 1-2 par rapport à l'atome d'azote ; R1 et R2 peuvent représenter un groupe de formule -R3-Z -R4 dans laquelle R3 est un groupe alkylène linéaire ou ramifié
de C2-C6 à condition qu'au moins deux atomes de carbone séparent l'atome d'azote du groupe Z ; R4 représente un groupe alkyle de C1-C4 et Z l'atome d'oxygène , de soufre ou le groupe N-R5, R5 représentant l'atome d'hydrogène ou un groupe alkyle de C1-C3 ; R1 et R2 peuvent former avec l'atome d'azote auquel ils sont rattachés un hétérocycle comprenant éventuellement un second hétéroatome.
Ar représente un groupe phényle, pyridyle, ou thienyle ou un groupe phényle substitué
par un ou deux substituants pris parmi les atomes d'halogène, les goupes alkyle, alcoxy et alkylthio de C1-C4, le groupe trifluorométhyle et le groupe nitro ;
A et B
sont indépendamment N ou CH.

Représente l'enchaînement Ou, lorsque A est N et B représente CH, l'un des enchaînements suivants :

X, Y représente indépendamment l'atome d'hydrogène, halogène, un groupe alkyle ou alkoxy comprenant de C1-C3, le groupe nitro ou trifluorométhyle.

8. Produit selon l'une des revendications 1 à 7 caractérisé en ce que ledit agent inducteur de l'apoptose est sélectionné parmi les agents qui endommagent l'ADN, les ligands naturels ou synthétiques du récepteur aux glucocorticoïdes, ou les seconds messagers pro-apoptotiques.

9. Produit selon la revendication 8 caractérisé en ce que ledit agent est de préférence sélectionné parmi les radiations gamma, l'étoposide, la doxorubicine, la dexamethasone, la céramide telle que la céramide C8, la lonidamine.

10. Produit selon la revendication 8 caractérisé en ce que ledit second messager pro-apoptotique est sélectionné parmi les dérivés des glucocorticoïdes, parmi les agents alkylants tels que les moutardes à l'azote, par exemple la cyclophosphamide, les complexes de Platine, par exemple la cisplatine, les dérivés de l'éthylène-imine, de diméthane sulfonoxy-alkanes, les dérivés de la pipérazine, parmi les inhibiteurs des topoisomérases tels que les inhibiteurs de la topoisomérase 2, par exemple les anthracyclines, l'epipodophyllotoxine tel que l'étoposide, les inhibiteurs de la topoisomérase 1, par exemple les dérivés de la camptothecine, parmi les antimétabolites tels que les antifolates, par exemple le méthotrexate, les antipurines, par exemple la 6-mercaptopurine, les antipyrimidines, par exemple la 5-fluorouracile, parmi les antimitotiques tels que les vinca-alcaloïdes, les taxoïdes tel que le taxol, taxotere, et parmi les cytolytiques divers tels que la bléomycine, la dacarbazine, l'hydroxycarbamide, l'asparaginase, la mitoguazone, la plicamycine.

11. Produit selon l'une des revendications 1-10 caractérisé en ce qu'il comporte en outre un vecteur viral qui possède un gène qui code pour la thymidine kinase.

12. Produit selon l'une des revendications 1 à 11 caractérisé en ce qu'il comporte en outre un ou plusieurs véhicules pharmaceutiquement acceptables.

13. Utilisation d'un produit selon la revendication 12 pour la fabrication d'un médicament destiné au traitement du cancer.

14. Utilisation d'un produit selon la revendication 12 pour la fabrication d'un médicament destiné induire la mort des cellules tumorales.

15. Utilisation d'un composé possédant une affinité sur le récepteur mitochondrial des benzodiazépines pour la fabrication d'un médicament destiné au traitement du cancer, notamment pour faciliter l'induction de l'apoptose.

16. Utilisation d'un composé selon la revendication 15 caractérisé en ce qu'il est de préférence sélectionné parmi les composés des familles de formule générale I, II, III, IV et V, notamment parmi les molécules suivantes:
1-(2-chlorophényl)-N-méthyl-N-(1-méthylpropyl)-3-isoquinoline carboxamide (PK11195), N,N-diéthylcarbamate de phényl-3 naphtyle-1, N,N-diéthyl .alpha.-méthyl phényl-2 quinazoline-4 propanamide, N-méthyl N-phényl phényl-2 quinazoline-4 propanamide, N,N-diéthyl (nitro-4 phényl)-2 quinazoline-4 propanamide, N,N-diéthyl [(phényl-2 trifluorométhyl-8 quinolinyl-4) oxy)-2 propanamide, N,N-diéthyl (méthoxy-3 phényl)-2 quinazoline-4 propanamide, N,N-diéthyl phényl-3 isoquinoléine-1 propanamide, N-méthyl N-(méthyl-1 propyl) phényl-7 benzo[b]thiophènecarboxamide-5, N,N-diéthyl phényl-3 naphtalènecarboxamide-1, Et N-méthyl N[méthyl-1 propyl] (chloro-2 phényl)-1 isoquinoléinecarboxamide-3.