CA2184635C - Marqueurs genetiques utilises conjointement pour le diagnostic de la maladie d'alzheimer, methode et kit de diagnostic - Google Patents
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Abstract
L'invention a pour objet l'utilisation conjointe d'au moins deux marqueurs génétiques choisis parmi APOE, D19S178 et APO CII pour le diagnostic de la maladie d'Alzheimer, en particulier les allèles APO e4, APO CII long (30+/-3 motifs répétitifs (CA)) et D19S178 court (moins de 167+/-4 nucléotides). L'invention a également pour objet un procédé de diagnostic de la maladie d'Alzheimer ainsi qu'un kit pour la mise en oeuvre du procédé.
Description
-'W0 95/24504 PCT/FR95100259 Mazqueurs génétirWas utilisés conjointement pour le diagnostic de la maladie d'Aleheimer, méthode et kit de dia-gnostic.
La présente invention concerne des marqueurs génétiques utilisés conjointement pour le diagnostic de la maladie d'Alzheimer.
La maladie d'Alzheimer est une pathologie encéphalique caractérisée par une démence précoce avec une perte de neurones corticaux associée à des plaques de R-amyloïde, des enchevêtrements de neurofibrilles et dans la plupart des cas une angiopathie amyloïde. Il existe de fortes présomptions pour une influence généti-que dans l'étiologie de la maladie d'Alzheïmer (WO
94/01772).
Cette composante génétique a été mis en évi-dence depuis de nombreuses années par des observations indirectes qui suggèrent une hérédité sur le mode autosomique dominant et une pénétrance dépendante de l'âge pour expliquer les liens familiaux entre des individus atteints par la maladie. Des études de géné-tique moléculaire récentes ont permis d'isoler des gènes putatifs de la maladie d'Alzheimer par la recherche de marqueurs génétiques polymorphes spécifiques de chromoso-mes (Bird et al., 1989, Neurobiology of Aging 10, 432-434).
Trois localisations chromosomiques ont été
décrites comme étant impliquées dans les formes familia-les à survenue précoce (âge de survenue inférieur à 60 ans) : le chromosome 21, le chromosome 14 et le chromo-some 19. Deux études de liaison ont suggéré que la région chromosomique 19q13.2 était associée à des formes de maladie d'Alzheimer familiales à survenue tardive (Peri-cak-Vance et al, Am. J. Hum. Genet. (1991), 48, 1034-1050 ; Schellenberg et al., Ann. Neurol.( 1992), 31, 223-227). Au sein de cette région chromosomique, le groupe de gènes d'apolipoprotéines (APO) E-CI-CI'-CII est une r5 1/ -7 --~ i 4U.CJJ
La présente invention concerne des marqueurs génétiques utilisés conjointement pour le diagnostic de la maladie d'Alzheimer.
La maladie d'Alzheimer est une pathologie encéphalique caractérisée par une démence précoce avec une perte de neurones corticaux associée à des plaques de R-amyloïde, des enchevêtrements de neurofibrilles et dans la plupart des cas une angiopathie amyloïde. Il existe de fortes présomptions pour une influence généti-que dans l'étiologie de la maladie d'Alzheïmer (WO
94/01772).
Cette composante génétique a été mis en évi-dence depuis de nombreuses années par des observations indirectes qui suggèrent une hérédité sur le mode autosomique dominant et une pénétrance dépendante de l'âge pour expliquer les liens familiaux entre des individus atteints par la maladie. Des études de géné-tique moléculaire récentes ont permis d'isoler des gènes putatifs de la maladie d'Alzheimer par la recherche de marqueurs génétiques polymorphes spécifiques de chromoso-mes (Bird et al., 1989, Neurobiology of Aging 10, 432-434).
Trois localisations chromosomiques ont été
décrites comme étant impliquées dans les formes familia-les à survenue précoce (âge de survenue inférieur à 60 ans) : le chromosome 21, le chromosome 14 et le chromo-some 19. Deux études de liaison ont suggéré que la région chromosomique 19q13.2 était associée à des formes de maladie d'Alzheimer familiales à survenue tardive (Peri-cak-Vance et al, Am. J. Hum. Genet. (1991), 48, 1034-1050 ; Schellenberg et al., Ann. Neurol.( 1992), 31, 223-227). Au sein de cette région chromosomique, le groupe de gènes d'apolipoprotéines (APO) E-CI-CI'-CII est une r5 1/ -7 --~ i 4U.CJJ
2 zone candidate. Parmi les produits de ces gènes, l'apoli-poprotéine E (APOE) est particulièrement impliquée dans le système nerveux : APOE est présente dans les plaques séniles et possède une affinité de liaison avec le peptide R-A4. Strittmatter et al. (Proc. Natl. Acad.
Sci. (1993) 90, 177-181) ont décrit une fréquence augmentée de l'allèle e4 du gène APOE dans les formes familiales de la maladie d'Alzheimer à survenue tardive.
Cette observation a été confirmée pour les formes familiales (Corder et al., Science (1993), 261, 921-923) et les formes sporadiques de la maladie d'Alzheimer (Corder et al., Science (1993), 261, 921-923 ; Saunders et al., Neurology -(1993), 13, 1467-1472).
D'autre part, Schellenberg et al. (Ann.
Neurol. 1992, 31:223-227) ont rapporté une association génétique entre l'allèle F du gène de l'apolipoprotéine CII (allèle du polymorphisme de longueur de fractions de restriction de TaqI (RFLP : Restriction Fragment Length Polymorphism)) et la forme familiale de la maladie d'Alz-heimer.
