CA2129364A1 - Oligothionucleotides - Google Patents
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Abstract
2129364 9316095 PCTABS00163 La présente invention a pour objet des composés chimiques constitués par un oligo-4'-thio-2'désoxyribonucléotide ou un oligo-4'-thioribonucléotide alpha ou bêta, caractérisés en ce qu'ils comportent un enchaînement de 4'-thio-2'désoxyribonucléotides ou 4'-thioribonucléotides respectivement, enchaînement pouvant être facultativement lié à un agent effecteur, notamment un radical correspondant à un agent d'intercalation ou un radical chimique ou photoactivable, tel qu'un radical porteur d'une fonction réagissant directement ou indirectement avec les chaînes de nucléotides ou un radical dont la présence permet une détection facile et sensible. Elle a également pour objet des procédés de préparations de ces composés et leurs applications thérapeutiques, diagnostiques ou à titre de réactifs de laboratoire.
Description
i ~ J ~ 9 PCI`/FR93/00115 WO 93/160gS ,~
OLIGOTHIONUCLEOTIDES
La présente invention concerne des composés chlmlques nouveaux, ainsi que leurs applications. Les composés chlmiques selon la présente invention sont des composés ollgonucléotides constltués au molns en partie par un oligo 4'-thlo-ribonucléotide ou un oligo 4'-thio-2'désoxy-ribonucléotide comportant un enchaînement de 4'thionucléotides.
Les composés selon l'invention peuvent présenter la configu-ration anomérique naturelle bêta ou la configuration anomérique non naturelle alpha.
Ainsi sont représentés par les formules (a) et (t,) respecti-vement des 4'-thionucléotldes alpha(a) et bêta(b) 1~ ( S')--O--CH2 (5')--~CH2 (a) ~ (b) O--(3') O--(3') (a) et (b) représenten~ des 4'-thlonucléosldes, il faut rajouter un phosphate en 5' pour obtenir des nucléotldes.
Dans ces conditlons~ de multiples utilisations à finalites biologiques et même pharmacologlques dejà connues pour les oli~onucleo-tides peuvent ~tre envisa~ées et ceci avec plus d'efficacité.
Plus precisément, la présente invention a pour objet des composés chimiques constitues par un oligo4'-thioribonucléotide ou un oligo-4'-thio-2'désoxyribonucleo~ide, caractérisés en ce qu'ils comportent un enchaînement de 4'-thiorlbonucléotides ou 4'-thio-2'désoxyribonucleo-tides respectivemen~, enchaînement pouvant être facultativcment lié à un a~ent effecteur, notamment un radical correspondant à un a~ent PCr/FR93/001 1 5 WO 93/1~095 d'in~ercalatlon ou un radical chimlque ou photoactivable, tel qu~un radical porteur d~une fonctlon réa~lssant direc~ement ou Indirectement avec les chaînes de nucléotides ou un radical dont la présence permet une detectlon facile es sensible.
En particulier, I'inventlon a pour objet les nouveaux dérlvés oligo-4'-thlonucléotides, leur préparatlon et leur emploi notamment comme sondes permettant la détection d'une séquence définie d'acides nuclélques, comme nucléases artificielles spécifiques de séquences d'ADN QU d'ARN ou bien comme agents de blocage sélectif de l'expression d'un gène qu'il solt endogène (par exemple, gène oncogène) ou exogène (par exemple ADN ou ARN de virus, de parasltes ou de bactéries).
Dans les demandes de brevet français FR 8301223 t2 540 122) et FR 84 11 795 (2 568 254) ont été décrits des composés chlmiques constitués par un oligonucléotide ou un oligodésoxynucléotide comportant un enchaînement de nucléotides naturels ou modifiés, c'est-à-dire des bêta-nucleotides, sur lesquel se trouve fixé par une liaison covalente au moins un groupe intercalant, qui possèdent la propriété de bloquer sélectivement l'expression d'un gène et qui, de ce fait, sont partlculière-ment utiles en thérapeutique comme substances antivirales, antibiotiques, antiparasitaires ou antitumorales.
Dans la demande internationale PCT WO 831014SI, a été
décrite une méthode pour bloquer la traduction de l'ARN messager (ARNm) en protéine par hybridation de l'ARNm avec un oligonucléotide ayant la séquence complémen~aire de l'ARNm, l'oligonucléotide étant stabilise sous
OLIGOTHIONUCLEOTIDES
La présente invention concerne des composés chlmlques nouveaux, ainsi que leurs applications. Les composés chlmiques selon la présente invention sont des composés ollgonucléotides constltués au molns en partie par un oligo 4'-thlo-ribonucléotide ou un oligo 4'-thio-2'désoxy-ribonucléotide comportant un enchaînement de 4'thionucléotides.
Les composés selon l'invention peuvent présenter la configu-ration anomérique naturelle bêta ou la configuration anomérique non naturelle alpha.
Ainsi sont représentés par les formules (a) et (t,) respecti-vement des 4'-thionucléotldes alpha(a) et bêta(b) 1~ ( S')--O--CH2 (5')--~CH2 (a) ~ (b) O--(3') O--(3') (a) et (b) représenten~ des 4'-thlonucléosldes, il faut rajouter un phosphate en 5' pour obtenir des nucléotldes.
Dans ces conditlons~ de multiples utilisations à finalites biologiques et même pharmacologlques dejà connues pour les oli~onucleo-tides peuvent ~tre envisa~ées et ceci avec plus d'efficacité.
Plus precisément, la présente invention a pour objet des composés chimiques constitues par un oligo4'-thioribonucléotide ou un oligo-4'-thio-2'désoxyribonucleo~ide, caractérisés en ce qu'ils comportent un enchaînement de 4'-thiorlbonucléotides ou 4'-thio-2'désoxyribonucleo-tides respectivemen~, enchaînement pouvant être facultativcment lié à un a~ent effecteur, notamment un radical correspondant à un a~ent PCr/FR93/001 1 5 WO 93/1~095 d'in~ercalatlon ou un radical chimlque ou photoactivable, tel qu~un radical porteur d~une fonctlon réa~lssant direc~ement ou Indirectement avec les chaînes de nucléotides ou un radical dont la présence permet une detectlon facile es sensible.
En particulier, I'inventlon a pour objet les nouveaux dérlvés oligo-4'-thlonucléotides, leur préparatlon et leur emploi notamment comme sondes permettant la détection d'une séquence définie d'acides nuclélques, comme nucléases artificielles spécifiques de séquences d'ADN QU d'ARN ou bien comme agents de blocage sélectif de l'expression d'un gène qu'il solt endogène (par exemple, gène oncogène) ou exogène (par exemple ADN ou ARN de virus, de parasltes ou de bactéries).
Dans les demandes de brevet français FR 8301223 t2 540 122) et FR 84 11 795 (2 568 254) ont été décrits des composés chlmiques constitués par un oligonucléotide ou un oligodésoxynucléotide comportant un enchaînement de nucléotides naturels ou modifiés, c'est-à-dire des bêta-nucleotides, sur lesquel se trouve fixé par une liaison covalente au moins un groupe intercalant, qui possèdent la propriété de bloquer sélectivement l'expression d'un gène et qui, de ce fait, sont partlculière-ment utiles en thérapeutique comme substances antivirales, antibiotiques, antiparasitaires ou antitumorales.
Dans la demande internationale PCT WO 831014SI, a été
décrite une méthode pour bloquer la traduction de l'ARN messager (ARNm) en protéine par hybridation de l'ARNm avec un oligonucléotide ayant la séquence complémen~aire de l'ARNm, l'oligonucléotide étant stabilise sous
2 5 f orme phosphotries~er.
Dans la demande internationale WO 88/04301 ont éte décrl~s des oligonucléotides de configuration anomérique alpha présentant des appariements parallèles avec des séquences complémentaires.
La Chimiothérapie par les oligonucléotides antisens concerne des cibles à ARN ou à ADN de tous les organismes vivants (cellules, bactéries, parasites, virus ou oncogènes).
L'utilisation d'oligonucléotides antisens synthetiques ayant la même structure que les acides nucléiques naturels se heurte principalement en milieu biologique à des problèmes de sensibilite aux nucleases et de }5 pénétration cellulaire.
PCl /FR9~/0011 WO 93~1609~
Pour palller ces limltes, des analo~ues ollgonucléotldlques susceptibles d'être plus réslstants vls à vls des nucléases et de mleux pénétrer dans les cellules à travers la membrane cytoplasmique on~ été
synthétisés.
11 a en effet été décrit dans la technique antérleure des dérivés de composés oligonucléotides resistant mieux aux dégradations enzymatiques dont la partle phosphate était modifiée en thiophosphate ou méthylphosphonate notamment. Toutefois ces dérivés présentent une chiralité au niveau du phosphate susceptible de générer des cliastéréolso-mères insslubleS.
La présente Invention fournit une nouvelle classe d'oligo-nucléotides chimères les 4'-thlo-oligonucléotides dans lesquels l'oxygène intrac~clique du cycle furannose a été remplacé par un atome de soufre.
Il a en effet maintenant été trouvé~ et c'est ce qui fait l'objet de la présente inventlon, que la substitution de l'oxygène par un soufre sur la partie sucre des nucléosides plutôt que sur le groupement phosphate d'une part, assure la solubllité des oligomères et, d'autre part, pourrait accro~tre leur pénétration dans la cellule cible, la substitution de l'oxy~ène par l'élément soufre rendant la molécule plus lipophile.
Les dérives de 4'-thionucléotides forment des complexes d'hybridation avec les séquences complémentaires d'ARN beaucoup plus stables que ceùx formés avec l'A~)N et que, vis-à-vis des ARNs, les derlYés de 4'-thionucléoti~es forment des complexes d'hybridation plus stables que les dérives de bêta-nucléotldes naturels.
Parmi les composes, selon la présente Invention, on peut clter plus particulièrement les composes oligomères bêta de formule S
dans laquelle:
WO 93/1609~ PCl /FR93/001 15 les radlcaux ~ peuvent être Identlques ou différents et représentent chacun une base d'un acide nuclélque éventuellement modifiée, activable et/ou comportant un groupement Intercalant;
les radicaux X peuvant être identiques ou différents et représentent chacun un oxoanion O , un thloanion S , un groupe alkyle, un groupe alcoxy, aryloxy, un groupe aminoalkyle, un groupe amlnoalcoxy, un groupe thioalkyle, un radical alkyle ou alcoxy substitué par un hétérocycle a~oté ou un groupement -Y-Z;
!, R et R', qui peuvent être Identiques ou différents, représen-tent chacun un atome d'hydrogène ou un groupement -Y-Z ou Y'-Z';
Y et Y' identlques ou differents représentent chacun un radical alcoylène droit ou ramifié -alk- ou un radical choisi parmi E E E
-C-alk-, -C-NH-alk~ S, 1l-U-alk, -Il~-alk-, alk-O-alk O O O O O
E E
-alk-C-N-alk-, -P-U-alk-X-Cll-alk- et -P-U-aik-C-IN-alk- avec U = O, S ou N
En particuller, Y et Y' représentent un radlcal cholsl parml -(d U~c~n~ t-~ I u}~CH2~n~ C~CH23n~ -C-NH~~CH2~
avec U = O, S ou N
E peut avoir les mêmes slgnifications que X excepte Y-Z ou Y'-Z';
L représente O, S ou -NH-;
n et n' représentent un nombre entier y compris 0;
J représente un atome d'hydrogène ou un groupe hydroxy;
Z et i:', identiques ou différents, représentent chacun OH ou WO 93/16095 ' ~ PCl/FR93/00115 un radical correspondant à un agent effecteur, notamment un radlcal correspondant à un a~ent d'intercalation ou un radlcal porteur d'une fonction qui réaglt directement ou Indirectement avec les chaînes de nucléotides ou un radical dont la présence permet une détectlon faclle et 5 sensible.
Dans cette formule 1, on utilise la représentation condensée des nucléotides sulvante:
SJ
-o ~_ \ .
qui corres~ond à la formule développée:
~5~ 2I~S
\~
J
O ~3 sur laquelle ont été mentionnées les extrémités (3') et (5').
Il convient de remarquer que la formule I représente un enchaînement de 4'-thionucléotldes qui peuvent être identiques ou 25 différents, de configuration D ou L, n indiquan~ simplement le nombre de nucléotides compris dans la molécule; n est de préférence un nombre compris entre 1 et 50, et de préférence encsre entre 1 et 25.
On cite en partlculier les produits pour lesquels L represente I'oxygène; R et R' représen~ent l'hydrogène et a une base nuclelque 30 naturelle, soit adénlne, thymine, cytosine ou guanine quand J = H et adénine, uracile, cytosine et guanlne quand J = OH.
Les agents d'intercalation sont des produits connus dans les techniques relatives aux acides nuclélques; ce sont des composés capables WO 93/16095 pcr/FR93/ool lr ~` ~ Q J~ f` r~ !
,~. ,, ;. ,. ,, J
de "s'lntercaler" dans la structure des ADN ou ~es ARN, c'est-à-dlre capables de s'msérer entre les plateaux de base des acldes nuclelques.
Les agents d'intercalation peuvent êtrê cholsis parml les composés polycycllques ayant une configuratlon plane tels que l'acridlne et 5 ses dérlvés, la furocoumarlne et ses dérivés, la daunomyclne et les autres dérlvés de l'anthracycline, la l,10-phénanthroline, la phénanthrldlne et ses dérlvés, la prsf lavine, les porphyrlnes, les dérivés du dipyrldo [ 1 ,2-a
Dans la demande internationale WO 88/04301 ont éte décrl~s des oligonucléotides de configuration anomérique alpha présentant des appariements parallèles avec des séquences complémentaires.
La Chimiothérapie par les oligonucléotides antisens concerne des cibles à ARN ou à ADN de tous les organismes vivants (cellules, bactéries, parasites, virus ou oncogènes).
L'utilisation d'oligonucléotides antisens synthetiques ayant la même structure que les acides nucléiques naturels se heurte principalement en milieu biologique à des problèmes de sensibilite aux nucleases et de }5 pénétration cellulaire.
PCl /FR9~/0011 WO 93~1609~
Pour palller ces limltes, des analo~ues ollgonucléotldlques susceptibles d'être plus réslstants vls à vls des nucléases et de mleux pénétrer dans les cellules à travers la membrane cytoplasmique on~ été
synthétisés.
11 a en effet été décrit dans la technique antérleure des dérivés de composés oligonucléotides resistant mieux aux dégradations enzymatiques dont la partle phosphate était modifiée en thiophosphate ou méthylphosphonate notamment. Toutefois ces dérivés présentent une chiralité au niveau du phosphate susceptible de générer des cliastéréolso-mères insslubleS.
La présente Invention fournit une nouvelle classe d'oligo-nucléotides chimères les 4'-thlo-oligonucléotides dans lesquels l'oxygène intrac~clique du cycle furannose a été remplacé par un atome de soufre.
Il a en effet maintenant été trouvé~ et c'est ce qui fait l'objet de la présente inventlon, que la substitution de l'oxygène par un soufre sur la partie sucre des nucléosides plutôt que sur le groupement phosphate d'une part, assure la solubllité des oligomères et, d'autre part, pourrait accro~tre leur pénétration dans la cellule cible, la substitution de l'oxy~ène par l'élément soufre rendant la molécule plus lipophile.
Les dérives de 4'-thionucléotides forment des complexes d'hybridation avec les séquences complémentaires d'ARN beaucoup plus stables que ceùx formés avec l'A~)N et que, vis-à-vis des ARNs, les derlYés de 4'-thionucléoti~es forment des complexes d'hybridation plus stables que les dérives de bêta-nucléotldes naturels.
Parmi les composes, selon la présente Invention, on peut clter plus particulièrement les composes oligomères bêta de formule S
dans laquelle:
WO 93/1609~ PCl /FR93/001 15 les radlcaux ~ peuvent être Identlques ou différents et représentent chacun une base d'un acide nuclélque éventuellement modifiée, activable et/ou comportant un groupement Intercalant;
les radicaux X peuvant être identiques ou différents et représentent chacun un oxoanion O , un thloanion S , un groupe alkyle, un groupe alcoxy, aryloxy, un groupe aminoalkyle, un groupe amlnoalcoxy, un groupe thioalkyle, un radical alkyle ou alcoxy substitué par un hétérocycle a~oté ou un groupement -Y-Z;
!, R et R', qui peuvent être Identiques ou différents, représen-tent chacun un atome d'hydrogène ou un groupement -Y-Z ou Y'-Z';
Y et Y' identlques ou differents représentent chacun un radical alcoylène droit ou ramifié -alk- ou un radical choisi parmi E E E
-C-alk-, -C-NH-alk~ S, 1l-U-alk, -Il~-alk-, alk-O-alk O O O O O
E E
-alk-C-N-alk-, -P-U-alk-X-Cll-alk- et -P-U-aik-C-IN-alk- avec U = O, S ou N
En particuller, Y et Y' représentent un radlcal cholsl parml -(d U~c~n~ t-~ I u}~CH2~n~ C~CH23n~ -C-NH~~CH2~
avec U = O, S ou N
E peut avoir les mêmes slgnifications que X excepte Y-Z ou Y'-Z';
L représente O, S ou -NH-;
n et n' représentent un nombre entier y compris 0;
J représente un atome d'hydrogène ou un groupe hydroxy;
Z et i:', identiques ou différents, représentent chacun OH ou WO 93/16095 ' ~ PCl/FR93/00115 un radical correspondant à un agent effecteur, notamment un radlcal correspondant à un a~ent d'intercalation ou un radlcal porteur d'une fonction qui réaglt directement ou Indirectement avec les chaînes de nucléotides ou un radical dont la présence permet une détectlon faclle et 5 sensible.
Dans cette formule 1, on utilise la représentation condensée des nucléotides sulvante:
SJ
-o ~_ \ .
qui corres~ond à la formule développée:
~5~ 2I~S
\~
J
O ~3 sur laquelle ont été mentionnées les extrémités (3') et (5').
Il convient de remarquer que la formule I représente un enchaînement de 4'-thionucléotldes qui peuvent être identiques ou 25 différents, de configuration D ou L, n indiquan~ simplement le nombre de nucléotides compris dans la molécule; n est de préférence un nombre compris entre 1 et 50, et de préférence encsre entre 1 et 25.
On cite en partlculier les produits pour lesquels L represente I'oxygène; R et R' représen~ent l'hydrogène et a une base nuclelque 30 naturelle, soit adénlne, thymine, cytosine ou guanine quand J = H et adénine, uracile, cytosine et guanlne quand J = OH.
Les agents d'intercalation sont des produits connus dans les techniques relatives aux acides nuclélques; ce sont des composés capables WO 93/16095 pcr/FR93/ool lr ~` ~ Q J~ f` r~ !
,~. ,, ;. ,. ,, J
de "s'lntercaler" dans la structure des ADN ou ~es ARN, c'est-à-dlre capables de s'msérer entre les plateaux de base des acldes nuclelques.
Les agents d'intercalation peuvent êtrê cholsis parml les composés polycycllques ayant une configuratlon plane tels que l'acridlne et 5 ses dérlvés, la furocoumarlne et ses dérivés, la daunomyclne et les autres dérlvés de l'anthracycline, la l,10-phénanthroline, la phénanthrldlne et ses dérlvés, la prsf lavine, les porphyrlnes, les dérivés du dipyrldo [ 1 ,2-a
3',2'-d] imidazole, I'ellipticlne ou l'ellipticinium et leurs dérivés et le diazapyrène et ses dérivés.
}_es radlcaux chlmlques réactifs peuvent être des radicaux pouvant réagir directement ou indlrectement avec une chaîne de nucléotides pour former une llaison covalente ou pour la modifier chlmiquement, ou pour la couper. De préférence, ces radicaux chimiques réactifs sont activables, par exemple, par voie chimique, biochimique ou 1 5 photochimique~
Les radicaux réactifs activables peuvent être choisis parml l'acide éthylène-diamine-tetraacétique, I'acide diéthylène-triamlne-pentaacétique, les porphyrlnes, la I, I 0-phénanthroline, I'azido-4 acéto-phénone, l'éthylènc-imine, la bêta-chloroéthylamine, le psoralène et leurs 20 dérivés, et les composés aromatlques absorbant les radiations du proche ultra-violet ou du visible ou pouvant réagir chimiquement avec les constltuants nucléiques.
Plus particulièremens, les radicaux chimiquement actlvables en présence d'ions métalliques, d'oxygène et d'un agent réducteur (aclde 25 éthylène-diamine-tétraacétique, aclde diéthylène-trl-amine-pentaacétlque, porphyrine, phénanthroline) mdulsent la coupure dans des sequences d'acides nucléiques situées dans leur volsinage.
Par irradiation dans le domalne du visible ou du proche ultra-violet, il est possible d'actlver les derivés qui absorbent ces radiatlons30 et de réaliser des reactions de ponta~e ou des reactions photo-induites (coupure et modif ication des bases nucleiques) des acides nucléiques sur lesquels est fixé l'oligothionucléotide porteur du ~roupement acuvable.
PCl`/FR93/001 1 5 ') 93/16095 Parml les radlcaux Z et Z' peuven2 etre plus partlcullèrement c ~ tés:
- les radlcaux dérlvés de l'aclde éthylène-dlamlne-tétra-acét~que de formule: -Il _ C-O-R
~ ,~, N ~_, -NH-C _~ i I
. Il O
O
- les radicaux dérlvés de l'aclde diéthylène-triamine-pentaacétlque, - les radicaux dérivés de la méthylpyrroporphyrine de formule:
CN3 C~3 .. ~ :
C~ ~ C~{
~ O ~ ~JC~ N~ C~Hs -~N~ L=f \~
C~3 C2~S
~5 - les radlcaux derives de la phénanthrollne de formule:
N~
WO 93/16095 PCr/FR93/001 1 ~ 8 - les radlcaux dérlvés de l'acrldlne:
H-tl' c; ~.~J
,, .
- les radicaux dérivés de la proflavlne R représentant un groupement amlno (NH2) ou azldo (N3) - les radicaux dérives de la blotlne -C, ~-c~l2)4 S
Q
- les radicaux dér~vés de l'azldo-4 acétophénone de formule:
'13 ~3,C~2-93/16095 ~ ~ ~ PCr/FR93/0011 Le radlcal ~ peut être, de préférence, choisi parm~ les bases nucléiques naturelles (thymine, adénine, cytosine, guanine, uraclle) mals ll est possible d'utiliser des bases nuclélques modifiées. Peuvent être cltés l'ammo-2 adénine et ses dérivés substltués, par exemple, sur l'atome 5 d'azote N6 par un radical aminoalkylène ou par un radica! azldophényl-alkylène, la guanine substituée sur l'atome d'oxygène o6, par exemple, par - un groupement (w-alkylène)-9-acridine, la (w-aminoalkyl)-amlno-8-adénme et ses dérivés substitués sur le radical amino en w par un groupe acrldlne, ou les dérivés halogénés ou azidés tels que le bromo-5 uracile, l'azido-8 10 adénine, la 7-déazaadénine, la 7-déazaguanine. Il est possible également d'utiliser des dérivés des bases nucléiques comportant un groupement Intercalant ou un groupement chimiquement ou photochlmlquement actlvable. `
Ainsi, la f onctlonnalisation de C ou T par un groupement 15 azlridine en position 4 conduit à la formation de pontages covalents CH2-CH2 entre les deux brins complémentalres sur respectivement G e~ A.
Donc, plus particulièrement, le radical B est alors choisi parml la
}_es radlcaux chlmlques réactifs peuvent être des radicaux pouvant réagir directement ou indlrectement avec une chaîne de nucléotides pour former une llaison covalente ou pour la modifier chlmiquement, ou pour la couper. De préférence, ces radicaux chimiques réactifs sont activables, par exemple, par voie chimique, biochimique ou 1 5 photochimique~
Les radicaux réactifs activables peuvent être choisis parml l'acide éthylène-diamine-tetraacétique, I'acide diéthylène-triamlne-pentaacétique, les porphyrlnes, la I, I 0-phénanthroline, I'azido-4 acéto-phénone, l'éthylènc-imine, la bêta-chloroéthylamine, le psoralène et leurs 20 dérivés, et les composés aromatlques absorbant les radiations du proche ultra-violet ou du visible ou pouvant réagir chimiquement avec les constltuants nucléiques.
Plus particulièremens, les radicaux chimiquement actlvables en présence d'ions métalliques, d'oxygène et d'un agent réducteur (aclde 25 éthylène-diamine-tétraacétique, aclde diéthylène-trl-amine-pentaacétlque, porphyrine, phénanthroline) mdulsent la coupure dans des sequences d'acides nucléiques situées dans leur volsinage.
Par irradiation dans le domalne du visible ou du proche ultra-violet, il est possible d'actlver les derivés qui absorbent ces radiatlons30 et de réaliser des reactions de ponta~e ou des reactions photo-induites (coupure et modif ication des bases nucleiques) des acides nucléiques sur lesquels est fixé l'oligothionucléotide porteur du ~roupement acuvable.
PCl`/FR93/001 1 5 ') 93/16095 Parml les radlcaux Z et Z' peuven2 etre plus partlcullèrement c ~ tés:
- les radlcaux dérlvés de l'aclde éthylène-dlamlne-tétra-acét~que de formule: -Il _ C-O-R
~ ,~, N ~_, -NH-C _~ i I
. Il O
O
- les radicaux dérlvés de l'aclde diéthylène-triamine-pentaacétlque, - les radicaux dérivés de la méthylpyrroporphyrine de formule:
CN3 C~3 .. ~ :
C~ ~ C~{
~ O ~ ~JC~ N~ C~Hs -~N~ L=f \~
C~3 C2~S
~5 - les radlcaux derives de la phénanthrollne de formule:
N~
WO 93/16095 PCr/FR93/001 1 ~ 8 - les radlcaux dérlvés de l'acrldlne:
H-tl' c; ~.~J
,, .
- les radicaux dérivés de la proflavlne R représentant un groupement amlno (NH2) ou azldo (N3) - les radicaux dérives de la blotlne -C, ~-c~l2)4 S
Q
- les radicaux dér~vés de l'azldo-4 acétophénone de formule:
'13 ~3,C~2-93/16095 ~ ~ ~ PCr/FR93/0011 Le radlcal ~ peut être, de préférence, choisi parm~ les bases nucléiques naturelles (thymine, adénine, cytosine, guanine, uraclle) mals ll est possible d'utiliser des bases nuclélques modifiées. Peuvent être cltés l'ammo-2 adénine et ses dérivés substltués, par exemple, sur l'atome 5 d'azote N6 par un radical aminoalkylène ou par un radica! azldophényl-alkylène, la guanine substituée sur l'atome d'oxygène o6, par exemple, par - un groupement (w-alkylène)-9-acridine, la (w-aminoalkyl)-amlno-8-adénme et ses dérivés substitués sur le radical amino en w par un groupe acrldlne, ou les dérivés halogénés ou azidés tels que le bromo-5 uracile, l'azido-8 10 adénine, la 7-déazaadénine, la 7-déazaguanine. Il est possible également d'utiliser des dérivés des bases nucléiques comportant un groupement Intercalant ou un groupement chimiquement ou photochlmlquement actlvable. `
Ainsi, la f onctlonnalisation de C ou T par un groupement 15 azlridine en position 4 conduit à la formation de pontages covalents CH2-CH2 entre les deux brins complémentalres sur respectivement G e~ A.
Donc, plus particulièrement, le radical B est alors choisi parml la
4-azldo-cytosinc ou la 4-azldo-thymlne.
De préférence, le radical X représente un oxoamon.
20 Cependant, le radical X peut représenter un radlcal alkyle contenant 1 à 7 atomes de carbone ~méthyle, éthyle, propyle), un radical alcoxy dont la partle alkyle con~ient 1 à 7 atomes de carbone (méthoxy, éthoxy, diméthyl-2,2 propyloxy), un radical aminoalkyle ou aminoalcoxy de formule générale RlR2N-alk-A- dans laquelle A représente une liaison ou un atome 25 d'oxy~sène, -alk- représente un radlcal alkylene contenant 1 à 10 atomes de carbonc et R î et R2, identlques ou dlfférents, reprcsentent un atome d'hydrogène ou un radical alkyle contenant I à 7 atomes de carbone ou forment ensemble avec l'atome d'azote auquel ils sont lies un héterocycle azoté saturé à S ou 6 chaînons, étant entendu que le groupemcns RIR~-30 peut être quaternarisé, ou un radical alcoylthio dont la partle alcoylecont~ent 1 à 7 atomes de carbone.
Dans la formule (1), le radical -alk- est de préférence un radical alcoylène droit ou ramifié ayant de 1 à 10 atomes de carbone.
De préférence, le radical X représente un oxoamon.
20 Cependant, le radical X peut représenter un radlcal alkyle contenant 1 à 7 atomes de carbone ~méthyle, éthyle, propyle), un radical alcoxy dont la partle alkyle con~ient 1 à 7 atomes de carbone (méthoxy, éthoxy, diméthyl-2,2 propyloxy), un radical aminoalkyle ou aminoalcoxy de formule générale RlR2N-alk-A- dans laquelle A représente une liaison ou un atome 25 d'oxy~sène, -alk- représente un radlcal alkylene contenant 1 à 10 atomes de carbonc et R î et R2, identlques ou dlfférents, reprcsentent un atome d'hydrogène ou un radical alkyle contenant I à 7 atomes de carbone ou forment ensemble avec l'atome d'azote auquel ils sont lies un héterocycle azoté saturé à S ou 6 chaînons, étant entendu que le groupemcns RIR~-30 peut être quaternarisé, ou un radical alcoylthio dont la partle alcoylecont~ent 1 à 7 atomes de carbone.
Dans la formule (1), le radical -alk- est de préférence un radical alcoylène droit ou ramifié ayant de 1 à 10 atomes de carbone.
5 PCl/FR93/0011' I O
En partlculier, à partlr des fonctlons alcool termmales 3~ ou 5~
de l'oligothionucléotlde, I'effec~eur 7. peut donc être lntrodult v la une chaîne (CH2)n liée à une fonctlonnalisatlon Z', de natures dlverses à la partie osidique de l'ol~gomère.
A partlr de la formule suivante:
ou -O-Z I -(CH2) -effecteur ~Z) 5~ , 1 0 on obtlendra, selon ce que représente Z l, par exemple - un phosphate ou méthyl phosphonate de formule gu - 0~ P ~ U ~(C~ ,2 ou C~l, U = O, N ou S
- un éther de formule générale o~ CHI ~ C~ J'~ ,Z
- un ester de formule générale:
-O ~ CO t~ C~ ~ t~
ou encore 30 - un carbamate de formule générale:
-O ~ CO NH t-t C~l '~nZ
3 5 En général, n' est comprls entre I et 10.
WO 93/16095 ~ P~/FR93/00115 La présente Inventlon concerne également les composes précédents sous forme de sel avec des bases ou des acldes, et les composés sous forme racémlque, ou sous forme d'isomètres R ou S optiques purifiés ou en mélange, de formule (I).
La présente invention concerne de préférence les composés précédents de formule (I) dans la série D.
On cite en particulier les produits composés D-oligothlonu-cléotide de formule générale:
:~-0 ~5 B
o X/ o ¦ ? -- ~ o ~
~H .
25 dans laquelle J et X sont déflnls cornme précédemment pour les composés de formule (1) et a représente une base nucléique naturelle.
Les oligonucléotldes selon la présente invention peuvent se présenter sous forme de séquences homogènes, comme dans les composés de formule (I) ou sous forme d'ollgomères mixtes, c'est-à-dire sous forme de 30 séquences particulières Incluses dans d'autres types d'oligonucleotldes de type ADN ou ARN, modifiés ou non au niveau de l'encha~nement phosphate, ces derniers corresondant à des composés de formule (1), dans lesquels l'oxygène intracyclique du cycle furannose est rétabli.
WO 93/1609~ PCI /FR93/()0115 - - ~ 1 2 La présente Inventlon a donc éga~ement pour objet des composés oligomères mixtes caractérisés en ce qu'ils sont constltués par des composes oligothionucléotides selon l'invention liés à des oligonucléotldes de type ADN ou ARN. On entend ici par "oligonucléotides de type ADN ou ARN" une séquence d'acides nucléiques de type ADN ou ARN modiflés ou non au nlveau de l'enchaînement phosphate et dans lesquels l'hétéroatome intracyclique du cycle furannose des nucléotides est l'oxygène.
La présente invention a notamment pour objet des composés oligomères mixtes constitués par une séquence oligothionucléotidique selon I'inventiont comprenant une séquence oligonucléotidique de type ADN ou ARN en son sein ou à une de ses extrémités.
Dans un mode de réalisation particulier, donc,- la séquence oligonucléotidique, de type ADN ou ARN, est encadrée par deux séquences d'oligothioribonucléQtides.
Les nouveaux protuits de formule générale (I) ou oligomères mixtes en comportant peuvent être préparés par voie chimique par des procédés connus et, en particuliert ceux qui sont décrits dans les demandes de procédés connus et, en particulier, ceux qui sont décrits dans les demandes de brevets français FR 8301223 (2 540 122) et FR 8411795 ~2 568 254), WO 88/04301 et FR 88 122648.
Les composés oligothionucléotides notamment de formule (I) peuvent être préparés par voie chimique par des procédés dans lesquels on appllque des synthèses au phosphodiester, au phospho~riester, au phospho-ramidite ou à l'hydrogenophosphonate classiques pour des oli~onucléotldes.
Dans ces procédes, on prépare tout d'abord la chaîne de 4'-thionucléotides, les différents groupements non mis en oeuvre étant protégés, puis on élimine enfin les groupements protecteurs pour obtenlr les produits recherchés.
On cite en partlculier un procédé de synthèse de composes oligothionucléotides selon l'invention sans a8ent effecteur, caractérlse en ce que on réalise une synthèse supportée selon la methode au phospho-roamidite comportant - une protection en 3' et 5' des 4'-thionucléotides ou oligo4'-thionucleo-tides de départ avec par exemple du diméthoxytrityl en 5' et du diisopropylaminophosphoramidite de méthyle en 3', WO 93/1609~
- la fonctlonnallsatlon d'un support sollde lncorporant un dérlvé 4'-thlo-nucléosidique par un lien par exemple succlnyle entre le groupement hydroxyle-3' du dérlvé 4'-thionucléosidique et un ~roupement arnlno du support solide, - l'élongation de la chaîne oligothionucléotldlque dans un réacteur synthétiseur, - enfin le décrochage, la déprotection et la purification de l'oligothlonu-cléotide prolon~é.
On cite également un procédé de synthèse de composés oligothionucléotides Incorporant un agent effecteur selon l'invention caractérisé en ce que l'on part d'un oligothionucléotide sans agent effecteur, ou d'un oligomère mixte en comprenant, protégé en 5', dont on fait réagir la terminalson OH 3' avec une fonction non protégée d'un bras difonctionnel dont I deuxième fonction est protégée et après déprotection I S du produit résultant, on lie ledit produit à l'a~ent effecteur par la deuxième fonction libre du bras difonctionnel.
La terminalson OH 3' de l'oligomère protégé en 5' peut être estérifiée avec un acide amlnohexanolque, dont la fonction amlne est protégée.
Un procédé de préparation en phase solide de séquences oligothionucléotides selon la méthode au phosphoramidite, objet dela présente invention, comporte les étapes essentielles suivantes:
- On immoblllse un dérivé 4'-thionucléoside protégé par l'intermédlalre d'une de ses fonctions hydroxyle en 3' ou, le cas échéant, 2' sur un support solide.
- On assemble sur ce support dans un réacteur synthétlseur manuel ou 3utomatique la chaîne d'oligothionucleotlde protégée par condensation de monomères constltues de 4'-thionucleosldes protégés substitués par des groupes phosphoraml~ltes en 3', le cas échéant, la fonctlon hydroxyle en 2' des riboses étant protégée par les groupes Ctmp ou TE~D lS.
- Les oligothlonucleotldes sont obtenus après décrochage de l'oligomère obtenu du support et éiimination des groupes protecteurs.
PCl`/FR93/001 1 5 ~ ~, ~ c - 1 4 De façon approprlée, I'assemblage de l'ollgothlonucléotlde se fait par condensation, en présence d'un agent activateur, desdlts monomères entre leur fonction en 3' et la fonctlon 5' du composé
4'-thionucléoside immobll~sé pour le premler monomère ou d'un composé
intermédiaire polythionucléotlde protégé fixé sur ledlt composé thlonu-cléoside immobilisé pour les monomères sulvants.
Notamment, I'agent actlvateur pour la condensation desdlts monomères peut être choisi parmi le tétrazole et ses dérivés, tels que le para-nltrophényl tétrazole.
Avantageusement, le groupe phosphoramidite en 3' desdits monomères est un groupe N,N dlalkylaminophosphoramidite de formule /N(RI)2 -P
avec R 1 qui représente un alkyle en C 1 à C7 éventuellement substitué
identique ou différent, tel que CH3, (CH3)2CH.
R2 qui représente un alkyle en Cl à C7 éventuellement substltué, tel que CH3~ CH2CH2CN.
En particulier, le groupe phosphoramidite en 3' desdits monomères est le diisopropylamlnophosphoramidite de méthyl (R 1 =
(CH3)2CH et R2 = CH3) ou le cyano-2 éthyl diisopropylamlnophosphlte (R 1 = (CH 3)2CH et R2 = CH2CH2CN).
De façon approprlée, les groupes hydroxyles desdits mono-2~ mères et dudit composé 4'-thlonucléoside immobilisé peuvent être pro.tégés en 5' par lë groupe DmTr.
Le cornposé 4'thlonucléoside immobilisé peut être fixé sur le support solide via un groupe dlvalent succinyle entre un de ses groupements OH en 2' ou 3' qui se trouve alnsl estérifié, et un groupement amlno du suppor~.
Le support solide peut être constitué par une longue chaîne alkylamine fixee sur un polymère, un gel de silice ou des billes de verre poreuses.
WO 93/16095 , , ~ , PCl/FR93/00115 . J ~J .~
On peut clter comme groupe fonctlonnel permettant la fixation ou étant lié sur support sollde doté d'un groupe amlno, le ~roupe de formule -C-(CH2) pCOR4 avec p - 1 à ~, dans lequel R4 représente H un ~roupe d'activation tel que C6C15 ou un radical NH lié à un support solide tel que le radical NH d'une chaîne 10 alkylamine fixée sur un polymère, gel de silice ou billes de verre poreuses.
Un lntérêt des composés homogènes ou mixte~s selon la présente invention, comprenant une chaîne d'oligo-thio-nucleotides, est aussi de pouvoir envisager leur utilisation indépendamment d'agents effecteurs, notamment d'agents intercalants, puisque ces nouvelles 15 substances oligonucléotides assurent la reconnaisance de ia séquence d'acide nucleique complémentaire, notammen~ d'ARN, avec une stabllité
très accrue; la fonction de l'a~ent intercalant étant d'augmenter la stabilité du complexe d'hybridation, sa présence n'est plus obligatoire.
Les composés selon l'invention, par leur grande afflnl~é
20 spécifique des séquences oligothionucléotidiques pour des séquences nucléiques complémentaires, sont en effet supérieurs aux oligonucléotldes actuels dont l'affinite pour les séquences complémentalres est plus falble.
Les composés~ selon la presente invention, sont donc utilisables de manière plus efficace, à titre de sondes d'hybridation, mals 25 également comme composants de purification pour des séquences dé~erminées d'ADN ou d'ARN.
Ces composés peuvent également etre utiiisés pour détecter des mutatlons au niveau d'un ADN ou d'un ARN de manière plus efflcace.