Les auteurs de la présente invention ont réalisé une étude portant sur deux populations d'origine différentes atteintes l'une d'une forme à survenue tardive de la maladie d'Alzheimer (après 65 ans), l'autre d'une forme à survenue précoce de la maladie d'Alzheimer (avant 65 ans), qui a permis d'établir une augmentation significative dans les deux groupes d'au moins deux des marqueurs génétiques suivants : allèle APOE c4, allèle D19S178 court et allèle APO CII long.
La localisation sur le chromosome 19 des marqueurs APOE, APO CII (APO C2) et D19S178 est connue et décrite notamment par Williamson et al. (Cyto Genetic and Cell Genetic 1991, vol. 58, p. 1678).
La présente invention a ainsi pour objet l'utilisation conjointe d'au moins deux marqueurs
Sci. (1993) 90, 177-181) ont décrit une fréquence augmentée de l'allèle e4 du gène APOE dans les formes familiales de la maladie d'Alzheimer à survenue tardive.
Cette observation a été confirmée pour les formes familiales (Corder et al., Science (1993), 261, 921-923) et les formes sporadiques de la maladie d'Alzheimer (Corder et al., Science (1993), 261, 921-923 ; Saunders et al., Neurology -(1993), 13, 1467-1472).
D'autre part, Schellenberg et al. (Ann.
Neurol. 1992, 31:223-227) ont rapporté une association génétique entre l'allèle F du gène de l'apolipoprotéine CII (allèle du polymorphisme de longueur de fractions de restriction de TaqI (RFLP : Restriction Fragment Length Polymorphism)) et la forme familiale de la maladie d'Alz-heimer.
Les auteurs de la présente invention ont réalisé une étude portant sur deux populations d'origine différentes atteintes l'une d'une forme à survenue tardive de la maladie d'Alzheimer (après 65 ans), l'autre d'une forme à survenue précoce de la maladie d'Alzheimer (avant 65 ans), qui a permis d'établir une augmentation significative dans les deux groupes d'au moins deux des marqueurs génétiques suivants : allèle APOE c4, allèle D19S178 court et allèle APO CII long.
La localisation sur le chromosome 19 des marqueurs APOE, APO CII (APO C2) et D19S178 est connue et décrite notamment par Williamson et al. (Cyto Genetic and Cell Genetic 1991, vol. 58, p. 1678).
La présente invention a ainsi pour objet l'utilisation conjointe d'au moins deux marqueurs
3 génétiques choisis parmi APOE, D19S178 et APO CII pour le diagnostic de la maladie d'Alzheimer, les marqueurs génétiques étant de préférence constitués par APOE et D19S178 et/ou APO CII, de préférence encore par APOE, D19S178 et APO CII.
Plus spécifiquement, la présente invention a pour objet une utilisation conjointe d'au moins deux marqueurs génétiques choisis parmi APOE, D19S178 et APO CII pour le diagnostic de la maladie d'Alzheimer.
Les marqueurs génétiques utilisés sont avantageusement l'allèle APOE c4, l'allèle D19S178 court et l'allèle APO CII long.
Le gène APOE possède trois allèles : e2, c3 et E4.
Par allèle APO CII long, on entend un allèle comprenant plus de 30 3, de préférence plus de 30 répétitions consécutives des bases cytosine-adénine.
Par allèle D19S178 court, on entend un allèle comprenant moins de 167 4, de préférence moins de 167 nucléotides.
L'invention a également pour objet un procédé
de diagnostic de la maladie d'Alzheimer caractérisé en ce que l'on recherche dans un échantillon biologique d'un patient la présence de deux au moins des marqueurs suivants : allèle APOE c4, allèle D19S178 court et allèle APO CII long.
La méthode selon l'invention comprend avantageusement les étapes suivantes :
a) mise en contact de l'échantillon biologi-que contenant de l'ADN avec un couple d'amorces spécifi-ques permettant l'amplification de tout ou d'une partie des gènes APOE, D19S178 et/ou APO CII, l'ADN humain contenu dans l'échantillon ayant été éventuellement rendu accessible à l'hybridation et dans des conditions permettant une hybridation des amorces à l'ADN humain contenu dans l'échantillon biologique ;
b) amplification de l'ADN humain c) révélation des produits d'amplification par les techniques appropriées ;
11~4~35
Plus spécifiquement, la présente invention a pour objet une utilisation conjointe d'au moins deux marqueurs génétiques choisis parmi APOE, D19S178 et APO CII pour le diagnostic de la maladie d'Alzheimer.
Les marqueurs génétiques utilisés sont avantageusement l'allèle APOE c4, l'allèle D19S178 court et l'allèle APO CII long.
Le gène APOE possède trois allèles : e2, c3 et E4.
Par allèle APO CII long, on entend un allèle comprenant plus de 30 3, de préférence plus de 30 répétitions consécutives des bases cytosine-adénine.
Par allèle D19S178 court, on entend un allèle comprenant moins de 167 4, de préférence moins de 167 nucléotides.
L'invention a également pour objet un procédé
de diagnostic de la maladie d'Alzheimer caractérisé en ce que l'on recherche dans un échantillon biologique d'un patient la présence de deux au moins des marqueurs suivants : allèle APOE c4, allèle D19S178 court et allèle APO CII long.
La méthode selon l'invention comprend avantageusement les étapes suivantes :
a) mise en contact de l'échantillon biologi-que contenant de l'ADN avec un couple d'amorces spécifi-ques permettant l'amplification de tout ou d'une partie des gènes APOE, D19S178 et/ou APO CII, l'ADN humain contenu dans l'échantillon ayant été éventuellement rendu accessible à l'hybridation et dans des conditions permettant une hybridation des amorces à l'ADN humain contenu dans l'échantillon biologique ;
b) amplification de l'ADN humain c) révélation des produits d'amplification par les techniques appropriées ;
11~4~35
4 PCT/FR95/00259 d) détection de la présence éventuelle des allèles APOE e4, D19S178 court et APO CII long par les techniques appropriées.