Les composés de la présente inventlon, par la proprlé~é des 30 séquences oli~othionucléotidiques de se fixer fortement sur la séquence nucléique complémentaire, puis d'induire la coupure de la chaîne d'acldes nucléiques en ce site, notamment lorsqu'ils sont couplés à un agent de coupure, sont utilisables à titrc de nucléases artificielles spéc~fiques de séquences. Ils peuvcr-t ~tre utilisés comme réactifs en biologie moléculalre 3~ ou en 8énie génétique.
~ a présence de la fonctlon hydroxyle en 2', le cas échéant, permet en outre d'envisager leur utilisation comme ribozymes artlficiels, que ce soit sous forme de séquences oli~othioribonucléotidiques homo~ènes ou mixtes~ c'est-à-dire associées à des oligonucléotides de type ADN ou 5 ARN.
L'objet de la présente invention est également l'application des composés selon l'invention pour réaliser le blocage spécifique des gènes cellulaires ou d'agents pathogènes préalablement choisis (virus, bactéries, parasites).
l 0 Les composés selon l'invention sont donc aussi utilisables à
titre de rnédicaments.
Les nouveaux produits de formule générale (I) selon l'invention et les prodults de formule générale (1~ dans laquelle L
représente un atome d'oxygène, R et R' représentent chacun un atome l 5 d'hydrogène et B représente une base nucléique naturelle forment des complexes d'hybridation avec les séquences complémentaires d'ARN
beaucoup plus stables que ceux qui sont formés avec l'ADN.
En particulier, les produits de formule (I) dans lesquels J = OH
(oligothioribonucléotides) s'apparient de manière plus stable avec des séquences d'ARN complémentaires que les produits de formule (I) dans lesquels J = H (oligothiodésoxyribonucléolides).
Compte tenu du falt que les cibles des molécules anti-sens en ~hérapies sont les gènes ARN messagers, cette propriété des oll~othio-ribonucléotides est tout à fai~ intéressante.
Cette différence de stabilité des complexes d'hybrldatlon permet une inhibition préférentlelle des ARNs messagers et des ARNs viraux sans risque important de provoquer des effets indésirables au nlveau de l'ADN du génome.
De plus, vis-à-vls des ARNs, les produits selon l'inventlon 3~ forment généralemcnt des cornplexes plus stables que ceux qui sont obtenus à partir des oligonucléotides naturels.
Les composés oligothioribonucléotides selon l'inventlon, notamment de formule (I) (J = OH), présentcnt en outre un certain nombre de caractéris~iques intéressantes, notamment pour une application comme 3S agent antisens:
WO 93/16095 PCI`/FR93/00115 - la confiE~uration bêta naturelle est respectée, - ils sont lsoélectriques des ARN naturels, - lls n~ont pas de chiralité au nlveau de la lialson phosphodiester~
- IIS sont plus lipophiles que les analogues naturels à cause de la présence 5 de l'atome de soufre.
Les séquences des ollgothionucléotides, couplés ou non à un agent intercalant ou à un groupement activable chimlquement ou photochimiquement, comportant un enchaînement de nucléosldes pyrlml-diques sont capables de se fixer sur une double hélice d'ADN ou d'ARN
10 comportant une séquence de bases puriques adjacentes associées par lialson hydrogene à la séquence complémentaire des bases pyrimidiques. Cette fixation implique la formation locale d'une trlple hélice dans laquelle les bases oyrimidiques de l'oligothionucléotide forment des liaisons hydrogène (de type Hoogsteen ou Hoogsteen inversé~ avec les bases puriques de la 15 double hélice. Dans ce contcxte, les oligothionucléotides forment des complexes plus stables que les oligonucléotides correspondants et lls permettent d'induire des réactions irréversibles (pontage, modification ou coupure) sur une double hélice d'ARN ou d'ADN.
'~es nouveaux produits de formule générale (I) selon 20 I'invention et les produits de formule générale (I) dans laquelle L
représente un atome d'oxygène, R et R' représentent chacun un atome d'hydrogène et a représente une base nucléique naturelle, qui possèdent la propriété de se fixer fortement sur la séquence nucléique complémentalre, ou oligomères mixtes en comprenant, peuvent être utilisés comme sondes 25 pour detecter la présence d'une chaîne de nucléotides complémentalres.
Cet~e détection est facilitée par la présence d'un groupe fluorescent ou d'un groupe biotine dans ces molécules.
La structure non naturelle des oligothionucléotides confère des propriétés d'antigénicité rendant ainsi possible la preparatlon 30 d~anticorps specifiques dirigés con~re des oligothionucléotides éven~uel-lement couplés à un agent Intercalant ou contre leurs complexes avec un ADN ou un ARN naturels.
Dans un but diagnostique ou pronostique, les oligothlonu-cléotides, éventuellement couplés à un agent intercalant, ou oligommères ~5 mixtes en comprenant, peuvent être attachés de façon covalente à un WO 93J16095 PCr/FR9~/00115 ~ t i~ 1 8 support solide. Le couplage à un marqueur luminescen~ ou générateur d'une réaction colorée, lumlnescente ou fluorescente permet de les utlllser comme sondes de séquences d'ADN ou d'ARN dans un but dia~nostique ou pronostique.
Les oligothionucléotides selon l'lnvention sont beaucoup plus réslstants vis-à-vis des nucléases que les dérivés de nucléosides naturels.
Cette stabilité vis-à-vis de l'hydrolyse enzymatique permet l'utilisation des produits selon l'inventlon, notamment de formule générale (1), ou oligomères mixtes en comprenant, dans des expérlmentations in vivo ou m vitro en présence de nucléases. f)e ce fait, les oligothionucléotides selon l'invention présentent des avantages lncontestables sur les dérivés de bêta-nucléosides déjà connus.
Les composés oligothioribonucléotides de formule (I) pour lesquels J = OH sont plus résitants à la dégradation enzymatiques que les composés oligothiodésoxyribonucléotides de formule I pour lesquels J = H.
Dès lors, comme on l'a vu, un autre objet de la présente invention concerne l'application des nouveaux produits selon l'inventlon, notamment de formule générale (1), et des produits de formule générale (1) dans laquelle L représente un atome d'oxygène, R et R' représentent chacun un atome d'hydro~ène et E~ représente une base nucléique naturelle, en particulier les produits pour lesquels J = OH, ou oligomères mlxtes en comprenant, au blocage spéclfique de glènes cellulalres ou d'agents pathogènes préalablement choisis (virus, bactéries, parasites), en partlculler les ARNm.
Les nouveaux produits selon l'invention, notamment de formule générale (I), et les produits de formule générale (I) dans laquelle L
représente un atome d'oxygène, R et R' representent chacun un atome d'hydrogène et B représente une base nucléique na~urelle, en particuller les produits pour lesquels J = OH, ou oligomères mixtes en comprenant, sont particulièrement utiles comme médicaments permettant de bloquer les gènes indésirables exogènes ~virus, bactéries, paraslte~) ou endogènes (gènes cellulairess oncogènes), en particulier les ARNm. L'expression de ces gènes peut ~tre bloquée en a~ssant soit directement sur l'ADN ou l'ARN
porteur de l'information génétique, soit sur l'ARN messager, copie du gène, WO 93/16095 ~, PC~/FR93/00115 en bloquant alors toute traduc~lon par hybridation ou par hybridatlon pUlS
pontage ou modification ou coupure de l'ARN messager ou vlral chois comme cible.
Ce blocage peut être réallsé en utilisant un produit selon 5 I'lnvention, notamment de formule ~énérale (I), ou un produit de formule ~énérale ~I) dans laquelle L représente un atome d'oxygène, R et R' représentent chacun un atome d'hydrogène et ~ représente une base nucléique naturelle, en particulier les produits pour lesquels J = OH, ou oligomères mixtes en comprenant, dont la séquence est complémentaire de l0 celle d'une région non complexée d'un ARN ou d'un ADN et, en particulier, d'un ARN messager. L'hybridation, suivie ou non du ponta~e, de la modification ou de la coupure de l'ARN messager ou viral, empêche la synthèse de l'ARN ou de la proteine correspondante ou l'expression des fonctions virales ou parasitaires.
Si cet ARN ou cette protéine est vital pour le virus, la bactérie ou le parasite, les produits selon l'invention, notamment de formule générale (I), et les produits de formule générale (I) dans laquelle L
représente un atome d'oxygene, R et R' représentent chacun un atome d'hydrogène et B représente une base nucléique naturelle, en prticulier les 20 produits pour lesquels J = OH, ou oligomères mixtes en comprenant, constitueront des médicaments à activité antivirale, antibactérlenne ou antiparasitaire.
Si cet ARN ou cette protéine n'est pas vital pour l'organisme, il est possible d'en supprlmer sélectlvement les effets. Oans ce cas, les 25 produits selon l'invention, notamment de formule générale (I), et les produits de formule générale (I) dans laquelle L représente un atome d'oxygène, R et R' représentent chacun un atome d'hydrogène et B
représente une base nucléique naturelle, en particulier les prodults pour lesquels J = OH, ou oligomères mlxtes en comprenant, constltueront solt des 30 médicaments à activité antltumorale lorsque le gène visé ou son AR,N
messager code pour une protéine lmpliquée dans la transformatlon cellulaire, soit des médicaments capables de supprimer le caractère de résistance aux antiviraux, aux antibiotiques ou aux antiparasitaires lorsque la protéine codée est responsable de l'inactlvation des antibiotiques, des 35 antiviraux ou des antiparasitaires.
WO 93/16095 P~/FR93/00115 Des effets cytotoxiques spécifiques peuvent être obtenus par action d'un produit selon l'inventlon, notamment de formule (1), ou d'un produit de formule générale (I) dans laquelle L représente un atome d'oxygène, R et R' représentent chacun un atome d'hydrogène et B
représente une base naturelle, en particulier les produits pour lesquels J =
OH, ou oligomères mixtes en comprenant, sur une fonction cellulalre indispensable à la cellule cible.
Les oligomères mixtes d'oligothioribonucléotides selon l'invention, comprenant une séquence oligonucléotidique d'ADN où
I'oxygène intracyclique est rétabli, sont particulièrement intéressants dans une utilisation comme agent antisens~ Ces oligomères mixtes sont susceptibles d'être hautement sélectifs dans la mesure où la "fenêtre" de structure ADN est seule substrat de la RNAse H après appariement de l'antisens avec sa séquence cible complémentaire d'ARNm, la dite RNAse H
induisant alors la coupure du complexe ADN/ARN.
D'autres caracteristiques et avantages de la présente invention apparaîtront à la lumière des exemples qui vont suivre.
La Figure 1 représente la courbe de stabilité thermique du duplex betadT5(SrT)dT6/bêtadC2A12C2 comparativement à celle du duplex naturel bêtadT121bêtadC~A12C2.
La Figure 2 représente la courbe de digestion enzymatique de beta~Sr~)dT 1 1-Dans la description qui suit, l'abréviation rS ou Sr précède un thioribonucléo~ide.
. 30 WO 93/16095 ~ ~ ~ n ~ 1~ I PCr/FR93/0011~
. _ ,,, ., i, l-SYNTHESE DE THIONUCLEOTIDES.
I . 1~ Les premières synth~ses de thiosucrcs ont et~ effecnlee~ entre 1960 et 1970.
Dew~ e~cemples sont donnés:
I~ syn~hèse de derivés du ~thi~ribofura~no~e se fait selon le schéma 1:
CHO ~IO ¦ OCH~ HO OCH, ~c~or rO or P
I
oC~ - ¦ oC~ T-O ¦ oc~, ~~1 ~~1 ~~1 ~2~ 3~
RO Ol~ ` ' ~ ' IP ID
S S R O
~_ O~o -- ~ OR
~0 OA~s ~0 0~ Q'O -~
SCHEMA I
Ce compos~ est ob~ 8 ~pes à par~ du L-L~ncos~ a~roc u~ ~eDdcm0~ global de 6 ~.
- R. IL W~DSrL~, W. E. DICK, T. R. INGLE, R. M. R~iVELL et B. URBAS. l~ ~8 30 Ch~m., 1964, 22. 3~372S.
- 8. URB~S et R. L. WHISTLER, J. r8. Chcm., 1966, 31. 8l3~816.
- E. 1. REIST, D. E. GU~ROY ct L. GOODM~N, J. ~ Ch~ Soc., 196~, ~, S6S~S663.
^ R. L. W~SILER et J. N. BeMlLLER d~ ~ Mahods ~ C~r~r~ Ch~ustnl' . R.
35 L. V~STLER et M. L. WOLFROM, Ed~., A~de~c P~, l~c., Nc~ ~orlc. l962. Vol.
I.p.79.
FEU~L~ EM~L~'`MENT
WO 93/16095 PCI~FK93/0011 ~ , ~ 2 Les déri~é~ du 4-thio-2-désoxy-~ribofurannose ont été obtenus selon le schema ~:
~OCH ~OCH3 ~/ C~3 O~Z
H O9n H C~
~5 HS~ --~ ~OCH3 AcS OCH3 OCH 5 OBn H OBn 11 OH
FEUILLE DE REMPLA~EMENT
WO 93/16095 ", ~ , PCI'/FR93/001 15 Cette svstthèsc cn 14 étapes conduit au mcth~ desoxv 4-tllio-D-c~o-pentofurannoside a~ec un rendemcnt ~lobal de 8 'O
- ~1'. L. Fl: et M. BOBE};. J. Or~. Chem . 1976. 41, 3831 3834.
5 - '1 . L. Fl i et M. BOBE};. dans ' Nclelc .~f-d ~ `hemlstn ". L. TOWSE~D et R S
TlPSQ~.Eds.. 19~8. P~r~ I pp. 183 19~
- ~. G. ~'AYAK et R.L. WHISTLER Llehl~s Ann Chem.~ 19701 741. 131 138.
De fa~on scmblable~ Iff déri~es du 4~thi~rabinofursnnose ont e~e obtenus:
- R. L. WHISTLER U. G. NAYAK et A ~' PERKIN' ~r.. J. Or~.. Chem.. 1970. 3~. 519-10 j~ I, 1. '. Les nucleosides co~espondants ont ensuite etc synthe~ises:a~ En scrie 4'-thio-2'-daoxy-D~ribofur~nnose - Y. L. Fl~ et M. BOBEK dans n Nuclelc Acid Chem~s~ry `', L. TOWSE~'D. R. L.
TIPSO~. Eds.. John Wiley & Sons. New ~ or~ 1978. p.; 17.
b) En ~erie 4'-thio-D-ribofur~nnose F. ~. REIST, D. E. GUEFFROY et L. GOODMA~. J. Am. Ct~em.~oc196~. 8~.
5658~663.
- E. J. RElST~ D. E. GUEFFROY ct L. GOODMAN~ Chem. Ind.. 196~. 1;6~-1365 - B. URBAS et ~. L. WHlSTLER J. Or~. Chem.~ 19S6. 31~ 813-816.
- M. BOBEK. R. L. WHlSTLER et A. BLOCH. J. Med Chem.. 1970. 13. ~1 1~1;
- M. BOBEK~ A. BLOCH. R PARTHASARATHY et R. L. WHISTL~R J .~led ~hem.. 1975, ~8. 784- 787.
- M. BOBEK. R. L. WHlSTLER et A. Bl,OCH. J Med ~hem.. 197~. 15. 168-171 - !~'. 9TOTANI ~t R. L. WHISTLER J. Med. Chem.. 1974. 17. 535- S;' - M. W. PIClCERlNG. J. T WITKOWS~I et R. 1~. ROE~BI~S. J. Med. (`hem 1976 9. 84 1 -842.
-A K M.ANlSUZAM~'et!~I D .4MI~`. J. Ban~ladeshAcad Scl.. 1978.'. 59-64 3Q - D. J HOFFMAN ct R~ L WHISTLER Blochemlsm~. 1970. 9. ~;6- - 'i7Q
c) Dans d'autre~ ~enes:
- R.G.S. RITCHI~ et W. A. SZ~REK J Chem. Soc Chem. Commu~. 1973. 686 - E J. REIST. L. V. FISCHER ct L. GOODMAN. J. Org Chem ~ 1968. 33~ 189-- R. L. WHISTLER L~ U' DONER et 1,' G. I\;AYA~ J~ Or~. Chem . 19 71. 36~ 108-110.
FEUILLE DE REMPLACEMENT
WO 93/160~5 PCl/FR93/00115 Ces nucleosides sont obtenus par les voies traditionnelles de la s~nthèse des nucleosides en sene oxvgenee.
Soit par 19 methode aux sel~ de mé~Jlux lourds:
Traitement de l'hcterocycle chloromcrcun4uc avcc le cl~o~osucrc correspondant - ~1. BOBE};. R. L. WHISTLER et A. BLOCH. J. Me~l. Chem., 1972. 15. 168-171 - D. E. GI~EFFROY et L. GOODM~. Chem. & lnd.. 1~64, l364-1365.
- E. J. REIST. M. BOBEK. R. L. WHISTLER et A. BLOCH~ J. Med Chem.. 1970. 13. 1 1 1-413.
- E. ~. RElST. D. E. GUEFFROY et L. GOODMAN, J. Am. Chem.Soc.. 1964. 86. 56~8-5663.
- E. J. REIST. L. V. FISCHER ct L. GOOD~ l, J. Org. Chem.. 1968. 33. 189 19' Soit p~r b m~thode de HILBERT et JOHNSON, 15 ~ par contensation dc 18 base pyrimidiniquc avec le dliochlorosucre co~cspond~nt.
- B. I~RBAS et R L. WHISl'LER J. Org. Chem.~ 1966, 3I~ 813-816.
- par condensation des denves silyles des bascs et tes thiochlo~osucres co~cspondants - ~1. BOBEK A. BLOCH~ R. PARTHASARATHY ct R. L. WHISTLER J. .~t~t. ( `hem .
19~S. t8~ ~84 787.
- R. L. WHISTLER L. W. DONER et U. G. NAYAK J. Org. Chem.. 19~1. 36. 108-110 2û - ~. OTOTANI et R. L. WHISTLER J. Med. Chem.~ 1974. 17. 535-5i7 - p~r b re ction de fu~ion du 3-cyano 1.2.4 triazole e~ du 1.~.3.5 teaa-O-acer l- l-thio-D-nbofuran~osc.
- ~. V. PICKERING. ~. T. WITK(:)WS~;l ct R. K. ROBI~S~ J. Me~l. Chem . 1976. 19. 8~ 1^
842.
~ psr IB méthode de VORBRUGGEI~i et Nll :DBALLA par condcnsanon de l'adeninc cs du 1,2,3.S te~ O-accryl thionbofurannosc en presence de catalvseur FRIEDEL
et CRAFTS.
- A. K. M. ANlSU&~i et ~vl. D AMIN, J. Bangladesh Acad. Scl.~ 1978. 2. ~9-6 Depuis peu~ 19 synthe de thionuclh ides ~ de nouve-u connu de l'int~ret .~insi. }c 2'.3'.5' tri-Q-bcnzyl 4'-tho~ -xvlofilJannosyl uracile a ete obtenu par une ~ole onginale selon le schema 3:
M W BREDNKAMP C W HOLZAPFEL et A D. SWANEPOEL Telrohe~ron 1.~11 .
199~. 31. ~S9-2~62.
- M. W. BREDENKAMP. C ~h. HOLZAPFEL A. O. SWA~EPC)EL. ~ r J (`n~
3~ t991. ~4. 31-33.
FEUILLE DE REMPLACEMENT
WO 93/16095 PCl`/FR93/00115 .. ~ . .-- ,,~ ~ " .~
. . ~ . . t ;s~/sBn ~, S~sar ~
~ 3~ B2 HO ~ ~ zO _ ~ ~ MsO-- MsC
3zO/ BlO~ 6zO/
\ ,. `
\i O
azo~ S (Y~ ~Z~l `
''~ ~hOAc i = oxyde dc dibutyl étain; ii = MsCI; iii = E~nCl: iv = iodure de tetra-butvlammon~um.
carbonate de barium; v = Hg(OAc)2 t AcOH; vi = Methode d'HlL8ERT JO~SO~;
25 modifiée.) La svnthèse d'analo~ues pynmidiniques de 4'-thio 2'-desoxv nucleosides a ete publiee - ~. R. DYSON. P. L. COE et R. T. WALKER J. Med. Chem.. 1991, 3~. ?78?-~786 par la med~ode de HORTON et MAR}COVS.
- D. HORTON et R. A. MARKOVS, Carboh.vdr~)e ~es.~ 1980, 80.356.
Elle cst illus~c pa~ le scbema 4:
FEUILLE DE REMPLACEMENl-WO 93/16095 P~/FR93JOOIlS
~6 ,~
r~
~n ~-- S /
, ~ Sa~ , ~nO~
3n`J ~f~' ~i = H~CI~. CdC03) D'une façon s~nblable~ les 2'-desoxy-4'-d~iocv~idine, 2'-désoxv-4'-thiouridine et 4-thiothv~idine ont he obtenus par J. A. SECRlST III et Coll. (J. A. SECRlST. };. !~;.
15 TIU'ARL J. M. RlORDA~ et J. A. MONTGOMERY. J. Med. Chem.. 1991. 3~. ~361-'~366?; ( J. A. MO~T&OMERY et J. A. SECRIST 111. PCT Int. Appl. U'O 910~$.0;~ ) à
parnr du 2-desoxy~4-thio-B-D-ery~ro~pentofurannose svnthétise selon BOBEK et Coll. (`s .
L. F~. M. BOBE~ J. Org. Chem.. 19?6, 41~ 3831-3834.) en utilisant le T!vlSTf comme catalvseur de coupla~e.
La s~thèse du 4'-thio 2'-désoxv-D- ribofurannose a fai~ l'objet d'un brevet ct de publlcanons - European Patcnt Applicanon. 0421 777 A I . R. T. WAL~;ER
- M. R. DYSON. P. L. COE et R. T. WALKER J. Chem. Soc. Chem. Comm. 1991.741-74~
- M R. DYSO~, P. L. COE et R. T WAL~;ER Carbohvdrale Res . 1991. 216. ';7-~48 Elle est decrite sur le schema ~:
FEUILLE DE REMPl_hCEMENT
WO 93/16095 ~ ! PCI`/FR93/00115 CHO
r)~ nO~
I r rLr~ anO
'~"2`J
0~ SBn ( ~ SBn ( v ` ~7 ~n anC~~( 9 0 ~ n OB~ OBn ~n i~ (vii) ~nO--~ ( viii, ix x ~ ~OAt ~nO RO
(i = HCl / MeOH. ii = BDBr I THF, iii = 8nSH / HCL iv = Ph3P / DEAD / BzOH i THF~ v =
McONa / MeOH / CH~C12~ vi = MsCl / Pyr.. vii -= Nal / CO3Ba / Acctone. ~ln - BC13 CH ~C12~ ix = p-toluovlCI~ x = Ac~O / H2S04) SCHEMA S
FEUILLE DE REMPLACEMENT
WO 93/16095 pcrtFR93/ool 15 J'1 Des ribothionucleosides dérivés des py~imidines ont fait l'objet du même brevet. Mais la svnthèse du thioribofi~rannose de depart a été realisee selon la methodc de E. ~. REIST.
- E J. REIST, D. E. GUEFFROY et L. GOODMAN. J. Am. Chem. Soc.~ 1964~ 84~ 5658.
5 1. 3.SYNTHESE DES SY~THONS DU 4'-THIO-BETA-D-RIBOFURA~OSE
NECESSAIRES A L'OBTENTlON DE THlOOLlGOMERES.
On a realisé la synthèse du L-thioLyxofurannose et du D-thioRibofuranslose en 7 etapes a pamr du D-ribose et du L-lyxose respectivement avec 29 et 21 % de rendemen~
respectivement. Cette synthèsc est illustree sur le schema 6.
Cuo ~0~ ' ~~ n ~_ 3nG~ C--r' 20~ 3nO OBn 2 o ~ ~ _ O
3nC OAc ~
3~ 09n 9r!C r~n '3 (i = MeOH, HCI~ BnBr~ KOH; iii = HCL.H~O.dioxane; iv = BnSH. HCI. ~ = ~tesCL.
pyr.: vi = NBu41. BaCO3; ~ni = Hg(OAc)2) FEUILLE DE REMPLA~EMENT
WO 93/1609~ PCr/FR93/00 Ls synthè~e pour obtenir le thio-D-ribofur~nno~e utilise le L~ o~e comme produit de départ comme d~n~ b ~nthese de WHISTLER ( page l9). Ce~te strstegie e~t appelée strategie C1--C4 . En effet. I'stomc de soufre e~t tout d'abord introduit en position anomère et une substitution nucleophile SN2 entre l'~tome de soufre porté par le5 carbone anomère (Cl) et le c~rbone C4 porteur d'u~ OH activé par un groupementMe~yl (Ms) ess en3uite e~fectuée. Cette str~tegie sppliquée ~ 1~ synthèse du ~thio-D-ribofurannose et du 4-thio-lrlyxofursnnose rsemble i celle que WALKER a utilisépour parvenir i la série 2~ o~y-D-ri~ofursnno~e ( Brevet ~ur. Pat. 0421 777 A 1 psge
En partlculier, à partlr des fonctlons alcool termmales 3~ ou 5~
de l'oligothionucléotlde, I'effec~eur 7. peut donc être lntrodult v la une chaîne (CH2)n liée à une fonctlonnalisatlon Z', de natures dlverses à la partie osidique de l'ol~gomère.
A partlr de la formule suivante:
ou -O-Z I -(CH2) -effecteur ~Z) 5~ , 1 0 on obtlendra, selon ce que représente Z l, par exemple - un phosphate ou méthyl phosphonate de formule gu - 0~ P ~ U ~(C~ ,2 ou C~l, U = O, N ou S
- un éther de formule générale o~ CHI ~ C~ J'~ ,Z
- un ester de formule générale:
-O ~ CO t~ C~ ~ t~
ou encore 30 - un carbamate de formule générale:
-O ~ CO NH t-t C~l '~nZ
3 5 En général, n' est comprls entre I et 10.
WO 93/16095 ~ P~/FR93/00115 La présente Inventlon concerne également les composes précédents sous forme de sel avec des bases ou des acldes, et les composés sous forme racémlque, ou sous forme d'isomètres R ou S optiques purifiés ou en mélange, de formule (I).
La présente invention concerne de préférence les composés précédents de formule (I) dans la série D.
On cite en particulier les produits composés D-oligothlonu-cléotide de formule générale:
:~-0 ~5 B
o X/ o ¦ ? -- ~ o ~
~H .
25 dans laquelle J et X sont déflnls cornme précédemment pour les composés de formule (1) et a représente une base nucléique naturelle.
Les oligonucléotldes selon la présente invention peuvent se présenter sous forme de séquences homogènes, comme dans les composés de formule (I) ou sous forme d'ollgomères mixtes, c'est-à-dire sous forme de 30 séquences particulières Incluses dans d'autres types d'oligonucleotldes de type ADN ou ARN, modifiés ou non au niveau de l'encha~nement phosphate, ces derniers corresondant à des composés de formule (1), dans lesquels l'oxygène intracyclique du cycle furannose est rétabli.
WO 93/1609~ PCI /FR93/()0115 - - ~ 1 2 La présente Inventlon a donc éga~ement pour objet des composés oligomères mixtes caractérisés en ce qu'ils sont constltués par des composes oligothionucléotides selon l'invention liés à des oligonucléotldes de type ADN ou ARN. On entend ici par "oligonucléotides de type ADN ou ARN" une séquence d'acides nucléiques de type ADN ou ARN modiflés ou non au nlveau de l'enchaînement phosphate et dans lesquels l'hétéroatome intracyclique du cycle furannose des nucléotides est l'oxygène.
La présente invention a notamment pour objet des composés oligomères mixtes constitués par une séquence oligothionucléotidique selon I'inventiont comprenant une séquence oligonucléotidique de type ADN ou ARN en son sein ou à une de ses extrémités.
Dans un mode de réalisation particulier, donc,- la séquence oligonucléotidique, de type ADN ou ARN, est encadrée par deux séquences d'oligothioribonucléQtides.
Les nouveaux protuits de formule générale (I) ou oligomères mixtes en comportant peuvent être préparés par voie chimique par des procédés connus et, en particuliert ceux qui sont décrits dans les demandes de procédés connus et, en particulier, ceux qui sont décrits dans les demandes de brevets français FR 8301223 (2 540 122) et FR 8411795 ~2 568 254), WO 88/04301 et FR 88 122648.
Les composés oligothionucléotides notamment de formule (I) peuvent être préparés par voie chimique par des procédés dans lesquels on appllque des synthèses au phosphodiester, au phospho~riester, au phospho-ramidite ou à l'hydrogenophosphonate classiques pour des oli~onucléotldes.
Dans ces procédes, on prépare tout d'abord la chaîne de 4'-thionucléotides, les différents groupements non mis en oeuvre étant protégés, puis on élimine enfin les groupements protecteurs pour obtenlr les produits recherchés.
On cite en partlculier un procédé de synthèse de composes oligothionucléotides selon l'invention sans a8ent effecteur, caractérlse en ce que on réalise une synthèse supportée selon la methode au phospho-roamidite comportant - une protection en 3' et 5' des 4'-thionucléotides ou oligo4'-thionucleo-tides de départ avec par exemple du diméthoxytrityl en 5' et du diisopropylaminophosphoramidite de méthyle en 3', WO 93/1609~
- la fonctlonnallsatlon d'un support sollde lncorporant un dérlvé 4'-thlo-nucléosidique par un lien par exemple succlnyle entre le groupement hydroxyle-3' du dérlvé 4'-thionucléosidique et un ~roupement arnlno du support solide, - l'élongation de la chaîne oligothionucléotldlque dans un réacteur synthétiseur, - enfin le décrochage, la déprotection et la purification de l'oligothlonu-cléotide prolon~é.
On cite également un procédé de synthèse de composés oligothionucléotides Incorporant un agent effecteur selon l'invention caractérisé en ce que l'on part d'un oligothionucléotide sans agent effecteur, ou d'un oligomère mixte en comprenant, protégé en 5', dont on fait réagir la terminalson OH 3' avec une fonction non protégée d'un bras difonctionnel dont I deuxième fonction est protégée et après déprotection I S du produit résultant, on lie ledit produit à l'a~ent effecteur par la deuxième fonction libre du bras difonctionnel.
La terminalson OH 3' de l'oligomère protégé en 5' peut être estérifiée avec un acide amlnohexanolque, dont la fonction amlne est protégée.
Un procédé de préparation en phase solide de séquences oligothionucléotides selon la méthode au phosphoramidite, objet dela présente invention, comporte les étapes essentielles suivantes:
- On immoblllse un dérivé 4'-thionucléoside protégé par l'intermédlalre d'une de ses fonctions hydroxyle en 3' ou, le cas échéant, 2' sur un support solide.
- On assemble sur ce support dans un réacteur synthétlseur manuel ou 3utomatique la chaîne d'oligothionucleotlde protégée par condensation de monomères constltues de 4'-thionucleosldes protégés substitués par des groupes phosphoraml~ltes en 3', le cas échéant, la fonctlon hydroxyle en 2' des riboses étant protégée par les groupes Ctmp ou TE~D lS.
- Les oligothlonucleotldes sont obtenus après décrochage de l'oligomère obtenu du support et éiimination des groupes protecteurs.
PCl`/FR93/001 1 5 ~ ~, ~ c - 1 4 De façon approprlée, I'assemblage de l'ollgothlonucléotlde se fait par condensation, en présence d'un agent activateur, desdlts monomères entre leur fonction en 3' et la fonctlon 5' du composé
4'-thionucléoside immobll~sé pour le premler monomère ou d'un composé
intermédiaire polythionucléotlde protégé fixé sur ledlt composé thlonu-cléoside immobilisé pour les monomères sulvants.
Notamment, I'agent actlvateur pour la condensation desdlts monomères peut être choisi parmi le tétrazole et ses dérivés, tels que le para-nltrophényl tétrazole.
Avantageusement, le groupe phosphoramidite en 3' desdits monomères est un groupe N,N dlalkylaminophosphoramidite de formule /N(RI)2 -P
avec R 1 qui représente un alkyle en C 1 à C7 éventuellement substitué
identique ou différent, tel que CH3, (CH3)2CH.
R2 qui représente un alkyle en Cl à C7 éventuellement substltué, tel que CH3~ CH2CH2CN.
En particulier, le groupe phosphoramidite en 3' desdits monomères est le diisopropylamlnophosphoramidite de méthyl (R 1 =
(CH3)2CH et R2 = CH3) ou le cyano-2 éthyl diisopropylamlnophosphlte (R 1 = (CH 3)2CH et R2 = CH2CH2CN).
De façon approprlée, les groupes hydroxyles desdits mono-2~ mères et dudit composé 4'-thlonucléoside immobilisé peuvent être pro.tégés en 5' par lë groupe DmTr.
Le cornposé 4'thlonucléoside immobilisé peut être fixé sur le support solide via un groupe dlvalent succinyle entre un de ses groupements OH en 2' ou 3' qui se trouve alnsl estérifié, et un groupement amlno du suppor~.
Le support solide peut être constitué par une longue chaîne alkylamine fixee sur un polymère, un gel de silice ou des billes de verre poreuses.
WO 93/16095 , , ~ , PCl/FR93/00115 . J ~J .~
On peut clter comme groupe fonctlonnel permettant la fixation ou étant lié sur support sollde doté d'un groupe amlno, le ~roupe de formule -C-(CH2) pCOR4 avec p - 1 à ~, dans lequel R4 représente H un ~roupe d'activation tel que C6C15 ou un radical NH lié à un support solide tel que le radical NH d'une chaîne 10 alkylamine fixée sur un polymère, gel de silice ou billes de verre poreuses.
Un lntérêt des composés homogènes ou mixte~s selon la présente invention, comprenant une chaîne d'oligo-thio-nucleotides, est aussi de pouvoir envisager leur utilisation indépendamment d'agents effecteurs, notamment d'agents intercalants, puisque ces nouvelles 15 substances oligonucléotides assurent la reconnaisance de ia séquence d'acide nucleique complémentaire, notammen~ d'ARN, avec une stabllité
très accrue; la fonction de l'a~ent intercalant étant d'augmenter la stabilité du complexe d'hybridation, sa présence n'est plus obligatoire.
Les composés selon l'invention, par leur grande afflnl~é
20 spécifique des séquences oligothionucléotidiques pour des séquences nucléiques complémentaires, sont en effet supérieurs aux oligonucléotldes actuels dont l'affinite pour les séquences complémentalres est plus falble.
Les composés~ selon la presente invention, sont donc utilisables de manière plus efficace, à titre de sondes d'hybridation, mals 25 également comme composants de purification pour des séquences dé~erminées d'ADN ou d'ARN.
Ces composés peuvent également etre utiiisés pour détecter des mutatlons au niveau d'un ADN ou d'un ARN de manière plus efflcace.
Les composés de la présente inventlon, par la proprlé~é des 30 séquences oli~othionucléotidiques de se fixer fortement sur la séquence nucléique complémentaire, puis d'induire la coupure de la chaîne d'acldes nucléiques en ce site, notamment lorsqu'ils sont couplés à un agent de coupure, sont utilisables à titrc de nucléases artificielles spéc~fiques de séquences. Ils peuvcr-t ~tre utilisés comme réactifs en biologie moléculalre 3~ ou en 8énie génétique.
~ a présence de la fonctlon hydroxyle en 2', le cas échéant, permet en outre d'envisager leur utilisation comme ribozymes artlficiels, que ce soit sous forme de séquences oli~othioribonucléotidiques homo~ènes ou mixtes~ c'est-à-dire associées à des oligonucléotides de type ADN ou 5 ARN.
L'objet de la présente invention est également l'application des composés selon l'invention pour réaliser le blocage spécifique des gènes cellulaires ou d'agents pathogènes préalablement choisis (virus, bactéries, parasites).
l 0 Les composés selon l'invention sont donc aussi utilisables à
titre de rnédicaments.
Les nouveaux produits de formule générale (I) selon l'invention et les prodults de formule générale (1~ dans laquelle L
représente un atome d'oxygène, R et R' représentent chacun un atome l 5 d'hydrogène et B représente une base nucléique naturelle forment des complexes d'hybridation avec les séquences complémentaires d'ARN
beaucoup plus stables que ceux qui sont formés avec l'ADN.
En particulier, les produits de formule (I) dans lesquels J = OH
(oligothioribonucléotides) s'apparient de manière plus stable avec des séquences d'ARN complémentaires que les produits de formule (I) dans lesquels J = H (oligothiodésoxyribonucléolides).
Compte tenu du falt que les cibles des molécules anti-sens en ~hérapies sont les gènes ARN messagers, cette propriété des oll~othio-ribonucléotides est tout à fai~ intéressante.
Cette différence de stabilité des complexes d'hybrldatlon permet une inhibition préférentlelle des ARNs messagers et des ARNs viraux sans risque important de provoquer des effets indésirables au nlveau de l'ADN du génome.
De plus, vis-à-vls des ARNs, les produits selon l'inventlon 3~ forment généralemcnt des cornplexes plus stables que ceux qui sont obtenus à partir des oligonucléotides naturels.
Les composés oligothioribonucléotides selon l'inventlon, notamment de formule (I) (J = OH), présentcnt en outre un certain nombre de caractéris~iques intéressantes, notamment pour une application comme 3S agent antisens:
WO 93/16095 PCI`/FR93/00115 - la confiE~uration bêta naturelle est respectée, - ils sont lsoélectriques des ARN naturels, - lls n~ont pas de chiralité au nlveau de la lialson phosphodiester~
- IIS sont plus lipophiles que les analogues naturels à cause de la présence 5 de l'atome de soufre.
Les séquences des ollgothionucléotides, couplés ou non à un agent intercalant ou à un groupement activable chimlquement ou photochimiquement, comportant un enchaînement de nucléosldes pyrlml-diques sont capables de se fixer sur une double hélice d'ADN ou d'ARN
10 comportant une séquence de bases puriques adjacentes associées par lialson hydrogene à la séquence complémentaire des bases pyrimidiques. Cette fixation implique la formation locale d'une trlple hélice dans laquelle les bases oyrimidiques de l'oligothionucléotide forment des liaisons hydrogène (de type Hoogsteen ou Hoogsteen inversé~ avec les bases puriques de la 15 double hélice. Dans ce contcxte, les oligothionucléotides forment des complexes plus stables que les oligonucléotides correspondants et lls permettent d'induire des réactions irréversibles (pontage, modification ou coupure) sur une double hélice d'ARN ou d'ADN.
'~es nouveaux produits de formule générale (I) selon 20 I'invention et les produits de formule générale (I) dans laquelle L
représente un atome d'oxygène, R et R' représentent chacun un atome d'hydrogène et a représente une base nucléique naturelle, qui possèdent la propriété de se fixer fortement sur la séquence nucléique complémentalre, ou oligomères mixtes en comprenant, peuvent être utilisés comme sondes 25 pour detecter la présence d'une chaîne de nucléotides complémentalres.
Cet~e détection est facilitée par la présence d'un groupe fluorescent ou d'un groupe biotine dans ces molécules.
La structure non naturelle des oligothionucléotides confère des propriétés d'antigénicité rendant ainsi possible la preparatlon 30 d~anticorps specifiques dirigés con~re des oligothionucléotides éven~uel-lement couplés à un agent Intercalant ou contre leurs complexes avec un ADN ou un ARN naturels.
Dans un but diagnostique ou pronostique, les oligothlonu-cléotides, éventuellement couplés à un agent intercalant, ou oligommères ~5 mixtes en comprenant, peuvent être attachés de façon covalente à un WO 93J16095 PCr/FR9~/00115 ~ t i~ 1 8 support solide. Le couplage à un marqueur luminescen~ ou générateur d'une réaction colorée, lumlnescente ou fluorescente permet de les utlllser comme sondes de séquences d'ADN ou d'ARN dans un but dia~nostique ou pronostique.