Par diagnostic, au sens de la présente invention, on entend la confirmation de la présence d'au moins deux marqueurs choisis parmi ceux décrits ci-dessus chez des patients dont le tableau clinique fait état d'une symptomatologie pouvant être attribuée à la maladie d'Alzheimer, ou encore une probabilité accrue chez des sujets de développer la maladie d'Alzheimer par rapport à l'ensemble d'une population, l'accroissement de la probabilité étant d'au moins un facteur 4.
L'échantillon biologique peut être le sang total, la fraction leucocytaire du sang ou encore un tissu à partir duquel de l'ADN peut être extrait, ou un fluide biologique.
Les amorces spécifiques utilisées dans le cadre de la présente invention peuvent être notamment celles décrites dans Roppers et al. (1991), Cytogenet.
Ceil Genet. 58, 751-784) pour D19S178, Hixson et al.
(1990), J. Lipid. Res. 31, 545-548 pour APOE et Weber et al., Am. J. Hum. Genet. 44, 388-396 pour APO CII.
D'autres amorces peuvent convenir, le critère de sélection des amorces étant qu'elles permettent l'amplification des parties des gènes APOE, D19S178 et APO CII comportant les polymorphismes respectifs : région 112-158 de APOE, extrémité 5' de APO CII.
Les allèles recherchés, notamment D19S178 et APO CII long, peuvent être mis en évidence par détermina-tion de la longueur des fragments amplifiés, par exemple par une électrophorèse sur gel de polyacrylamide ou par détermination de la séquence du fragment amplifié.
Les allèles recherchés, notamment APO E4, peuvent également être détectés par la technique d'ana-.
lvse de polymorgnisme conformazionnel de simples 5r:ns ( '~1nCy'1?-5 ~.~ZR~ CO[PLO~r1a _i"n ?oly!iiorDRi7.i1' (SSC? ) telle que décri te DZz McSaLo 0; i ta et z? ., ou encore Dar hy~_idatîon de sor.de à l'aide d'une sonde sppc;rique.
La présente invention a également pour objet un kit pour la mise en oeuvre du procédé selon l'invention, dans un échantillon comprenant les éléments suivants:
- des couples d'amorces spécifiques des gènes APOE, D19S178 et APO CII, - les réactifs nécessaires pour effectuer une amoli_ication d'ADN, - A-ventuellement les réactifs pe:,net=ant la détection des al?èles APOE e4, D19S178 court et/ou APO
CII long, par exemple des réactifs nécessaires à ûne éZectroohorèse sur gel de oolyacrylamide et la révélation des fragments avrès migrati-on des 5ra. Ca= QS de ---?- c tCe CG :5~1~' _S= ~~_ i_'s all?l:s saL'TaÇeS
La 7=?SZ__Ce a éçz? eme:.t po1:_ objet des groduits c' a.~p:? =_cacion de tou_ ou d'au moi~s deu:c ~_nes c~o_s_s -par-t: ~.P
. - 0 ~.._ S:73.
3 =f:.S@ gal IriSn de aL: n0;:_5 72~_GC=ÇL:Ss c-0~3~5 za=, é:?O
Plus spécifiquement, l'invention a pour objet une composition comprenant les produits d'amplification de tout ou partie d'au moins deux gènes choisis parmi APOE, APO CII et D19S178, dans laquelle le produits d'amplification de APOE
comprend la région 112-158 de APOE, le produits d'amplification de APO CII
comprend l'extrémité 5' de APO CII, et le produit d'amplification de D19S178 comprend la totalité de D19S178.
On _appor;.era ci-après les résultats de l'étude des inventeurs auteurs de la présente invention, montrant 1"_mo? ;.cation des marqueu, sAPQE, Ap0 CIZ et D19S178 dans la fréquence de survenue de la maladie d' Al zheime= .
L=-: ude ~0 c=Z= s~_ c''-x y_cuP es ca paen-- s a--~'_ l s C2 _d un Ç70UZe "_a:1ça:.S
composé àe 35 pa zients c une forme à su_venue tard,ve de 1a maladi= c'A1z:~eime= (78_9 ans ,_nze_valle ans) e; un g_oupe britannique composé de 34 Da-tl _nts Dresentant une --o;me a survenue oL' _COCe de la maladie d' a.1z:~.eine= (37_z ans ,_ n--=_rval'_e 49-ô~ ans) Ci3C~.~.ost_~u?~3s DZ= 1 a cl _~_ ~e.
ûes Ge'.f -_Cl.:~ _s Cnz -'~--;-E1 cOm?a: _s r deux _ ouoes 'é ~o _ mérnes àclas, comoosés ç -_=soec'_re,e ..3 J_ . ' . J.
maladie d'Alzheimer.
L'ADN génomique des patient a été extrait des leucocytes selon la méthode décrite par Marcadet et al.
(Standardized Southern-Blot Workshop Technique-Histocom-patibility Testing, Springer Verlag, New-York, Vol. 1).
L'ADN génomique a été amplifié par PCR à l'aide d'un appareil d'amplification Perkin Elmer Cetus.
Cinq marqueurs localisés dans la région chromosomique 19q13.2 ont été étudiés comme décrit dans les références correspondantes : deux marqueurs anonymes contenant des motifs (CA)õ , D19S47 (référencé sous Mfd 9 (Weber et al. (1989), Am. J. Hum. Genet. 44, 388-396)) et D19S178 (référencé sous Mfd 139 (Ropers et al. (1991) Cytogenet. Cell Genet. 58, 751-784)), le polymorphisme APOE (Hixson et al. (1990) J. Lipid. Res. 31, 545-548), le polymorphisme de longueur de fragments de restriction (RFLP) pour HpaI de l'extrémité 5' du locus du gène Apo CI (Nillesen et al. (1990), Nucleic Acids Res. 18, 3428) et le polymorphisme de motifs répétitifs (CA),, dans le gène APO CII (référencé sous Mfd 5) (Weber et al., Am.
J. Hum. Genet. 44, 388-396).
Les analyses statistiques ont été réalisées avec un logiciel SAS version 6,04. Des analyses "Univa-riates" ont été réalisées à l'aide du test Xz de Pearson et du test exact de Fisher si nécessaire. Compte tenu de la rareté de la fréquence de certains allèles observée pour des polymorphismes microsatellites, les allèles ont été regroupés en deux groupes en fonction de leur nombre de nucléotides. Ainsi, D19S178 a été partagé en allèles longs (167 nucléotides et au-delà) et allèles courts (moins de 167 nucléotides), les allèles de l'extrémité
Par diagnostic, au sens de la présente invention, on entend la confirmation de la présence d'au moins deux marqueurs choisis parmi ceux décrits ci-dessus chez des patients dont le tableau clinique fait état d'une symptomatologie pouvant être attribuée à la maladie d'Alzheimer, ou encore une probabilité accrue chez des sujets de développer la maladie d'Alzheimer par rapport à l'ensemble d'une population, l'accroissement de la probabilité étant d'au moins un facteur 4.
L'échantillon biologique peut être le sang total, la fraction leucocytaire du sang ou encore un tissu à partir duquel de l'ADN peut être extrait, ou un fluide biologique.
Les amorces spécifiques utilisées dans le cadre de la présente invention peuvent être notamment celles décrites dans Roppers et al. (1991), Cytogenet.
Ceil Genet. 58, 751-784) pour D19S178, Hixson et al.
(1990), J. Lipid. Res. 31, 545-548 pour APOE et Weber et al., Am. J. Hum. Genet. 44, 388-396 pour APO CII.
D'autres amorces peuvent convenir, le critère de sélection des amorces étant qu'elles permettent l'amplification des parties des gènes APOE, D19S178 et APO CII comportant les polymorphismes respectifs : région 112-158 de APOE, extrémité 5' de APO CII.
Les allèles recherchés, notamment D19S178 et APO CII long, peuvent être mis en évidence par détermina-tion de la longueur des fragments amplifiés, par exemple par une électrophorèse sur gel de polyacrylamide ou par détermination de la séquence du fragment amplifié.
Les allèles recherchés, notamment APO E4, peuvent également être détectés par la technique d'ana-.
lvse de polymorgnisme conformazionnel de simples 5r:ns ( '~1nCy'1?-5 ~.~ZR~ CO[PLO~r1a _i"n ?oly!iiorDRi7.i1' (SSC? ) telle que décri te DZz McSaLo 0; i ta et z? ., ou encore Dar hy~_idatîon de sor.de à l'aide d'une sonde sppc;rique.
La présente invention a également pour objet un kit pour la mise en oeuvre du procédé selon l'invention, dans un échantillon comprenant les éléments suivants:
- des couples d'amorces spécifiques des gènes APOE, D19S178 et APO CII, - les réactifs nécessaires pour effectuer une amoli_ication d'ADN, - A-ventuellement les réactifs pe:,net=ant la détection des al?èles APOE e4, D19S178 court et/ou APO
CII long, par exemple des réactifs nécessaires à ûne éZectroohorèse sur gel de oolyacrylamide et la révélation des fragments avrès migrati-on des 5ra. Ca= QS de ---?- c tCe CG :5~1~' _S= ~~_ i_'s all?l:s saL'TaÇeS
La 7=?SZ__Ce a éçz? eme:.t po1:_ objet des groduits c' a.~p:? =_cacion de tou_ ou d'au moi~s deu:c ~_nes c~o_s_s -par-t: ~.P
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Plus spécifiquement, l'invention a pour objet une composition comprenant les produits d'amplification de tout ou partie d'au moins deux gènes choisis parmi APOE, APO CII et D19S178, dans laquelle le produits d'amplification de APOE
comprend la région 112-158 de APOE, le produits d'amplification de APO CII
comprend l'extrémité 5' de APO CII, et le produit d'amplification de D19S178 comprend la totalité de D19S178.
On _appor;.era ci-après les résultats de l'étude des inventeurs auteurs de la présente invention, montrant 1"_mo? ;.cation des marqueu, sAPQE, Ap0 CIZ et D19S178 dans la fréquence de survenue de la maladie d' Al zheime= .
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composé àe 35 pa zients c une forme à su_venue tard,ve de 1a maladi= c'A1z:~eime= (78_9 ans ,_nze_valle ans) e; un g_oupe britannique composé de 34 Da-tl _nts Dresentant une --o;me a survenue oL' _COCe de la maladie d' a.1z:~.eine= (37_z ans ,_ n--=_rval'_e 49-ô~ ans) Ci3C~.~.ost_~u?~3s DZ= 1 a cl _~_ ~e.
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maladie d'Alzheimer.
L'ADN génomique des patient a été extrait des leucocytes selon la méthode décrite par Marcadet et al.
(Standardized Southern-Blot Workshop Technique-Histocom-patibility Testing, Springer Verlag, New-York, Vol. 1).
L'ADN génomique a été amplifié par PCR à l'aide d'un appareil d'amplification Perkin Elmer Cetus.