Les oligothionucléotides selon l'lnvention sont beaucoup plus réslstants vis-à-vis des nucléases que les dérivés de nucléosides naturels.
Cette stabilité vis-à-vis de l'hydrolyse enzymatique permet l'utilisation des produits selon l'inventlon, notamment de formule générale (1), ou oligomères mixtes en comprenant, dans des expérlmentations in vivo ou m vitro en présence de nucléases. f)e ce fait, les oligothionucléotides selon l'invention présentent des avantages lncontestables sur les dérivés de bêta-nucléosides déjà connus.
Les composés oligothioribonucléotides de formule (I) pour lesquels J = OH sont plus résitants à la dégradation enzymatiques que les composés oligothiodésoxyribonucléotides de formule I pour lesquels J = H.
Dès lors, comme on l'a vu, un autre objet de la présente invention concerne l'application des nouveaux produits selon l'inventlon, notamment de formule générale (1), et des produits de formule générale (1) dans laquelle L représente un atome d'oxygène, R et R' représentent chacun un atome d'hydro~ène et E~ représente une base nucléique naturelle, en particulier les produits pour lesquels J = OH, ou oligomères mlxtes en comprenant, au blocage spéclfique de glènes cellulalres ou d'agents pathogènes préalablement choisis (virus, bactéries, parasites), en partlculler les ARNm.
Les nouveaux produits selon l'invention, notamment de formule générale (I), et les produits de formule générale (I) dans laquelle L
représente un atome d'oxygène, R et R' representent chacun un atome d'hydrogène et B représente une base nucléique na~urelle, en particuller les produits pour lesquels J = OH, ou oligomères mixtes en comprenant, sont particulièrement utiles comme médicaments permettant de bloquer les gènes indésirables exogènes ~virus, bactéries, paraslte~) ou endogènes (gènes cellulairess oncogènes), en particulier les ARNm. L'expression de ces gènes peut ~tre bloquée en a~ssant soit directement sur l'ADN ou l'ARN
porteur de l'information génétique, soit sur l'ARN messager, copie du gène, WO 93/16095 ~, PC~/FR93/00115 en bloquant alors toute traduc~lon par hybridation ou par hybridatlon pUlS
pontage ou modification ou coupure de l'ARN messager ou vlral chois comme cible.
Ce blocage peut être réallsé en utilisant un produit selon 5 I'lnvention, notamment de formule ~énérale (I), ou un produit de formule ~énérale ~I) dans laquelle L représente un atome d'oxygène, R et R' représentent chacun un atome d'hydrogène et ~ représente une base nucléique naturelle, en particulier les produits pour lesquels J = OH, ou oligomères mixtes en comprenant, dont la séquence est complémentaire de l0 celle d'une région non complexée d'un ARN ou d'un ADN et, en particulier, d'un ARN messager. L'hybridation, suivie ou non du ponta~e, de la modification ou de la coupure de l'ARN messager ou viral, empêche la synthèse de l'ARN ou de la proteine correspondante ou l'expression des fonctions virales ou parasitaires.
Si cet ARN ou cette protéine est vital pour le virus, la bactérie ou le parasite, les produits selon l'invention, notamment de formule générale (I), et les produits de formule générale (I) dans laquelle L
représente un atome d'oxygene, R et R' représentent chacun un atome d'hydrogène et B représente une base nucléique naturelle, en prticulier les 20 produits pour lesquels J = OH, ou oligomères mixtes en comprenant, constitueront des médicaments à activité antivirale, antibactérlenne ou antiparasitaire.
Si cet ARN ou cette protéine n'est pas vital pour l'organisme, il est possible d'en supprlmer sélectlvement les effets. Oans ce cas, les 25 produits selon l'invention, notamment de formule générale (I), et les produits de formule générale (I) dans laquelle L représente un atome d'oxygène, R et R' représentent chacun un atome d'hydrogène et B
représente une base nucléique naturelle, en particulier les prodults pour lesquels J = OH, ou oligomères mlxtes en comprenant, constltueront solt des 30 médicaments à activité antltumorale lorsque le gène visé ou son AR,N
messager code pour une protéine lmpliquée dans la transformatlon cellulaire, soit des médicaments capables de supprimer le caractère de résistance aux antiviraux, aux antibiotiques ou aux antiparasitaires lorsque la protéine codée est responsable de l'inactlvation des antibiotiques, des 35 antiviraux ou des antiparasitaires.
WO 93/16095 P~/FR93/00115 Des effets cytotoxiques spécifiques peuvent être obtenus par action d'un produit selon l'inventlon, notamment de formule (1), ou d'un produit de formule générale (I) dans laquelle L représente un atome d'oxygène, R et R' représentent chacun un atome d'hydrogène et B
représente une base naturelle, en particulier les produits pour lesquels J =
OH, ou oligomères mixtes en comprenant, sur une fonction cellulalre indispensable à la cellule cible.
Les oligomères mixtes d'oligothioribonucléotides selon l'invention, comprenant une séquence oligonucléotidique d'ADN où
I'oxygène intracyclique est rétabli, sont particulièrement intéressants dans une utilisation comme agent antisens~ Ces oligomères mixtes sont susceptibles d'être hautement sélectifs dans la mesure où la "fenêtre" de structure ADN est seule substrat de la RNAse H après appariement de l'antisens avec sa séquence cible complémentaire d'ARNm, la dite RNAse H
induisant alors la coupure du complexe ADN/ARN.
D'autres caracteristiques et avantages de la présente invention apparaîtront à la lumière des exemples qui vont suivre.
La Figure 1 représente la courbe de stabilité thermique du duplex betadT5(SrT)dT6/bêtadC2A12C2 comparativement à celle du duplex naturel bêtadT121bêtadC~A12C2.
La Figure 2 représente la courbe de digestion enzymatique de beta~Sr~)dT 1 1-Dans la description qui suit, l'abréviation rS ou Sr précède un thioribonucléo~ide.
. 30 WO 93/16095 ~ ~ ~ n ~ 1~ I PCr/FR93/0011~
. _ ,,, ., i, l-SYNTHESE DE THIONUCLEOTIDES.
I . 1~ Les premières synth~ses de thiosucrcs ont et~ effecnlee~ entre 1960 et 1970.
Dew~ e~cemples sont donnés:
I~ syn~hèse de derivés du ~thi~ribofura~no~e se fait selon le schéma 1:
CHO ~IO ¦ OCH~ HO OCH, ~c~or rO or P
I
oC~ - ¦ oC~ T-O ¦ oc~, ~~1 ~~1 ~~1 ~2~ 3~
RO Ol~ ` ' ~ ' IP ID
S S R O
~_ O~o -- ~ OR
~0 OA~s ~0 0~ Q'O -~
SCHEMA I
Ce compos~ est ob~ 8 ~pes à par~ du L-L~ncos~ a~roc u~ ~eDdcm0~ global de 6 ~.
- R. IL W~DSrL~, W. E. DICK, T. R. INGLE, R. M. R~iVELL et B. URBAS. l~ ~8 30 Ch~m., 1964, 22. 3~372S.
- 8. URB~S et R. L. WHISTLER, J. r8. Chcm., 1966, 31. 8l3~816.
- E. 1. REIST, D. E. GU~ROY ct L. GOODM~N, J. ~ Ch~ Soc., 196~, ~, S6S~S663.
^ R. L. W~SILER et J. N. BeMlLLER d~ ~ Mahods ~ C~r~r~ Ch~ustnl' . R.
35 L. V~STLER et M. L. WOLFROM, Ed~., A~de~c P~, l~c., Nc~ ~orlc. l962. Vol.
I.p.79.
FEU~L~ EM~L~'`MENT
WO 93/16095 PCI~FK93/0011 ~ , ~ 2 Les déri~é~ du 4-thio-2-désoxy-~ribofurannose ont été obtenus selon le schema ~:
~OCH ~OCH3 ~/ C~3 O~Z
H O9n H C~
~5 HS~ --~ ~OCH3 AcS OCH3 OCH 5 OBn H OBn 11 OH
FEUILLE DE REMPLA~EMENT
WO 93/16095 ", ~ , PCI'/FR93/001 15 Cette svstthèsc cn 14 étapes conduit au mcth~ desoxv 4-tllio-D-c~o-pentofurannoside a~ec un rendemcnt ~lobal de 8 'O
- ~1'. L. Fl: et M. BOBE};. J. Or~. Chem . 1976. 41, 3831 3834.
5 - '1 . L. Fl i et M. BOBE};. dans ' Nclelc .~f-d ~ `hemlstn ". L. TOWSE~D et R S
TlPSQ~.Eds.. 19~8. P~r~ I pp. 183 19~
- ~. G. ~'AYAK et R.L. WHISTLER Llehl~s Ann Chem.~ 19701 741. 131 138.
De fa~on scmblable~ Iff déri~es du 4~thi~rabinofursnnose ont e~e obtenus:
- R. L. WHISTLER U. G. NAYAK et A ~' PERKIN' ~r.. J. Or~.. Chem.. 1970. 3~. 519-10 j~ I, 1. '. Les nucleosides co~espondants ont ensuite etc synthe~ises:a~ En scrie 4'-thio-2'-daoxy-D~ribofur~nnose - Y. L. Fl~ et M. BOBEK dans n Nuclelc Acid Chem~s~ry `', L. TOWSE~'D. R. L.
TIPSO~. Eds.. John Wiley & Sons. New ~ or~ 1978. p.; 17.
b) En ~erie 4'-thio-D-ribofur~nnose F. ~. REIST, D. E. GUEFFROY et L. GOODMA~. J. Am. Ct~em.~oc196~. 8~.
5658~663.
- E. J. RElST~ D. E. GUEFFROY ct L. GOODMAN~ Chem. Ind.. 196~. 1;6~-1365 - B. URBAS et ~. L. WHlSTLER J. Or~. Chem.~ 19S6. 31~ 813-816.
- M. BOBEK. R. L. WHlSTLER et A. BLOCH. J. Med Chem.. 1970. 13. ~1 1~1;
- M. BOBEK~ A. BLOCH. R PARTHASARATHY et R. L. WHISTL~R J .~led ~hem.. 1975, ~8. 784- 787.
- M. BOBEK. R. L. WHlSTLER et A. Bl,OCH. J Med ~hem.. 197~. 15. 168-171 - !~'. 9TOTANI ~t R. L. WHISTLER J. Med. Chem.. 1974. 17. 535- S;' - M. W. PIClCERlNG. J. T WITKOWS~I et R. 1~. ROE~BI~S. J. Med. (`hem 1976 9. 84 1 -842.
-A K M.ANlSUZAM~'et!~I D .4MI~`. J. Ban~ladeshAcad Scl.. 1978.'. 59-64 3Q - D. J HOFFMAN ct R~ L WHISTLER Blochemlsm~. 1970. 9. ~;6- - 'i7Q
c) Dans d'autre~ ~enes:
- R.G.S. RITCHI~ et W. A. SZ~REK J Chem. Soc Chem. Commu~. 1973. 686 - E J. REIST. L. V. FISCHER ct L. GOODMAN. J. Org Chem ~ 1968. 33~ 189-- R. L. WHISTLER L~ U' DONER et 1,' G. I\;AYA~ J~ Or~. Chem . 19 71. 36~ 108-110.
FEUILLE DE REMPLACEMENT
WO 93/160~5 PCl/FR93/00115 Ces nucleosides sont obtenus par les voies traditionnelles de la s~nthèse des nucleosides en sene oxvgenee.
Soit par 19 methode aux sel~ de mé~Jlux lourds:
Traitement de l'hcterocycle chloromcrcun4uc avcc le cl~o~osucrc correspondant - ~1. BOBE};. R. L. WHISTLER et A. BLOCH. J. Me~l. Chem., 1972. 15. 168-171 - D. E. GI~EFFROY et L. GOODM~. Chem. & lnd.. 1~64, l364-1365.
- E. J. REIST. M. BOBEK. R. L. WHISTLER et A. BLOCH~ J. Med Chem.. 1970. 13. 1 1 1-413.
- E. ~. RElST. D. E. GUEFFROY et L. GOODMAN, J. Am. Chem.Soc.. 1964. 86. 56~8-5663.
- E. J. REIST. L. V. FISCHER ct L. GOOD~ l, J. Org. Chem.. 1968. 33. 189 19' Soit p~r b m~thode de HILBERT et JOHNSON, 15 ~ par contensation dc 18 base pyrimidiniquc avec le dliochlorosucre co~cspond~nt.
- B. I~RBAS et R L. WHISl'LER J. Org. Chem.~ 1966, 3I~ 813-816.
- par condensation des denves silyles des bascs et tes thiochlo~osucres co~cspondants - ~1. BOBEK A. BLOCH~ R. PARTHASARATHY ct R. L. WHISTLER J. .~t~t. ( `hem .
19~S. t8~ ~84 787.
- R. L. WHISTLER L. W. DONER et U. G. NAYAK J. Org. Chem.. 19~1. 36. 108-110 2û - ~. OTOTANI et R. L. WHISTLER J. Med. Chem.~ 1974. 17. 535-5i7 - p~r b re ction de fu~ion du 3-cyano 1.2.4 triazole e~ du 1.~.3.5 teaa-O-acer l- l-thio-D-nbofuran~osc.
- ~. V. PICKERING. ~. T. WITK(:)WS~;l ct R. K. ROBI~S~ J. Me~l. Chem . 1976. 19. 8~ 1^
842.
~ psr IB méthode de VORBRUGGEI~i et Nll :DBALLA par condcnsanon de l'adeninc cs du 1,2,3.S te~ O-accryl thionbofurannosc en presence de catalvseur FRIEDEL
et CRAFTS.
- A. K. M. ANlSU&~i et ~vl. D AMIN, J. Bangladesh Acad. Scl.~ 1978. 2. ~9-6 Depuis peu~ 19 synthe de thionuclh ides ~ de nouve-u connu de l'int~ret .~insi. }c 2'.3'.5' tri-Q-bcnzyl 4'-tho~ -xvlofilJannosyl uracile a ete obtenu par une ~ole onginale selon le schema 3:
M W BREDNKAMP C W HOLZAPFEL et A D. SWANEPOEL Telrohe~ron 1.~11 .
199~. 31. ~S9-2~62.
- M. W. BREDENKAMP. C ~h. HOLZAPFEL A. O. SWA~EPC)EL. ~ r J (`n~
3~ t991. ~4. 31-33.
FEUILLE DE REMPLACEMENT
WO 93/16095 PCl`/FR93/00115 .. ~ . .-- ,,~ ~ " .~
. . ~ . . t ;s~/sBn ~, S~sar ~
~ 3~ B2 HO ~ ~ zO _ ~ ~ MsO-- MsC
3zO/ BlO~ 6zO/
\ ,. `
\i O
azo~ S (Y~ ~Z~l `
''~ ~hOAc i = oxyde dc dibutyl étain; ii = MsCI; iii = E~nCl: iv = iodure de tetra-butvlammon~um.
carbonate de barium; v = Hg(OAc)2 t AcOH; vi = Methode d'HlL8ERT JO~SO~;
25 modifiée.) La svnthèse d'analo~ues pynmidiniques de 4'-thio 2'-desoxv nucleosides a ete publiee - ~. R. DYSON. P. L. COE et R. T. WALKER J. Med. Chem.. 1991, 3~. ?78?-~786 par la med~ode de HORTON et MAR}COVS.
- D. HORTON et R. A. MARKOVS, Carboh.vdr~)e ~es.~ 1980, 80.356.
Elle cst illus~c pa~ le scbema 4:
FEUILLE DE REMPLACEMENl-WO 93/16095 P~/FR93JOOIlS
~6 ,~
r~
~n ~-- S /
, ~ Sa~ , ~nO~
3n`J ~f~' ~i = H~CI~. CdC03) D'une façon s~nblable~ les 2'-desoxy-4'-d~iocv~idine, 2'-désoxv-4'-thiouridine et 4-thiothv~idine ont he obtenus par J. A. SECRlST III et Coll. (J. A. SECRlST. };. !~;.
15 TIU'ARL J. M. RlORDA~ et J. A. MONTGOMERY. J. Med. Chem.. 1991. 3~. ~361-'~366?; ( J. A. MO~T&OMERY et J. A. SECRIST 111. PCT Int. Appl. U'O 910~$.0;~ ) à
parnr du 2-desoxy~4-thio-B-D-ery~ro~pentofurannose svnthétise selon BOBEK et Coll. (`s .
L. F~. M. BOBE~ J. Org. Chem.. 19?6, 41~ 3831-3834.) en utilisant le T!vlSTf comme catalvseur de coupla~e.
La s~thèse du 4'-thio 2'-désoxv-D- ribofurannose a fai~ l'objet d'un brevet ct de publlcanons - European Patcnt Applicanon. 0421 777 A I . R. T. WAL~;ER
- M. R. DYSON. P. L. COE et R. T. WALKER J. Chem. Soc. Chem. Comm. 1991.741-74~
- M R. DYSO~, P. L. COE et R. T WAL~;ER Carbohvdrale Res . 1991. 216. ';7-~48 Elle est decrite sur le schema ~:
FEUILLE DE REMPl_hCEMENT
WO 93/16095 ~ ! PCI`/FR93/00115 CHO
r)~ nO~
I r rLr~ anO
'~"2`J
0~ SBn ( ~ SBn ( v ` ~7 ~n anC~~( 9 0 ~ n OB~ OBn ~n i~ (vii) ~nO--~ ( viii, ix x ~ ~OAt ~nO RO
(i = HCl / MeOH. ii = BDBr I THF, iii = 8nSH / HCL iv = Ph3P / DEAD / BzOH i THF~ v =
McONa / MeOH / CH~C12~ vi = MsCl / Pyr.. vii -= Nal / CO3Ba / Acctone. ~ln - BC13 CH ~C12~ ix = p-toluovlCI~ x = Ac~O / H2S04) SCHEMA S
FEUILLE DE REMPLACEMENT
WO 93/16095 pcrtFR93/ool 15 J'1 Des ribothionucleosides dérivés des py~imidines ont fait l'objet du même brevet. Mais la svnthèse du thioribofi~rannose de depart a été realisee selon la methodc de E. ~. REIST.
- E J. REIST, D. E. GUEFFROY et L. GOODMAN. J. Am. Chem. Soc.~ 1964~ 84~ 5658.
5 1. 3.SYNTHESE DES SY~THONS DU 4'-THIO-BETA-D-RIBOFURA~OSE
NECESSAIRES A L'OBTENTlON DE THlOOLlGOMERES.
On a realisé la synthèse du L-thioLyxofurannose et du D-thioRibofuranslose en 7 etapes a pamr du D-ribose et du L-lyxose respectivement avec 29 et 21 % de rendemen~
respectivement. Cette synthèsc est illustree sur le schema 6.
Cuo ~0~ ' ~~ n ~_ 3nG~ C--r' 20~ 3nO OBn 2 o ~ ~ _ O
3nC OAc ~
3~ 09n 9r!C r~n '3 (i = MeOH, HCI~ BnBr~ KOH; iii = HCL.H~O.dioxane; iv = BnSH. HCI. ~ = ~tesCL.
pyr.: vi = NBu41. BaCO3; ~ni = Hg(OAc)2) FEUILLE DE REMPLA~EMENT
WO 93/1609~ PCr/FR93/00 Ls synthè~e pour obtenir le thio-D-ribofur~nno~e utilise le L~ o~e comme produit de départ comme d~n~ b ~nthese de WHISTLER ( page l9). Ce~te strstegie e~t appelée strategie C1--C4 . En effet. I'stomc de soufre e~t tout d'abord introduit en position anomère et une substitution nucleophile SN2 entre l'~tome de soufre porté par le5 carbone anomère (Cl) et le c~rbone C4 porteur d'u~ OH activé par un groupementMe~yl (Ms) ess en3uite e~fectuée. Cette str~tegie sppliquée ~ 1~ synthèse du ~thio-D-ribofurannose et du 4-thio-lrlyxofursnnose rsemble i celle que WALKER a utilisépour parvenir i la série 2~ o~y-D-ri~ofursnno~e ( Brevet ~ur. Pat. 0421 777 A 1 psge
6). Par e~emple, le produit S (Schema S) de WALKER est semblable à notre produit 10 (Schema 6) en serie L-L~xofurannose.
~G ~nO~ ~ ;
OA~ 1 Base ~ B
éterocyclique \~
~ n EnO OBn 13 ~ - I t~3, 14 -B - U 15~, 15B
B = ~ 16~, 16B
B - A 11~ ,n `~
(i = BSA T~SSTf~CH3CN; ii = BBr3, CH Cl~
La svnthèse des thionucleosides de l'uracilc ~ de la thvm~ne et de la cvtosine a ete effectuee en utilisant le bis-lruncthylsilvl acctamite (BSA) conune a~ent silvlant ct Ic tnmcthvlsihl trifluoromethanc sulfGnate (TMSTfl comme agent de couplage. Les nucleosides O et B ont eté obtenus avec 74 . 77 et 7Q % de .~udement rcspectivcmcnt ~ La s~thcse des thionucleosides de l'adenine a è~e rea1iscc pu le SnC14 dans l'acctorutrile. ~es nucleosldes O
35 et B sont obtcnus avcc 58 % de rendement (Schema 7)~
Il. SYNTHESE D'OLlGO-l~llONUCLEOTlDES SUR SUPPORT SOLIDE.
FElJlL~E DE f~El~Pl.ACEhlENT
WO g3/16095 PCI`/FR93/00115 ~ s . ~ 1 3 o La s~nthèse supportée des B oli~o-thionbonuclcoodes a cte effecn~ee à l aldc d un s~nthe~seur GENE modèle APPLIED BIOSYSTEM 31 8A sclon la mcthode aw phosphorsmidites Elle est semblable à cclle dccrite pour la scric ~ oligodesoxy~ibo~ucleonde naturelle par 5 CARUTHERS ct Coll (S~ L BEAUCAGE et M H CARUTHERS. Jélrahedron Lel~.
1981. 22. 18S9 1862; L ~. Mc BRlDE ct M H CARUTHERS, Tetr~hedron Letl.. 1983. 24.
~45-248.) ct a celle decnte par USM~i et Coll pour les oligoribonucleatidcs (~ l,'SI~
OGILVIE. M Y. JlANG et R J. CEDERGRE~'. J An~ Chem. Soc.. 1987. 109. 7845-7854.3 Cette ~ynthèse a nécessite 1) Ls ~r~on de synthons B d~ioribonucleoside phosphoramidites S correspondant aux bascs T. U. C, A et G.
I13 La fonc~onnalisation du support solide inco~porant un dcnve B
thionbo~ucléosidique .
m) L'élonp~on te la chai~c oligothioribonuclcondi4ue à }'aide d`un svnthcnseur automatique~
IV) Enfin, au telme tu Dombre requis de cycles de sy~thèse~ l'oligothionucleo~ide a etc decroche dc so~ suppor~ deprotege et purifie Il.1 - SyDtb~e du pbosphonmidite de~ bê~-thioribonucleoside 26 a-d.
Il 1 I Syn~èse d,es den~es 5'-DmTr-2'~TBDMS (Schéma 8) Le probleme maje~ da~s la s~thesc chimlque des oligonbonuclcosidcs cst la presence de l~ydroxyle en 2' t~s lc cyclc ribosc ou thioribosc ~ui da~ande une protection selecnve La sclcc~ao~ d'un groupcmcnt protec~cur pour l~ydroxyle en 2' doit colTespondrc a plusleurs critères, il doi~ être st~b}e:
- sous les w~diaoDs dc couplage pendant la deprotec~oo des ~roupements protecteurs en 5' pour pennenre l'extension de 1~1 chaine - pendant l'oxytuion d~s le cas dc la methode aux phosphites tnesters - pcntant le masquagc qui SUit le coupla~e.
- pend~nt b tcprosecsion dcs groupements protectcurs dcs ~mincs cxoc~cllqucs - pendant la dcprotcction tes phospbatcs.
- et d~s Ic cas des s~mthcses sur supp~r~ solide pcndant Ic cli~ragc de l`olleomcre du suppor~.
FEUILLE DE REMPLA~EMENT
WO 93/16095 ~ PCI /FR93/OOl lS
Fma~ement ce groupement pro~ccteur doit ctre cnleve sous dcs co~ditions très douces pow ev~ter une attaquc de la fonc~ion hydroxyle en 2' lib~ree sur la liuson phosphodiester adjacente.
5 ~ n nom~rc impor~nt dc stratégics p~ur protcger les hydroxyles en 2' ODt ete dcveloppees et illus~rcnt les tifficultes ~ans lc choix tu schema de protecnon tes groupemcnts hvdroxvles.
IC. B. REESE. Nucleosides Nvcleolldes. 1985, 4. 117-127; R. }CIER~ECK. M. H.
CARUTHERS. C. E. LONGFEI_LOW. D. SW~NTON. D. H. TURNIER et S. M. FREIER
Blochem~slrv. 1986. 2S, 7840-7846; S. IU'AI et E. OHTSUIC~ Nucleic Acids Res.. 19~8.
16~ 9443-9456;
10 C. LEHMA~. Y. Z. XU. C. CHRlSTOWULOU. Z. K. TAN et M. ~. G.UT. ~vucletc Ac~ es.. 1989, 17. 2379-2390; T. TANAKA~ S. TAMATSUICU~l. et M. IKEHAR~
h~ucleicAcids Res.. 1986, 14, 626S-62?9.).
L'uilis tion dc groupements protectc~s alkylsilyl et not~nmcnt le ler~-butyldimethvlsil~l ~TBDMS) pour l~ytroxy!e en 2' a facilité la sy~thèse des oligoribonucleotides. Le ~oupement TBDMS est suffis~ment st~blc duls des contitio~s acides ou basiques et est facilemcnt c~leve pu le fluorurc te ~ctro bu~yl ~o~ium d~s le I~IF pour être utilise dl~ns la strategic cn phase solide (N. USMAN, K. K. OGILVIE, M. Y. JU.~Ci ct R. L.
LEDERGEN~ J. An~ Che~ Soc.~ 1987. 109, 784S-78S4; N. USMAN~ K. NICOGHOSIA~.
R. L. CEDERGl~EN et K. K. OGlLVIE, Proc. Na~L Sct. USA, 1988, 8S, S764-S768.; S. A.
SCANNGE. C. F. FRANC~Cl,Y~ et N. USMAN. ~uclcic Acids Res., 1990~ 18~ 5433-S441.;K. K. OGlLVIE et M. J. NEMER re~ cdron Len., 1980, 21, 41S9: R T. PO~ et K. K. OGILVIE~ Nucleosides Nucfeondes~ 1984~ 3~ 48S: R. T. PON et ~. K. OGll VIE~
~ra~edron Le~., 1984, 2S~ 713.) On a donc appliqué en scric B oligothioribonucleo~de le schema de protccrion utilise pour les nucléosites oxyge~es (Schema 8).
A savoir lcs protec~oDs:
zoyl pour l'adcDinc et la c~osine~ isoButyl po~ la guani~c en tant que protccoondes groupeme~ ino exocycliques - Dime~oxy~ityl (DmTr) pour prote~er les hydroxyles pr~ires en 5`.
- ~ert-butyldimé~ymsi}yl (TBDMS) pour prote~er l~ydroxyle sccondaire en ' - Me~oxy po~ la protecion des phosphates~
La premie ~pe permet de prote~ 1 bydroxyle libre en 5' pu u~ ~upcment aclde labile le DmTr (Scbema ~).Ainsi le denve nucleosidique ~ est trute par le chlorure de dim~box~itylc ( 1.27 cqt~ivalcnts mol~r:es~ d~s la pyTid~ne Jnhydrc sous a~nosphere 3~ incste. Aprcs t~cnt usuel du mel~ge ~o~el, le dcnvc dim~thoxv~i~vle 23 est p~fie p~r chrom togr phie sur ~el dc silice et isolc avec tcs rcndements ~uisnt de 70 8Q %.
FEUILLE DE REMPLA~EMENT
wo 43/t60s~ PCr/FR93/00 iJ 3~
Les caractéristiques physico-chimiqucs de ces denvés 23 ( R.M.N.~ Masse~ sont en accord avec les strurure^ proposees.
( i ) ~ 24~-i ' I
~û ~ Hr` 3Li 22 ~-~J 23 c~ r~l B
~ ~ .
n ~3~ 0 OH
25 o-d ( i = DmTrCI. p~. ii = TBDMSCI. p~
Les abre~iuions on~ les si~nifica~ions sulvantes:
a~ B = T = Th~une b- B = U = ~uraGile.
c B = CE~z - N-Bc~zoyl~Cvtosine.
25 d- B = AB~ = N Benzoyl~Adenine.
e- B - GPal = N-Palmitoyl~2-G~ ine.
tr = Dimét~oxy 4,4'-ttityl. iPr = Isopro~yl. Bz - Benzoyl. TBD~lS = tert-butyldimedlylsilyl. (iP~)2P(Cl)OMe = Chloro. (~ ~1 diisopropyl~o.metho~vphospllme SCHl~MA 8 La tewueme éu~e (Schema 8) conslste cn la protection te l~ydroxvle secondalre en ' Or.
tura~ la silyla~on U~l mélan~e de ~ silyl ~4 et dc SOD re~oisomè~e ;'-~-sll~l 'S est obtenu ( K. K~ OGlLV~E ct D. W. E~TWlSl-LE~ Carbo~d ~es.. 1981. 89. '0;-210. K KOGILVIE~ A. L. SCHIFMA~ ct C. L. PE~NEY. Can. J. C~m.~ 19~9. 57. U;0. G H
HAKIMELAHI. Z. A. PROBA et IC. ~;. OGIL~IE. Can J. Chem.. 1982. 60. 110~ ~ Ces isomè~es toiv~t e~e scp~res avec beaucoup de soins sur coloDne de ~el de slllce afm ~EUILLE DE REMPLACEME~NT
WO 93/16095 Pcr/FRs3/oo1l5 I~ ~ r ~ , s ~
d'ob~cnir le denvc 2'-O-TBDMS 24 avec une purete superieure a 99.95 /O mesuree par CLPH.
En cffe~ si ce n'cst pas le cas. les etapes ultericures nous conduiront à des melan~es d'oli~othionucleotite S'-3' attendus avec l'lsomere indes~rable 5' 2'.
5 En conseque~ce~ la pureté du 5'-O-DmTr-2'-O-silyl 24 est primordiale pour unc borme svnthèse.
Ainsi. l'obten~on des composes 5'-DrnTr-2'-~TBDMS 24 a tout d'abort eté réalisee selon la methode d'OGILVIE et Coll. (~;. K. C)GlLVlE. A. L. SCHIFMAN et C. L. PE~E`~.
(`an. J. Chem.. 1979..S7. 2230.) qul consis~e à condenser 23 avcc du chlosure de l~rl-10 butyldiméthylsilyle (TBDMSCl) (1.2 equivalent molure) tans la py~idi~e en presenced'in~itazole (2.6 eqwvalenu molures). En fm de reaction~ on obtient un melan~c de den~e 2'-O-TBDMS 24 et te son isomere ;'-O-TBDMS 2S. Le compose anendu X4 est sèpare du melange par chromuographic sur colonne de ~el te silice.
Il est ensuite possible par une reaction d'equilibration d'obt~ir 24 à pamr dc son isomerc ~'-15 O-TBDMS ~ (S. S. JONES et C. B. REESE. J. Chem. Soc. Perl~7n Trans 1. 1979. 2762.).
Cette ~grasiorl tu groupement TBDMS est iD~moleculaire et s'effecnle la un intenncdiaire possedant un atome de silicium pentavalent. L'isomerisation tu dcnve ;'-O-TBDMS obtenu p.recédemment apres une prcmicre sepa~ano~ chromato~raphque cst effcctuec tans l'éthanol à temperature ambiante pcnd~t une nutt. Les dcux isomères de position ùnsi obtenus sont à nouveau sct~ares par c~romato8raphie sur colonne de ~el de 20 silice. Cettc op~ ion d'isomensation sui~rie d'unc p~ific~on est repetee trois fois Cependant les rentemc~ts en 5' DmTr-2'~0-TBDMS ~4 obtenus par cette methode ~ ~0 a ~0 % selon les bases) nc nous ont pas puu sstisfaisants. Nous en avons utilise une au~re. plus recente~ mise au point pu OGIL~IE ( G. H. HAKIMELAHI. Z. .~. PROB.~ et l; ~
OGILVIE~ Con. J. C~em.. 198. 60. 1106.) 4ui pcrmet l'introduction prefcrcnnellc du 25 TBDMS en positton ~' dcs ribo~ucleosides B. Ce~te tec~ique preconise l'utilisat~oo de sels d'argcnts.
Ainsi le S'~ hoxyaityl 23 est condense avec du chlomre de TBDMS ( l.3 equlvalents molaircs) en prescncc de iitratc d'argcnt ( 1.2 eguivalen~ molaires~ et dc 3.7 equl~alents de pvridinc dar~s lc THF anhydre. Après punfication par chromatographie sur coloMe de ~el de 30 silicc on ob~ent S6 % de rendement en W et '~7 .~O en 5'-DmTr-3'-O-TBDMS 2~
En consequence. Ic S`-DmTr-2'4-TBD~S 24 est obtenu dans ces nouvelles condmons en une seule hape avec u~ meillew rendemen~ mùs la selecti~ e d'introducDon du groupement TBDMS en 2' n'est pas amelioree .
11.1.2 Syntbes des denves pbosphoralDIdi~es ~ ~Scbema 9) FEUtLLE Q~: R~MPL~CEMENT
WO 93/16095 PCl`tFR93/00115 n ~ r ~, Les quatre B thioribonucleosides phosphoramidites l\i-proteges 26 R~i sont ensuite obtcnus a pamr des 5'-DmTr-2'-O-TBDMS B thioribonucléosides ~-protéges colTespondants 2 (Schema 9~.
Le derive nucleosidi~ue 24 a éte trate par du chJoro N. N diisopropylamino methoxv 5 phosphine ( '.5 equivalents molaires~ en psésence de ~.~.N diisopropyl éthylamine (DIE.
dans ~e dichloromethane sous atmosphère intc. Lc d~ivé phosphoramidite 26 a ete purifie par chromato~rap~ie sur gel de silice ct Iyopbilise dans le bcnzènc~ les phosphoramidites 26 a-d sont obtenus avec des rendements vanant de 78 à 80 % selon la nature dle la base.
:,~Trr`-- S 3 , . ~ r~mTrO-- -~
~Q ~T~J~S ( jPr)2N \ ~ VTE~US
24^-d ' 26 !\/leC
i = (iPr) ~P(CI)OMe~ DEA DMAP~ CH ~C12) SCHEMA ~
Les analv~cs dcs spectrcs de RM~ du 31P et du lH de 26 montrent clslrement quc nous obtenons une seule paire de di~stereoisomères ce qui etablit la puretc rc~ioisomènque des 25 compo~es obtenus.
En e~et. ~uelqucs wteuJs (R. ~CIER~EK M. H. CARUTHERS. C. E. LOl`iGFELLO~. D.
SWWON, D. H. TURNER et S. M. FREER BlochemJs~n~, 1986. 2S~ 7840~78~6 ~ a~slcnt emis l~ypoth~se que lcs groupemcnts silyles en position 2' n'etaicnt pas stables dans les condioons de la phosph~ylaoon. Cependant~ il B cte mODt~ (W, K. 1;OHLER ~
SCHLOSSERM, G. CHARUBALA et W PFLEIDLERER Chemlsln~ and Blolo~ of 30 ,~cleosldes and Nucleo~ides~ Academic Press, ~lew York. 1978~ pp 347 ;58: }i. ~
OGILVIE Ct D. W. E~STLE~ Carbo~trate Res.~ 198E 89~ 20;-210: ~ ~S~t.~;. ~;.
~;. OGILVIE M. Y. JLANG Ct R J. CEDERGRE~. J. Am. Ch~ Soc.. 1987. 109. 7845-7854.~ qUC leS 8rOl~pCS ~IS;1VIeS m;~t danS kS SOI~tS PrOnqUeS COmme le methanO1OU d~S 1CS SOIU~OnS aqUCUSCS COmme 1e mC1an8C p~ nC/eaU. ~S CeS ~OUPementS
35 Sj1Y1CS SOnt S~bleS danS 1eS SOI~tS ~hydreS et nOt~Cnt ~1eS baSeS nOn PrOnqUeS
COmme 1a pyrid~C ~hydrC (~;~ }C. OG1LVIE~ D. W. ENTV~STLE~ Carboh dra~ s.
1981. 89 203-210; W. KOHLER W. SCHLOSSER G. CHARUBAL.~ e~
FEUIL~E DE REMPLA~EMENT
WO 93/16095 "~ PCl /FR93/00115 PFLEIDERER Chemis~ry and Blology of ~lucleosides ond ~ucleot-des, Acadcmic Press.
Ncw York, 1978, pp 347-3S8.). D'autre par~ il a cté clairemcnt démontre cn scne ribonucléotidc que l'utilisation dcs 2'-O-silyl ribonuclcosides tans la synthèsed'oligoribonucltotidcs conduit exclusivcmcnt à des liusons 5'-3' (K~ K. OGILVIE. M. J.
5 ~iEMER Telrahedron Lett.. 1980. 21. 4159: R. T. PON ct K, K OGILVIE. Terrahedron Len., 1984, 2S~ 713; R T PO~. a K. K. OGILVIE, Nuclcosides Nucleondes. 1984. 3.
48S;P. J. GAREGG. 1. L~DH. I. STAWI~SKL et R STROMBERG. Tetrahedron Le~
1986, 27. 40SS-40S8). La synd~cse de phosphoranuditcs n'est pas stéreospccifique ct la fonoaoon en 4u~mtcs egales des deux diastercoisomeres est tue à la chiralitc de l'atomc dc phosphore de configur tion R ou S. La formation dc ces dcux produits n'est pas genante 10 duls b mcsure où les iéactions d'oxydation ulterieures sup~nt ce~te chir~lite.
Il. 2. PARTE EXPER~IENTALE
M6thodc gencnk pour la prcparation des 5'~dimctboxvtrityl N--cyi 4'-thio-~D-15 r~bonuckosid~23 -d.
A u~c solu~on dc N-wyl ~dliofibonucleoside 23 a-d ( lmmole) dans la py~itine anhydre (S~6ml) est ~jouté du chlon~re de d~méthoxym~rle (1.2?mmole, 430mg). Le mel~e réac~olmcl est gité i ~e ambiulte sous a~Dosphèrc ine~tc pend nt 90 a 120 n~in puis du mé~ol (lml) cst ~jouté. Après 10 minutcs t'~tion suppléme~taire. Ie mel~e 20 rc ctionnd est versé sur une solu~oD aqueuse s~ec te bic rbonate de sodium (~Sml) et Ics produits sont ex~its avcc du dichlorometh~e (2 x 20ml), Les phases or~anlques sont lavecs avec dc l'c u (2 x 100ml) puis secbees sur sulfate dc sodit~D et filtrees. Le filtsat cst evaporc sous pression reduite et le rcsidu ob~u est chrom-togr~hié sur une colonne de ~el de silice, L'eh~ ef~ecnlee avec un mél~ge CH2C12/MeOH 98n en presencc de tAe~ylu~ e 1%; lcs ~o~s cont~n~nt le protuit sont.evaporees i sec et les nucleosides 25 23 ~-d sont obteDus sous fomle d'une huile.
1-14'-th~5'~dim~tbo~trltyle~ nnnosyl~Thymine Relldc~en~ 68 %.
Spcctromé~ie dc m~ sse FAB>0 NOBA mJz = 577 [M+Hl~ 303 lDmTrl ~
30 RM~ IH tDMSOd6. 360MHz) ~ 24~ ( s. 1 H~ NH); 7.44~ ( s~ I H~ H6): 6.87-7~30~ t m.
13H~HArom~iques);S,83,(d,1H,Hl~,Jl~2~=7,0~;S.S3,(d.1H~OH~.JoH~ =5.8);
5 3O` ( d~ l H` oH3~ JoH~3~ ~ 4~ 4~l4~ ~ td~ l H~ H2~ J2~ 6~9~ ~l7~ 3~ = 3 o); ~ oo ~
H~ H3', J3',2' ~ 3.0~ J3',4' ~ 3~0); 3~69~ ( s~ 6 H, OMe); 3.30, ( dd lH. H4~ m. 7 ~1.
Hs~, Hs~); 1,60, ( s, 3 H, CH3)~
1-14'.1hio S-~}di~tbo~ytriqle l~ n~ no~ Uncile ~.
Re~ nt 70%.
FEUILI_E DE REMPL~SEMENT
WO 93/1609~ PCl`/FR93/00115 . .. _ . . ~ ., _ R~ lH (DMSOd6, 360 MH2) ~ 11.31~ (s. I H. NH~; 7.70. (d, 1 H, H6. J6,S = 8 0)~ 7 40 6 89. (ITL 13 H. H aromatiques du groupement dmTr); 5.84 (~ I H. H~ 1 ?' = S 7). 5.~3 1 H- OH2~. JoH2~ 5.6), 5.48. (d~ I H. Hs. J5.6 ~ 8.0); 5.26, (d, 1 H, OH3. JoH3 3 =~45):4.02.(m.2H.H~.H3~);3.74~ts.6H.OMe).3.31.(~3H.~4~.Hs.Hs ) 5 Spec~ome~c de m~sse FAB~O NOBA ~ z = S63 ~+H~+, 303 [DmTr~-1-14'-~hio S'-O dimetho~rtrityle ~D ribofur~nno~yllN~beDzoylCyto~ine 23 c Rendcmcnt 69 %.
R~ ' lH (D~lSOt6. 2SO M~:lz) o 11.32. ~s. lH. NH); 8.40. (~ lH. H6. J6.s = 7.5); 8.01.
(~ 2H, Ho du ~oup~ment bc~lzoylc): 7.63. (~ lH, HS. IS.6 - 7.3); 7 44. (~L 17H. H
10 aroma~ques tu gJoupemcnt DmTr ct Hm.p du groupne~t benzoyle); S.88.(~ lH. H1Jl ?~ = 4.1); S.73, (d~ IH~ OH2~ JoH ~ = S.2); 5.27.~4 IH, OH3~. ~O~.H3' = 5.7). 4 06.~m.
~H. H~J2~ 1~ = 4 0- ]2',3' = 3 7 J2'.0H = S.2); 4.03.~m~ lH, H3~, l3~ 2~ = 3 7. ~; ~ = S.;.
~3~.0H - 5.7); 3.76.(s. 6H. OCH3 du ~oupcmcnt DmTr); 3.43.(m. 3H. H4 ~ Hs~ct H~ ).
15 S~ométrie d~ massc }:AB>O NOBA m/z = 666 [M+HI+, 51~ [M+H-0CONH~]+~
303 lDmTrl +
1~14'~thiD 5'~dim~thosytrityle ~ribofbnDno~ N6-be~oyl~dénine 23 d Rcndement 70 %
R~I~' lH (DMSOd6~ 2SO MHz) ~ 11.25,( s. IH. NH); 8.63, (s, lH, Hg); 8.57, (s. lH. ~
20 8 04. (t. 2H. Ho du groupemc~t b~oylc~; 7.Sl, (m. 13H. H aromstiqucs du ~roupement DmTr): 6.92. (d~ 3~ Hm.p du group~mcnt benzoyle); 5.98. (d. lH. H~ = S 8). S.75.
~d- lH OH~ JOH,2~=3~);S4S.(d~ IH.OH3,JoH3~=2.5):470.(nL IH.H~ 6.(n~
lH. H3~); 3.74,( s~ 6}1, OCH3 du ~Foupemcnt DmTr~; 3.53. (m~ 3H. H4~.Hs~ e~ H
Spec~mc~ne de massc FAB>0 NOBA m/z = 690 lM I Hl~. 303 ~DmTrl+
5 M~th~e gen~nle pour b pr~p~ntion d~ 2'~ bu~ldim~th~ ih~1-4'-thio-S'~
dim~tho~ ql~N~cyl~ribon~Jcteo~id ~ el de leur i~o~ère 3'-l~D~S 25 A une sohtio~l de S'~dimethox~ilvl 4'-thio ~J-acyl B-~ribonucleoside ~3 ~-d ( Immole~
dans le THF ~n~ydrc (lOml) est ajoutc du mtrate d'~r8ent (1.2mmole~ 203m~). Lc mel-n~c 30 rcactioDnel est alors ~gitc S miDu~cs à tem~turc ambi~tc a~t l'atdi~on du chlonue de lerl-buryldimethylsilyle (TBDMSCl. 1.3mmole. 195mg) et de la py~idine anh~r~c (3.7mmole. 0.193ml). L`~itatioD à temperan~re u~bi~te est lors prolon~ce pendant 2~ h puis la soltmon hete~ogene est filtree av-nt d'ctre versee d~s unc solu~on a4ueusc de biwbonate de sodium i S% (30mJ). Lcs ptoduits SOD cx~its avec tu ~iebloromethanc(3x20ml) et ks ph~s otE~niques sont lavecs avec de l'eau puis secbees sur sulfate de 3~ sodium ct fil~es. Le Sltrat est cvapo* à scc et le residu est c~ographie sur uDe colonne dc gel de silice cn utilisant commc cluant un meb~e dc CH~Cl ~/AcOEt: 9~ S puls I:EUILLE DE REMPLACEMENT
WO 93~16095 PCl'/FR93/00115 f~ ~ r~ ,~
,., ,~, ~. , , ` , de C~?Cl~/AcOEt:80/20 . Les ~acaons contenant le produit desire (2'-O-TBDMS 24 a-d) sont reE~oupccs et évaporécs à sec. L'isomere 3'-O-TBDMS 2S a-d est ensuite obtenu.
1 -12'-0-tert-but~ldiméthylsilvl-4'-thio-5'-0-diméthox~trin~l-~D-ribofursnnosyl 5 Thymine ~.
Rendemcnt: 33 %.
Speclrome~ie dc masse F~>0 ~OBA mlz = 691 lM+H)+, 713 lM~ia]+.
R~T lH (DMSOd6, 300MHz): ~ 11.36, ( s. 1 H. NH); 7.58, ( s~ 1 H, H6): 7~33-6.90. ( m.
13 H. H Aroma~iques): ~.89~ ~ s. 1 H. H] . Jl ? = 6.1); 5.27, ( nL 1 H. OH3): 4.20. ( dd. I
H. H?. J~ = 6.10, ~?,3~= 3,5~: 3.97. ( m. 1 H. H3~); 3.73, ( s, 6 H. OMe): 3.36. ( m. 1 H.
10 H4):3.~5.(~2H.~s~.Hs~);1.58.(s.3H.CH3);0.81.(s.9H.tert-butvl):0Ø(d.6H.
!~Ae ~Si).
1-12'-0-iert-butyldiméthy!~ilyl~ thio-5'-0-dimétho~ytrityl~ ribofurannosvl 15 Ijracile 24 b.
Rcndement 56% .
Tf = 1 14~C.
RMN lH (DMSOd6, 360 MHz): ~ 11.20, (s. 1 H, NH); 7.81. (d. 1 H, H6. J6 5 = 8.1 ); 7.30-6.89. (m, 13 H, H asoma~iques du ~roupemcnt dmTr) 5.84, (~ 1 H. H~ ~ Jl' ~ = 5 ~); 5 50 (~ I H. Hs, ~5,6 = 8.1); 5.23. (d~ 1 H, OH3, JoH3 ,3 = 4.7), 4.11, (4 I H. H~ J~ 1~ = 5.5.
20 ~?~ 3 ~ = ;.5): 3.95. (m~ 1 H. H3~); ;.74. (s. 6 H. OMe); 3.38. (m, 2 H. H4. H5~ J~ ~ = 3.?8.
(~L 1 H. Hs~); 0.82, (s. 9 H. ~ert-butvl); 0.05, (~ 6 H. Me ~Si).
Spec~ome~c de masse FAB~0 NOBA n-lz = 677 [M ~ H) . 619 lM I H-ten-butane~-. 303[dmTr)-I-12'-0~ but~rldiméthylsiiyl~ thio-5'-0-diméthon~trityl-~D-ribofur~nnos~lI
!~i4 benxoylC~to~ine 24 c.
Rendement 32%.
H (DMSOd6~ 250 MHz): ~ 11.31. (s. IH, ~H); 8.51. (d~ 1~. H6~ J6.s = ~.3): 8.01.
(~ 2H. Ho du ~roupement benzoyle) 7.Sl. (rn 14H. H aromaoques du ~oupemcnt Dm~r et Hs): 6.93,( ~ 3H, Hm.p du ~roupemcnt bcnzoyle): 5.93.(~ lH. Hl . Jl ~ = ~ 0~: 5.20.(d.
lH. OH3~, JoH H3~ = 5.0); 4.14.(~ lH. H ~ 4.00.(~ lH H3 ); 3 76 ~s. 6H. OCH~ du ~roupement DmTr); 3.38.~ 3H. H4 . Hs~et Hs ~): 0.86. ~s. 9H. rerf-bu~l): 0 60. ~ 6H.
Me ~Si!
SpectrometTie dc masse FAB~0 NOBA mlz ?80 lM+HI~, 303 [DmTr)~
1-12'-0-ter.f-butyldim~thylsilvl-4'-thio-~'-0-dimetho%~ D-ribofur~nnos~ l ~6 benwyl~deni~e 24 d.
Ren~ement 3S %
FEUILLE DE REMPLACEMENT
WO 93/16095 PCI`/FR93/OOllS
R~ IH (DMSOd6, 2S0 ~z): ~ 11.2S,( s. lH~ NH); 8.64, (s~ lH, Hg); 8.61, (s~ lH~ H2)~
8.04. ~d. 2H, Ho du groupcment benzoyle). 7.51, (n~ 13H~ H ~rom~iqucs du groupement DmTr): 6.95, (d, 3H, Hm,p du groupemcnt ~nzoyle); 6.01, (d. IH, Hl~. Jl'.2' = 5 8); 5.48.
(~ lH, OH3~, JoH,3~ = 2.S); 4.70~ (nu lH. H~ ); 4.26, (m, IH, H3~); 3.75.( s. 6H. OCH3 du groupe~ncnt DmTr); 3~S3, (n~ 3H, H4~.11S n Hs~); 0.82~ (s. 9H, lerl-butyl); 0.50, (~ 6H.
MC2Sj) Spec~omc~c tc masse FAB>O NOBA m/z 804 [M+H]+, 303 lM l H] ' 1-13'-O tat-butyldimeth~l~ilyl-4'-thio-S'-O-dim~tho~ytrityl B-D-ribohnnno~yll , Th~mine 2S ~.
Re~dement 13%.
RM~ lH (DMSOd6, 360 M}lz): ~ 11.34, (5, lH; NH); 7.46, (s~ IH~ H6); 7.89-7.30~ Im.
13H.Harom~qucs);5.87.(d~ IH.Hl,J~ =7.8);S.46.(d~ lH.OH2~,JoH~=5.1):4 1,.
Im~ IH~ H3~): 4~11,(m, lH, H~, 32~ 1~ = 7.8, JoH,2` = 5.1); 3.73, (s. 6H~ OMe); 1.66~ (s~ 3H~
CH3); 0~84.(s. 9H. Ier~-butyl); 0.50,(d~ 6H.Me2Si).
1~l3~tat-buqldim~ tbio-s~ m~tho~ytriq~ ribohnnnos~
linciIe 2S b.
Re~demeslt 2r~
Tf = 109C.
RMN lH (DMS~ 360 MHz): S 11.30,(s. I H, ~H); 7.70, (d, 1 H~ H6~ J6 5 = 8.0): 7.30-6.89~ (13 H~ H a~om~i~ues du groupe-ment dmTr): 5.84, ~d~ 1 H, Hl~. Jl'.2' = 7.3): 5.57~ (d.
1 ~ H5~ JS.6 ~ 8~0); 5.46, (d~ I H. OH~. JoH2~2~ = 5 1): 4.12~ (~ I H- H3 J; ~
J3~4~ = 3~ 4~03~ (m, I H~ H2~); 3.74, (s. 6 H. OMe); 3.41. lnL 1 H. H4); ;.'1. (m~ ' H.
Hs~ Hs~); 0.08~ (s, 9 H, tert-butyl); 0.02. (~ 6 ~ Me2Si).
Spectromc~ie de ~sse FAB~O NOBA m~z 677 [M+~ 619 [M~H-tert-butane)-. 303 ~dmTr)t.
Cc composc a ~ mis eD prcscnce avec une soluion e~noVme~ylamine 0.25~o (~
pendant unc 12 h i t~ re ~mbia~te pour don~er en propor~on eg~le un melan~e ct 2S b.
1-13'~tat-butyldim~thyl~ilyl~ thio-5'~0 dim~tho~rit~ ribofur-nno~l 1'~4~be~o~1 cy~int ~.
Rcndement 31 ~/o.
RMN lH (DMSOd6, 2S0 MHz~: ~ 11.33. (s. lH. NH); 8.40. (d~ lH. H6. ~6 ~ = 7 4): 8 01.
(L 2~ Ho du grou~xment benzovle~; 7.60, (m, I4H. H uom~oques du ~roupement DmTr e~ Hs~; 6.92~ ( d, 3H, Hmp du groupement benz~yle); S.92,(d. lH. Hl, Jl'.'' = ~ 3);
5.60~(d, IH OH2~. JoH ~ s 5.0); 4.1S,(nL 2H~ H ~, H3~); 3.~S,(s~ 6H. OCH3 du IFoupement DmTr); 3.38.(~ 3H. H4: Hs~et Hs~); 0.79. (s. 9H, Jert~butyl); 0 00, ~d, 6H. Me-Si!.
Spectrom;c~ie dc massc FAB>0 NOBA m/z 780 ~M+H]+. 303 ~DmTr FEUILLE DE REMPLACEMENT
WO 93/16095 PCl~/FR93/00115 r l .t 1-13'-0-tcrt-but~yldimethgl~ilyl-4'-thio-S'~dim~tho~ytritvl ll-D-ribofur~nno~yl ~6-benzoyl ~d~nine ~.
Rendcment 29% .
R~ lH (DMSOd6~ 2S0 MHz~ 5,( s~ lH. NH); 8.64. (s. lH, Hg); 8.61, (s~ lH. H2);
5 8 04~ 2H. Ho du groupement ber~oylc)~ 7.51~ (nL 13H. H ~rom~ques du groupement DmTr): 6.9S. (d. 3H. Hm.p du ~roupement balzoyle); 6.01~ (d. IH~ Hl~. Jl~ ~ = S 8): S 79~
(d~ IH~ OH~. JoH~r ~ 3.S); 4 70. (~ lH. H~); 4.26. ~m~ IH. H3~); 3.7S~( s. 6H. OCH3 du ~ment ~Tr); 3.S3. (m. 3H. H4~.HS~ et Hs~ 0.82~ (s, 9H, Icrl-butyl); 0.01. ~ 6H.
!~c~Si).
Spectrometnc de m~ssc FAB>0 NOE~A m/z 804 lM~H] ' . 303 IM+H
Met~de ~ener~le de p~retion dff ~D nbonucl~o~ide phosphor~m;ditn 26 ~-d~
A une solu~ion des composes 24 ~-d (1 mmole) d~s du dichlorome~ne ~nhvdrc (3 8ml~
sont ~outes sous ~e inffte d' rgoll la N~N,N diiso~letbylulune (4 mmoles 15 0 7~ b~ chloro N~N~iiso~l_~_ (2 S~mole) 0 48ml) a la ~
(0 2~ole, 24 4mg) Le me~8e ~ctioDnel es~ ~itc de ~0 à
-- 90 ~ nbunte puis est dilue ~vec te I'~ate d'ethvlc (35ml) La solL~ cst l~vee s~lec de la s~umure (4~S0ml) puis ~vec dc l'e-u ('~xS0ml) La ph~orgal~ique est sechee sur sulf~te de sodium~ fih~ée et evaporee sous pression reduite Lc residu est cb_~hie sur colo~e de gel de silice et l'elutioo est re lisee i l' ide 20 d`un melu~ge de cyclobex~ne~ de dicbloromét~nc et de tnethylunine ~100/0/0 1 i SOIS010 1) Les produits 26 d soDt ob~e~us sous b fonne d'u~e poudrc blanchc apres Iyophilis tion d ns le b~ne 1-12'~rt-butyldim~thylsilyl-3'-N~N-diisopropylmétho~rphosphor~midite-4'thio-S' O-2 diméthorytrityle-~ribofursnnosyllThymine ~ (melange diastercoisomerique Rendcment 89%.
R~N31P~Cl)3CN) ~lSI,32etlS003 RM~ 1H 8 7 99, (s, 1 H, NH), ~ 6S, (~ 1 H, H6~; 7,3S-6 80 (m 13 H H uomaoques ~;S 97~ (~ I H H1~); 4,2S, (~ 1 H H~); 4 13 (~L 1 H H3~); 3 78 (s~ 6 H OMe); i 68 I H H4~); 3 S4~ (nL 2 H Hs~ Hs~); 3 35 (m~ 3 H McO du groupe~nent phosphorunJdltc 30 3 '5, (~ 2 H CH dcs ~roupements isopropyle); 1~60, (m 3 H CH3); I lS lm 12 H CH~
des groupements isopropyle); 0~86, (s 9 H #rt-butyl); 0 0S, (D~ 6 H~ Me ~Si) Spec~ome~ne de m~se F~0 NOBA m/z ~ 8S2 lM-H~
1-12'~1di~tbyl ibl-3'~N~-dii opropyl~ho~ypbospboro-midi-e-4'tllio S'-O~ ribohnnnosyllUncik~ gedi s#reoison~nque~
35 ~ R~Ddcm~78%.
RMN 31P~CDC13): ~ IS0.65 a ISO.S0.
FEUILLE DE REMPLACEI AENT
Wo 93/16095 pcr/FR93/ooll5 . i ,~ n ~, ~0 1 40 R~ IH (CD3CN,250 MHz): ~ 7.99~ (s~ 1 H. NH). 7.22, (m. I H. H6): 7.30-6.89. ~m. 13 H. H aromanques du groupcmcnt DmTr): 5.90. (m. 1 H, Hl~); 5.50. (m. 1 H. Hs); 4.13. ~m.
H. H2. H3~); 3.80, (s, 6 H, OMe du ~roupe DmTr); 3.58~ (m, 3 H, H4. Hs~ Hs ); 3.4 lm. ' H. ? CH des ~roupements isopropyle); 3.30 (m~ 3 H. MeO du ~roupement DmTr)~
5 1.19. (m. 1~ H. CH3 des ~oupements isopropyle); 0.84. (s. 9 H. Ierl-but~ 0.05. (m. S H.
Me~Si).
Spectrometne de masse FAB>0 NOBA mlz = 534 [MtH-DmTrHI+
I -12`-0-tcrt-but~ldimethylsilyl-3'-N,N-diisopropylmethosyphosphoro-midite-~1'shio-5'-O-dimethoxytrityle-l~D-ribofur~nnosyll !~4-benzoyl Cyto~ine 26 c.
10 Rendcment 7~% .
RM~' 31P (CD3C~): 8 1Sl~30 et 150.05 Spectrometric de masse FAB>O PEG mJz 941 [M+H~, 637 IM+H-DmTrH) 303 ~DmTr]~
1-12'-0-tert-butyldiméthylsilyl-3'-N,N-diisopropvlmethoxyphosphoroamidi~ 1'thi~'-O-diméthoxytrityle-~D-ribofurannosyll r~i~benzoyl Adenine 26 d Rendement 71% .
RM~ 31P (CDC13): ~ ISI.26 et 150,01 Spectromct~ie dc masse FAB~O PEG nuz 964 ~M+H~-~ 600 ~M ' H-DmTrH] 303 ~DmTr]~.
Il. 3 Fonctionalis~tion du support solide (Schema 10).
Le support solide ou LCA-CPG ( LoDg Chain Alkylamine Controllcd Pore Glass) P-l a tout 20 d`abord etc acive par une solution d'acide trichloroacetique à 3 % dans le dich~oromethane à
temperature ambiante pendsDt 2 à 3 heures afin de liberer le plus grand nombrc de ~roupements amino. ce qui cnnduit au maximum de sites reactifs sur la surfacc des billes de verre. Le supporl ainsi active P-2 est a~ors fonctiormalise par coupla~e avec de l'anhvdride succinique dans ia pyridine en préscnce de 4-DMAP ce qui conduit à P-3. Dans l`etape suivante. Ie nuclcoside 3'-silyle 25 est utilise puisqu' il a éte obtenu penàant la reacnon de 25 silylation des thioribonucleosides et n'est pas necessaire pour la svnthèse d'oli~othionucleohdcs co~tenant la liaison phosphodiester 3`-5'. Ainsi. P-3 acti~,e par le l-(3-dime~ylaminopropyl~ 3-ethylcarbodiimide (~)EC) en presence de 4-~MAP est rnis en reactioD dans la pyridine anhy~re avec le 5'-O-DmTr-3`-OTBDMS ~thioribonucleoside 2~. Les sites non uilis~es du suppon sont masques à l`aide de pipcridine. Une derniere etape 30 de masquage à l'ar~vdride aceique en presence de collidine dans le THF conduit à P-6. La quas~tite de nucleoside fixee sur le suppon est dcterminee par spec~ophotometrie V. ~ . en mesurant la quan~ate de cation dimethox~itvle libere après un ~aitement par une solution a 10 % d'acide tric~oroacetique dans le dichloromcthane. Lc dene de fonctionnallsation ~arie de 21 à 38 ,~unole par gran~nc dc suppon suivant la nan~re de la basc nuclcosidique.
.
FEUILLE OE REMPLACEMENT
WO 93/1609~i ~ PCI`/FR93/00115 ,., ~., . . ~
(~\~NH ( i )~A~ ( ii )~NH-C(O)-(c~12) s ?2 ~3 ( 'ii ) o DmirO B DmTrO
1~/ iv lST~0MS0 0(0)C ~h~ T~OMSO 0(0)C w~~
Cl C~ ,~J ~J
CI(~OlC-(CHl)-C(O)-HN~p5 HO2C-(CHl)-C(O)-Hh~
20 Cl Cl v, vi 0mTrOl S
~,/ \~/
~I
I aDMSO O(O)C ~,~
CN-O2C-(CH2)-C(O)-HN~ P6 ( i = TCA3/~, CH2C:12; ii = anhydride succinique. DMAP, Pyr.; iii = S'~DmTr~'~ 3 l~DMS~ nbo~ucléositc, DMAP, NEt3, DEC Pyr.; i~r = pe~t~chlorophenoh v = pipcridine; vi = Ac20 O.SM da~s THF ) W O 93/16095 PCl`/FR93/OOllS
Il. 4. Svnthe~e sutomati~ee des thiooiigonucl~otide~ (Schem~ 11).
Les thiooligonucleo~idcs ont ete svnthe~ses sur un s~nthetiseu~ a AD~ (Applied ~iosvstems modele ;81 .~). Le c~clc d'elon~anon compor~e quat~re etapes importantes: -Desntvlarion du nucleoside ou de l`oli~onucleotide fixe sur le suppon solidc.
Condensation du phosphoramidi~e acnve par le tetr~ole sur l'hvdroxvle 5` libre du nucleoside ou de l'oli~onucleonde.
Aasqua~e des foncDons 5'-hvdroxvles qui n'ont ,~as rea~i.
Oxvdanon des foncions phosphte~cstcr en phvspbotricster.
WO 93/16095 L~ PCl`/FR93/00115 ,`., . , ~ ~ . , ,~
~... o_~z ~Y m ~ LL' O
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FEUlllE~ DE REMPLACEMENT
WO 93/16095 PCI'/FRg3/00115 '` r~ ~ 4 4 r ~ `J ,t _, :
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_1 c~ _ _~ _ ~FUILLE DE REMPLACEMENT
wO 93/16095 ~ pcr/FR93/ool15 Chaque synthese a etc effecnlee sur une colonnc contenant 40 mg de support solJde Le rendement de chaque incorporation cst dc 98 % évalue en mcsurant la concen~anon des canons dunethox,~tyles recuperes apres chaque coupbgc par traitement du suppon al'acide ~ichloroacetique.
Des lavages sont cffcctues entre chaque eulpc. et la durée t'un cycle d'elon~anon est dc 21.1 minutes pour la s,vnthese de l~omododccamerc 4'-thio~ ribonucleondc I BrS~
( Tablcau I ).
.
~umero I Etape ! Temps ~scc.3 I_ Solvant et Reacnfs I ¦Sechageet Lavage ! _ 24 _ MeC~ non ~ ¦ Detri~lat~on _ 8û TCA à 3% dans CH~CI~
3 ! Secha~e et Lava~e 74 _ ~ ~cC~-Argon _ ~ Couplage 915 amidite 0. IM(2 ~eq. )-~lcC~
tetrazole O.SM( lOeq. )~
.
_ Sechage _ ~5 _ A~80n 6 M~squagc ~3 Methyli~udazole-THF
?0 - - -- ---- Ac~Otlutitine/THF 1 1 8
~G ~nO~ ~ ;
OA~ 1 Base ~ B
éterocyclique \~
~ n EnO OBn 13 ~ - I t~3, 14 -B - U 15~, 15B
B = ~ 16~, 16B
B - A 11~ ,n `~
(i = BSA T~SSTf~CH3CN; ii = BBr3, CH Cl~
La svnthèse des thionucleosides de l'uracilc ~ de la thvm~ne et de la cvtosine a ete effectuee en utilisant le bis-lruncthylsilvl acctamite (BSA) conune a~ent silvlant ct Ic tnmcthvlsihl trifluoromethanc sulfGnate (TMSTfl comme agent de couplage. Les nucleosides O et B ont eté obtenus avec 74 . 77 et 7Q % de .~udement rcspectivcmcnt ~ La s~thcse des thionucleosides de l'adenine a è~e rea1iscc pu le SnC14 dans l'acctorutrile. ~es nucleosldes O
35 et B sont obtcnus avcc 58 % de rendement (Schema 7)~
Il. SYNTHESE D'OLlGO-l~llONUCLEOTlDES SUR SUPPORT SOLIDE.
FElJlL~E DE f~El~Pl.ACEhlENT
WO g3/16095 PCI`/FR93/00115 ~ s . ~ 1 3 o La s~nthèse supportée des B oli~o-thionbonuclcoodes a cte effecn~ee à l aldc d un s~nthe~seur GENE modèle APPLIED BIOSYSTEM 31 8A sclon la mcthode aw phosphorsmidites Elle est semblable à cclle dccrite pour la scric ~ oligodesoxy~ibo~ucleonde naturelle par 5 CARUTHERS ct Coll (S~ L BEAUCAGE et M H CARUTHERS. Jélrahedron Lel~.
1981. 22. 18S9 1862; L ~. Mc BRlDE ct M H CARUTHERS, Tetr~hedron Letl.. 1983. 24.
~45-248.) ct a celle decnte par USM~i et Coll pour les oligoribonucleatidcs (~ l,'SI~
OGILVIE. M Y. JlANG et R J. CEDERGRE~'. J An~ Chem. Soc.. 1987. 109. 7845-7854.3 Cette ~ynthèse a nécessite 1) Ls ~r~on de synthons B d~ioribonucleoside phosphoramidites S correspondant aux bascs T. U. C, A et G.
I13 La fonc~onnalisation du support solide inco~porant un dcnve B
thionbo~ucléosidique .
m) L'élonp~on te la chai~c oligothioribonuclcondi4ue à }'aide d`un svnthcnseur automatique~
IV) Enfin, au telme tu Dombre requis de cycles de sy~thèse~ l'oligothionucleo~ide a etc decroche dc so~ suppor~ deprotege et purifie Il.1 - SyDtb~e du pbosphonmidite de~ bê~-thioribonucleoside 26 a-d.
Il 1 I Syn~èse d,es den~es 5'-DmTr-2'~TBDMS (Schéma 8) Le probleme maje~ da~s la s~thesc chimlque des oligonbonuclcosidcs cst la presence de l~ydroxyle en 2' t~s lc cyclc ribosc ou thioribosc ~ui da~ande une protection selecnve La sclcc~ao~ d'un groupcmcnt protec~cur pour l~ydroxyle en 2' doit colTespondrc a plusleurs critères, il doi~ être st~b}e:
- sous les w~diaoDs dc couplage pendant la deprotec~oo des ~roupements protecteurs en 5' pour pennenre l'extension de 1~1 chaine - pendant l'oxytuion d~s le cas dc la methode aux phosphites tnesters - pcntant le masquagc qui SUit le coupla~e.
- pend~nt b tcprosecsion dcs groupements protectcurs dcs ~mincs cxoc~cllqucs - pendant la dcprotcction tes phospbatcs.
- et d~s Ic cas des s~mthcses sur supp~r~ solide pcndant Ic cli~ragc de l`olleomcre du suppor~.
FEUILLE DE REMPLA~EMENT
WO 93/16095 ~ PCI /FR93/OOl lS
Fma~ement ce groupement pro~ccteur doit ctre cnleve sous dcs co~ditions très douces pow ev~ter une attaquc de la fonc~ion hydroxyle en 2' lib~ree sur la liuson phosphodiester adjacente.
5 ~ n nom~rc impor~nt dc stratégics p~ur protcger les hydroxyles en 2' ODt ete dcveloppees et illus~rcnt les tifficultes ~ans lc choix tu schema de protecnon tes groupemcnts hvdroxvles.
IC. B. REESE. Nucleosides Nvcleolldes. 1985, 4. 117-127; R. }CIER~ECK. M. H.
CARUTHERS. C. E. LONGFEI_LOW. D. SW~NTON. D. H. TURNIER et S. M. FREIER
Blochem~slrv. 1986. 2S, 7840-7846; S. IU'AI et E. OHTSUIC~ Nucleic Acids Res.. 19~8.
16~ 9443-9456;
10 C. LEHMA~. Y. Z. XU. C. CHRlSTOWULOU. Z. K. TAN et M. ~. G.UT. ~vucletc Ac~ es.. 1989, 17. 2379-2390; T. TANAKA~ S. TAMATSUICU~l. et M. IKEHAR~
h~ucleicAcids Res.. 1986, 14, 626S-62?9.).
L'uilis tion dc groupements protectc~s alkylsilyl et not~nmcnt le ler~-butyldimethvlsil~l ~TBDMS) pour l~ytroxy!e en 2' a facilité la sy~thèse des oligoribonucleotides. Le ~oupement TBDMS est suffis~ment st~blc duls des contitio~s acides ou basiques et est facilemcnt c~leve pu le fluorurc te ~ctro bu~yl ~o~ium d~s le I~IF pour être utilise dl~ns la strategic cn phase solide (N. USMAN, K. K. OGILVIE, M. Y. JU.~Ci ct R. L.
LEDERGEN~ J. An~ Che~ Soc.~ 1987. 109, 784S-78S4; N. USMAN~ K. NICOGHOSIA~.
R. L. CEDERGl~EN et K. K. OGlLVIE, Proc. Na~L Sct. USA, 1988, 8S, S764-S768.; S. A.
SCANNGE. C. F. FRANC~Cl,Y~ et N. USMAN. ~uclcic Acids Res., 1990~ 18~ 5433-S441.;K. K. OGlLVIE et M. J. NEMER re~ cdron Len., 1980, 21, 41S9: R T. PO~ et K. K. OGILVIE~ Nucleosides Nucfeondes~ 1984~ 3~ 48S: R. T. PON et ~. K. OGll VIE~
~ra~edron Le~., 1984, 2S~ 713.) On a donc appliqué en scric B oligothioribonucleo~de le schema de protccrion utilise pour les nucléosites oxyge~es (Schema 8).
A savoir lcs protec~oDs:
zoyl pour l'adcDinc et la c~osine~ isoButyl po~ la guani~c en tant que protccoondes groupeme~ ino exocycliques - Dime~oxy~ityl (DmTr) pour prote~er les hydroxyles pr~ires en 5`.
- ~ert-butyldimé~ymsi}yl (TBDMS) pour prote~er l~ydroxyle sccondaire en ' - Me~oxy po~ la protecion des phosphates~
La premie ~pe permet de prote~ 1 bydroxyle libre en 5' pu u~ ~upcment aclde labile le DmTr (Scbema ~).Ainsi le denve nucleosidique ~ est trute par le chlorure de dim~box~itylc ( 1.27 cqt~ivalcnts mol~r:es~ d~s la pyTid~ne Jnhydrc sous a~nosphere 3~ incste. Aprcs t~cnt usuel du mel~ge ~o~el, le dcnvc dim~thoxv~i~vle 23 est p~fie p~r chrom togr phie sur ~el dc silice et isolc avec tcs rcndements ~uisnt de 70 8Q %.
FEUILLE DE REMPLA~EMENT
wo 43/t60s~ PCr/FR93/00 iJ 3~
Les caractéristiques physico-chimiqucs de ces denvés 23 ( R.M.N.~ Masse~ sont en accord avec les strurure^ proposees.
( i ) ~ 24~-i ' I
~û ~ Hr` 3Li 22 ~-~J 23 c~ r~l B
~ ~ .
n ~3~ 0 OH
25 o-d ( i = DmTrCI. p~. ii = TBDMSCI. p~
Les abre~iuions on~ les si~nifica~ions sulvantes:
a~ B = T = Th~une b- B = U = ~uraGile.
c B = CE~z - N-Bc~zoyl~Cvtosine.
25 d- B = AB~ = N Benzoyl~Adenine.
e- B - GPal = N-Palmitoyl~2-G~ ine.
tr = Dimét~oxy 4,4'-ttityl. iPr = Isopro~yl. Bz - Benzoyl. TBD~lS = tert-butyldimedlylsilyl. (iP~)2P(Cl)OMe = Chloro. (~ ~1 diisopropyl~o.metho~vphospllme SCHl~MA 8 La tewueme éu~e (Schema 8) conslste cn la protection te l~ydroxvle secondalre en ' Or.
tura~ la silyla~on U~l mélan~e de ~ silyl ~4 et dc SOD re~oisomè~e ;'-~-sll~l 'S est obtenu ( K. K~ OGlLV~E ct D. W. E~TWlSl-LE~ Carbo~d ~es.. 1981. 89. '0;-210. K KOGILVIE~ A. L. SCHIFMA~ ct C. L. PE~NEY. Can. J. C~m.~ 19~9. 57. U;0. G H
HAKIMELAHI. Z. A. PROBA et IC. ~;. OGIL~IE. Can J. Chem.. 1982. 60. 110~ ~ Ces isomè~es toiv~t e~e scp~res avec beaucoup de soins sur coloDne de ~el de slllce afm ~EUILLE DE REMPLACEME~NT
WO 93/16095 Pcr/FRs3/oo1l5 I~ ~ r ~ , s ~
d'ob~cnir le denvc 2'-O-TBDMS 24 avec une purete superieure a 99.95 /O mesuree par CLPH.
En cffe~ si ce n'cst pas le cas. les etapes ultericures nous conduiront à des melan~es d'oli~othionucleotite S'-3' attendus avec l'lsomere indes~rable 5' 2'.
5 En conseque~ce~ la pureté du 5'-O-DmTr-2'-O-silyl 24 est primordiale pour unc borme svnthèse.
Ainsi. l'obten~on des composes 5'-DrnTr-2'-~TBDMS 24 a tout d'abort eté réalisee selon la methode d'OGILVIE et Coll. (~;. K. C)GlLVlE. A. L. SCHIFMAN et C. L. PE~E`~.
(`an. J. Chem.. 1979..S7. 2230.) qul consis~e à condenser 23 avcc du chlosure de l~rl-10 butyldiméthylsilyle (TBDMSCl) (1.2 equivalent molure) tans la py~idi~e en presenced'in~itazole (2.6 eqwvalenu molures). En fm de reaction~ on obtient un melan~c de den~e 2'-O-TBDMS 24 et te son isomere ;'-O-TBDMS 2S. Le compose anendu X4 est sèpare du melange par chromuographic sur colonne de ~el te silice.
Il est ensuite possible par une reaction d'equilibration d'obt~ir 24 à pamr dc son isomerc ~'-15 O-TBDMS ~ (S. S. JONES et C. B. REESE. J. Chem. Soc. Perl~7n Trans 1. 1979. 2762.).
Cette ~grasiorl tu groupement TBDMS est iD~moleculaire et s'effecnle la un intenncdiaire possedant un atome de silicium pentavalent. L'isomerisation tu dcnve ;'-O-TBDMS obtenu p.recédemment apres une prcmicre sepa~ano~ chromato~raphque cst effcctuec tans l'éthanol à temperature ambiante pcnd~t une nutt. Les dcux isomères de position ùnsi obtenus sont à nouveau sct~ares par c~romato8raphie sur colonne de ~el de 20 silice. Cettc op~ ion d'isomensation sui~rie d'unc p~ific~on est repetee trois fois Cependant les rentemc~ts en 5' DmTr-2'~0-TBDMS ~4 obtenus par cette methode ~ ~0 a ~0 % selon les bases) nc nous ont pas puu sstisfaisants. Nous en avons utilise une au~re. plus recente~ mise au point pu OGIL~IE ( G. H. HAKIMELAHI. Z. .~. PROB.~ et l; ~
OGILVIE~ Con. J. C~em.. 198. 60. 1106.) 4ui pcrmet l'introduction prefcrcnnellc du 25 TBDMS en positton ~' dcs ribo~ucleosides B. Ce~te tec~ique preconise l'utilisat~oo de sels d'argcnts.
Ainsi le S'~ hoxyaityl 23 est condense avec du chlomre de TBDMS ( l.3 equlvalents molaircs) en prescncc de iitratc d'argcnt ( 1.2 eguivalen~ molaires~ et dc 3.7 equl~alents de pvridinc dar~s lc THF anhydre. Après punfication par chromatographie sur coloMe de ~el de 30 silicc on ob~ent S6 % de rendement en W et '~7 .~O en 5'-DmTr-3'-O-TBDMS 2~
En consequence. Ic S`-DmTr-2'4-TBD~S 24 est obtenu dans ces nouvelles condmons en une seule hape avec u~ meillew rendemen~ mùs la selecti~ e d'introducDon du groupement TBDMS en 2' n'est pas amelioree .
11.1.2 Syntbes des denves pbosphoralDIdi~es ~ ~Scbema 9) FEUtLLE Q~: R~MPL~CEMENT
WO 93/16095 PCl`tFR93/00115 n ~ r ~, Les quatre B thioribonucleosides phosphoramidites l\i-proteges 26 R~i sont ensuite obtcnus a pamr des 5'-DmTr-2'-O-TBDMS B thioribonucléosides ~-protéges colTespondants 2 (Schema 9~.
Le derive nucleosidi~ue 24 a éte trate par du chJoro N. N diisopropylamino methoxv 5 phosphine ( '.5 equivalents molaires~ en psésence de ~.~.N diisopropyl éthylamine (DIE.
dans ~e dichloromethane sous atmosphère intc. Lc d~ivé phosphoramidite 26 a ete purifie par chromato~rap~ie sur gel de silice ct Iyopbilise dans le bcnzènc~ les phosphoramidites 26 a-d sont obtenus avec des rendements vanant de 78 à 80 % selon la nature dle la base.