Cinq marqueurs localisés dans la région chromosomique 19q13.2 ont été étudiés comme décrit dans les références correspondantes : deux marqueurs anonymes contenant des motifs (CA)õ , D19S47 (référencé sous Mfd 9 (Weber et al. (1989), Am. J. Hum. Genet. 44, 388-396)) et D19S178 (référencé sous Mfd 139 (Ropers et al. (1991) Cytogenet. Cell Genet. 58, 751-784)), le polymorphisme APOE (Hixson et al. (1990) J. Lipid. Res. 31, 545-548), le polymorphisme de longueur de fragments de restriction (RFLP) pour HpaI de l'extrémité 5' du locus du gène Apo CI (Nillesen et al. (1990), Nucleic Acids Res. 18, 3428) et le polymorphisme de motifs répétitifs (CA),, dans le gène APO CII (référencé sous Mfd 5) (Weber et al., Am.
J. Hum. Genet. 44, 388-396).
Les analyses statistiques ont été réalisées avec un logiciel SAS version 6,04. Des analyses "Univa-riates" ont été réalisées à l'aide du test Xz de Pearson et du test exact de Fisher si nécessaire. Compte tenu de la rareté de la fréquence de certains allèles observée pour des polymorphismes microsatellites, les allèles ont été regroupés en deux groupes en fonction de leur nombre de nucléotides. Ainsi, D19S178 a été partagé en allèles longs (167 nucléotides et au-delà) et allèles courts (moins de 167 nucléotides), les allèles de l'extrémité
5' de APO CII à motifs répétitifs ont été divisés en allèles longs (30 motifs répétitifs et au-delà) et allèles courts (moins de 30 motifs répétitifs).
Les fréquences alléliques ont été calculées * (marque de commerce) par comptage des allèles.
Les résultats recueillis ont été traités par informatique en utilisant un modèle de régression logistique par étape à l'aide de tests statistiques de vraisemblance comme décrit par Breslow N.E. et al., Statistical Methods in Cancer Research, Vol. 1, pp. 192-247. L'analyse des déséquilibres de liaison a été faite comme décrit par Thompson E.A. et al., Am. J. Hum.
Genet., 42, 113-124 et Hill, W.G., 1974, Hereditary, 33, 229-239.
Les fréquences des marqueurs D19S178, APOE, APO CI et APO CII ont été estimées à l'aide de l'algo-rythme décrit par McLean et Morton, Genet. Epidemiol. 2, 263-272, mis sous forme de programme informatique, comme décrit par Cox et al., Am. J. Hum. Genet., 43, 495-501.
Les fréquences estimées ont été comparées à
celles attendues sur la base de l'équilibre du Xz de Pearson ou du test exact de Fischer.
Les résultats sont rapportés aux Tableaux I
à IV ci-après.
Le tableau I rapporte les distributions de fréquence allélique des polymorphismes génomiques pour des sujets sporadiques atteints de la maladie d'Alzheimer par rapport à des témoins.
Aucune différence significative n'apparaît entre les sujets et les témoins dans la distribution de l'allèle D19S47 pour les différentes populations. Dans la population à survenue tardive de la maladie, les fréquences des polymorphismes des gènes APOE et APO CII
étaient significativement différentes entre les sujets et les témoins : l'allèle APOE e4 et les allèles APO CII
longs étaient observés plus fréquemment chez les sujets à survenue tardive de la maladie d' Alzheimer que chez les témoins.
Les mêmes analyses ont été réalisées pour une JJ
population indépendante du Royaume-Uni de sujets sporadi-ques à survenue précoce par rapport à des témoins. Cette population a été étudiée pour les deux limites d'âge de survenue généralement acceptées, c'est-à-dire moins de 65 ans et moins de 60 ans. Pour le groupe de sujets dont l'âge de survenue était inférieur à 65 ans, les distribu-tions alléliques des polymorphismes des gènes D19S178, APOE et APOCI étaient significativement différentes entre les sujets et les témoins : les allèles D19S178 courts, l'allèle APOE e4 et la présence du site de restriction de HpaI dans APO CI (allèle 2) ont été plus fréquemment observés chez les malades où la survenue de la maladie était précoce que chez les témoins. Pour les groupes de sujets avec un âge de survenue de la maladie inférieure à 60 ans, les distributions alléliques des polymorphismes des gènes D19S178, APOE et APO CI étaient similaires à
celles du groupe de sujets avec un âge de survenue de la maladie inférieur à 65 ans.
Pour les analyses suivantes, la limite de séparation en fonction de l'âge entre le groupe à
survenue précoce et le groupe à survenue tardive était de 65 ans.
La fréquence observée pour l'allèle APOE E4 dans le groupe de malades à survenue précoce n'était pas significativement différente de celle observée dans le groupe de malades à survenue tardive, et dans les deux populations, l'allèle APOE e2 était rare chez les sujets atteints de la maladie d'Alzheimer.
Une corrélation inverse entre l'âge de survenue et le nombre de copies de l'allèle APOE e4 était observée dans la population à survenue tardive (p <
0,026), mais non dans la population à survenue précoce.
Les âges moyens de survenue des sujets ayant deux allèles APO c4, un allèle e4 ou sans l'allèle APO E4 étaient respectivement de 70,5, 75,0 et 81,2 ans dans le groupe 21~~6~5 à survenue tardive, et 58,5, 56,6 et 57,3 ans dans le groupe à survenue précoce.
Les résultats d'études de déséquilibre de liaison deux à deux entre les polymorphismes D19S178, APOE, APO CI et APO CII sont rapportés au Tableau II.