:,~Trr`-- S 3 , . ~ r~mTrO-- -~
~Q ~T~J~S ( jPr)2N \ ~ VTE~US
24^-d ' 26 !\/leC
i = (iPr) ~P(CI)OMe~ DEA DMAP~ CH ~C12) SCHEMA ~
Les analv~cs dcs spectrcs de RM~ du 31P et du lH de 26 montrent clslrement quc nous obtenons une seule paire de di~stereoisomères ce qui etablit la puretc rc~ioisomènque des 25 compo~es obtenus.
En e~et. ~uelqucs wteuJs (R. ~CIER~EK M. H. CARUTHERS. C. E. LOl`iGFELLO~. D.
SWWON, D. H. TURNER et S. M. FREER BlochemJs~n~, 1986. 2S~ 7840~78~6 ~ a~slcnt emis l~ypoth~se que lcs groupemcnts silyles en position 2' n'etaicnt pas stables dans les condioons de la phosph~ylaoon. Cependant~ il B cte mODt~ (W, K. 1;OHLER ~
SCHLOSSERM, G. CHARUBALA et W PFLEIDLERER Chemlsln~ and Blolo~ of 30 ,~cleosldes and Nucleo~ides~ Academic Press, ~lew York. 1978~ pp 347 ;58: }i. ~
OGILVIE Ct D. W. E~STLE~ Carbo~trate Res.~ 198E 89~ 20;-210: ~ ~S~t.~;. ~;.
~;. OGILVIE M. Y. JLANG Ct R J. CEDERGRE~. J. Am. Ch~ Soc.. 1987. 109. 7845-7854.~ qUC leS 8rOl~pCS ~IS;1VIeS m;~t danS kS SOI~tS PrOnqUeS COmme le methanO1OU d~S 1CS SOIU~OnS aqUCUSCS COmme 1e mC1an8C p~ nC/eaU. ~S CeS ~OUPementS
35 Sj1Y1CS SOnt S~bleS danS 1eS SOI~tS ~hydreS et nOt~Cnt ~1eS baSeS nOn PrOnqUeS
COmme 1a pyrid~C ~hydrC (~;~ }C. OG1LVIE~ D. W. ENTV~STLE~ Carboh dra~ s.
1981. 89 203-210; W. KOHLER W. SCHLOSSER G. CHARUBAL.~ e~
FEUIL~E DE REMPLA~EMENT
WO 93/16095 "~ PCl /FR93/00115 PFLEIDERER Chemis~ry and Blology of ~lucleosides ond ~ucleot-des, Acadcmic Press.
Ncw York, 1978, pp 347-3S8.). D'autre par~ il a cté clairemcnt démontre cn scne ribonucléotidc que l'utilisation dcs 2'-O-silyl ribonuclcosides tans la synthèsed'oligoribonucltotidcs conduit exclusivcmcnt à des liusons 5'-3' (K~ K. OGILVIE. M. J.
5 ~iEMER Telrahedron Lett.. 1980. 21. 4159: R. T. PON ct K, K OGILVIE. Terrahedron Len., 1984, 2S~ 713; R T PO~. a K. K. OGILVIE, Nuclcosides Nucleondes. 1984. 3.
48S;P. J. GAREGG. 1. L~DH. I. STAWI~SKL et R STROMBERG. Tetrahedron Le~
1986, 27. 40SS-40S8). La synd~cse de phosphoranuditcs n'est pas stéreospccifique ct la fonoaoon en 4u~mtcs egales des deux diastercoisomeres est tue à la chiralitc de l'atomc dc phosphore de configur tion R ou S. La formation dc ces dcux produits n'est pas genante 10 duls b mcsure où les iéactions d'oxydation ulterieures sup~nt ce~te chir~lite.
Il. 2. PARTE EXPER~IENTALE
M6thodc gencnk pour la prcparation des 5'~dimctboxvtrityl N--cyi 4'-thio-~D-15 r~bonuckosid~23 -d.
A u~c solu~on dc N-wyl ~dliofibonucleoside 23 a-d ( lmmole) dans la py~itine anhydre (S~6ml) est ~jouté du chlon~re de d~méthoxym~rle (1.2?mmole, 430mg). Le mel~e réac~olmcl est gité i ~e ambiulte sous a~Dosphèrc ine~tc pend nt 90 a 120 n~in puis du mé~ol (lml) cst ~jouté. Après 10 minutcs t'~tion suppléme~taire. Ie mel~e 20 rc ctionnd est versé sur une solu~oD aqueuse s~ec te bic rbonate de sodium (~Sml) et Ics produits sont ex~its avcc du dichlorometh~e (2 x 20ml), Les phases or~anlques sont lavecs avec dc l'c u (2 x 100ml) puis secbees sur sulfate dc sodit~D et filtrees. Le filtsat cst evaporc sous pression reduite et le rcsidu ob~u est chrom-togr~hié sur une colonne de ~el de silice, L'eh~ ef~ecnlee avec un mél~ge CH2C12/MeOH 98n en presencc de tAe~ylu~ e 1%; lcs ~o~s cont~n~nt le protuit sont.evaporees i sec et les nucleosides 25 23 ~-d sont obteDus sous fomle d'une huile.
1-14'-th~5'~dim~tbo~trltyle~ nnnosyl~Thymine Relldc~en~ 68 %.
Spcctromé~ie dc m~ sse FAB>0 NOBA mJz = 577 [M+Hl~ 303 lDmTrl ~
30 RM~ IH tDMSOd6. 360MHz) ~ 24~ ( s. 1 H~ NH); 7.44~ ( s~ I H~ H6): 6.87-7~30~ t m.
13H~HArom~iques);S,83,(d,1H,Hl~,Jl~2~=7,0~;S.S3,(d.1H~OH~.JoH~ =5.8);
5 3O` ( d~ l H` oH3~ JoH~3~ ~ 4~ 4~l4~ ~ td~ l H~ H2~ J2~ 6~9~ ~l7~ 3~ = 3 o); ~ oo ~
H~ H3', J3',2' ~ 3.0~ J3',4' ~ 3~0); 3~69~ ( s~ 6 H, OMe); 3.30, ( dd lH. H4~ m. 7 ~1.
Hs~, Hs~); 1,60, ( s, 3 H, CH3)~
1-14'.1hio S-~}di~tbo~ytriqle l~ n~ no~ Uncile ~.
Re~ nt 70%.
FEUILI_E DE REMPL~SEMENT
WO 93/1609~ PCl`/FR93/00115 . .. _ . . ~ ., _ R~ lH (DMSOd6, 360 MH2) ~ 11.31~ (s. I H. NH~; 7.70. (d, 1 H, H6. J6,S = 8 0)~ 7 40 6 89. (ITL 13 H. H aromatiques du groupement dmTr); 5.84 (~ I H. H~ 1 ?' = S 7). 5.~3 1 H- OH2~. JoH2~ 5.6), 5.48. (d~ I H. Hs. J5.6 ~ 8.0); 5.26, (d, 1 H, OH3. JoH3 3 =~45):4.02.(m.2H.H~.H3~);3.74~ts.6H.OMe).3.31.(~3H.~4~.Hs.Hs ) 5 Spec~ome~c de m~sse FAB~O NOBA ~ z = S63 ~+H~+, 303 [DmTr~-1-14'-~hio S'-O dimetho~rtrityle ~D ribofur~nno~yllN~beDzoylCyto~ine 23 c Rendcmcnt 69 %.
R~ ' lH (D~lSOt6. 2SO M~:lz) o 11.32. ~s. lH. NH); 8.40. (~ lH. H6. J6.s = 7.5); 8.01.
(~ 2H, Ho du ~oup~ment bc~lzoylc): 7.63. (~ lH, HS. IS.6 - 7.3); 7 44. (~L 17H. H
10 aroma~ques tu gJoupemcnt DmTr ct Hm.p du groupne~t benzoyle); S.88.(~ lH. H1Jl ?~ = 4.1); S.73, (d~ IH~ OH2~ JoH ~ = S.2); 5.27.~4 IH, OH3~. ~O~.H3' = 5.7). 4 06.~m.
~H. H~J2~ 1~ = 4 0- ]2',3' = 3 7 J2'.0H = S.2); 4.03.~m~ lH, H3~, l3~ 2~ = 3 7. ~; ~ = S.;.
~3~.0H - 5.7); 3.76.(s. 6H. OCH3 du ~oupcmcnt DmTr); 3.43.(m. 3H. H4 ~ Hs~ct H~ ).
15 S~ométrie d~ massc }:AB>O NOBA m/z = 666 [M+HI+, 51~ [M+H-0CONH~]+~
303 lDmTrl +
1~14'~thiD 5'~dim~thosytrityle ~ribofbnDno~ N6-be~oyl~dénine 23 d Rcndement 70 %
R~I~' lH (DMSOd6~ 2SO MHz) ~ 11.25,( s. IH. NH); 8.63, (s, lH, Hg); 8.57, (s. lH. ~
20 8 04. (t. 2H. Ho du groupemc~t b~oylc~; 7.Sl, (m. 13H. H aromstiqucs du ~roupement DmTr): 6.92. (d~ 3~ Hm.p du group~mcnt benzoyle); 5.98. (d. lH. H~ = S 8). S.75.
~d- lH OH~ JOH,2~=3~);S4S.(d~ IH.OH3,JoH3~=2.5):470.(nL IH.H~ 6.(n~
lH. H3~); 3.74,( s~ 6}1, OCH3 du ~Foupemcnt DmTr~; 3.53. (m~ 3H. H4~.Hs~ e~ H
Spec~mc~ne de massc FAB>0 NOBA m/z = 690 lM I Hl~. 303 ~DmTrl+
5 M~th~e gen~nle pour b pr~p~ntion d~ 2'~ bu~ldim~th~ ih~1-4'-thio-S'~
dim~tho~ ql~N~cyl~ribon~Jcteo~id ~ el de leur i~o~ère 3'-l~D~S 25 A une sohtio~l de S'~dimethox~ilvl 4'-thio ~J-acyl B-~ribonucleoside ~3 ~-d ( Immole~
dans le THF ~n~ydrc (lOml) est ajoutc du mtrate d'~r8ent (1.2mmole~ 203m~). Lc mel-n~c 30 rcactioDnel est alors ~gitc S miDu~cs à tem~turc ambi~tc a~t l'atdi~on du chlonue de lerl-buryldimethylsilyle (TBDMSCl. 1.3mmole. 195mg) et de la py~idine anh~r~c (3.7mmole. 0.193ml). L`~itatioD à temperan~re u~bi~te est lors prolon~ce pendant 2~ h puis la soltmon hete~ogene est filtree av-nt d'ctre versee d~s unc solu~on a4ueusc de biwbonate de sodium i S% (30mJ). Lcs ptoduits SOD cx~its avec tu ~iebloromethanc(3x20ml) et ks ph~s otE~niques sont lavecs avec de l'eau puis secbees sur sulfate de 3~ sodium ct fil~es. Le Sltrat est cvapo* à scc et le residu est c~ographie sur uDe colonne dc gel de silice cn utilisant commc cluant un meb~e dc CH~Cl ~/AcOEt: 9~ S puls I:EUILLE DE REMPLACEMENT
WO 93~16095 PCl'/FR93/00115 f~ ~ r~ ,~
,., ,~, ~. , , ` , de C~?Cl~/AcOEt:80/20 . Les ~acaons contenant le produit desire (2'-O-TBDMS 24 a-d) sont reE~oupccs et évaporécs à sec. L'isomere 3'-O-TBDMS 2S a-d est ensuite obtenu.
1 -12'-0-tert-but~ldiméthylsilvl-4'-thio-5'-0-diméthox~trin~l-~D-ribofursnnosyl 5 Thymine ~.
Rendemcnt: 33 %.
Speclrome~ie dc masse F~>0 ~OBA mlz = 691 lM+H)+, 713 lM~ia]+.
R~T lH (DMSOd6, 300MHz): ~ 11.36, ( s. 1 H. NH); 7.58, ( s~ 1 H, H6): 7~33-6.90. ( m.
13 H. H Aroma~iques): ~.89~ ~ s. 1 H. H] . Jl ? = 6.1); 5.27, ( nL 1 H. OH3): 4.20. ( dd. I
H. H?. J~ = 6.10, ~?,3~= 3,5~: 3.97. ( m. 1 H. H3~); 3.73, ( s, 6 H. OMe): 3.36. ( m. 1 H.
10 H4):3.~5.(~2H.~s~.Hs~);1.58.(s.3H.CH3);0.81.(s.9H.tert-butvl):0Ø(d.6H.
!~Ae ~Si).
1-12'-0-iert-butyldiméthy!~ilyl~ thio-5'-0-dimétho~ytrityl~ ribofurannosvl 15 Ijracile 24 b.
Rcndement 56% .
Tf = 1 14~C.
RMN lH (DMSOd6, 360 MHz): ~ 11.20, (s. 1 H, NH); 7.81. (d. 1 H, H6. J6 5 = 8.1 ); 7.30-6.89. (m, 13 H, H asoma~iques du ~roupemcnt dmTr) 5.84, (~ 1 H. H~ ~ Jl' ~ = 5 ~); 5 50 (~ I H. Hs, ~5,6 = 8.1); 5.23. (d~ 1 H, OH3, JoH3 ,3 = 4.7), 4.11, (4 I H. H~ J~ 1~ = 5.5.
20 ~?~ 3 ~ = ;.5): 3.95. (m~ 1 H. H3~); ;.74. (s. 6 H. OMe); 3.38. (m, 2 H. H4. H5~ J~ ~ = 3.?8.
(~L 1 H. Hs~); 0.82, (s. 9 H. ~ert-butvl); 0.05, (~ 6 H. Me ~Si).
Spec~ome~c de masse FAB~0 NOBA n-lz = 677 [M ~ H) . 619 lM I H-ten-butane~-. 303[dmTr)-I-12'-0~ but~rldiméthylsiiyl~ thio-5'-0-diméthon~trityl-~D-ribofur~nnos~lI
!~i4 benxoylC~to~ine 24 c.
Rendement 32%.
H (DMSOd6~ 250 MHz): ~ 11.31. (s. IH, ~H); 8.51. (d~ 1~. H6~ J6.s = ~.3): 8.01.
(~ 2H. Ho du ~roupement benzoyle) 7.Sl. (rn 14H. H aromaoques du ~oupemcnt Dm~r et Hs): 6.93,( ~ 3H, Hm.p du ~roupemcnt bcnzoyle): 5.93.(~ lH. Hl . Jl ~ = ~ 0~: 5.20.(d.
lH. OH3~, JoH H3~ = 5.0); 4.14.(~ lH. H ~ 4.00.(~ lH H3 ); 3 76 ~s. 6H. OCH~ du ~roupement DmTr); 3.38.~ 3H. H4 . Hs~et Hs ~): 0.86. ~s. 9H. rerf-bu~l): 0 60. ~ 6H.
Me ~Si!
SpectrometTie dc masse FAB~0 NOBA mlz ?80 lM+HI~, 303 [DmTr)~
1-12'-0-ter.f-butyldim~thylsilvl-4'-thio-~'-0-dimetho%~ D-ribofur~nnos~ l ~6 benwyl~deni~e 24 d.
Ren~ement 3S %
FEUILLE DE REMPLACEMENT
WO 93/16095 PCI`/FR93/OOllS
R~ IH (DMSOd6, 2S0 ~z): ~ 11.2S,( s. lH~ NH); 8.64, (s~ lH, Hg); 8.61, (s~ lH~ H2)~
8.04. ~d. 2H, Ho du groupcment benzoyle). 7.51, (n~ 13H~ H ~rom~iqucs du groupement DmTr): 6.95, (d, 3H, Hm,p du groupemcnt ~nzoyle); 6.01, (d. IH, Hl~. Jl'.2' = 5 8); 5.48.
(~ lH, OH3~, JoH,3~ = 2.S); 4.70~ (nu lH. H~ ); 4.26, (m, IH, H3~); 3.75.( s. 6H. OCH3 du groupe~ncnt DmTr); 3~S3, (n~ 3H, H4~.11S n Hs~); 0.82~ (s. 9H, lerl-butyl); 0.50, (~ 6H.
MC2Sj) Spec~omc~c tc masse FAB>O NOBA m/z 804 [M+H]+, 303 lM l H] ' 1-13'-O tat-butyldimeth~l~ilyl-4'-thio-S'-O-dim~tho~ytrityl B-D-ribohnnno~yll , Th~mine 2S ~.
Re~dement 13%.
RM~ lH (DMSOd6, 360 M}lz): ~ 11.34, (5, lH; NH); 7.46, (s~ IH~ H6); 7.89-7.30~ Im.
13H.Harom~qucs);5.87.(d~ IH.Hl,J~ =7.8);S.46.(d~ lH.OH2~,JoH~=5.1):4 1,.
Im~ IH~ H3~): 4~11,(m, lH, H~, 32~ 1~ = 7.8, JoH,2` = 5.1); 3.73, (s. 6H~ OMe); 1.66~ (s~ 3H~
CH3); 0~84.(s. 9H. Ier~-butyl); 0.50,(d~ 6H.Me2Si).
1~l3~tat-buqldim~ tbio-s~ m~tho~ytriq~ ribohnnnos~
linciIe 2S b.
Re~demeslt 2r~
Tf = 109C.
RMN lH (DMS~ 360 MHz): S 11.30,(s. I H, ~H); 7.70, (d, 1 H~ H6~ J6 5 = 8.0): 7.30-6.89~ (13 H~ H a~om~i~ues du groupe-ment dmTr): 5.84, ~d~ 1 H, Hl~. Jl'.2' = 7.3): 5.57~ (d.
1 ~ H5~ JS.6 ~ 8~0); 5.46, (d~ I H. OH~. JoH2~2~ = 5 1): 4.12~ (~ I H- H3 J; ~
J3~4~ = 3~ 4~03~ (m, I H~ H2~); 3.74, (s. 6 H. OMe); 3.41. lnL 1 H. H4); ;.'1. (m~ ' H.
Hs~ Hs~); 0.08~ (s, 9 H, tert-butyl); 0.02. (~ 6 ~ Me2Si).
Spectromc~ie de ~sse FAB~O NOBA m~z 677 [M+~ 619 [M~H-tert-butane)-. 303 ~dmTr)t.
Cc composc a ~ mis eD prcscnce avec une soluion e~noVme~ylamine 0.25~o (~
pendant unc 12 h i t~ re ~mbia~te pour don~er en propor~on eg~le un melan~e ct 2S b.
1-13'~tat-butyldim~thyl~ilyl~ thio-5'~0 dim~tho~rit~ ribofur-nno~l 1'~4~be~o~1 cy~int ~.
Rcndement 31 ~/o.
RMN lH (DMSOd6, 2S0 MHz~: ~ 11.33. (s. lH. NH); 8.40. (d~ lH. H6. ~6 ~ = 7 4): 8 01.
(L 2~ Ho du grou~xment benzovle~; 7.60, (m, I4H. H uom~oques du ~roupement DmTr e~ Hs~; 6.92~ ( d, 3H, Hmp du groupement benz~yle); S.92,(d. lH. Hl, Jl'.'' = ~ 3);
5.60~(d, IH OH2~. JoH ~ s 5.0); 4.1S,(nL 2H~ H ~, H3~); 3.~S,(s~ 6H. OCH3 du IFoupement DmTr); 3.38.(~ 3H. H4: Hs~et Hs~); 0.79. (s. 9H, Jert~butyl); 0 00, ~d, 6H. Me-Si!.
Spectrom;c~ie dc massc FAB>0 NOBA m/z 780 ~M+H]+. 303 ~DmTr FEUILLE DE REMPLACEMENT
WO 93/16095 PCl~/FR93/00115 r l .t 1-13'-0-tcrt-but~yldimethgl~ilyl-4'-thio-S'~dim~tho~ytritvl ll-D-ribofur~nno~yl ~6-benzoyl ~d~nine ~.
Rendcment 29% .
R~ lH (DMSOd6~ 2S0 MHz~ 5,( s~ lH. NH); 8.64. (s. lH, Hg); 8.61, (s~ lH. H2);
5 8 04~ 2H. Ho du groupement ber~oylc)~ 7.51~ (nL 13H. H ~rom~ques du groupement DmTr): 6.9S. (d. 3H. Hm.p du ~roupement balzoyle); 6.01~ (d. IH~ Hl~. Jl~ ~ = S 8): S 79~
(d~ IH~ OH~. JoH~r ~ 3.S); 4 70. (~ lH. H~); 4.26. ~m~ IH. H3~); 3.7S~( s. 6H. OCH3 du ~ment ~Tr); 3.S3. (m. 3H. H4~.HS~ et Hs~ 0.82~ (s, 9H, Icrl-butyl); 0.01. ~ 6H.
!~c~Si).
Spectrometnc de m~ssc FAB>0 NOE~A m/z 804 lM~H] ' . 303 IM+H
Met~de ~ener~le de p~retion dff ~D nbonucl~o~ide phosphor~m;ditn 26 ~-d~
A une solu~ion des composes 24 ~-d (1 mmole) d~s du dichlorome~ne ~nhvdrc (3 8ml~
sont ~outes sous ~e inffte d' rgoll la N~N,N diiso~letbylulune (4 mmoles 15 0 7~ b~ chloro N~N~iiso~l_~_ (2 S~mole) 0 48ml) a la ~
(0 2~ole, 24 4mg) Le me~8e ~ctioDnel es~ ~itc de ~0 à
-- 90 ~ nbunte puis est dilue ~vec te I'~ate d'ethvlc (35ml) La solL~ cst l~vee s~lec de la s~umure (4~S0ml) puis ~vec dc l'e-u ('~xS0ml) La ph~orgal~ique est sechee sur sulf~te de sodium~ fih~ée et evaporee sous pression reduite Lc residu est cb_~hie sur colo~e de gel de silice et l'elutioo est re lisee i l' ide 20 d`un melu~ge de cyclobex~ne~ de dicbloromét~nc et de tnethylunine ~100/0/0 1 i SOIS010 1) Les produits 26 d soDt ob~e~us sous b fonne d'u~e poudrc blanchc apres Iyophilis tion d ns le b~ne 1-12'~rt-butyldim~thylsilyl-3'-N~N-diisopropylmétho~rphosphor~midite-4'thio-S' O-2 diméthorytrityle-~ribofursnnosyllThymine ~ (melange diastercoisomerique Rendcment 89%.
R~N31P~Cl)3CN) ~lSI,32etlS003 RM~ 1H 8 7 99, (s, 1 H, NH), ~ 6S, (~ 1 H, H6~; 7,3S-6 80 (m 13 H H uomaoques ~;S 97~ (~ I H H1~); 4,2S, (~ 1 H H~); 4 13 (~L 1 H H3~); 3 78 (s~ 6 H OMe); i 68 I H H4~); 3 S4~ (nL 2 H Hs~ Hs~); 3 35 (m~ 3 H McO du groupe~nent phosphorunJdltc 30 3 '5, (~ 2 H CH dcs ~roupements isopropyle); 1~60, (m 3 H CH3); I lS lm 12 H CH~
des groupements isopropyle); 0~86, (s 9 H #rt-butyl); 0 0S, (D~ 6 H~ Me ~Si) Spec~ome~ne de m~se F~0 NOBA m/z ~ 8S2 lM-H~
1-12'~1di~tbyl ibl-3'~N~-dii opropyl~ho~ypbospboro-midi-e-4'tllio S'-O~ ribohnnnosyllUncik~ gedi s#reoison~nque~
35 ~ R~Ddcm~78%.
RMN 31P~CDC13): ~ IS0.65 a ISO.S0.
FEUILLE DE REMPLACEI AENT
Wo 93/16095 pcr/FR93/ooll5 . i ,~ n ~, ~0 1 40 R~ IH (CD3CN,250 MHz): ~ 7.99~ (s~ 1 H. NH). 7.22, (m. I H. H6): 7.30-6.89. ~m. 13 H. H aromanques du groupcmcnt DmTr): 5.90. (m. 1 H, Hl~); 5.50. (m. 1 H. Hs); 4.13. ~m.
H. H2. H3~); 3.80, (s, 6 H, OMe du ~roupe DmTr); 3.58~ (m, 3 H, H4. Hs~ Hs ); 3.4 lm. ' H. ? CH des ~roupements isopropyle); 3.30 (m~ 3 H. MeO du ~roupement DmTr)~
5 1.19. (m. 1~ H. CH3 des ~oupements isopropyle); 0.84. (s. 9 H. Ierl-but~ 0.05. (m. S H.
Me~Si).
Spectrometne de masse FAB>0 NOBA mlz = 534 [MtH-DmTrHI+
I -12`-0-tcrt-but~ldimethylsilyl-3'-N,N-diisopropylmethosyphosphoro-midite-~1'shio-5'-O-dimethoxytrityle-l~D-ribofur~nnosyll !~4-benzoyl Cyto~ine 26 c.
10 Rendcment 7~% .
RM~' 31P (CD3C~): 8 1Sl~30 et 150.05 Spectrometric de masse FAB>O PEG mJz 941 [M+H~, 637 IM+H-DmTrH) 303 ~DmTr]~
1-12'-0-tert-butyldiméthylsilyl-3'-N,N-diisopropvlmethoxyphosphoroamidi~ 1'thi~'-O-diméthoxytrityle-~D-ribofurannosyll r~i~benzoyl Adenine 26 d Rendement 71% .
RM~ 31P (CDC13): ~ ISI.26 et 150,01 Spectromct~ie dc masse FAB~O PEG nuz 964 ~M+H~-~ 600 ~M ' H-DmTrH] 303 ~DmTr]~.
Il. 3 Fonctionalis~tion du support solide (Schema 10).
Le support solide ou LCA-CPG ( LoDg Chain Alkylamine Controllcd Pore Glass) P-l a tout 20 d`abord etc acive par une solution d'acide trichloroacetique à 3 % dans le dich~oromethane à
temperature ambiante pendsDt 2 à 3 heures afin de liberer le plus grand nombrc de ~roupements amino. ce qui cnnduit au maximum de sites reactifs sur la surfacc des billes de verre. Le supporl ainsi active P-2 est a~ors fonctiormalise par coupla~e avec de l'anhvdride succinique dans ia pyridine en préscnce de 4-DMAP ce qui conduit à P-3. Dans l`etape suivante. Ie nuclcoside 3'-silyle 25 est utilise puisqu' il a éte obtenu penàant la reacnon de 25 silylation des thioribonucleosides et n'est pas necessaire pour la svnthèse d'oli~othionucleohdcs co~tenant la liaison phosphodiester 3`-5'. Ainsi. P-3 acti~,e par le l-(3-dime~ylaminopropyl~ 3-ethylcarbodiimide (~)EC) en presence de 4-~MAP est rnis en reactioD dans la pyridine anhy~re avec le 5'-O-DmTr-3`-OTBDMS ~thioribonucleoside 2~. Les sites non uilis~es du suppon sont masques à l`aide de pipcridine. Une derniere etape 30 de masquage à l'ar~vdride aceique en presence de collidine dans le THF conduit à P-6. La quas~tite de nucleoside fixee sur le suppon est dcterminee par spec~ophotometrie V. ~ . en mesurant la quan~ate de cation dimethox~itvle libere après un ~aitement par une solution a 10 % d'acide tric~oroacetique dans le dichloromcthane. Lc dene de fonctionnallsation ~arie de 21 à 38 ,~unole par gran~nc dc suppon suivant la nan~re de la basc nuclcosidique.
.
FEUILLE OE REMPLACEMENT
WO 93/1609~i ~ PCI`/FR93/00115 ,., ~., . . ~
(~\~NH ( i )~A~ ( ii )~NH-C(O)-(c~12) s ?2 ~3 ( 'ii ) o DmirO B DmTrO
1~/ iv lST~0MS0 0(0)C ~h~ T~OMSO 0(0)C w~~
Cl C~ ,~J ~J
CI(~OlC-(CHl)-C(O)-HN~p5 HO2C-(CHl)-C(O)-Hh~
20 Cl Cl v, vi 0mTrOl S
~,/ \~/
~I
I aDMSO O(O)C ~,~
CN-O2C-(CH2)-C(O)-HN~ P6 ( i = TCA3/~, CH2C:12; ii = anhydride succinique. DMAP, Pyr.; iii = S'~DmTr~'~ 3 l~DMS~ nbo~ucléositc, DMAP, NEt3, DEC Pyr.; i~r = pe~t~chlorophenoh v = pipcridine; vi = Ac20 O.SM da~s THF ) W O 93/16095 PCl`/FR93/OOllS
Il. 4. Svnthe~e sutomati~ee des thiooiigonucl~otide~ (Schem~ 11).
Les thiooligonucleo~idcs ont ete svnthe~ses sur un s~nthetiseu~ a AD~ (Applied ~iosvstems modele ;81 .~). Le c~clc d'elon~anon compor~e quat~re etapes importantes: -Desntvlarion du nucleoside ou de l`oli~onucleotide fixe sur le suppon solidc.
Condensation du phosphoramidi~e acnve par le tetr~ole sur l'hvdroxvle 5` libre du nucleoside ou de l'oli~onucleonde.
Aasqua~e des foncDons 5'-hvdroxvles qui n'ont ,~as rea~i.
Oxvdanon des foncions phosphte~cstcr en phvspbotricster.
WO 93/16095 L~ PCl`/FR93/00115 ,`., . , ~ ~ . , ,~
~... o_~z ~Y m ~ LL' O
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FEUlllE~ DE REMPLACEMENT
WO 93/16095 PCI'/FRg3/00115 '` r~ ~ 4 4 r ~ `J ,t _, :
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Cl C ~
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_1 c~ _ _~ _ ~FUILLE DE REMPLACEMENT
wO 93/16095 ~ pcr/FR93/ool15 Chaque synthese a etc effecnlee sur une colonnc contenant 40 mg de support solJde Le rendement de chaque incorporation cst dc 98 % évalue en mcsurant la concen~anon des canons dunethox,~tyles recuperes apres chaque coupbgc par traitement du suppon al'acide ~ichloroacetique.
Des lavages sont cffcctues entre chaque eulpc. et la durée t'un cycle d'elon~anon est dc 21.1 minutes pour la s,vnthese de l~omododccamerc 4'-thio~ ribonucleondc I BrS~
( Tablcau I ).
.
~umero I Etape ! Temps ~scc.3 I_ Solvant et Reacnfs I ¦Sechageet Lavage ! _ 24 _ MeC~ non ~ ¦ Detri~lat~on _ 8û TCA à 3% dans CH~CI~
3 ! Secha~e et Lava~e 74 _ ~ ~cC~-Argon _ ~ Couplage 915 amidite 0. IM(2 ~eq. )-~lcC~
tetrazole O.SM( lOeq. )~
.
_ Sechage _ ~5 _ A~80n 6 M~squagc ~3 Methyli~udazole-THF
?0 - - -- ---- Ac~Otlutitine/THF 1 1 8
7 SCch~e j 11 A~on _ _
8 Oxyda~on 1 ~3 ¦1~ 0.1~ dans THF P~T H'O
1 140tlO/
_
1 140tlO/
_
9 eC~ -2S TABLEAIJ' 1~ Cycle d'élonga~on unllse pour la synthcsc du ~rSU12.
3û
FEUILLE DE REMPLACEMENT
WO 93/16095 PCl`/FR93/0()11 ? r ~
r~ ~ r .. ~ ~ ~J ,t Il. ~. Decrochage, Déprotection et Purific~l~ion du thiooligomère.
.~pres avoir realisc les etapes de deprotccnon dcs methox~phosphatc dicsters au thiophenol.
Ic decrochage du dodecarnère du support solide par l'am~noniaque. Ia deprotectlon des 5 hvdroxyles par le TBAF. Ie thiooli~omere a ete dessalé sur unc colonne d'cxclusion G-'5 DEAE Sephadex ou sur une colonne iontque A-25 Sephadex DEAE et purifie par CLHP en phase inverse.
11.6.. P.~RTIE EXPERIMENTALE.
Exemple 1: S~rnthese de l'homododec~mère ûrSU12.
1-1 S,vn~ese du support. solide:
15 Le support solide P-l (2~415 g~ est mis en suspeDsion avec une solu~ion (50 ml~ d'aclde trichloroacctique a 3 % dans CH2C12 anhydrc. Après 4 h IS d'a~ation. 50 ml d`unesolu~aon de tnethylamine et de diisopropylamine ~9:1~ est ajoutec e~ après ~ mn d'aestanon la solution cst fil~e. Le support solide P-2 ainsi obteslu est lave par du tichloromethane ~ ' 50 ml) puis par te l'eth ~0 ml) et mis à secher.
Le support solide P-2 est ensu~tc mls en suspension dans de la pyridine anhvdre I 1-1.5 ml ~ en ~0 prèsence t'anhytride succ~que (0.48 g! et de DMAP (0~080S g~. La suspenslon est a~tce pentant 20 heurcs puis fil~e. Le support solide P-3 est alors lavc avec dc la p~ndme anhydre ~50 ml~ du dichloromcthane (2 x ~0 ml,) e~ de l'ether (2 x S0 ml) pUI5 IlUS a jecher sous ~lide.
Condens~tton du ~uppor~ ~olide P-3 sveC le 1-13'-O-tat-bu~ldime~hyhilvl-2'-h~drosv-4`thio-S'~dîm~tho~ytrityle~ ribofur-nno~l~Ur~cile 25 b l,'n mcla~ge dc P-3 (2~415 g) de 1-[3`~ rl-butyltiméthyl~ilyl-2`-hvdrox~`th~C'-O-dimethoxy~tvle-i~ribofi~raDDosylll,'tacile ~S b (333 m~ 1 eq.) dc la D~P ('4.~ msn~
0~5 eq.) de la tncthylamine (0~146 m~ 202 ,uh 0~003 eq.) et du DEC (920 mL 10 eq ~ d,ans 30 ~9 ml dc pyridirle anhydre cst a~te 3 ~ours à temperan~re ambiante~
On ajoute ensuitc du pcntachlorophenol ~321 mg~ 2.S eq.) et on liisse sous a~taoon '~
heures supplcmentures. Le suppott solide est alors filtre. nncc avec de 1~ p,~ndme anh dre (2 x S0 ml) puis avec du dichJoromethanc (2 x S0 ml) de l'ethcr (2 x S0 ml) Immediatcment après~ 'on tra~te Ic suppon solide ~-S par 25 ml de plpendme ~presa~ta~ion à ~cmperamre ambiantc pendant 24 heures~ le support solide est fil~e. Ia~e pu du 35 dvichlorometh~ne (2 x S0 ml) puis dc l'è~er (2 x50 ml) et ~us a sech sous ~lde F:EUILLE DE REMPLACEMEN~
WO 93t16095 ~ t PCl/FR93/00115 ~, ,, , , i, ~
Le support solidc scc (2.415 g) est mls en presence d'u~c solution d'anhvdndc accn~ue 10.5 ~1) dans le THF ( 1~ ml! et d'une solution de collidme (0~5 .~) dans le THF ( 15 rnl) .~pres ~
heures dc reaction~ le support solidc est lavc a~ec de la py~idme anhydre ~' x 50 ml). du dich~oromethanc (2 x 50 ml). du THF ~ ' ~ 50 rn~ ) e~ dc l'ether (~ x 50 ml 5 P-6 amsi obtenu est n~is a sechcr sous vide.
1-2) Delem~ma~ion du taw~ de fonctionnalisanon du support solide P-6.
Cette tcte~ination s'cffectue par dosa~e des ~roupemeDts DmTr liberes en milieu ac~dc On pèse exactement 38~0 m8 de P-6 qui sont mis en suspension dans 3.4 ml d'unc solunon
3û
FEUILLE DE REMPLACEMENT
WO 93/16095 PCl`/FR93/0()11 ? r ~
r~ ~ r .. ~ ~ ~J ,t Il. ~. Decrochage, Déprotection et Purific~l~ion du thiooligomère.
.~pres avoir realisc les etapes de deprotccnon dcs methox~phosphatc dicsters au thiophenol.
Ic decrochage du dodecarnère du support solide par l'am~noniaque. Ia deprotectlon des 5 hvdroxyles par le TBAF. Ie thiooli~omere a ete dessalé sur unc colonne d'cxclusion G-'5 DEAE Sephadex ou sur une colonne iontque A-25 Sephadex DEAE et purifie par CLHP en phase inverse.
11.6.. P.~RTIE EXPERIMENTALE.
Exemple 1: S~rnthese de l'homododec~mère ûrSU12.
1-1 S,vn~ese du support. solide:
15 Le support solide P-l (2~415 g~ est mis en suspeDsion avec une solu~ion (50 ml~ d'aclde trichloroacctique a 3 % dans CH2C12 anhydrc. Après 4 h IS d'a~ation. 50 ml d`unesolu~aon de tnethylamine et de diisopropylamine ~9:1~ est ajoutec e~ après ~ mn d'aestanon la solution cst fil~e. Le support solide P-2 ainsi obteslu est lave par du tichloromethane ~ ' 50 ml) puis par te l'eth ~0 ml) et mis à secher.
Le support solide P-2 est ensu~tc mls en suspension dans de la pyridine anhvdre I 1-1.5 ml ~ en ~0 prèsence t'anhytride succ~que (0.48 g! et de DMAP (0~080S g~. La suspenslon est a~tce pentant 20 heurcs puis fil~e. Le support solide P-3 est alors lavc avec dc la p~ndme anhydre ~50 ml~ du dichloromcthane (2 x ~0 ml,) e~ de l'ether (2 x S0 ml) pUI5 IlUS a jecher sous ~lide.
Condens~tton du ~uppor~ ~olide P-3 sveC le 1-13'-O-tat-bu~ldime~hyhilvl-2'-h~drosv-4`thio-S'~dîm~tho~ytrityle~ ribofur-nno~l~Ur~cile 25 b l,'n mcla~ge dc P-3 (2~415 g) de 1-[3`~ rl-butyltiméthyl~ilyl-2`-hvdrox~`th~C'-O-dimethoxy~tvle-i~ribofi~raDDosylll,'tacile ~S b (333 m~ 1 eq.) dc la D~P ('4.~ msn~
0~5 eq.) de la tncthylamine (0~146 m~ 202 ,uh 0~003 eq.) et du DEC (920 mL 10 eq ~ d,ans 30 ~9 ml dc pyridirle anhydre cst a~te 3 ~ours à temperan~re ambiante~
On ajoute ensuitc du pcntachlorophenol ~321 mg~ 2.S eq.) et on liisse sous a~taoon '~
heures supplcmentures. Le suppott solide est alors filtre. nncc avec de 1~ p,~ndme anh dre (2 x S0 ml) puis avec du dichJoromethanc (2 x S0 ml) de l'ethcr (2 x S0 ml) Immediatcment après~ 'on tra~te Ic suppon solide ~-S par 25 ml de plpendme ~presa~ta~ion à ~cmperamre ambiantc pendant 24 heures~ le support solide est fil~e. Ia~e pu du 35 dvichlorometh~ne (2 x S0 ml) puis dc l'è~er (2 x50 ml) et ~us a sech sous ~lde F:EUILLE DE REMPLACEMEN~
WO 93t16095 ~ t PCl/FR93/00115 ~, ,, , , i, ~
Le support solidc scc (2.415 g) est mls en presence d'u~c solution d'anhvdndc accn~ue 10.5 ~1) dans le THF ( 1~ ml! et d'une solution de collidme (0~5 .~) dans le THF ( 15 rnl) .~pres ~
heures dc reaction~ le support solidc est lavc a~ec de la py~idme anhydre ~' x 50 ml). du dich~oromethanc (2 x 50 ml). du THF ~ ' ~ 50 rn~ ) e~ dc l'ether (~ x 50 ml 5 P-6 amsi obtenu est n~is a sechcr sous vide.
1-2) Delem~ma~ion du taw~ de fonctionnalisanon du support solide P-6.
Cette tcte~ination s'cffectue par dosa~e des ~roupemeDts DmTr liberes en milieu ac~dc On pèse exactement 38~0 m8 de P-6 qui sont mis en suspension dans 3.4 ml d'unc solunon
10 d'acide paro-toluenc sulfonique (0.1 ~) dans l'acctonitrile. Lc melange est ag~te 15 mn pUlS
sonique pendant 2 mn.
On ajuste alors le volume à 10 rnl avec la solutio~ 0.1 M d'acidc pa~-toluène sulfon~que dans l'acetoni~nle. On prelève 0.3 ml dc cette solution à laqucllc on a~outc ~ ml de la solution û~l M d'tcidep~ra-tolucre sulfonique. La lecNre de la DO (0.;1? un~te de DO) a 15 500 nm nous pesmct de calculer le de~re dc fonctionnalisa~on du suppon P-6 ~ul est dans ce cas de 21 llmolciEramme dc support solide.
1-3) Svnthèsc automa~see de l~omodod;ecamere arSU12.
La svnthèse est cffcctuee sur une coloDe contenant 39.8 m~ de suppon solide foncnonna 20 lise à ~1 ~molcl~ de rcsine. soit 0.835 ~mole ( 1 eq) de 4'-thioundine.
Chaque cvcle d'elongar~on necessite un exces de synthon phosphora~udite (20 llmole. 24 eq) soi~ 24û ~mole au total pour la svnthèse du dodcc;lmère. Le synthenscur prele~ant 200,ul d`une solunon 0~1 M tc synthon dans l`acctom~rile par inco~poration.
La duree d'u~ cyclc t'clongation est de 21.1 rnn (Tableau 1).
L'etape de coupl~gc a eté considerablement au~mentee (900 s contre 45 s dans le ;as dun desoxynucleosidc) à ~sc de la mo~ndre reac~ e du svnthon nbonucleoode Le dos~ge des caDo~s timethox~ les libercs à chaque etape de ~ètnr;lanon a penrus d'eva~ucr le rcn~m~t moyen d'incorporanon dc l'unite dliolibonuclcotidique à 98~ %.
1~) Decrocha8e. teprotect~on et punficaoon du thio homododccamère a,~u~-Le suppon solide portant le thlo-bomododecame QrSI;12 est ~ute par S ml d`une solunon de thiophenol. ~ètbyl m~ne. dioxane 1. ~ (1!3'~) pend~t une dcmi-heure a temperanre ambiante.
La solution dc thiopbcnol est alors filtrcc et le support tave par une solunon d ~rnrnonlaque 3~ % tans l'ethu~ol 9S (311: v~v) ~; ~ S00~LI) pout dccroches le thio-homododccamcre du 35 support solide. La solution a~nsl obtenuc cs~ ev~poree~ ise par 500 ul deau pUlS
Ivophilisec.
FEUILLE DE REMPLA~EMENT
r ~
L'oligomere est alors dissout dans 300 ~I d'u~c solution dc TBAF ( 1,1 M) dans le THF Le melan~c reactionnel est laissé sous a~itation pendant 24 heures. La reaction cst alors stoppee a~ec 300 111 d'une solution aqucusc d'acetate d'a~unonium (0~0S M).
La solution est évaporec a sec. coevaporee 3 fois avec de I'eau ct le residu chromato~raph~e 5 sur colonne de gel d'exclusion Sephadex G 25. Les ~actions contcnant le ~ioohgomere sont rassemblees. evaporees à scc ct analysces par CLPH.
.~nalvse et Purifica~ion du thio-oligomère BrSU12 obtcnu.
L'analyse CLPH du thiooligomère a ete ef~ectuée sur une colonne Bec~nan C-18 RP ~ u 10 LODS Ul~aspherc dans les conditions de ~radicnt suiv~tes:
,~ 10 D~o d'acetonitrilc dans USIC solunon aqucuse 0,05 M d'scetate te tnethylammon~um.
8: 15 /O d'acétonitnle ~ans une solution aqueusc 0.05 M d'~cet~te de ~iethvlammomum Gradien~:
B .--A
~' 10' S' 5 Temps d'analyse: ;0' Dans ccs conditions on constate que Ic ~iooligomè~rc est pur à 92~73 %.
On ef~ectuc alors u~c punfication de ûrSUI~ sur colonne semi-preparative ~;ucleos~-l a~-ec un Eradicnt:
A--B----B-----A
15' 10' 5' OD obticnt dans ccs conditions le ~rSU12 avec une puretc de 94~4~ % suffisante pour les ètudes ultcnèures.
Exemple 11: Synthe~ du dodèc~mère ~ ~ SrT)l dTI 1
sonique pendant 2 mn.
On ajuste alors le volume à 10 rnl avec la solutio~ 0.1 M d'acidc pa~-toluène sulfon~que dans l'acetoni~nle. On prelève 0.3 ml dc cette solution à laqucllc on a~outc ~ ml de la solution û~l M d'tcidep~ra-tolucre sulfonique. La lecNre de la DO (0.;1? un~te de DO) a 15 500 nm nous pesmct de calculer le de~re dc fonctionnalisa~on du suppon P-6 ~ul est dans ce cas de 21 llmolciEramme dc support solide.
1-3) Svnthèsc automa~see de l~omodod;ecamere arSU12.
La svnthèse est cffcctuee sur une coloDe contenant 39.8 m~ de suppon solide foncnonna 20 lise à ~1 ~molcl~ de rcsine. soit 0.835 ~mole ( 1 eq) de 4'-thioundine.
Chaque cvcle d'elongar~on necessite un exces de synthon phosphora~udite (20 llmole. 24 eq) soi~ 24û ~mole au total pour la svnthèse du dodcc;lmère. Le synthenscur prele~ant 200,ul d`une solunon 0~1 M tc synthon dans l`acctom~rile par inco~poration.
La duree d'u~ cyclc t'clongation est de 21.1 rnn (Tableau 1).
L'etape de coupl~gc a eté considerablement au~mentee (900 s contre 45 s dans le ;as dun desoxynucleosidc) à ~sc de la mo~ndre reac~ e du svnthon nbonucleoode Le dos~ge des caDo~s timethox~ les libercs à chaque etape de ~ètnr;lanon a penrus d'eva~ucr le rcn~m~t moyen d'incorporanon dc l'unite dliolibonuclcotidique à 98~ %.
1~) Decrocha8e. teprotect~on et punficaoon du thio homododccamère a,~u~-Le suppon solide portant le thlo-bomododecame QrSI;12 est ~ute par S ml d`une solunon de thiophenol. ~ètbyl m~ne. dioxane 1. ~ (1!3'~) pend~t une dcmi-heure a temperanre ambiante.
La solution dc thiopbcnol est alors filtrcc et le support tave par une solunon d ~rnrnonlaque 3~ % tans l'ethu~ol 9S (311: v~v) ~; ~ S00~LI) pout dccroches le thio-homododccamcre du 35 support solide. La solution a~nsl obtenuc cs~ ev~poree~ ise par 500 ul deau pUlS
Ivophilisec.
FEUILLE DE REMPLA~EMENT
r ~
L'oligomere est alors dissout dans 300 ~I d'u~c solution dc TBAF ( 1,1 M) dans le THF Le melan~c reactionnel est laissé sous a~itation pendant 24 heures. La reaction cst alors stoppee a~ec 300 111 d'une solution aqucusc d'acetate d'a~unonium (0~0S M).
La solution est évaporec a sec. coevaporee 3 fois avec de I'eau ct le residu chromato~raph~e 5 sur colonne de gel d'exclusion Sephadex G 25. Les ~actions contcnant le ~ioohgomere sont rassemblees. evaporees à scc ct analysces par CLPH.
.~nalvse et Purifica~ion du thio-oligomère BrSU12 obtcnu.
L'analyse CLPH du thiooligomère a ete ef~ectuée sur une colonne Bec~nan C-18 RP ~ u 10 LODS Ul~aspherc dans les conditions de ~radicnt suiv~tes:
,~ 10 D~o d'acetonitrilc dans USIC solunon aqucuse 0,05 M d'scetate te tnethylammon~um.
8: 15 /O d'acétonitnle ~ans une solution aqueusc 0.05 M d'~cet~te de ~iethvlammomum Gradien~:
B .--A
~' 10' S' 5 Temps d'analyse: ;0' Dans ccs conditions on constate que Ic ~iooligomè~rc est pur à 92~73 %.
On ef~ectuc alors u~c punfication de ûrSUI~ sur colonne semi-preparative ~;ucleos~-l a~-ec un Eradicnt:
A--B----B-----A
15' 10' 5' OD obticnt dans ccs conditions le ~rSU12 avec une puretc de 94~4~ % suffisante pour les ètudes ultcnèures.
Exemple 11: Synthe~ du dodèc~mère ~ ~ SrT)l dTI 1
11-1 ) S~rnthèse du suppor~ solidc.
Le support solide fo~ctionnalise à 1 ~mole pour 35 mg de resine de 2'~esox~ mldme ai~si quc lcs synthons 1-~ S'~ mTr-3'-O-N~ diisopropyl~o cya~oeth~l phosphme. ' -desox~ ribofimnnosyl thvmine sont commercialises par Applied 13ios,vstcms II-2) Svnt~cse automatisee de û ( SrT)l dTI 1.
La syndlèse est cf~cctuee sur une colonne conteDant 35 m~ te support solide solt I umole de ~'-desoxyth~midine. Chaque c~;cle d'clongation ncccssitc un exces de synthons phos~horamiditc ~20 l~moles~ 20 cq) soit 220 ~mole de s,~nthons 2'-dcsox~ nudme es ~0 ~5 llmoles de syllthoD 4'-thi~th~ dinc ~. Le synthcsseur p~elcYan~ ~00 umoics pas incorpotation t`une solution 0~1 ~ de cha4uc synthon dans l'acctonitnle. La durec d`un ~EUILL~ PJ~PL~:EMENT
WO 93~16095 ~ ` , ` .t PCT/FR93/001 15 cvcle d'incorporation d'une unité désoxythv~udine est de 5.5 mn .Alors qu'elle est de . 0.1 mn pour un cvcle d'incorporation du svnthon 4'-thioth,v~udine.
L'au~nentation de la duree du cycle d'incorporation du synthon chimère est due a l etape de couplage de 909 ` contre 36 ' pour le svnthon ''-desoxvth,vmidine 5 Le dosa~e des cations diméthox,~rityles liberes à cha4ue ctape de detnt,vlanon a permls d'évalucr le rendement moven d'incorporation de l'unite ~'-desoxv~hvn~idine a 98.S O et 9~.
~o pour le sy thon i'-thiothvTrudine.
11-3) Décrochage.deprotection et purification du B (SrT)l dTI I
10 Le support solide portant l'olieomcre ~ (SrT)l dTl I est traite par une solunon d'ammoniaque (32 %) dans l'cthanol 95 (3/1~ v/v) (3 x 500 ,ul) pcndant 3 cvcles de ~) mn chacun afin de decrocher l'olieomère de son support~ puis le dodecarnere est incube pendan~
' hr dans une etuve sèche dans lc mèmc melan~e a~n dc deproteger les foncnons c~ anoeth~ l et methoxv.
15 L'oligomèrc cst ensuitc evaporc sous vide~ repris par 500 111 d'eau et Iyophilise.
La deprotection tes ~roupements TBDMS est effectuee selon le protocolc mis au pOlSlt dans : I`exemple 1.
Le tésidu obtenu cst chromato8raphie sur colonne de gd de DEAE Sephadex .',-" Les f~actions contenant l'oligomère sont rasscmblees~ evaporees à sec et analvsees par CLPH
20 Analvse et Purificanon du ~ (SrT)l dTt 1 par CLPH.
L'anal,vse CLPH de l'oli~omère a etè effectuee sur une eolonne Beckman C 18 RP ~ u ltrasphère dans les conditions de gradjent suivantcs:
.~: 6 % d'acctonitrilc dans un tampon acetate de tncthyl armnoniurn 0.05 ~
25 B: ~0 /o d'acetonitrile dans un tampon acetate dc triethyl ammorlium 0.05 ~1.
--B~ B
15' 1~' Temps d'anaJyse: 'S mn.
Dans ces conditions. l'oli~omère est pur à 49~3 %
30 une purificanon dc ~ ( SrT)l dTI 1 est alors effectuce par CLPH semi-preparan~e a~ e; une colonne ~ucleosvl dans les condlnons de ~radicnt su~vantcs:
.~--- ----- - B~ B
15' S`
Le 1 ~-mer presentc aJors un temps dc retcnoon dc 1~ mn et unc purete supeneur~ a 99 ~, 11.4.: Syn~hàe du dodecamère ~ dTS (SrT) dT6 FEUIL~E DE REMPl AC`EMENT
ISAIEP
wo 93t16095 pcr/FR93toolts ~o 11~ 1) S~hese du support solide.
Le suppor~ sol~dc defini dans l'excmple ll a esc unlise.
5 Il- l ~) S~,nthèse automansce de ~ dTS (SrT) dT6.
Les memes condinons de svnthèse mises au pOU t pOUS la synthèse dc ~ ( SrT)~ dTI 1 ont ete utiiisccs.
Le dosage des canons dime~ox~iryles liberes a chaque etape dc detnrylanon a pe~us d'evaluer le reDdemeM moyen t'inco~poranon dc l'unite 2' dcsoxy~vnut~ne a 99. ~ O e~ a 10 96. l ~0 pour le s,~n~hon 4' thiothvmltine.
11~.3~ Decrochage punfic~oon du ~ dTS (SrT) dT~, Le traitcment te cet oligomcre ~ ete ef~ecnlc sclon le protocole mis ~u poult tans l'exemple 15 Il. L'analyse ct la purification CLHP~ rcalisee da~s lcs memff conti~aons dc ~dtent revele u~ temps de retcn~ion te 13.18 minutes et u~c purete spectrophotomc~i4ue a '60nm de ~00 o~o 111. SY~THESE AUTOMATIS~E DE 4'-THIO-OLIGORIBONl~'CLEOTIDES ET
OLIGOMERES MIXTES.
On decnt la s~nthèse d'un 4'~thio-ri~o oligom~ homogene 1 tin~e sur la scquence d'epissage ace~ce du ~ene lat du HIV. O~l mon~c qu'il est cnsulte posslble d'obtemr des oli~omcs mixtcs eomprc~ant u~c scquc~cc limi~cc t'AD~I prescntant des llausons phosphodicstcrs ~e 4) ou pbosphor~thioa~cs ~scqueDce 5) De ~cllc~ ~eque&~ mi~e~ S~ S-ARN I ADN l 4-S-A~3` 4 et ~ p~ent ètre uulisee~
2 5 tan~ une appr~eho an~ c~ som susceptible~ t~ h~emont ~l~ d~ la me~e où
la "~ ro" t~ ~uc~ ADN ~era s~le sub~ras to ~ 40 H ~ tppuiement dc 1'~ aveo w~s c bb complemem~. Il cst à noter que l~ ADN (phosphodic~et ou pho~phorothio~o) p~ ~ d~ lon~ucur ~l~ - d~ lc~ ~ 4 e~ 5 il y a six de~oxynud~tite~ . ~t quo cett~ "fcn~ pcut ~ ulchuo ~ nqmpon~ qucUe position dc 3 o l'oligom~ m*no ux ~mit~ S' et / ou 3'.
Complh~eD~uement~ cctsc possib'll~'t~ ou~Te la vole ~1~ co~cepoon de nboz~mes amfic~cls ~homo~e~es ou non) compon~t dcs scquenccs d'oligo~nbonuclèo~des ~ R~
On ~ synthe~sc un ca~ nombre de 4:thio oli~oribont~cleotides homo~enes l~
35 sur un syD~edsct~ i A.D~ ~Applied E~iosystaDs mo~ele 381A) eD unhs;~t le procede gcn~l d~c~it prJ~t.
C'cst le c~s no~unent: FEUILLE DE REMPLAC`EMENT
ISAJEP
W O 93/16095 ~ PCT/FR93/00115 ., 1 . . , ~; ,~
du~'-Sr-~A-C-A-C-C-C-A-A-~-U-C-U)l du4'-Sr-t~-U-U-U-U-O.(4'-SrU6),2 etdu~'-Sr-(~-U-U-U-U-U-3'-P-CH2-CH2-CH~-OH~,(4'-SrU6-3'n-p~DH)3.
L'expression 4'-Sr vcut dirc: oligoribonucléotidc de configuration ~ où l'oxv~ènc du cvcle furannosc des sucres est rcmplace par un atome de sou~e.
3'n-prOH siynifie qu'unc fonction n-propanol est fixce sur Ic ~roupemcnt phosphatc introtuit à l'extrcmite 3' de l'oligoribonuclcoride.
De plus. des oligomes mixtes comprenant des se~uences d'oligodesoxvnucleondes pbosphodicster ou phosphorothioates ont ete obtenus et les modifications apportees au cvcle d'elongation sont decrites cn prenunt comme cxemple les sequenccs suivantes 4'-Sr-(U-U-U~d(T-T-T-T-T-T~4'-Sr-~U-U-U) I P11, ~'-SrU3~dT6-4-SrU3 / Plll ~
et4'-Sr~U-U-U~d(T-T-T-T-T~ 4'-Sr~U-U-U~P3PSsP3, 14'-SrU3-dT6~'- SrU3/P3PSsP31 S
ou 4'-Sr 8 deja cte tefini comme precetem~ent, Px corrcspond au nombrc de liaisons phospbodicster enere les unites nucleotidiques et PSy au nombre de lia~sons phosphorothioate entre les unites nuclgotidiques.
Les thio-oligonbonucleotites ont ete syn~etises sur un synthetiseur a .4D~ pplied Biosys~ems modèle 381 A).
J S.~nlhese des ~'-thloollgorlb~ cleotldes ~ Sr-(A-C-A-C-C-C-A-A-~
~'-SrU6. 2. el ~'-SrU6-3'n-prOH 3 Lc cvclc d' elongstion comporte qua~c etapes importantes " .
' 5 a) Détrityla~on du nucleoside ou de l'oligonucléotide fixe sur le suppo~ solide tans lec~ de4'-SrU6etde 4'-Sr~A-C-A~C-CdC~A-~-U-U-C-U),.ou bien de~n~ la~on du b~as D-props~nol fixe sur le suppor~ solitc ou de l`oligonucleotide fixe sur le llen n-propa~ol dans le cas de 4'-SrU6-3'n-prOH.
3 0 b) Co~densation du pbospboramidite active par le te~azole sur l~ydroxylc 5' libre du nucleoside ou de l'oli~onucleo~ide.dans lc cas de 4'-SrU6 et de 4-Sr-~A-C-A-C-C-C~ U-U C-U).ou bien sur l~ydroxyle libre du bras D-propanol ou sur l~ydroxvle en 5' de roligonucleotide dans le cas de 4'-SrU6-3'n-prOH.
c) Masqua~e des fonc~ions 5`-hydroxyles qui n'ont pas reap.
IL~E DE~5RA~ME~T
WO 93/16095 PCI`/FR93/OOtl~i n ~' 1 Chaquc svnthesc a ete cffectuee sur une colonnc conte~ant 40 m~ de suppon sol~de. Le rendcment de chaque mco~poranon est de 98 O evalue en mcsurant la denslte opnque des eanons dlmethoxy~tyles liberes apres chaque couplase par ~raltemcnt du support a l aclde ~nchloroacetique.
5 Des la-ages sont ef~ccsues enFe chaque etape. et la durce d'un cycle d'elon2anon e5t de ' I.16 m~nutes pour la s~lnshese dcs ~ois ollgomeres prec~tcs. ( Tableau;~l .
ETAPES ~ 1PS ~econde~) I SOLVANTS ET RE:ACTlFS
Lava~e~sechage ~ CH~CN I .~
Couplage 915~ucleoside pbosphoram~dlsc 0.1 .
~1 (20 eq.) dans CH3C~ ~
. tesrazole O,S ~t ( lO eq. ) dans L - _ . . CH~C~I. l L vage-sech~c ¦ ~l _CH3CN ~ GO~
Oxyd-non ¦ ;6 12(0.1 M)dansTHF/ PY H20 I (40/lO~l).
_ . _ .
LavaQe-scchage _ 1 59 I CH~C~ I ARGO~
~vlasquagc ~3Methylimidazolc~THF I
Ac~O/luadine/~ 1 18 1.
_ l Lava~ ? I ~CH~C~ / ARGO~.
2 ûDem lanon 98 _TC.~ à 3~O~a~
~ _ ! CH~C~i ~ ARGO~;
TA~LEAU 2 Cycle d'élonga~o~ u~se po~ la syn~ès~e te4'-Sr~A~C-A-C C-C-.~.~ V-2 5 U-C-l~') l, ~'-Sr~$ 2, et 4' Srl~'6 3'n-prOH. 3.
II~-2 Syn~h~K ~ oli~o~tcs mi~cs: ~t'.Sr~ U3 ~ P~ s~u~ J~
Srl-'3/P3PSf~3 111- '-I OI~gonucléotlde ~:SrU3-dT6 ~:5rC. 3 P
La svathèse automa~sce tc cct oli~onucleo~ide reprend les qua~e etapes decntes au l l- l Ch~que s,vnt~c# ~ cté cffcctuee sur unc coloDne contcn nt ~0 m~ te support sollde Le rendement de chaquc ~ncolporat~olL es~ dc 98 %. La duree d'un cyclc d'cloncaoon par monomère 4' Sr~U est de 21.43 mmutes contrc 6.73 mmutes pour un monomcrc dr Ccrse 3; dif~erencc est due i ru~cn~on du temps dc couplage d'unc entitè 4'-Sr U qul ei~ ~e ~1 s~contcs con~c 36 sccondcs pour unc u~utc dT.(t blc~u 3).
F~EUILLE DE RE M PLJ~CEM ENT
.
WO 93/16095/ ~ PCl /FR93/00115 ET.4.PES ~ ps~s~condes) I SOLVANTS ET I
¦ REACTlFS
j Lava~e-sechaee 1 '5 I CHlC~ I ARGO~;_ Coupla~e ~' Sr l_ I 915 I!~iuclcoside phosphoramldlle¦ 10.1 M ~_0 eq.) dans CH;CN
dT ' 36 ~ tetrazole 0.5 M ( 10 eq.
l da~l5 CH C~i.
¦Lavaee-secha~e L - 4 ! I CH~C.~ RGON
Oxvd~lon I -6 12 (0~1 M~ dans THF / P~T
_ _I . H ~O (40/10/1).
¦Lav~e sècha~e_ ! 59 ¦ CH~C~ 'ARGOI~
IMasquage ! ~; Methylinudaz,ole THF: I
_ ~ IAc OAundinc/lHF 1/118 1 L La~a~e-secha~c 1 71 ! CH3C~ ,' ARGO~
j Detnrvl~non ~ 98 ! TCA à 3% ~ns C}~Cl~
15 ~
T.~BLE.~I ' 3: Cyclc d'elonga~ion u~lisc pour la synthèse de 4'-Srl;3-dT~ Sr~ 3 J Pl 1 ~.
2 ~ O~lgonu~leollde 4 '-Sr~;3-d~6-~'-Sr~'~ P3PSSP3.~
Les memes condinons de s~lnthese automanscc ont e~e appliquees à ce dodecamerc nu~te compo~ a la fois des liaisons phosphodlestcrs et phospborothioates.
L3 svnthese a elc effecn~ce a l'echelle d'une ~lmole soit sur une colonne contenant en~on 5 ~0 m~ de support solide fo~caon~lalise a 21 ,umole ! ~, Lc rendement mo~ven d ncorporanon es~dc98%.
Lors dc l'iDtroduc~on d'une liaison intcrnucleondique de ~pe phospho~othioate. lctzpe d`oxvdanoD definie au paragraphc ~ l (etape 4. Table3u3 ) a ete remplacce par une etape de sulfurisation dc Sl sccondes u~ilisant le reactif de Bcauca~e ( ~rives de sulfon3 c~r~thioanhydri~de d~ benz~ne'~ dissout dasls l'acèton~tnlc a une 3 concen~anon d~ 0.0S ~.
Lcs autres etapes tu c~cle d`elonga~on demeurent inchan~ees.
fJ~-3 D~croch~c, Dcprotcction c~ Purif~c~non dcs 4 ~-thiooli~or~onYclcotidcs (4'~1~.
3~
FEUILLE DE REMPLA~EMENT
WO 93/16095 PCI'/FR93/00115 ,., ~ . ~ ,.. .
Après avoLr réalisé les etapes de déprotection des méthoxyphosphotnesters en phosphodiesters pa,r traitement au thiopheno~. les 4-thioQligoribonucleo~ides ont ete separes des supports solides par un traitement à l'arnrnon~aque. Les groupements TBDMS ~ntroduits sur les hydroxyles en ~' ont ete deproteges par une solu~ion de TB~F dans le THF. Les 5 thiooligomères sont ensuite dessalés sur une colonne d'exclusion DEAE Sephadex G-~5 p ~is purifiés par CLHP en phase inverse.
111-4 PARTIE EXPERIMENT~LE.
~` 10 Exemple l: Synthè~e des hesamèr ~ SrU6 2 et 4'-SrU6-3'n-prO~, 3.
1-1 Synt/~csc d~s suppor~s sol des:
15 Le suppor~ soUde néca~ire ~ la synthèse de 4'-SrU~. 2 est le même quc celui utilise pour la s~nth~se de BrSUl~.
La synd~# de 4-SrU6-3'n-prOH 3 necessite l'utilisa~on du support soUde u~vcrscl:
/^\
~ ~ ~ 21~
' / \CH/ ~C/ ``'--/
2~ 0 A pa~ir de l'intennedia~re P-3 decrit dan~ le Brevet n 9~ 01275 un melan~e de l -O-DmTr-propanol-3 ( l eq.), de DMAP (29,5 mg, 0 5 eq.), de triethylamine (O, l46 mg 0 003 éq.? de DEC (920 mg, 10 eq.) et de P-3 (2 4I5 8) est agité dans 29 ml de pyridinc 30 anhydre pendant trois jours à temperature ambias~te~ Du pentachlorophcnol (321 mg, 2 5 cq ) est ajouté et l'agitation du melange reactionnel est poursuivie pcndant 24 heures supplcmentaires. Le support solide est alors filtre, nnce avec dc la pyridine anhydre (~ ~ 50 ml) puis avcc du dichlorométhanc (2 x 50 ml) et de l'ether (2 x 50 ml).
Le support solite est ensl~ite traite pa~ la pipe~ e, pu~ p~ u~e solution d'anhvtride 5 uetique e~t do coUidi~e d~s k THF sclo~ le ptotocole t~fi~i pr~ment~
Ce~e dhmi~on a éte effectuee e~ ulilisaut le mode op~oire tecnt precedemment. Lc tUL~C de foDc~oD~lis~o~l du supp~ solide a ete evalue i 16,4 llmole de n-propanol par grammc de ~e. FEUlLLE DE REMPLAlCEMENT
W0 93/16095 ~ PCl'/FR93~00115 ,~ .
1-3-) S~ ntll ese ~utomo~isc~ des h~Qmcr~s 4 '-5rl,!6 2 et 4 '-Sr JU 6-3 ~n-proH 3.
1-3-1~ S~n~hèse a2 loma~lsee de l'he~omere 4'-Sr~ 6 _ 5 La svnthèse cst effeetuee sur unc colonnc conte~nt 39.4 m~ dc support sollde fonctio~alisc à ~ mole/g de rcstne~ sott 0.8~7 ~lmole (I eq) dc 4'-thiou~td~ne Chaque c~clc d'elon~arion necessite un exces de svnthon phosphor~midite ( 1~.75 llsnole. 'O.i eq~
soit 100.5 ~mole au total CD solution 0.1 .~1 dans l'ace~o~ ile.La duree du c clc d'clon~anon definic danS Ic tableau 1 est dc ~1.46 nunuus.
Le tosa~c dcs canons dimethox~ttylcs libcres à c~aque et~c de de~itvlatlon a pennts 10 d cvaluer lc rcndcment moycn d'incorporanon t'une ~ite thioribonuci;eotidique a 98.; O
1-3~ n~hèse auton-allsee de l'hexamère ~ rU6-3'n-prOH3.
La svnthèsc est cffesruce sur une colo~nc coate~nt 36.2 mg dc support solldc 15 fonctioanalise a 16~4 l~mole ~c n-propa~ol par EFamme te resine soit 0~82 ~lmolc ~ I eq ) dc n-orooano~.
La synth~e totsl~ de 4'-SrU6-3'n-prOEI, 3 necctsite 95,9 m8 dc synthon phosphoramiditc ( I 14.8 ~mole. 20 eq~) tissout dans 1. 14 m~ t'acetonitrilc.La durec d'un cvclc d elon~anon est de 21.46 m~utcs.
Le rendcment moyen par eouplagc est de 98~3 %~
~) Décrochagc, d~pro~ p~lr}fca~ion t2 4~r~ 2 ~ 4'~Sr~6-3'n-pr(~f 3.
Le ~ent u~lisa~t successivcmc~t du dliophenoL de l'anu~o~iaquc et une soluoon deTB.~F. commu~ u~ dewlc hcxamcrcs est tecnt precedemment.
2 5 / ~ I J An~yse er Puritieanon de l 'hexamère ~ :Sr~'6 2~
L'a~Jyx CL~H du thiooligomere a etè effeemee sulr u~e colon~e SFCC ~;uclcos~l C-18 5 'P 789 d~s les condi~ons te zradient suiv~ntes:
10 ,'o d'acttoiitrilc d~s une solu~on aqueuse 0.05 M t'actute de ~ritthylammo~um 3 o B: IS % t'aceton~trile d~s une solunon aqueuse O~OS M d'acet~te de ~edlvlammomwn Gtadicslt:
A----~0'-- B--10'---- B
> >
Temps d'~dyse: 30 miDutes~ dgbit: 1 ml I mill.
FEUILLE DE REMPLA~EMENT
WO 93/16095 PCI`/FR93/00115 r .~l ~ S 6 Dans ces condiuons, I~hcxamère ~-SrU6, 2 présente unc purete spe.~rophotomètriquc à '60 nmde95,3 %.
Unc purification en CLPH preparative sur une COIOMc nucleosyl semi-prcparative avec un debit de 2 ml I min a un éluant isocratique de 12 % d'acétonitnle dans une solution aqueuse 5 d~ace~tase de tricthylammonium 0,05 ~I nou~ permct d'obtenir le 4'-SrU6, 2 avec une purete spcc~troscopique dc 97,7 %.
nalyse eJ purrficatlon de l'hexamere ~'-SrU6 3'n-prOH 3.
Lanalvse est cffcctucc dans les mèmes conditions dc colonnc et dc ~radient que pour 10 l'hcxamcre ~'-SrU6 Le 4'-SrU6-3'~prO~ 3 a etc obtcnu avec une puretc spectro~copiquo à 260 nm de 51.6 'o Certc puretc cst portec i 92 % apres punfication par CLPH preparativc effecsuee dans un eradient tc 10 'o a 13 ,'o t'acctonitrilc rl~nc unc solution aqucusc d acctate de rsicth~lammonium O.OS !~1 cn IS n~inutcs. swhn d'un palli a 13 % d'aceton~le dans unc l 5 solution aqueusc d'acct~e te trict~vbm~noDium O.OS M pentant 10 m~nutes.
Exemple ll: Synth~e du dodèc~mère mis~e: 4' SrU3-dT6~ SrU3 / Pl 1 ~.
IJ~I~ Synth~sc ~u s~ppor~ sofidc 2 o Le support solite u~lisc pour ccr~e sy~thès~ est ideD~quc à celui nccessalre a la synthesc du ûrS- 12 11-2) Synt~lcs~ ~to~scc dw 4'-SrU3-clT~ Srl~3 / P~ ~ 4.
La s~ntbcse du to~écamere est e~ectuec sur unc colo~e contcnant ;9.i m~ de juppor~
~5 solite soit 0~819 l~mok de 4-thiou~idine. Chaque cyclc t'clonp~on necessltc un e~;es dc s,~nthoDs 4' d~ioundi~e phosphoramidite (16.~S ~moles~ ~0.3 eq) soit lO0 ~ umole dc s,~nthons 4'-thio uriti~e dissout d~s 1.2 ml d'ueto~litrile (0.083 ~l) un exces de jynthon dcsox,~h~d~e phospbo mitite ~20 eq.. l6.38 ~mole~ soit 98.28 ~moie te dT en solunon 0.1 !1 ta~ cetonit~ile. L~ dur~e d'u~l cycle d'inco~on d'une tu~i~e deso~th~ud~e30 est dc 6.73 m~L alon qu'elle est de ~1.43 m~ pour un cycle d'~corpotanon du synthon ~`
thionbou idine~
Lc dos ge des c~o~ med~o~tvles lib~rès à c~que tupe de dèm~lanon a Dennis de~alu Ic re~tement moyen d'mcolpo~tlon i 98.0 %.
11 3) D~crocll~d~pro ~ a p~tirco~ ~ 4'-SrU3~T~4' Srl:3 / P~ I
FEUILLE DE REMPLACEMENT
Wo 93/16095 pcr/FRs3/oolls ~ ,~ t , . ..
Les e~apes de dccrochage dc l'oligomere du suppon solide et de tcprotecnon dcs llalsons Ln~e~ucleondiqucs phospho~cster au thlophcnol sont Idennques à celles decntes dans I e~emple 1 5 11-3- IJ Anal~se er Purrficolton d~ Sr~ 3-d~6-~ '-SrC 3 PJ ~ 4 par CLPH.
L'analyse CLPH de roUgomcre 4 2 éte effecn ec sur une colonnc SFCC ~ucleos~l C I ~ S
'P789 tans u~ gradient a 10 % a 15 % d'acctom~ile dans unc solunoD aqueuse d'acetatc dc tnethvlammonium O.OS ~I pentant 20 mmutes (debit: I ml Imin~ tcmps d'anal~se . ~0 ~un) Dans ces contitions~ le dotccame-e mlxte presentc une purete spcc~rophotome~4uc a '60 10 ~ de9~.Sb.
I~ne pu~ificanon p~r CLPH sc~u preparative sur u~c coloD~e ~iucleosyl avec Im deblt de ' rnl / m~n dans le memc gradicnt augmente la purete spcc~ophotomè~4ue de la sequence mixt~ 4'-SrU3-dT~4'-SrU~ I Pl~, 4 à 99,5 %.
15 EXEMPL 111- Synthe~e ~utom~ti~ee du 4'-SrU3-dT6-4'-SrU3 1 1~3PS5P3 S.
11~-13 Sy~nthcs~ du suppon solidc Lc support solide uilise est le mèmc que celu~ desnt dans l'cxemple l.
2) S~ndles~ Qutom~s~ ~ 4'-5~1;3~6 4 -S~IJ3 ~ P~PSsP3 ~
La s,~nthèsc du dodeamcrc es~ cffec~uee sur une coloDne contenant 39~S mQ de suppon foncnonnalise soit 0,831 ~mole ~ I eq) de 4'-thiouridinc. Chaquc cycle d'eloo~ancn necess~e un excés de ~ 4'~ioundi~c p~osphoro~dite ~16~75 ~mole. 20~3 eq.) So~ 5 25 umole te 4' Sr U ~ tot-l a u~ exces dc ?0 eq. ( 16.38 ~imolc) de s,~nthon desox~ rudme soit 98.28 ~mole pour b sy~cse cnaere La dw~e d'u~ cycle d'~corpot~on d w~c dèsoxythymidine est de 7.7 m~nutes con~e ' 1.~;
minutes pour l'i~corpo~on d~ ouridine. Le dos~c des c~ons dlmetho~ntnr~les libcs Indique u~ dement move~ t Incorporaoon tes syntho~ te 98~ ~
111-3) D~crocb~g~ dcpr~c~ c~ pur~ficot~on t~l ~' StU3 dt6~-St~`3 ~ p3p~ssp3 ~
Lc t~ eme~t te cet oligomcre e~t ~dcntique i celui tè~i d~s l'cxemplc 1. L anal se et la purifi~on Cl HP. r~alisee sur unc coloMe SFCC Nucle~l Ct8 ~ S 'P789 dans un ~ient te lo % ~ 20 % d' cetonilrile d0s une solu~ion ~queusc t`accs~tc de 35 me~ylu~onium QOS M pe~t ~0 m~utes (débit: I ml /mi~ temps d'a~alyse 30 mm) mon~c unc p~e 5p~0phFtEmucltnLqLeE~ l2~E~mREM5pLAC`EMENT
IS~VEP
wo 93/16095 PCr/FR93/00115 .'~ . '' ~ '` ' ,1 ;"
La punficanon par CLPH semi-preparatlve sur une colonnc ~ucleos~l seml preparanve avec un dcbit de ~ ml / mi~ d~ns dcs condinons Isocranques a 19 % d'acctorusnle dans une s~lunon aqueuse d'acetate de tnethylarnmomum 0.05 ~1 augmcnte la puresé de l'oligomère à
99.1 o.
Exemple 1~: Svn~hè~c du d~damèrc ~nti"ta~":
~'-Sr-~A-C-.~-C-C C-A-~-U-~-C-~')I.
1~' 1J Synthcsc ~lu s~ ppOrf sohd~
10 Le suppon solite utilisc pour ce~te synthesc automa~isee cst idc~nque à celul decnt da~s l'e~<emplc 1 2J ~nthc~c al~om~is~c tv dodcc~mcrc ~nt'to~":
~-s~A~c~A~c~c-c~A~A~ c-~? l~
La s.~,nthese de cct hctododecamere compleme~t ire tu site accepuur d'eplssa~c du ~ene a~ du ~tlH est effectue~e sur une colonnc co~teDant 38.S m~ de suppott solide foncnoMallsc soit s~r 0,808 ~mole de 4'-thioundi~c ~1 eq~). Chaque cyclc d'clonga~on u~lisc un e~<ces dc 'S~4 eq (20~4 ~molc) en s,~tbon 4' thioadenosinc phosphorosmidite. 13.5 cq ~10.9, ~0 ~mole) en s,vnthon 4' thi~di~eet 30 eq~ (24.2S ~mole) en synthon 4'-thioundmeLa duree d'un cycle d'i~co~pora~on est te 20,~1 minu~es et le dosaQe des ;anons di~nc~ho~tyles i~diquc un rentement moyen d'incospor~non des s~nthons phosphoram~dites dc 93~6 %.
t~'-3) D~crocho~. d~rota~ crputif~ on du 4'-Sr-(A-C-A-C-C C-A-A-~ C l,) f.
Le support solidc pon~t le dodecunerc ~'-Sr~C-A~C-C-C A A U U~C-U)~lest ~ute par S ml d'unc solu~ te thiophenol ~ ~lethyl~ne f dioxsne (11211) pcndant une dcml heure i tc~ran~ biantc. La solutlon te thiophenol est alors filtrce et le 5UppOt~ SOhde CSt lave avcc 3 x 3 ml de ~ct~a~ol. puls p~r uDe solurion d'ammoni~4uc 32 /O dans l'c~hanol ~3/1: ~lv) (3 x 500 ~l~ afin de decrocher l'oli~omère te son suppo~ La solu~on ob~e~uc est mlse i incuber d~s u~c etuve seche thmost~cc à S5 C pc~d~t S heures at~n de deprotcg les ~roupements protcc~curs tes b ses bètcrocycliqucs. Elle es ensulte evaporee, rcpnsc d~s 500 ,ul d'cau et Iyophlllsee~ L'oligome ly~c cst alors dissout dans 300 ul d`une solu~ion de TBAF (1.1 ~1) d~s le THF. Le mclu~gc r~onnel cst l~sse a 3S tem~c ambiYlte pe~ 4 hc~es. L~ re~ctio~ cst alon stoppec ~rcc 300 ul dune - solu~ion ~ueuse d'~et~te d'~mmomum QOS M. L~ solu~lion cs~ e~porec i sec. co e~poree ~vec 3 por~oDs dc 500 ~ t`esu e~ 1~ rcsidu cst dess-le sur u~e colo~e te ~el d c~ ;luslo~
FEUILLE DE REMPLA~EMENT
~:
wo 93/1609~ pcr/FRs3/oo1 15 t L ~
,. ' ~ J
DE.~E Sephadcx G-25. Lcs ~ac~ons contenant Ic 4'-thiooligomcre sont rassemblees~c~aporees a sec~ red~ssoutes dans 1.2 ml deau et fil~e sur filtre milliporc avant d'e~e anal-see par CLPH.