Aucune déviation de l'équilibre de Hardy-Weinberg n'était observée. Un déséquilibre de liaison complet était retrouvé entre l'allèle APO e4 et l'allèle 2 du polymorphisme de longueur des fragments de restric-tion (RFLP) de APO CI dans les deux populations.
Dans la population témoin, un déséquilibre de liaison non significatif était retr'ouvé entre les polymorphismes D19S178 et APOE et à l'intérieur de l'ensemble APOE-CI-CI'-CII.
Les fréquences haplotypiques des 4 marqueurs (D19S178, APOE, APO CI et APO CII) ont été estimées comme rapporté au Tableau III ci-après.
Parmi les 24 haplotypes théoriques, seuls 15 étaient retrouvés avec l'algorythme par la méthode décrite par McLean et Morton. Certains haplotypes étaient observés seulement chez les malades (n 1, 2 et 7) et d'autres seulement chez les témoins (n" 12 et 13) à la fois dans la population à survenue tardive et celle à
survenue précoce. L'haplotype n 10 était deux fois plus fréquent dans la population de malades à survenue tardive que dans la population à survenue précoce.
Le contenu d'informations du polymorphisme (Polymorphism Information Content (PIC)) et le degré
d'hétérozygotie obtenus en combinant ces 4 marqueurs étaient élevés dans les deux groupes.
Les différences dans la distribution des fréquences d'haplotypes estimées entre les malades et les témoins ont été testées à l'aide du test de rapport de probabilité (likelihood ratio test) avec un nombre de degré de liberté égal à 15. Les résultats étaient de 88,4 ~ -7 r-et 93,2 respectivement pour le groupe de malades à
survenue tardive et le groupe de malades à survenue précoce.
Pour estimer la tendance à développer la 5 maladie ("odds ratio") pour les porteurs d'au moins un des allèles des différents génotypes, on a utilisé des modèles de régression logistique multiple par étapes, qui ont été adaptés aux observations.
Dans le groupe à survenue tardive, les "odds 10 ratios" estimés étaient de 6,49 pour l'allèle APOE e4 (intervalle de confiance à 95% =[1,68 ; 25,03]), 0,10 pour l'allèle APOE 2 (intervalle de confiance à 95%
=
[1,19 ; 10,70] ).
Dans le groupe à survenue précoce, les "odds ratios" estimés obtenus étaient de 3,80 pour l'allèle APO
c4 (intervalle de confiance à 95% = [0,01 ; 0,85]) et 4,44 pour les allèles courts de D19S178 (intervalle de confiance à 95% = [1,27 ; 15,49]).
L'odds ratio (approximation du risque) ajusté
pour les porteurs d'au moins un allèle APOE e4 de développer une maladie d'Alzheimer sporadique de type à
survenue précoce ou à survenue tardive était de 4.10 (intervalle de confiance à 95% = [1.84 ; 9.16]), comme estimé dans un modèle de régression, logistique adapté
pour les données se rapportant à la population totale.
Pour les porteurs d'au moins un allèle, APOE
e2, l'odds ratio était de 0.11 (intervalle de confiance à 95% = [0,02 ; 0,50]), suggérant ainsi un effet protec-teur de cet allèle.
Le risque de développer une maladie d'Alz-heimer pour les porteurs d'au moins un allèle e4 et d'au moins un des deux marqueurs : allèle D19S178 court et allèle APO CII long est rapporté au tableau IV ci-dessous.
Dans les deux populations, les risques "odds CA 02184635 1996-08-30, j _ ~1~4bJ5 ratios" étaient significativement augmentés lorsque l'un de ces deux marqueurs était considéré en même temps que l'allèle APOE E4.
Par exemple, le risque de déclarer une maladie d'Alzheimer à survenue tardive pour un sujet porteur d'au moins un allèle APOE c4 et d'au moins un allèle APO CII long est maximal, cette configuration n'étant jamais retrouvée chez les témoins. Dans cette même population à début tardif, pour les porteurs d'au moins un allèle APOE E4 et d'au moins un allèle D19S178 court, l'odds ratio s'élève à 14 (14.23). Cet odds est également augmenté (supérieur à 8 (8.68)) pour ces mêmes allèles dans le cas d'une maladie d'Alzheimer à début précoce.
1.5 Dans l'ensemble de la population, le risque de développer une maladie d'Alzheimer indépendemment de l'àge de survenue est augmenté pour les porteurs d'au moins un allèle APOE E4 et d'au moins un allèle D19S178 court comme en témoigne l'élévation de l'odds ratio supérieur à 12 (12.46) ainsi que pour les porteurs d'au moins un APOE e4 et d'au moins un allèle APO CII long (odds ratio supérieur à 9 (9,72)).
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Les résultats recueillis ont été traités par informatique en utilisant un modèle de régression logistique par étape à l'aide de tests statistiques de vraisemblance comme décrit par Breslow N.E. et al., Statistical Methods in Cancer Research, Vol. 1, pp. 192-247. L'analyse des déséquilibres de liaison a été faite comme décrit par Thompson E.A. et al., Am. J. Hum.
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Les fréquences des marqueurs D19S178, APOE, APO CI et APO CII ont été estimées à l'aide de l'algo-rythme décrit par McLean et Morton, Genet. Epidemiol. 2, 263-272, mis sous forme de programme informatique, comme décrit par Cox et al., Am. J. Hum. Genet., 43, 495-501.
Les fréquences estimées ont été comparées à
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Les résultats sont rapportés aux Tableaux I
à IV ci-après.
Le tableau I rapporte les distributions de fréquence allélique des polymorphismes génomiques pour des sujets sporadiques atteints de la maladie d'Alzheimer par rapport à des témoins.