5 1~' J) Anal~ se et pur~fcat~on du 4 '~Sr-/A-C~A-C C-C-A-A-~ -C~
L'analyse CLPH analy~quc du doteearnere I a ésé éf~e~tuee ~r une colonne SFCC Nucleosyl C18 N125 2P789 dan~ gradient de 10% à 15 % d'acétoritrile tans une solution aqucuse d'acetate de tri~hylammsniwn 0,05 M a~ec un tébit de I ml ~ e~ temps d'analyse de 30 sninutcs. Le chromatogramme indiquc unc purc~é spt~ophotomémque à 260 nm de ~4,9 %.
~Une puri~cado~ par CLPH s~-prépara~ive sur une coloMe Nucleosyl C18 semi-prepara~ive en utiL;s~t le meme gradi~nt av un t~it de 2 ml ~ ot un temps t'analyse de 30 ~unuta amènc 1~ pur~té spec~oscopiquc du 4'-Sr~(A-C-A-CC-C-A-A-U-U-C-U), I à 100 ~O
IV . PROPRIETE D'HYBRlDATlON l)ES ~ OLICONOCLEO~IDES.
La spectrophotome~c Ij. V. pmet d'etudi Ics acides nuclciques ct tc mes~c en e~ldence la fonnatio~ de duplex. la tcmperature tc fusion ct~nt u~c des caractcnstiques d'un duplex L'cmpilcmcnt et l'appancment des bases dcs acides nucleiques sont accompa~es d une diminution de l'absorb~on ~ V. (H~rpochro~uàte). Ai~si par spectrophotomesne U.V. il 20 est possiblc de con~oler la fo~natlon ou la tissociation d'un duplex. ~f S~`lGER
Prlnclples of ~luc~elc Ac~d Strucnre~ Spnnger Verlag..~icw-Yorlt 1984. pp 1~ 9 Lorsque la tcm~e d'une solutloo conten~t une doublc helice (ADN ou AR~) es~
len~cmeDt a~entec. l'absorb~on l,.V. croit nettement tout au long de la tlssoclanon. Le pomt d'inflcxio~ t~ la cour~c d'allure sygmoYdale de la vana~on d'absorbancc en fonc~on dc la tcmp~ est ~ppclcc tcmpamre de ~usio~ ou Tm et co~espond a la co-e~stcnce2 5 dc bn~s ~es ct te brins appanes tans un rapport SO / ~0.
I 'analysc tes cou~cs dc ~s~on tes duplex ~4' thiooligoribonucleonde / ~
oligodéso%yri~o~ucleo~ide e~ ooligonbonucleon~e / ~oligoribonucleonde pennc~3 de tcfi~ir la s~bilitt ~quc dc tels duplex p~ i8 mcswc dc îa tcmperaturc àe nlslon.
Ces ex~c~ces d~ tion son~ mc~ees e~ respcct~nt uQe ~toecl~iome~e I I I en~e les 30 dcux brins complementaircs. cn prcxnce d'un tampon 1 M ~taCt. 10 n~ cacod l~tc de sodiu~n. Unc fonc concen~on cn ~aCl favorise en effe~ Ics appuiements en soI~aw~t les cb~rges ntp~ves autour des a~omcs de phosphote des tew~ oli~onuc~eonde ~ous a~fons do~c cffcffut ces expenences dhvbrida~on ~ u~ ~u~ ampon: 0.1 M l~JaCI . 10 m1~ cacodyl~# de sodium.
35 IV. 1. RESULTATS ET DlSCl,SS10 E~emph~ I et 11: E~penences de fusion da duple~ as.u~2 Ipoqr~
FEUILLE DE REMPLACEMENT
Wo 93/I6095 pcr/FRs3/oolls et ~rl~ 1 2 / pol~rA.
Ces expencnces permettent dc meme en ev-dcnce l'influcnce de l'atome de soufre en poslnon ~` du dodecamcre modifie sur la stabilitc thcn~uque du duplex cn comparanl les Tm ob~cnus avec ceux du duplcx nan rel.
Le tableau 4 reswnc les temperamrcs dc fusion obtenues dans les deux expenences Concentraoon ¦ BSr~ I ? / polvrA 'C Brli l2 / polvrA ac en ~aCI H~.~ochron~icitc '0 Hypochromieite O
_ _ I _ _ _ -1~1 1 46^C '5% _ en cours 100.1 = t5'o ~ en cours _ _ __ _ ~ __ _ , Tablcau 4 Temperan~rcs de fUSlOD des duplcx de todecamcres Concemrat~on; ~ l en cha4ue oligomèrc.
15 Lanalysc de ces rcsuita~s mon~reM quc le duplex 6SrUI2 / polyrA presente unc bonne stabilite thesmique represen~ce par le Tm dc 46C obtcnu à unc concentranon de I l~l en ~;a(~
Exemple~ lll et l~': E~perience~ dc fu~ion de~ duple~ I~Srl~l2 l BdC2Al.C. et ~rUl-I BdC2A12C~-to Les ~empcratures de fusion obtcnues dans les de~; expcriences sont rcsumees dans le tableau S~
_ _ Conccn~aQon BSr~ adC_.~l~Ct oCl Brl~l2 ' BdCt.~l~Co C
en NaCl H~ochrorn~c~te % I. Hvpochromicl~e o 2 5 _ . ~
lM ~?C 9 3% ¦en cours . _ ~
0. IM 5'C ~.6io en cours _~ . _ _ _ _ . _ _ Tabl~ 5 Tempcran~res de ~sion des duplex dc dodecames Concentraslon 3 ~lM cn chaque olisomcres E~emple IV: E~perience d'autohvbridation de l'oligomere ~SrUI~.
.~fin de verifi les rtsultats preccdents. il est ntcessaire dc s'assurer quc le dodecamere 3Srl;lt ne conduit à aucune autohybndation. Pour ceh on a effccruè une c~penenccd'auto-hybrida~o~ tu totecamcre BSrl, It i deux concentr~ons en ~aCl ( I ~t et 0 1 ~
Les cour'oes d'hybnta~on ne presentcnt pas l'allurc sigmoïdalc caractensn4ue mals ob~issent à l'tquation A = k-T où A cs~ I'zbsor~ancc i 260 nm. T la ~emperanlre et ~ une co~stante. Aucun point d'inflex~oo ne peut etre ~risualisc sur une ~ellc drolte Nous ~ou~ons donc conclure que Ic dod~camcte Bsr~ I t nc s'auto ~pparic pas.
FEUILLE DE REMPLACEMENT
WO 93/16095 ~ f ¦ pcr/FRs3/ooll5 .. ~ ,.. .... .
La comp~raison d tempér~tures de fusion dn duplex ~Srljl2 / ~dC2A12C2 (Tablc~u S) et BSr~:l2 / polvrA (Tableau 4) montre une stabilité thermique de l'homoduplex .~R~/AR~' (Tm = ~6 C) nettement supérieure à celle de l'he~eroduplc~ AR~ DI~, (Tm = 27 c) d'autre psrt, aucune ~uto-hybridation de BSrl;12 n'a é~é conststée.
Exemple ~l et ~ Expérience de fusion des duplex ~dTs(SrT)dT6 / ~dC~Al-C~ e BdT~ dc~Al2c2 Cette experience permct d'evalucr la stabilité thennique du duplex ~dTs(SrT!dT6 / ~dC?.~I~C~ comparanvement à celle du duplex naturel BdTI~ l 3dlC~AI~C~
iO (Fi~ure 1) Les temperatures dc fusion de ces duplcx SODt indiquees dans le tableau 6.
_ _ Concen~ration BdTs(SrT)dT6/BdC2AI~C~ C l BdTI~ / BdCa.~l~C~ ^C
en ~;aCI Hvoochromicitc % HvpochromiciIe ~O
1 c , .... _ _ .
1~3 40C 18 % ~5 C '0 ~ %
. _ _ Tableau 6 Temperature de fusion des duplex BdTs(SrT)dT6 / BdC >AI~C~
et BdTI~ / BdC~AI~C~
Concentrasion en chaquc oli~omère 10 ~M
Au vu de ces resultats~ il apparait que la stabili~e the~n~ique du duplex modifie cst infeneure à celle du duplex naturel. Cependant la di~ér~nce de 5~C existante entre les delLx temperanlres de fusion est tlQp faible pour conclure à un mesappar~ement. En effet. ce~ns auteurs ~Y.KAWASE~ S.IWAI~ H.I~OI TE~ K.Mn,lRA et E.OKTSUK ~ ucle~c Acld R~search~ 1986, 14, 772~) ont mon~e que l'existence d'un seul mesappanement dans un ~5 du~lex de 13 unites nucleotidjques se traduisait par une timinuDon dc Tm supèneure a I oac~
On peut donc conclure que l'unite 4'-thio-nucléotidique s'~ppsrie bien avec l~ 2'-desoxysdénosine msb ~ec une ~ffinite inférieure i celle de b 2'-deson~thymidine 3 ~ comme le confirme 19 tifference de Tm de S C obtenue ~T~ble-u 6)~
1~'. 2. PARTIE WERIME~TALE
!.1ethode G~ner~le pour l experiences d'h~brid~tion 3~
FEUILLE DE I~EMPLACEMENT
Wo 93/l6095 pcrlFRs3/ool 15 r ", ~, J ~ 6 ~
.~ - Dosage des ollgomères complemen~alres ,~fn dc reallscr l`expencncc d'h~bndanon. il est neccssalre de cormaitre la conccn~ranon en chaque oli~omcrc pour rcspecter la stoechometne l: l cntre les de~ bnns 5 complementaLrcs. Selon la loi de BEER-L.~lE3ERT A = EIC. IeS absorbances dcs oligomeres ont etc mesurees a 80C afin d'elinuner le phenomenc d'cmpllement des bases crcan~ une pemlrbanon de l'h~rperchromlcite duc à l'cxistence de strucnlrcs ~emalres On peut donc connaitrc les coefficients d'exnncnon moléculure des dodecameres à 80-C ,elon la relanon ~ 265(Srl t ~) = 12~ 265~rl.
B - ~ vndlt~ons d'hvbr~datton.
Les expericnces d'hybndanon sont cffectuees avec un spectrophotome~e U~l~;O~ 810~CO?~TRO~I). couple a un nucroor~inateur IBM compa~bk. La temperarure e5t con~rolce par un programatcur de tempcrature HlJ'BER PD 415 con~ecte a un bain Ihcrmosta~e15 (HliMER MI~IISTAT). Les cuves l V. sont cn qu~re de I cm de long ct unc clrculanon coninuel~e d'azote est utilisce pour les tem~tures infeneures a '0-C ~ant l'exper.encc~; ~M (Exemples I a V) ou 10 IlM (Exemples Vl et ~,11) d'oll20mcres complementaires sont m~s en prcscnce dans une quan~te suffisan~e pour 1000 ul detampon 1 M ~`iaCl et 10 mM cacodvlate de s~um. ajustc a pH 7 (Exemples I a ~11) Ce melange est chauffe à 80C pendant 1 heure~ puis re~oidit jusqu'à - tOC selon une pente 20 de temperan~re de 0.5C par mmute. Les valeurs *absorbance et de temperamre sont collectees toutes les 30 secondes.
La memc e~cpesie~ce est effec~uce cn unlisant une quannte suffisante pour 1000 ul de tampon d~ybnda~on 0.1 ~ ~aCI. 10 rnM cacod~late de sodium aJuste a pH ~ a~n d'eYaluer la stabilite thn~lquc du duplex dans ce tampon favonsant molns les ariemc~
E~emple 1: St~bilit~ thennique du duple~ BSrlil2 / polyrA
1-1 Dosage tes o/~gomcres ConcentTarion de BSrl ' l~ = 0 3S ln~l 3 o Concentra~on de polvrA = 4~$1 l-2 ~ ondlnons d'h~brt~llon 3 ~M (8~SS ~ dc BSrUI~ et 3 ~ 7.79 ~11) tc pol,~rrA sont mis en presence dc ~ 6 ul des ~ampons tl~ybritation (I ~1 ~aCl. 10 n~l cacodylate de sodium ou 0.1 ~ ~aCI. I0 mM cacodylate tc sodium3 E~emple 11: St~bilit~ ~hermique du duple~ ~rl;l2 / polvrA
l:EUILLE DE REMPLACEMENT
WO 93/16095 ~ PCl /FR93/00115 , . . .
en cours Exemple 111: Stsbilite thermique du duplex ~SrU12 / ~dC2Al2C7 5 111-1 Dosa~e ~es ollgomeres Concentra~ion de BSrlJ 1~ = 0.351 mM
Concentration de BdC~AI~C~ = 0.;69 mM
111-'~`ondlt~ons d'hvbrldatlon 1(8.5~ ul) dc BSrlJI~ et 3 ~1~1 (8.11 ~1) de BdC2A12C~ sont Il~is cn presence de 98;, !11 des tampons d~ybridation ( I vt ~iaCI. 10 mM cacodylatc de sodium ou 0.1 ~1 ~aCI. 10 nL~l cacodylate de sodium) Exemple IV: Stabilité thermique du duplex ~rU12 I BdC2A12C2 ~en cour5) IV.I Dosa~e des ol~gomères 5 Concentranon de Brl i 1~ =
Concen~anon de BdC2Al~C~ - 0.369 mM
' Con~lt~ons d'hybridatl~n 3 ~ 1) dc BrU 1 ~ et 3 ~lM (8.1 1 ~1) de BdC2A12C2 sont mis en presence de ul des tampons d~ybridation (1 M NaCL 10 mM cacodylate de sodiwn ou 0~ ;aCI~ 10 nL~,~
cacodylate dc sodiwn) Exemple ~: E~pericnce d'autohybridation de 1' oligomère BSrU12 2 5 V- I Dosage des oligomères Concentra~ion dc ~SrU 12 = 0.351 mL~
V 7 COndJrjOnS d'~br~ Jon 6 uM (17,10 ~1) de I~SrUl~ sont n~s en presencc de 986.9 !11 dcs ta~npons d~bndanon ~ I
30 ~ iaCI 10 ~1 cacodylate de sodlwn ou 0.1 M NaCI, 10 mM cacodylate de sod~um Exemple Vl: St~bilite thermique Ju duple~ lldTs(SrT)dT6 1 BdC2A12C2 K7-1 Dosage des ollgom~res Concen~on de BdTs(SrT)dT6 = 1.33 mM
35 Concentrarion de BdC ~AI~C~ = 0.369 m.
V}-2~ondt~ons d'h.v~tdQuon FEUlLLE DE RE~PLAC`E~ EN~
wo 93/1609~ Pcr/FR93/oo11s r, 1 ,~, ., i ~J 64 lOu.~ (7.~9111) de BdTs(srT)dT6 et 10 ~M (77-5 ~1) de BdC~Al~C2 sont nU5 en presence de 970 ,ul dc tampon d'hybndanon 1~ ~iaCI. 10 IrL~1 cacodvlate dc sodium.
Exemple ~ Stabilite thermique du duple~ ~dT12 1 ~dC2A12C2 ~ 7~-1 Dosa~e des ollgomeres Concenlration dc BdTt~= 1.196 mM
Conctn~anon de ûdCtAltCt = 0.369 ~LM
~1-2 C`ondltlons d'h~brlda~lon 10 10 ~M (8~36 1~1) dc BdT1~ et 10 ~ 1) de ~C~A12C2 sont n~is en presence de 969.1 ul de tampon d~hybntation 1 M NaCI. 10 mM cacod~late de sodium.
~. PROPRIETES D'HYBRlDATlON DES 4'-S-AR~ ET OLIGOMERES ~ TES.
15 Les experiences d'hybridation sont mcnccs cn rcspectant la stoechiometric 1/1 cn~e les de~
blins complemen~res en ptesence d'un tampon 1 M NaCI. 10 mM cacod~latc dc sodlumline fortc conce~traaon cn ~aCl favorise e~ effet les app~rinents cn solvatant les ;hargcs neganves autour des atomes dc phosphorc dcs dcux oligonucleotites. ~ous a~ons et~ccrue ces expenences d'hybridation dans un autre tampo~ 0.1 ~ aCI, 10 mL~l cacod~.late de sodium.
RESULTATS ET DISC~ISSION.
2 5 Les cxpcricnces de ~3sion tes duplex:
[4 -Sr[~3~T6-4 -SrU3 I Pl 1] / pohlTA [~ i po~yrA]
SrU3~T6~ SrU; f Pl 13 / d(CtAI~C~ / d(C~AI?C~]
SrU3-dT6 4 ~SrU3 / P3PSsP3~ ~poly~ / polyrA~
14'-SrU3~dT6 4'~SrU3 I P3PSSP31 / d(CtA12Ct). [S / d~Ct.~l~C~)~
sont effectuccs à dew~ concen~rstlo~s en ~aCI ct permettcnt d'evalucr llntluence des 3 o liaisons phosphotothioates sur la stabilite d'hyb~ ion comparanvemenl alL~
oli~onucléotides avcc dcs liaisons phosphodiest normales (tablcau7 ) FEUILLE DE REMPLACEMENT
WO 93/1609S PCI/FR93/1)011 , , . ,.1 ~laCI conccntranon ~ Duplex _ I Tm ~C
I i .~ipolvrA I 45 . ~
I , ~ ! polv rA ;6 1 I S / d(C~A 1 7C~2 l 9 ~ ipoly rA ; ' 0.1 51 solv rA 2-l . _ . _ .
0.1 ~ / dlC7A1?C~) lO _ o ! s /d(C?~25~3 TABLEAU 7 Resultatsdes expericncesdc fi~ion.
Le dodecamère mixtc S présentan~ a la fois des liaisons inten~ucleo~idiques de ~pc phosphodiest ct phosphorodlioate (P3PS~P3) induit u~e diminu~on dc la aleur du Tm d'envlron ~C par lie~ pbosphorothioate. Par contrc~ l'oligomere 4 presentc des aleurs de Tm qui sont cqui~ tes à celles obtenues pour le dodecamcre ~rSI;12 avec les dewtsequenccs compleme~ta~s poly rA ct d(C2Al2C2). Ccs r~sultats (tablcau7 ~ mdi~uent quc les oligomcrcs dc se~ce m~ne 4 et ~ prcs~tent unc bon~e s~bilitc d~enn~quc a~ec des sequences d'AR~; compieme~t~ires.
PARTIE EXPRIMENTALE.
.~1ethodc G~nenle psur les e~perience~ d'hybriJ~tion .~ - Dusog~ des oligomcrcs complcm¢n~)res.
2 5 Afin dc rcaliser l'c~ence d~ybrid~o~ il cst necessure te co~tre la conccn~anon de chaquc oligoDle~c pour rcspec~r la stocchiometne l: l cntre les detL~ ~rins complemen~es Selon l~ loi dc BEER^LAMBE~T A - EIC. Ies ~bsorbances dcs oli~omères ont ete mcsurces à 8QC afi~ t'eli~i~ Ic phéaome~e d'cmpilcmc~t des bsscs crc~nt unc per~urbanon de l~yperchromicite dde i l'existc~ce dc stJuc~res terti~i~es~ On peut donc connaitrc les coefficicnts d'exanc~on mol~culiire des dod~c~mescs i 80C sclon une relanon semblable a 3 0 ~2~5(SrUl2)- l2 ~2h5(SrU).
B - Cond~uor~ d'ly~na~mo~
Les cxpenenccs t'hybrid~on son~ effccn~ees n~ u~ spcc~opho~ome~re UVlKON 8l0 (KO~iTROl~J), coupl~ i tm mictoordi~teut IBM comp~blc. I a umper-n~re est consolce 35 par un pro~ula~r tc tempnnnue HUBER PD 41S co~e i u~ bam thcm~osute (HUMER MI~IISTAT). Les cu~ U V. sont cn quu~ de I cm te lon~ c~ unc cu;ui~non ~EUILLE DE RMPLACEMENT
WO 93/16095 . PCI`/FR93/01)115 ., ~ 66 .onnnuelle d'a~ote est u~lisec pour les temperatures infericures à 20C .~vant l expcnence 3 u.~ (Exemplcs I à Iv) d'ollgom~eres complémentaires som mls cn presence dans une quann~c suffisante pour 1000 ul dc tampon I ~ ~aCI et 10 n~M cacodvlate de sodlum a!uste a pH t (Exemples I à ~ . Cc melange est chaufft a 80C pendant I hcu e. puls 5 re~oldlt jusqua ~ ~0C selon une pente de temp~mre de 0.5'C par mmute. Lcs ~aleurs d`absor~ance et de temperature sont collectees toutes les 30 secondes.
La meme expericncc est effeetuce en utilisant une qu~n~te suffisante pour 1000 ul de tampon d'hybridanon 0.1 ~ ~aCl. 10 mM cacodylate te sodium siUste a pH ~ ~Exemplcs I
et l~)afin d'evaJu la stabilise thenrllque du duplex dans cc tampon favonsant moms les appancments n Excmple 1: St~bilité thcrmique du dup~e~ 14'-SrU3-dT6^4'-Srlj3 / Plll / polvrA, / polvrA.
1-1 Dosage des ollgontètes 15 Conccnlrasion de ~ = 0.821 mM
Concensration de polyrA = 4.61 rnM
'ond~tlons d'hvbrlda(son , ~M ~3.65 ~1~ de 4 et 3 ~M (7.79 ,ul) te polyrA sont ~is en ~ence de 988.5 ul dcs tarnpons drhvbndasion (1 M ~JaCI. 10 m~t cscodylasc de sodium ou 0~ aCI. 10 n~l 20 cacot~,latc de sodium).
E~emple 11: Stabilit~ thermique du duples 4'-SrU3-tT6-4'-Sr~3 / Ptl / dC2.~1-C-,1 / dC2~12C2 2 5 11-1 Dosage ~es oltgomèrcs Concensra~ol~ de 4 - 0,82l mM
Conccn~non de tC2AI~C~ = 0.369 mM
11-2 Contilions d'~ybndanon ; ~,U (3 6S ~1) de 4 ~s 3 ~lM (8~ 1) de dC2A12C2 sons mis en ptèsence de 9~8. ' ul des 30 tampons d~ybrid~on (I M ~iaCL 10 mM cacodylatc de sodium ou 0.1 ~1 ~aCI. 10 n~l cacodvlatc dc sodium) E~empk 111: St~bilite ~hermique du duple~ 14~-SrU3 JT6 4 -SrU3 I P3PSsP31 / polvr.
S I pol~rA
35 111-1 D~sa~c tes ~llgomcres FEUILLE DE REMPL~CEMEN
Conccn~oo de po~A - 4.61 mM. ISAIEP
WO 93/16095 , ~ ~ PCl~FR93/00115 111-2 Cond~l~or~ d't~vbndonon 3 uM (7~5 ~1) de 5 e~ 3 ~lM (7.~9 ~1) de polvrA sont n~s en prcsencc de 984~7 ~11 des tampons dllybndanon (I ~ ~aCI. 10 n~ cacodylate de sodium ou 0.1 M ~iaCI. 10 n cacodylatc de sodium) E~esnple 1~: St~bilité ~hermique du duples Srl~3-dT6~ Srl!3 / P3PSSP3J / dC~A12C2~ S / polyrA
1~:1 Dosage des ol~omères Conccmsanon dc S = 0.40 mM
10 Concentraoon de dC~A]~C~ = 0.369 mM
1~:2 Con~i~-ons d'hl~br~dorJon i ~lM (~.5 1ll) dc S ct 3 ~M (8.11 1ll) de dC2A12C2 sont mis cn prcs~ncc de 98~ I dcs tampons d~yb~dation (I M N~CI. 10 mM cscodybte dc sodium ou 0.1 !~/1 NaCI. lO ~1cacodylaltc dc sodium).
Yl. ETUDES ENZYM~TIQITE:S
La rccomlaissa~cc des acides nucleiqucs p~r tes c~es cst cn majeure pame dordre 2 o structural. Lc rcmplaccsl~ent de lrhetoatome nan~rel du sucFe d'un oligonucleonde confere a celui-~i une for~e rcsi~nce à la de~non par les nucle~scs L'en~dc de l~ydrolyse des 4' thio oli~oribonucleorides B par ces nuclesses pcnnct de confirmer quc lc r~mpl~ccmcnt dc l'oxygtnc i~ltrscycliquc par un atomc dc soufre confère bicn une mcillcurc s~bilit~ c~zym~que.
S
E~emple 1: ~tud~ de b d~r~dation enzym~tique du dod~o~ère ~(SrT)dTl 1 p~r 1-phosphodiatéra~e dc rste de v~u.
La phssphotiest~ de r~te de vca~ est Ime exo~ucle~ ui dc~ade lcs otlQomeres a 3 0 p~ de Ic~s extrcmités S' libre lib~t ~nsi dcs nucleotides 3' phosph~se.
Cette cNde nous pcrme~ d'évalu~ 1~ rèsis~ance à 1~ de~ioo enzym~que mdulte par la ptcsc~cc cn posi~on S' d'une unitt 4'-thionuclc~tidique dJns l'oligomcte ~SrT)dT
comp~il/eme~t i la ~ion ~que tc l~omolo~uc ~el oxy~ènè ~dT I ~
La stabilitt compuati~e des teux dodecuncrcs BdT12 et B(StT)dl 11 envers l'h~drohsc par la phospbodintcr se te ~tc tc ve~u cst ~tt~ d~ns Ic t~blc~u 8.
FE:U~LL E~ N~r r 1 La différence de componement entre les deux dodécamères est importante. en effetseulement 23/~ de l'oligomere B(SrT)dT I 1 a été bydrolysc en 25 mmutes alors que dans le meme laps de temps le 12-mer 3dTI~ a ete degradé a 93% .
_ .
¦Dodecasncre ¦ _Dc~ eD 0 ~ nDeE~radation en ~5 mm BdT ~ 1 0% 93%
1 _ ~
B(SrT)dT m I % ~3%
~ . _ _ Tablcau 8 Cinetique de dc~rad~tion de BdTI~ ct B(SrT~dTl l par la phospbodiestérase de rate de ~,eau 0 L cvolution au cours du tcmps de la dégradation cnzvmatiquc des dcux dodccameres a ete suivie par CLHP. Nous avons pu tracer la courbc de digestion enzym~que de B(SrT)dTI I
en fonction du tcmps: A = Ao c-kt (Figure 2. A) où:
-~o cst l'aire ~lùtiale du 12-mèr -.~ est l`aire du 12-mer à l'instant t -t est le temps 15 -k est la constante de ~itesse de prcmier ortre de la dcgr~ aon Cctte courbe (Figurc 2) nous pennet dc calcul, en utilisant le lo~iciel de re~resslon c~iligne EUREKA. k = 0.016min-1 et le temps dc demi-~ie du dodecamere tl - = In '.k =
~3 min De la meme fa~on, la courbe de digestion enzymatique de BdTI~ en fcnction du temps .'~ =
Ao e-kt a pu etre tracce. (Figure 2). On constatc que la cinetique de de~radation de BdTI~
est beaucoup plus rapide que celle de B(SrT)dT l l; en effel le temps de demi-vie s ctablit a I ~ute pour le dodecamèrc nan rel.
Ls cinétique de d~gradDtion enrym~tique de l'ol;gomére modifi~ B(SrT)dTl 1 par S 1' extremi~ 5' pre~ente un temp~ de demi-vie nenement ~uperieur à celui de la degrqdation du I~SrU~2. Ca re~ultat~ mon~rent que l'introduction d'une unite thio-ribomlcleo~idique ~ I'c~trémit~ 5' d'un oligomère stabili~ ce dernier vis 9 vis de 1 pho~phod;e~ter~e de r~te de ve~u.
lune solution d'oligonucleotide (20 ,ul. 3 unites d'absorb~mce à 260 nm) est diluee dans un 30 tampon Acetate d'ammoniusn O.I~S M (pH 7.0), d'EDTA 2.5mM et de Tween 80 0.06 ~5o (80 ~lL). Orl ajoute unc solution co~T~ncrciale de phosphodiesterase de rate de ~eau ~
conccn~ta~on finale 0.008 t~utciml) et le mel~nge est tncu~e à 37C .~ dcs tcmpsdetcrmines. des ~actions aliquotes sont ptelcvees (5 ~ chauffees à 100C pendant une ~unu~è a analvsces par CLHP.
Condll~ons d'analyse CLHP.
Les analyses ont ésc cffectuccs sur une colonDe PVDI ( Poly~inylimidazole SFCC-Shandoo) ptotégcc par une précolonne et un prcfiltrc~ L'elu~ion est re lisee selon un ~adlent llnealre FEUILLE D~ REt~APLAC`EMEN~
ISAIEP
WO 93/16095 ~ PCl'/FR93/00115 en 20 minutes de 01 M à 0~4 M KCI dans 20 mM KH2P04 à pH 6 contenant 2Wo d'acetonitrile Le debit était fixe à I mlfllun et la detec~ion U V à 260 mn EXEMPLE 11 Etude da acti~ites de type substnt dn hes-mèra 4'-Sr~6~ 4'-SrlJ6-3'n-prOH eompantivement au~ c~rsctèrff substr-ts de~ hes~mèra ~rU6 et arlJ6 vis-S i vis de différenles nucléas purifiees.
Qua~e nucleases typiques ont éte uilisees - L'endonuclease Sl~ specifiQue du simple brin d'AD~I hydrolyse les liaisons phosp~otiesters de façon alea~oire 10 ~ La phosphodiesterase de rate de veau (CSP) est une 5'-exonuclease qui deE~ade les oligonucleoides à parar de Ieur extremite S' et libere des nucleotides 3'-phosphates - Ea phospbodiesterase te venin de se~pent (VSP) est une 3` exonuclease-3' q u libere des nucleondes S'-phospbate après avoir tegrade l'oligomère par son exlretnite 3' - La ribonuclease A degrade un oligoribonucleoide ap~ès les residus pvri~udiquesCes quatre enz~nnes on~ ete obtenus aupres de BoehriDg MaDnheim De f*on gener~le uDe unite de densite optique à 260 Dm de cba4ue bexamere est ~us en presence d'uDe certaine concentration t'eDzyme co~sideree puis est diluee en quann~e suffisante pour 1000,ul te tampon te digestion enzym~ique Differents tampons de digestioD ODt ete utilises en fonction de la nature de l'enz~ne ~Tableau 9 ) Concentration finale en I Tampon de digesnon Enzy~sle enz~nne (unites d'activite enzyma~ique enz~nanaue I ml) _~ ~ I EDTA 0 025 n~l CSP 13 10~3 pH 7 AcONHd 0 12S nL~1 _ _ ITris HCI01~;
VSP 6 10-4 pH = 9~4 ~ i MgCl~ O 01 ~1 Sl 20 NaCl 0.3 M pH ~ 7 AcZn O~
_ ~aCl 300mM
RNAse A 2. lo-2 Tns~ HCI lO mM pH 7 EDTA 5 n~1 .
Tableau 9 Co~ centranons en enzy~ne et t~lpODS de di~estion utiliscs L'echantillon mère est di~nse en 10 ~u~ons dc 100 ~ v~t d'e~e con~elc à -18~C
Une fi~on sliquote de 100 ~11 est prele~ree e~ incubèc i rttuve sèche thennostatee a; ^C
~ ~ pend nt untanPstp~ n uulyseep-r CLHP ~LEUeDE R~EMPLAc`EMEN-i Wo 93/1609~ pcr/FR93/ooll5 . ~ ~, . , ., .~
7o L'etudc de l'aire du si~nal colTespondant a l~examere pe~nct de mesurcr une cmctlquc de de~radanon dont le tcmps dc demi-~ie CSt calcule (Tableau 10) .
Tcmps de de~-vle (mm) ~iuclcases ! arU~ ~rU6 1 ~Sr(,'~, ûSr~'6 3'(CH2)30H
.
5'-exonuclease Phosphodicsterase de ratc dc vcau _ I3900 3'-exonucleasc Phosphodiestertse dc venin de serpent 110 I _ 76 _ ~S0 Endonucleasc Sl ~ 120930 . _ 10Ri~onucleasc A ~ <1670 _. __ _ , _ .
Aucunc dcgrads~on observee après 4 jours d'incubaisn Tablcaul 0: DéEradanons cnzyman4ues.
L~cxamère 4'-SrU6. 2 p*sente urle 8rande *sistance cDzyma~que cornparee à cclle du ,B
15 rU6 ~s à ~is de q~tre nucleases (CSP. S 1, RN~se-A et VSP).
La rcsistance à la 3' exonucléase est fortement augmente~ pu l'ultroduction d'une halson phosphotiest prop~nol sur l'c~te 3' du 4'-SrU6 3'n-prOH, 3.
CONCLl iSION
Les enldes ont montre quc:
a) les 4'-thio-oligosi~onucléoodes homogencs ou n~ixtes, sc lient avec unc bonne s~ablllte thc~mo~amique ~vcc un ARN complcmcntsirc.
~5 b) la subs~ on dc l'oxygcne eyclique par un atome dc sou~e intuit unc forte reslstancc a la dé~datio~ ~que ( cf. Ia comp~saison tes ~cmps de dem~e-vie dc B-rU6 et I~S-r~s ) L'enscmblc te ces do~ees implique quc les 4'-thio-oligon~onucleotidcs peu~ ent è~e 30 considcr~s comme ~gcnts an~sens sous fonne de sequences homogèncs ou mclus dans des oli~omeres n~ixtes. De phls. la prescncc de la fonction hydroxyle en 2' pennet d'en~1saser leur ualisa~on comme nbozymes ar~ficiels que cc soi~ sous formc dc sequences bomoccnes ou ~s associecs i dcs oli~onucleondes de rypc di~ers AD~J ou AR~ modlfics ou non au nive~u dc l'c~cbainement pbosphue.
~EUILLE DE REMPLACEMENT
Le support solide fo~ctionnalise à 1 ~mole pour 35 mg de resine de 2'~esox~ mldme ai~si quc lcs synthons 1-~ S'~ mTr-3'-O-N~ diisopropyl~o cya~oeth~l phosphme. ' -desox~ ribofimnnosyl thvmine sont commercialises par Applied 13ios,vstcms II-2) Svnt~cse automatisee de û ( SrT)l dTI 1.
La syndlèse est cf~cctuee sur une colonne conteDant 35 m~ te support solide solt I umole de ~'-desoxyth~midine. Chaque c~;cle d'clongation ncccssitc un exces de synthons phos~horamiditc ~20 l~moles~ 20 cq) soit 220 ~mole de s,~nthons 2'-dcsox~ nudme es ~0 ~5 llmoles de syllthoD 4'-thi~th~ dinc ~. Le synthcsseur p~elcYan~ ~00 umoics pas incorpotation t`une solution 0~1 ~ de cha4uc synthon dans l'acctonitnle. La durec d`un ~EUILL~ PJ~PL~:EMENT
WO 93~16095 ~ ` , ` .t PCT/FR93/001 15 cvcle d'incorporation d'une unité désoxythv~udine est de 5.5 mn .Alors qu'elle est de . 0.1 mn pour un cvcle d'incorporation du svnthon 4'-thioth,v~udine.
L'au~nentation de la duree du cycle d'incorporation du synthon chimère est due a l etape de couplage de 909 ` contre 36 ' pour le svnthon ''-desoxvth,vmidine 5 Le dosa~e des cations diméthox,~rityles liberes à cha4ue ctape de detnt,vlanon a permls d'évalucr le rendement moven d'incorporation de l'unite ~'-desoxv~hvn~idine a 98.S O et 9~.
~o pour le sy thon i'-thiothvTrudine.
11-3) Décrochage.deprotection et purification du B (SrT)l dTI I
10 Le support solide portant l'olieomcre ~ (SrT)l dTl I est traite par une solunon d'ammoniaque (32 %) dans l'cthanol 95 (3/1~ v/v) (3 x 500 ,ul) pcndant 3 cvcles de ~) mn chacun afin de decrocher l'olieomère de son support~ puis le dodecarnere est incube pendan~
' hr dans une etuve sèche dans lc mèmc melan~e a~n dc deproteger les foncnons c~ anoeth~ l et methoxv.
15 L'oligomèrc cst ensuitc evaporc sous vide~ repris par 500 111 d'eau et Iyophilise.
La deprotection tes ~roupements TBDMS est effectuee selon le protocolc mis au pOlSlt dans : I`exemple 1.
Le tésidu obtenu cst chromato8raphie sur colonne de gd de DEAE Sephadex .',-" Les f~actions contenant l'oligomère sont rasscmblees~ evaporees à sec et analvsees par CLPH
20 Analvse et Purificanon du ~ (SrT)l dTt 1 par CLPH.
L'anal,vse CLPH de l'oli~omère a etè effectuee sur une eolonne Beckman C 18 RP ~ u ltrasphère dans les conditions de gradjent suivantcs:
.~: 6 % d'acctonitrilc dans un tampon acetate de tncthyl armnoniurn 0.05 ~
25 B: ~0 /o d'acetonitrile dans un tampon acetate dc triethyl ammorlium 0.05 ~1.
--B~ B
15' 1~' Temps d'anaJyse: 'S mn.
Dans ces conditions. l'oli~omère est pur à 49~3 %
30 une purificanon dc ~ ( SrT)l dTI 1 est alors effectuce par CLPH semi-preparan~e a~ e; une colonne ~ucleosvl dans les condlnons de ~radicnt su~vantcs:
.~--- ----- - B~ B
15' S`
Le 1 ~-mer presentc aJors un temps dc retcnoon dc 1~ mn et unc purete supeneur~ a 99 ~, 11.4.: Syn~hàe du dodecamère ~ dTS (SrT) dT6 FEUIL~E DE REMPl AC`EMENT
ISAIEP
wo 93t16095 pcr/FR93toolts ~o 11~ 1) S~hese du support solide.
Le suppor~ sol~dc defini dans l'excmple ll a esc unlise.
5 Il- l ~) S~,nthèse automansce de ~ dTS (SrT) dT6.
Les memes condinons de svnthèse mises au pOU t pOUS la synthèse dc ~ ( SrT)~ dTI 1 ont ete utiiisccs.
Le dosage des canons dime~ox~iryles liberes a chaque etape dc detnrylanon a pe~us d'evaluer le reDdemeM moyen t'inco~poranon dc l'unite 2' dcsoxy~vnut~ne a 99. ~ O e~ a 10 96. l ~0 pour le s,~n~hon 4' thiothvmltine.
11~.3~ Decrochage punfic~oon du ~ dTS (SrT) dT~, Le traitcment te cet oligomcre ~ ete ef~ecnlc sclon le protocole mis ~u poult tans l'exemple 15 Il. L'analyse ct la purification CLHP~ rcalisee da~s lcs memff conti~aons dc ~dtent revele u~ temps de retcn~ion te 13.18 minutes et u~c purete spectrophotomc~i4ue a '60nm de ~00 o~o 111. SY~THESE AUTOMATIS~E DE 4'-THIO-OLIGORIBONl~'CLEOTIDES ET
OLIGOMERES MIXTES.