Aucune différence significative n'apparaît entre les sujets et les témoins dans la distribution de l'allèle D19S47 pour les différentes populations. Dans la population à survenue tardive de la maladie, les fréquences des polymorphismes des gènes APOE et APO CII
étaient significativement différentes entre les sujets et les témoins : l'allèle APOE e4 et les allèles APO CII
longs étaient observés plus fréquemment chez les sujets à survenue tardive de la maladie d' Alzheimer que chez les témoins.
Les mêmes analyses ont été réalisées pour une JJ
population indépendante du Royaume-Uni de sujets sporadi-ques à survenue précoce par rapport à des témoins. Cette population a été étudiée pour les deux limites d'âge de survenue généralement acceptées, c'est-à-dire moins de 65 ans et moins de 60 ans. Pour le groupe de sujets dont l'âge de survenue était inférieur à 65 ans, les distribu-tions alléliques des polymorphismes des gènes D19S178, APOE et APOCI étaient significativement différentes entre les sujets et les témoins : les allèles D19S178 courts, l'allèle APOE e4 et la présence du site de restriction de HpaI dans APO CI (allèle 2) ont été plus fréquemment observés chez les malades où la survenue de la maladie était précoce que chez les témoins. Pour les groupes de sujets avec un âge de survenue de la maladie inférieure à 60 ans, les distributions alléliques des polymorphismes des gènes D19S178, APOE et APO CI étaient similaires à
celles du groupe de sujets avec un âge de survenue de la maladie inférieur à 65 ans.
Pour les analyses suivantes, la limite de séparation en fonction de l'âge entre le groupe à
survenue précoce et le groupe à survenue tardive était de 65 ans.
La fréquence observée pour l'allèle APOE E4 dans le groupe de malades à survenue précoce n'était pas significativement différente de celle observée dans le groupe de malades à survenue tardive, et dans les deux populations, l'allèle APOE e2 était rare chez les sujets atteints de la maladie d'Alzheimer.
Une corrélation inverse entre l'âge de survenue et le nombre de copies de l'allèle APOE e4 était observée dans la population à survenue tardive (p <
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Les âges moyens de survenue des sujets ayant deux allèles APO c4, un allèle e4 ou sans l'allèle APO E4 étaient respectivement de 70,5, 75,0 et 81,2 ans dans le groupe 21~~6~5 à survenue tardive, et 58,5, 56,6 et 57,3 ans dans le groupe à survenue précoce.
Les résultats d'études de déséquilibre de liaison deux à deux entre les polymorphismes D19S178, APOE, APO CI et APO CII sont rapportés au Tableau II.
Aucune déviation de l'équilibre de Hardy-Weinberg n'était observée. Un déséquilibre de liaison complet était retrouvé entre l'allèle APO e4 et l'allèle 2 du polymorphisme de longueur des fragments de restric-tion (RFLP) de APO CI dans les deux populations.
Dans la population témoin, un déséquilibre de liaison non significatif était retr'ouvé entre les polymorphismes D19S178 et APOE et à l'intérieur de l'ensemble APOE-CI-CI'-CII.
Les fréquences haplotypiques des 4 marqueurs (D19S178, APOE, APO CI et APO CII) ont été estimées comme rapporté au Tableau III ci-après.
Parmi les 24 haplotypes théoriques, seuls 15 étaient retrouvés avec l'algorythme par la méthode décrite par McLean et Morton. Certains haplotypes étaient observés seulement chez les malades (n 1, 2 et 7) et d'autres seulement chez les témoins (n" 12 et 13) à la fois dans la population à survenue tardive et celle à
survenue précoce. L'haplotype n 10 était deux fois plus fréquent dans la population de malades à survenue tardive que dans la population à survenue précoce.
Le contenu d'informations du polymorphisme (Polymorphism Information Content (PIC)) et le degré
d'hétérozygotie obtenus en combinant ces 4 marqueurs étaient élevés dans les deux groupes.
Les différences dans la distribution des fréquences d'haplotypes estimées entre les malades et les témoins ont été testées à l'aide du test de rapport de probabilité (likelihood ratio test) avec un nombre de degré de liberté égal à 15. Les résultats étaient de 88,4 ~ -7 r-et 93,2 respectivement pour le groupe de malades à
survenue tardive et le groupe de malades à survenue précoce.
Pour estimer la tendance à développer la 5 maladie ("odds ratio") pour les porteurs d'au moins un des allèles des différents génotypes, on a utilisé des modèles de régression logistique multiple par étapes, qui ont été adaptés aux observations.
Dans le groupe à survenue tardive, les "odds 10 ratios" estimés étaient de 6,49 pour l'allèle APOE e4 (intervalle de confiance à 95% =[1,68 ; 25,03]), 0,10 pour l'allèle APOE 2 (intervalle de confiance à 95%
=
[1,19 ; 10,70] ).
Dans le groupe à survenue précoce, les "odds ratios" estimés obtenus étaient de 3,80 pour l'allèle APO
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L'odds ratio (approximation du risque) ajusté
pour les porteurs d'au moins un allèle APOE e4 de développer une maladie d'Alzheimer sporadique de type à
survenue précoce ou à survenue tardive était de 4.10 (intervalle de confiance à 95% = [1.84 ; 9.16]), comme estimé dans un modèle de régression, logistique adapté
pour les données se rapportant à la population totale.
Pour les porteurs d'au moins un allèle, APOE
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Le risque de développer une maladie d'Alz-heimer pour les porteurs d'au moins un allèle e4 et d'au moins un des deux marqueurs : allèle D19S178 court et allèle APO CII long est rapporté au tableau IV ci-dessous.
Dans les deux populations, les risques "odds CA 02184635 1996-08-30, j _ ~1~4bJ5 ratios" étaient significativement augmentés lorsque l'un de ces deux marqueurs était considéré en même temps que l'allèle APOE E4.
Par exemple, le risque de déclarer une maladie d'Alzheimer à survenue tardive pour un sujet porteur d'au moins un allèle APOE c4 et d'au moins un allèle APO CII long est maximal, cette configuration n'étant jamais retrouvée chez les témoins. Dans cette même population à début tardif, pour les porteurs d'au moins un allèle APOE E4 et d'au moins un allèle D19S178 court, l'odds ratio s'élève à 14 (14.23). Cet odds est également augmenté (supérieur à 8 (8.68)) pour ces mêmes allèles dans le cas d'une maladie d'Alzheimer à début précoce.
1.5 Dans l'ensemble de la population, le risque de développer une maladie d'Alzheimer indépendemment de l'àge de survenue est augmenté pour les porteurs d'au moins un allèle APOE E4 et d'au moins un allèle D19S178 court comme en témoigne l'élévation de l'odds ratio supérieur à 12 (12.46) ainsi que pour les porteurs d'au moins un APOE e4 et d'au moins un allèle APO CII long (odds ratio supérieur à 9 (9,72)).
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F-
Claims (18)
1. Utilisation conjointe d'au moins deux marqueurs génétiques choisis parmi APOE, D19S178 et APO CII pour le diagnostic de la maladie d'Alzheimer.
2. Utilisation selon la revendication 1 des marqueurs APOE et APO
CII ou APOE et D19S178.
CII ou APOE et D19S178.
3. Utilisation selon la revendication 1 ou la revendication 2 des marqueurs APOE, D19S178 et APO CII.
4. Utilisation selon l'une quelconque des revendications 1 à 3, caractérisée en ce que les marqueurs sont l'allèle APOE F-4, l'allèle D19S178 court et l'allèle APO CII long.
5. Utilisation selon la revendication 4, caractérisée en ce que l'allèle D19S178 court comporte moins de 167 ~ 4 nucléotides.
6. Utilisation selon la revendication 4, caractérisée en ce que l'allèle D19S178 court comporte moins de 167 nucléotides.
7. Utilisation selon la revendication 4, caractérisée en ce que l'allèle APO CII long comporte plus de 30 ~ 3 motifs répétitifs (CA).
8. Utilisation selon la revendication 4, caractérisée en ce que l'allèle APO CII long comporte plus de 30 motifs répéitifs (CA).
9. Méthode de diagnostic de la maladie d'Alzheimer, caractérisée en ce que l'on recherche dans un échantillon biologique d'un patient la présence de deux au moins des marqueurs suivants : allèle APOE E4, allèle D19S178 court, et allèle APO CII long.
10. Méthode selon la revendication 9, caractérisée par les étapes suivantes :
a) mise en contact de l'échantillon biologique contenant de l'ADN avec un couple d'amorces spécifiques permettant l'amplification de tout ou partie d'au moins deux des gènes APOE, D19S178 et APO CII, dans des conditions permettant une hybridation des amorces à l'ADN
humain contenu dans l'échantillon biologique;
b) amplification de l'ADN humain;
c) révélation des produits d'amplification par les techniques appropriées;
d) détection de la présence éventuelle des allèles APOE .epsilon.4, D19S178 court et APO CII long par les techniques appropriées.
a) mise en contact de l'échantillon biologique contenant de l'ADN avec un couple d'amorces spécifiques permettant l'amplification de tout ou partie d'au moins deux des gènes APOE, D19S178 et APO CII, dans des conditions permettant une hybridation des amorces à l'ADN
humain contenu dans l'échantillon biologique;
b) amplification de l'ADN humain;
c) révélation des produits d'amplification par les techniques appropriées;
d) détection de la présence éventuelle des allèles APOE .epsilon.4, D19S178 court et APO CII long par les techniques appropriées.
11. Méthode selon la revendication 10, caractérisée en ce que l'ADN humain contenu dans l'échantillon a été rendu accessible à
l'hybridation.
l'hybridation.
12. Méthode selon la revendication 10 ou 11, caractérisée en ce que la présence des allèles APOE .epsilon.4, D19S178 court et APO CII long est mise en évidence par la technique d'électrophorèse sur gel de polyacrylamide.
13. Kit pour la mise en oeuvre d'une méthode selon l'une des revendications 10 à 12, caractérisé en ce qu'il comprend :
- des couples d'amorces spécifiques de deux au moins des gènes APOE, D19S178 et APO CII, et - les réactifs nécessaires pour effectuer une amplification d'ADN.
- des couples d'amorces spécifiques de deux au moins des gènes APOE, D19S178 et APO CII, et - les réactifs nécessaires pour effectuer une amplification d'ADN.
14. Kit selon la revendication 13, comprenant en outre les réactifs permettant la détection des allèles APOE .epsilon.4 et D19S178 court ou APOE .epsilon.4 et APO CII.
15. Kit selon la revendication 13 ou 14, comprenant en outre des réactifs nécessaires à une électrophorèse sur gel de polyacrylamide et la révélation des fragments après migration.
16. Kit selon l'une quelconque des revendications 13 à 15, comprenant en outre des standards de référence constitués par les allèles sauvages des gènes mutants.
17. Composition comprenant les produits d'amplification de tout ou partie d'au moins deux gènes choisis parmi APOE, APO CII et D19S178, dans laquelle le produit d'amplification de APOE comprend la région 112-158 de APOE, le produit d'amplification de APO CII comprend l'extrémité 5' de APO CII, et le produit d'amplification de D19S178 comprend la totalité de D19S178.
18. Composition constituée d'au moins deux marqueurs génétiques choisis parmi APOE, APO CII et D19S178.
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