On decnt la s~nthèse d'un 4'~thio-ri~o oligom~ homogene 1 tin~e sur la scquence d'epissage ace~ce du ~ene lat du HIV. O~l mon~c qu'il est cnsulte posslble d'obtemr des oli~omcs mixtcs eomprc~ant u~c scquc~cc limi~cc t'AD~I prescntant des llausons phosphodicstcrs ~e 4) ou pbosphor~thioa~cs ~scqueDce 5) De ~cllc~ ~eque&~ mi~e~ S~ S-ARN I ADN l 4-S-A~3` 4 et ~ p~ent ètre uulisee~
2 5 tan~ une appr~eho an~ c~ som susceptible~ t~ h~emont ~l~ d~ la me~e où
la "~ ro" t~ ~uc~ ADN ~era s~le sub~ras to ~ 40 H ~ tppuiement dc 1'~ aveo w~s c bb complemem~. Il cst à noter que l~ ADN (phosphodic~et ou pho~phorothio~o) p~ ~ d~ lon~ucur ~l~ - d~ lc~ ~ 4 e~ 5 il y a six de~oxynud~tite~ . ~t quo cett~ "fcn~ pcut ~ ulchuo ~ nqmpon~ qucUe position dc 3 o l'oligom~ m*no ux ~mit~ S' et / ou 3'.
Complh~eD~uement~ cctsc possib'll~'t~ ou~Te la vole ~1~ co~cepoon de nboz~mes amfic~cls ~homo~e~es ou non) compon~t dcs scquenccs d'oligo~nbonuclèo~des ~ R~
On ~ synthe~sc un ca~ nombre de 4:thio oli~oribont~cleotides homo~enes l~
35 sur un syD~edsct~ i A.D~ ~Applied E~iosystaDs mo~ele 381A) eD unhs;~t le procede gcn~l d~c~it prJ~t.
C'cst le c~s no~unent: FEUILLE DE REMPLAC`EMENT
ISAJEP
W O 93/16095 ~ PCT/FR93/00115 ., 1 . . , ~; ,~
du~'-Sr-~A-C-A-C-C-C-A-A-~-U-C-U)l du4'-Sr-t~-U-U-U-U-O.(4'-SrU6),2 etdu~'-Sr-(~-U-U-U-U-U-3'-P-CH2-CH2-CH~-OH~,(4'-SrU6-3'n-p~DH)3.
L'expression 4'-Sr vcut dirc: oligoribonucléotidc de configuration ~ où l'oxv~ènc du cvcle furannosc des sucres est rcmplace par un atome de sou~e.
3'n-prOH siynifie qu'unc fonction n-propanol est fixce sur Ic ~roupemcnt phosphatc introtuit à l'extrcmite 3' de l'oligoribonuclcoride.
De plus. des oligomes mixtes comprenant des se~uences d'oligodesoxvnucleondes pbosphodicster ou phosphorothioates ont ete obtenus et les modifications apportees au cvcle d'elongation sont decrites cn prenunt comme cxemple les sequenccs suivantes 4'-Sr-(U-U-U~d(T-T-T-T-T-T~4'-Sr-~U-U-U) I P11, ~'-SrU3~dT6-4-SrU3 / Plll ~
et4'-Sr~U-U-U~d(T-T-T-T-T~ 4'-Sr~U-U-U~P3PSsP3, 14'-SrU3-dT6~'- SrU3/P3PSsP31 S
ou 4'-Sr 8 deja cte tefini comme precetem~ent, Px corrcspond au nombrc de liaisons phospbodicster enere les unites nucleotidiques et PSy au nombre de lia~sons phosphorothioate entre les unites nuclgotidiques.
Les thio-oligonbonucleotites ont ete syn~etises sur un synthetiseur a .4D~ pplied Biosys~ems modèle 381 A).
J S.~nlhese des ~'-thloollgorlb~ cleotldes ~ Sr-(A-C-A-C-C-C-A-A-~
~'-SrU6. 2. el ~'-SrU6-3'n-prOH 3 Lc cvclc d' elongstion comporte qua~c etapes importantes " .
' 5 a) Détrityla~on du nucleoside ou de l'oligonucléotide fixe sur le suppo~ solide tans lec~ de4'-SrU6etde 4'-Sr~A-C-A~C-CdC~A-~-U-U-C-U),.ou bien de~n~ la~on du b~as D-props~nol fixe sur le suppor~ solitc ou de l`oligonucleotide fixe sur le llen n-propa~ol dans le cas de 4'-SrU6-3'n-prOH.
3 0 b) Co~densation du pbospboramidite active par le te~azole sur l~ydroxylc 5' libre du nucleoside ou de l'oli~onucleo~ide.dans lc cas de 4'-SrU6 et de 4-Sr-~A-C-A-C-C-C~ U-U C-U).ou bien sur l~ydroxyle libre du bras D-propanol ou sur l~ydroxvle en 5' de roligonucleotide dans le cas de 4'-SrU6-3'n-prOH.
c) Masqua~e des fonc~ions 5`-hydroxyles qui n'ont pas reap.
IL~E DE~5RA~ME~T
WO 93/16095 PCI`/FR93/OOtl~i n ~' 1 Chaquc svnthesc a ete cffectuee sur une colonnc conte~ant 40 m~ de suppon sol~de. Le rendcment de chaque mco~poranon est de 98 O evalue en mcsurant la denslte opnque des eanons dlmethoxy~tyles liberes apres chaque couplase par ~raltemcnt du support a l aclde ~nchloroacetique.
5 Des la-ages sont ef~ccsues enFe chaque etape. et la durce d'un cycle d'elon2anon e5t de ' I.16 m~nutes pour la s~lnshese dcs ~ois ollgomeres prec~tcs. ( Tableau;~l .
ETAPES ~ 1PS ~econde~) I SOLVANTS ET RE:ACTlFS
Lava~e~sechage ~ CH~CN I .~
Couplage 915~ucleoside pbosphoram~dlsc 0.1 .
~1 (20 eq.) dans CH3C~ ~
. tesrazole O,S ~t ( lO eq. ) dans L - _ . . CH~C~I. l L vage-sech~c ¦ ~l _CH3CN ~ GO~
Oxyd-non ¦ ;6 12(0.1 M)dansTHF/ PY H20 I (40/lO~l).
_ . _ .
LavaQe-scchage _ 1 59 I CH~C~ I ARGO~
~vlasquagc ~3Methylimidazolc~THF I
Ac~O/luadine/~ 1 18 1.
_ l Lava~ ? I ~CH~C~ / ARGO~.
2 ûDem lanon 98 _TC.~ à 3~O~a~
~ _ ! CH~C~i ~ ARGO~;
TA~LEAU 2 Cycle d'élonga~o~ u~se po~ la syn~ès~e te4'-Sr~A~C-A-C C-C-.~.~ V-2 5 U-C-l~') l, ~'-Sr~$ 2, et 4' Srl~'6 3'n-prOH. 3.
II~-2 Syn~h~K ~ oli~o~tcs mi~cs: ~t'.Sr~ U3 ~ P~ s~u~ J~
Srl-'3/P3PSf~3 111- '-I OI~gonucléotlde ~:SrU3-dT6 ~:5rC. 3 P
La svathèse automa~sce tc cct oli~onucleo~ide reprend les qua~e etapes decntes au l l- l Ch~que s,vnt~c# ~ cté cffcctuee sur unc coloDne contcn nt ~0 m~ te support sollde Le rendement de chaquc ~ncolporat~olL es~ dc 98 %. La duree d'un cyclc d'cloncaoon par monomère 4' Sr~U est de 21.43 mmutes contrc 6.73 mmutes pour un monomcrc dr Ccrse 3; dif~erencc est due i ru~cn~on du temps dc couplage d'unc entitè 4'-Sr U qul ei~ ~e ~1 s~contcs con~c 36 sccondcs pour unc u~utc dT.(t blc~u 3).
F~EUILLE DE RE M PLJ~CEM ENT
.
WO 93/16095/ ~ PCl /FR93/00115 ET.4.PES ~ ps~s~condes) I SOLVANTS ET I
¦ REACTlFS
j Lava~e-sechaee 1 '5 I CHlC~ I ARGO~;_ Coupla~e ~' Sr l_ I 915 I!~iuclcoside phosphoramldlle¦ 10.1 M ~_0 eq.) dans CH;CN
dT ' 36 ~ tetrazole 0.5 M ( 10 eq.
l da~l5 CH C~i.
¦Lavaee-secha~e L - 4 ! I CH~C.~ RGON
Oxvd~lon I -6 12 (0~1 M~ dans THF / P~T
_ _I . H ~O (40/10/1).
¦Lav~e sècha~e_ ! 59 ¦ CH~C~ 'ARGOI~
IMasquage ! ~; Methylinudaz,ole THF: I
_ ~ IAc OAundinc/lHF 1/118 1 L La~a~e-secha~c 1 71 ! CH3C~ ,' ARGO~
j Detnrvl~non ~ 98 ! TCA à 3% ~ns C}~Cl~
15 ~
T.~BLE.~I ' 3: Cyclc d'elonga~ion u~lisc pour la synthèse de 4'-Srl;3-dT~ Sr~ 3 J Pl 1 ~.
2 ~ O~lgonu~leollde 4 '-Sr~;3-d~6-~'-Sr~'~ P3PSSP3.~
Les memes condinons de s~lnthese automanscc ont e~e appliquees à ce dodecamerc nu~te compo~ a la fois des liaisons phosphodlestcrs et phospborothioates.
L3 svnthese a elc effecn~ce a l'echelle d'une ~lmole soit sur une colonne contenant en~on 5 ~0 m~ de support solide fo~caon~lalise a 21 ,umole ! ~, Lc rendement mo~ven d ncorporanon es~dc98%.
Lors dc l'iDtroduc~on d'une liaison intcrnucleondique de ~pe phospho~othioate. lctzpe d`oxvdanoD definie au paragraphc ~ l (etape 4. Table3u3 ) a ete remplacce par une etape de sulfurisation dc Sl sccondes u~ilisant le reactif de Bcauca~e ( ~rives de sulfon3 c~r~thioanhydri~de d~ benz~ne'~ dissout dasls l'acèton~tnlc a une 3 concen~anon d~ 0.0S ~.
Lcs autres etapes tu c~cle d`elonga~on demeurent inchan~ees.
fJ~-3 D~croch~c, Dcprotcction c~ Purif~c~non dcs 4 ~-thiooli~or~onYclcotidcs (4'~1~.
3~
FEUILLE DE REMPLA~EMENT
WO 93/16095 PCI'/FR93/00115 ,., ~ . ~ ,.. .
Après avoLr réalisé les etapes de déprotection des méthoxyphosphotnesters en phosphodiesters pa,r traitement au thiopheno~. les 4-thioQligoribonucleo~ides ont ete separes des supports solides par un traitement à l'arnrnon~aque. Les groupements TBDMS ~ntroduits sur les hydroxyles en ~' ont ete deproteges par une solu~ion de TB~F dans le THF. Les 5 thiooligomères sont ensuite dessalés sur une colonne d'exclusion DEAE Sephadex G-~5 p ~is purifiés par CLHP en phase inverse.
111-4 PARTIE EXPERIMENT~LE.
~` 10 Exemple l: Synthè~e des hesamèr ~ SrU6 2 et 4'-SrU6-3'n-prO~, 3.
1-1 Synt/~csc d~s suppor~s sol des:
15 Le suppor~ soUde néca~ire ~ la synthèse de 4'-SrU~. 2 est le même quc celui utilise pour la s~nth~se de BrSUl~.
La synd~# de 4-SrU6-3'n-prOH 3 necessite l'utilisa~on du support soUde u~vcrscl:
/^\
~ ~ ~ 21~
' / \CH/ ~C/ ``'--/
2~ 0 A pa~ir de l'intennedia~re P-3 decrit dan~ le Brevet n 9~ 01275 un melan~e de l -O-DmTr-propanol-3 ( l eq.), de DMAP (29,5 mg, 0 5 eq.), de triethylamine (O, l46 mg 0 003 éq.? de DEC (920 mg, 10 eq.) et de P-3 (2 4I5 8) est agité dans 29 ml de pyridinc 30 anhydre pendant trois jours à temperature ambias~te~ Du pentachlorophcnol (321 mg, 2 5 cq ) est ajouté et l'agitation du melange reactionnel est poursuivie pcndant 24 heures supplcmentaires. Le support solide est alors filtre, nnce avec dc la pyridine anhydre (~ ~ 50 ml) puis avcc du dichlorométhanc (2 x 50 ml) et de l'ether (2 x 50 ml).
Le support solite est ensl~ite traite pa~ la pipe~ e, pu~ p~ u~e solution d'anhvtride 5 uetique e~t do coUidi~e d~s k THF sclo~ le ptotocole t~fi~i pr~ment~
Ce~e dhmi~on a éte effectuee e~ ulilisaut le mode op~oire tecnt precedemment. Lc tUL~C de foDc~oD~lis~o~l du supp~ solide a ete evalue i 16,4 llmole de n-propanol par grammc de ~e. FEUlLLE DE REMPLAlCEMENT
W0 93/16095 ~ PCl'/FR93~00115 ,~ .
1-3-) S~ ntll ese ~utomo~isc~ des h~Qmcr~s 4 '-5rl,!6 2 et 4 '-Sr JU 6-3 ~n-proH 3.
1-3-1~ S~n~hèse a2 loma~lsee de l'he~omere 4'-Sr~ 6 _ 5 La svnthèse cst effeetuee sur unc colonnc conte~nt 39.4 m~ dc support sollde fonctio~alisc à ~ mole/g de rcstne~ sott 0.8~7 ~lmole (I eq) dc 4'-thiou~td~ne Chaque c~clc d'elon~arion necessite un exces de svnthon phosphor~midite ( 1~.75 llsnole. 'O.i eq~
soit 100.5 ~mole au total CD solution 0.1 .~1 dans l'ace~o~ ile.La duree du c clc d'clon~anon definic danS Ic tableau 1 est dc ~1.46 nunuus.
Le tosa~c dcs canons dimethox~ttylcs libcres à c~aque et~c de de~itvlatlon a pennts 10 d cvaluer lc rcndcment moycn d'incorporanon t'une ~ite thioribonuci;eotidique a 98.; O
1-3~ n~hèse auton-allsee de l'hexamère ~ rU6-3'n-prOH3.
La svnthèsc est cffesruce sur une colo~nc coate~nt 36.2 mg dc support solldc 15 fonctioanalise a 16~4 l~mole ~c n-propa~ol par EFamme te resine soit 0~82 ~lmolc ~ I eq ) dc n-orooano~.
La synth~e totsl~ de 4'-SrU6-3'n-prOEI, 3 necctsite 95,9 m8 dc synthon phosphoramiditc ( I 14.8 ~mole. 20 eq~) tissout dans 1. 14 m~ t'acetonitrilc.La durec d'un cvclc d elon~anon est de 21.46 m~utcs.
Le rendcment moyen par eouplagc est de 98~3 %~
~) Décrochagc, d~pro~ p~lr}fca~ion t2 4~r~ 2 ~ 4'~Sr~6-3'n-pr(~f 3.
Le ~ent u~lisa~t successivcmc~t du dliophenoL de l'anu~o~iaquc et une soluoon deTB.~F. commu~ u~ dewlc hcxamcrcs est tecnt precedemment.
2 5 / ~ I J An~yse er Puritieanon de l 'hexamère ~ :Sr~'6 2~
L'a~Jyx CL~H du thiooligomere a etè effeemee sulr u~e colon~e SFCC ~;uclcos~l C-18 5 'P 789 d~s les condi~ons te zradient suiv~ntes:
10 ,'o d'acttoiitrilc d~s une solu~on aqueuse 0.05 M t'actute de ~ritthylammo~um 3 o B: IS % t'aceton~trile d~s une solunon aqueuse O~OS M d'acet~te de ~edlvlammomwn Gtadicslt:
A----~0'-- B--10'---- B
> >
Temps d'~dyse: 30 miDutes~ dgbit: 1 ml I mill.
FEUILLE DE REMPLA~EMENT
WO 93/16095 PCI`/FR93/00115 r .~l ~ S 6 Dans ces condiuons, I~hcxamère ~-SrU6, 2 présente unc purete spe.~rophotomètriquc à '60 nmde95,3 %.
Unc purification en CLPH preparative sur une COIOMc nucleosyl semi-prcparative avec un debit de 2 ml I min a un éluant isocratique de 12 % d'acétonitnle dans une solution aqueuse 5 d~ace~tase de tricthylammonium 0,05 ~I nou~ permct d'obtenir le 4'-SrU6, 2 avec une purete spcc~troscopique dc 97,7 %.
nalyse eJ purrficatlon de l'hexamere ~'-SrU6 3'n-prOH 3.
Lanalvse est cffcctucc dans les mèmes conditions dc colonnc et dc ~radient que pour 10 l'hcxamcre ~'-SrU6 Le 4'-SrU6-3'~prO~ 3 a etc obtcnu avec une puretc spectro~copiquo à 260 nm de 51.6 'o Certc puretc cst portec i 92 % apres punfication par CLPH preparativc effecsuee dans un eradient tc 10 'o a 13 ,'o t'acctonitrilc rl~nc unc solution aqucusc d acctate de rsicth~lammonium O.OS !~1 cn IS n~inutcs. swhn d'un palli a 13 % d'aceton~le dans unc l 5 solution aqueusc d'acct~e te trict~vbm~noDium O.OS M pentant 10 m~nutes.
Exemple ll: Synth~e du dodèc~mère mis~e: 4' SrU3-dT6~ SrU3 / Pl 1 ~.
IJ~I~ Synth~sc ~u s~ppor~ sofidc 2 o Le support solite u~lisc pour ccr~e sy~thès~ est ideD~quc à celui nccessalre a la synthesc du ûrS- 12 11-2) Synt~lcs~ ~to~scc dw 4'-SrU3-clT~ Srl~3 / P~ ~ 4.
La s~ntbcse du to~écamere est e~ectuec sur unc colo~e contcnant ;9.i m~ de juppor~
~5 solite soit 0~819 l~mok de 4-thiou~idine. Chaque cyclc t'clonp~on necessltc un e~;es dc s,~nthoDs 4' d~ioundi~e phosphoramidite (16.~S ~moles~ ~0.3 eq) soit lO0 ~ umole dc s,~nthons 4'-thio uriti~e dissout d~s 1.2 ml d'ueto~litrile (0.083 ~l) un exces de jynthon dcsox,~h~d~e phospbo mitite ~20 eq.. l6.38 ~mole~ soit 98.28 ~moie te dT en solunon 0.1 !1 ta~ cetonit~ile. L~ dur~e d'u~l cycle d'inco~on d'une tu~i~e deso~th~ud~e30 est dc 6.73 m~L alon qu'elle est de ~1.43 m~ pour un cycle d'~corpotanon du synthon ~`
thionbou idine~
Lc dos ge des c~o~ med~o~tvles lib~rès à c~que tupe de dèm~lanon a Dennis de~alu Ic re~tement moyen d'mcolpo~tlon i 98.0 %.
11 3) D~crocll~d~pro ~ a p~tirco~ ~ 4'-SrU3~T~4' Srl:3 / P~ I
FEUILLE DE REMPLACEMENT
Wo 93/16095 pcr/FRs3/oolls ~ ,~ t , . ..
Les e~apes de dccrochage dc l'oligomere du suppon solide et de tcprotecnon dcs llalsons Ln~e~ucleondiqucs phospho~cster au thlophcnol sont Idennques à celles decntes dans I e~emple 1 5 11-3- IJ Anal~se er Purrficolton d~ Sr~ 3-d~6-~ '-SrC 3 PJ ~ 4 par CLPH.
L'analyse CLPH de roUgomcre 4 2 éte effecn ec sur une colonnc SFCC ~ucleos~l C I ~ S
'P789 tans u~ gradient a 10 % a 15 % d'acctom~ile dans unc solunoD aqueuse d'acetatc dc tnethvlammonium O.OS ~I pentant 20 mmutes (debit: I ml Imin~ tcmps d'anal~se . ~0 ~un) Dans ces contitions~ le dotccame-e mlxte presentc une purete spcc~rophotome~4uc a '60 10 ~ de9~.Sb.
I~ne pu~ificanon p~r CLPH sc~u preparative sur u~c coloD~e ~iucleosyl avec Im deblt de ' rnl / m~n dans le memc gradicnt augmente la purete spcc~ophotomè~4ue de la sequence mixt~ 4'-SrU3-dT~4'-SrU~ I Pl~, 4 à 99,5 %.
15 EXEMPL 111- Synthe~e ~utom~ti~ee du 4'-SrU3-dT6-4'-SrU3 1 1~3PS5P3 S.
11~-13 Sy~nthcs~ du suppon solidc Lc support solide uilise est le mèmc que celu~ desnt dans l'cxemple l.
2) S~ndles~ Qutom~s~ ~ 4'-5~1;3~6 4 -S~IJ3 ~ P~PSsP3 ~
La s,~nthèsc du dodeamcrc es~ cffec~uee sur une coloDne contenant 39~S mQ de suppon foncnonnalise soit 0,831 ~mole ~ I eq) de 4'-thiouridinc. Chaquc cycle d'eloo~ancn necess~e un excés de ~ 4'~ioundi~c p~osphoro~dite ~16~75 ~mole. 20~3 eq.) So~ 5 25 umole te 4' Sr U ~ tot-l a u~ exces dc ?0 eq. ( 16.38 ~imolc) de s,~nthon desox~ rudme soit 98.28 ~mole pour b sy~cse cnaere La dw~e d'u~ cycle d'~corpot~on d w~c dèsoxythymidine est de 7.7 m~nutes con~e ' 1.~;
minutes pour l'i~corpo~on d~ ouridine. Le dos~c des c~ons dlmetho~ntnr~les libcs Indique u~ dement move~ t Incorporaoon tes syntho~ te 98~ ~
111-3) D~crocb~g~ dcpr~c~ c~ pur~ficot~on t~l ~' StU3 dt6~-St~`3 ~ p3p~ssp3 ~
Lc t~ eme~t te cet oligomcre e~t ~dcntique i celui tè~i d~s l'cxemplc 1. L anal se et la purifi~on Cl HP. r~alisee sur unc coloMe SFCC Nucle~l Ct8 ~ S 'P789 dans un ~ient te lo % ~ 20 % d' cetonilrile d0s une solu~ion ~queusc t`accs~tc de 35 me~ylu~onium QOS M pe~t ~0 m~utes (débit: I ml /mi~ temps d'a~alyse 30 mm) mon~c unc p~e 5p~0phFtEmucltnLqLeE~ l2~E~mREM5pLAC`EMENT
IS~VEP
wo 93/16095 PCr/FR93/00115 .'~ . '' ~ '` ' ,1 ;"
La punficanon par CLPH semi-preparatlve sur une colonnc ~ucleos~l seml preparanve avec un dcbit de ~ ml / mi~ d~ns dcs condinons Isocranques a 19 % d'acctorusnle dans une s~lunon aqueuse d'acetate de tnethylarnmomum 0.05 ~1 augmcnte la puresé de l'oligomère à
99.1 o.
Exemple 1~: Svn~hè~c du d~damèrc ~nti"ta~":
~'-Sr-~A-C-.~-C-C C-A-~-U-~-C-~')I.
1~' 1J Synthcsc ~lu s~ ppOrf sohd~
10 Le suppon solite utilisc pour ce~te synthesc automa~isee cst idc~nque à celul decnt da~s l'e~<emplc 1 2J ~nthc~c al~om~is~c tv dodcc~mcrc ~nt'to~":
~-s~A~c~A~c~c-c~A~A~ c-~? l~
La s.~,nthese de cct hctododecamere compleme~t ire tu site accepuur d'eplssa~c du ~ene a~ du ~tlH est effectue~e sur une colonnc co~teDant 38.S m~ de suppott solide foncnoMallsc soit s~r 0,808 ~mole de 4'-thioundi~c ~1 eq~). Chaque cyclc d'clonga~on u~lisc un e~<ces dc 'S~4 eq (20~4 ~molc) en s,~tbon 4' thioadenosinc phosphorosmidite. 13.5 cq ~10.9, ~0 ~mole) en s,vnthon 4' thi~di~eet 30 eq~ (24.2S ~mole) en synthon 4'-thioundmeLa duree d'un cycle d'i~co~pora~on est te 20,~1 minu~es et le dosaQe des ;anons di~nc~ho~tyles i~diquc un rentement moyen d'incospor~non des s~nthons phosphoram~dites dc 93~6 %.
t~'-3) D~crocho~. d~rota~ crputif~ on du 4'-Sr-(A-C-A-C-C C-A-A-~ C l,) f.
Le support solidc pon~t le dodecunerc ~'-Sr~C-A~C-C-C A A U U~C-U)~lest ~ute par S ml d'unc solu~ te thiophenol ~ ~lethyl~ne f dioxsne (11211) pcndant une dcml heure i tc~ran~ biantc. La solutlon te thiophenol est alors filtrce et le 5UppOt~ SOhde CSt lave avcc 3 x 3 ml de ~ct~a~ol. puls p~r uDe solurion d'ammoni~4uc 32 /O dans l'c~hanol ~3/1: ~lv) (3 x 500 ~l~ afin de decrocher l'oli~omère te son suppo~ La solu~on ob~e~uc est mlse i incuber d~s u~c etuve seche thmost~cc à S5 C pc~d~t S heures at~n de deprotcg les ~roupements protcc~curs tes b ses bètcrocycliqucs. Elle es ensulte evaporee, rcpnsc d~s 500 ,ul d'cau et Iyophlllsee~ L'oligome ly~c cst alors dissout dans 300 ul d`une solu~ion de TBAF (1.1 ~1) d~s le THF. Le mclu~gc r~onnel cst l~sse a 3S tem~c ambiYlte pe~ 4 hc~es. L~ re~ctio~ cst alon stoppec ~rcc 300 ul dune - solu~ion ~ueuse d'~et~te d'~mmomum QOS M. L~ solu~lion cs~ e~porec i sec. co e~poree ~vec 3 por~oDs dc 500 ~ t`esu e~ 1~ rcsidu cst dess-le sur u~e colo~e te ~el d c~ ;luslo~
FEUILLE DE REMPLA~EMENT
~:
wo 93/1609~ pcr/FRs3/oo1 15 t L ~
,. ' ~ J
DE.~E Sephadcx G-25. Lcs ~ac~ons contenant Ic 4'-thiooligomcre sont rassemblees~c~aporees a sec~ red~ssoutes dans 1.2 ml deau et fil~e sur filtre milliporc avant d'e~e anal-see par CLPH.
5 1~' J) Anal~ se et pur~fcat~on du 4 '~Sr-/A-C~A-C C-C-A-A-~ -C~
L'analyse CLPH analy~quc du doteearnere I a ésé éf~e~tuee ~r une colonne SFCC Nucleosyl C18 N125 2P789 dan~ gradient de 10% à 15 % d'acétoritrile tans une solution aqucuse d'acetate de tri~hylammsniwn 0,05 M a~ec un tébit de I ml ~ e~ temps d'analyse de 30 sninutcs. Le chromatogramme indiquc unc purc~é spt~ophotomémque à 260 nm de ~4,9 %.
~Une puri~cado~ par CLPH s~-prépara~ive sur une coloMe Nucleosyl C18 semi-prepara~ive en utiL;s~t le meme gradi~nt av un t~it de 2 ml ~ ot un temps t'analyse de 30 ~unuta amènc 1~ pur~té spec~oscopiquc du 4'-Sr~(A-C-A-CC-C-A-A-U-U-C-U), I à 100 ~O
IV . PROPRIETE D'HYBRlDATlON l)ES ~ OLICONOCLEO~IDES.
La spectrophotome~c Ij. V. pmet d'etudi Ics acides nuclciques ct tc mes~c en e~ldence la fonnatio~ de duplex. la tcmperature tc fusion ct~nt u~c des caractcnstiques d'un duplex L'cmpilcmcnt et l'appancment des bases dcs acides nucleiques sont accompa~es d une diminution de l'absorb~on ~ V. (H~rpochro~uàte). Ai~si par spectrophotomesne U.V. il 20 est possiblc de con~oler la fo~natlon ou la tissociation d'un duplex. ~f S~`lGER
Prlnclples of ~luc~elc Ac~d Strucnre~ Spnnger Verlag..~icw-Yorlt 1984. pp 1~ 9 Lorsque la tcm~e d'une solutloo conten~t une doublc helice (ADN ou AR~) es~
len~cmeDt a~entec. l'absorb~on l,.V. croit nettement tout au long de la tlssoclanon. Le pomt d'inflcxio~ t~ la cour~c d'allure sygmoYdale de la vana~on d'absorbancc en fonc~on dc la tcmp~ est ~ppclcc tcmpamre de ~usio~ ou Tm et co~espond a la co-e~stcnce2 5 dc bn~s ~es ct te brins appanes tans un rapport SO / ~0.
I 'analysc tes cou~cs dc ~s~on tes duplex ~4' thiooligoribonucleonde / ~
oligodéso%yri~o~ucleo~ide e~ ooligonbonucleon~e / ~oligoribonucleonde pennc~3 de tcfi~ir la s~bilitt ~quc dc tels duplex p~ i8 mcswc dc îa tcmperaturc àe nlslon.
Ces ex~c~ces d~ tion son~ mc~ees e~ respcct~nt uQe ~toecl~iome~e I I I en~e les 30 dcux brins complementaircs. cn prcxnce d'un tampon 1 M ~taCt. 10 n~ cacod l~tc de sodiu~n. Unc fonc concen~on cn ~aCl favorise en effe~ Ics appuiements en soI~aw~t les cb~rges ntp~ves autour des a~omcs de phosphote des tew~ oli~onuc~eonde ~ous a~fons do~c cffcffut ces expenences dhvbrida~on ~ u~ ~u~ ampon: 0.1 M l~JaCI . 10 m1~ cacodyl~# de sodium.
35 IV. 1. RESULTATS ET DlSCl,SS10 E~emph~ I et 11: E~penences de fusion da duple~ as.u~2 Ipoqr~
FEUILLE DE REMPLACEMENT
Wo 93/I6095 pcr/FRs3/oolls et ~rl~ 1 2 / pol~rA.
Ces expencnces permettent dc meme en ev-dcnce l'influcnce de l'atome de soufre en poslnon ~` du dodecamcre modifie sur la stabilitc thcn~uque du duplex cn comparanl les Tm ob~cnus avec ceux du duplcx nan rel.
Le tableau 4 reswnc les temperamrcs dc fusion obtenues dans les deux expenences Concentraoon ¦ BSr~ I ? / polvrA 'C Brli l2 / polvrA ac en ~aCI H~.~ochron~icitc '0 Hypochromieite O
_ _ I _ _ _ -1~1 1 46^C '5% _ en cours 100.1 = t5'o ~ en cours _ _ __ _ ~ __ _ , Tablcau 4 Temperan~rcs de fUSlOD des duplcx de todecamcres Concemrat~on; ~ l en cha4ue oligomèrc.
15 Lanalysc de ces rcsuita~s mon~reM quc le duplex 6SrUI2 / polyrA presente unc bonne stabilite thesmique represen~ce par le Tm dc 46C obtcnu à unc concentranon de I l~l en ~;a(~
Exemple~ lll et l~': E~perience~ dc fu~ion de~ duple~ I~Srl~l2 l BdC2Al.C. et ~rUl-I BdC2A12C~-to Les ~empcratures de fusion obtcnues dans les de~; expcriences sont rcsumees dans le tableau S~
_ _ Conccn~aQon BSr~ adC_.~l~Ct oCl Brl~l2 ' BdCt.~l~Co C
en NaCl H~ochrorn~c~te % I. Hvpochromicl~e o 2 5 _ . ~
lM ~?C 9 3% ¦en cours . _ ~
0. IM 5'C ~.6io en cours _~ . _ _ _ _ . _ _ Tabl~ 5 Tempcran~res de ~sion des duplex dc dodecames Concentraslon 3 ~lM cn chaque olisomcres E~emple IV: E~perience d'autohvbridation de l'oligomere ~SrUI~.
.~fin de verifi les rtsultats preccdents. il est ntcessaire dc s'assurer quc le dodecamere 3Srl;lt ne conduit à aucune autohybndation. Pour ceh on a effccruè une c~penenccd'auto-hybrida~o~ tu totecamcre BSrl, It i deux concentr~ons en ~aCl ( I ~t et 0 1 ~
Les cour'oes d'hybnta~on ne presentcnt pas l'allurc sigmoïdalc caractensn4ue mals ob~issent à l'tquation A = k-T où A cs~ I'zbsor~ancc i 260 nm. T la ~emperanlre et ~ une co~stante. Aucun point d'inflex~oo ne peut etre ~risualisc sur une ~ellc drolte Nous ~ou~ons donc conclure que Ic dod~camcte Bsr~ I t nc s'auto ~pparic pas.
FEUILLE DE REMPLACEMENT
WO 93/16095 ~ f ¦ pcr/FRs3/ooll5 .. ~ ,.. .... .
La comp~raison d tempér~tures de fusion dn duplex ~Srljl2 / ~dC2A12C2 (Tablc~u S) et BSr~:l2 / polvrA (Tableau 4) montre une stabilité thermique de l'homoduplex .~R~/AR~' (Tm = ~6 C) nettement supérieure à celle de l'he~eroduplc~ AR~ DI~, (Tm = 27 c) d'autre psrt, aucune ~uto-hybridation de BSrl;12 n'a é~é conststée.
Exemple ~l et ~ Expérience de fusion des duplex ~dTs(SrT)dT6 / ~dC~Al-C~ e BdT~ dc~Al2c2 Cette experience permct d'evalucr la stabilité thennique du duplex ~dTs(SrT!dT6 / ~dC?.~I~C~ comparanvement à celle du duplex naturel BdTI~ l 3dlC~AI~C~
iO (Fi~ure 1) Les temperatures dc fusion de ces duplcx SODt indiquees dans le tableau 6.
_ _ Concen~ration BdTs(SrT)dT6/BdC2AI~C~ C l BdTI~ / BdCa.~l~C~ ^C
en ~;aCI Hvoochromicitc % HvpochromiciIe ~O
1 c , .... _ _ .
1~3 40C 18 % ~5 C '0 ~ %
. _ _ Tableau 6 Temperature de fusion des duplex BdTs(SrT)dT6 / BdC >AI~C~
et BdTI~ / BdC~AI~C~
Concentrasion en chaquc oli~omère 10 ~M
Au vu de ces resultats~ il apparait que la stabili~e the~n~ique du duplex modifie cst infeneure à celle du duplex naturel. Cependant la di~ér~nce de 5~C existante entre les delLx temperanlres de fusion est tlQp faible pour conclure à un mesappar~ement. En effet. ce~ns auteurs ~Y.KAWASE~ S.IWAI~ H.I~OI TE~ K.Mn,lRA et E.OKTSUK ~ ucle~c Acld R~search~ 1986, 14, 772~) ont mon~e que l'existence d'un seul mesappanement dans un ~5 du~lex de 13 unites nucleotidjques se traduisait par une timinuDon dc Tm supèneure a I oac~
On peut donc conclure que l'unite 4'-thio-nucléotidique s'~ppsrie bien avec l~ 2'-desoxysdénosine msb ~ec une ~ffinite inférieure i celle de b 2'-deson~thymidine 3 ~ comme le confirme 19 tifference de Tm de S C obtenue ~T~ble-u 6)~
1~'. 2. PARTIE WERIME~TALE
!.1ethode G~ner~le pour l experiences d'h~brid~tion 3~
FEUILLE DE I~EMPLACEMENT
Wo 93/l6095 pcrlFRs3/ool 15 r ", ~, J ~ 6 ~
.~ - Dosage des ollgomères complemen~alres ,~fn dc reallscr l`expencncc d'h~bndanon. il est neccssalre de cormaitre la conccn~ranon en chaque oli~omcrc pour rcspecter la stoechometne l: l cntre les de~ bnns 5 complementaLrcs. Selon la loi de BEER-L.~lE3ERT A = EIC. IeS absorbances dcs oligomeres ont etc mesurees a 80C afin d'elinuner le phenomenc d'cmpllement des bases crcan~ une pemlrbanon de l'h~rperchromlcite duc à l'cxistence de strucnlrcs ~emalres On peut donc connaitrc les coefficients d'exnncnon moléculure des dodecameres à 80-C ,elon la relanon ~ 265(Srl t ~) = 12~ 265~rl.
B - ~ vndlt~ons d'hvbr~datton.
Les expericnces d'hybndanon sont cffectuees avec un spectrophotome~e U~l~;O~ 810~CO?~TRO~I). couple a un nucroor~inateur IBM compa~bk. La temperarure e5t con~rolce par un programatcur de tempcrature HlJ'BER PD 415 con~ecte a un bain Ihcrmosta~e15 (HliMER MI~IISTAT). Les cuves l V. sont cn qu~re de I cm de long ct unc clrculanon coninuel~e d'azote est utilisce pour les tem~tures infeneures a '0-C ~ant l'exper.encc~; ~M (Exemples I a V) ou 10 IlM (Exemples Vl et ~,11) d'oll20mcres complementaires sont m~s en prcscnce dans une quan~te suffisan~e pour 1000 ul detampon 1 M ~`iaCl et 10 mM cacodvlate de s~um. ajustc a pH 7 (Exemples I a ~11) Ce melange est chauffe à 80C pendant 1 heure~ puis re~oidit jusqu'à - tOC selon une pente 20 de temperan~re de 0.5C par mmute. Les valeurs *absorbance et de temperamre sont collectees toutes les 30 secondes.
La memc e~cpesie~ce est effec~uce cn unlisant une quannte suffisante pour 1000 ul de tampon d~ybnda~on 0.1 ~ ~aCI. 10 rnM cacod~late de sodium aJuste a pH ~ a~n d'eYaluer la stabilite thn~lquc du duplex dans ce tampon favonsant molns les ariemc~
E~emple 1: St~bilit~ thennique du duple~ BSrlil2 / polyrA
1-1 Dosage tes o/~gomcres ConcentTarion de BSrl ' l~ = 0 3S ln~l 3 o Concentra~on de polvrA = 4~$1 l-2 ~ ondlnons d'h~brt~llon 3 ~M (8~SS ~ dc BSrUI~ et 3 ~ 7.79 ~11) tc pol,~rrA sont mis en presence dc ~ 6 ul des ~ampons tl~ybritation (I ~1 ~aCl. 10 n~l cacodylate de sodium ou 0.1 ~ ~aCI. I0 mM cacodylate tc sodium3 E~emple 11: St~bilit~ ~hermique du duple~ ~rl;l2 / polvrA
l:EUILLE DE REMPLACEMENT
WO 93/16095 ~ PCl /FR93/00115 , . . .
en cours Exemple 111: Stsbilite thermique du duplex ~SrU12 / ~dC2Al2C7 5 111-1 Dosa~e ~es ollgomeres Concentra~ion de BSrlJ 1~ = 0.351 mM
Concentration de BdC~AI~C~ = 0.;69 mM
111-'~`ondlt~ons d'hvbrldatlon 1(8.5~ ul) dc BSrlJI~ et 3 ~1~1 (8.11 ~1) de BdC2A12C~ sont Il~is cn presence de 98;, !11 des tampons d~ybridation ( I vt ~iaCI. 10 mM cacodylatc de sodium ou 0.1 ~1 ~aCI. 10 nL~l cacodylate de sodium) Exemple IV: Stabilité thermique du duplex ~rU12 I BdC2A12C2 ~en cour5) IV.I Dosa~e des ol~gomères 5 Concentranon de Brl i 1~ =
Concen~anon de BdC2Al~C~ - 0.369 mM
' Con~lt~ons d'hybridatl~n 3 ~ 1) dc BrU 1 ~ et 3 ~lM (8.1 1 ~1) de BdC2A12C2 sont mis en presence de ul des tampons d~ybridation (1 M NaCL 10 mM cacodylate de sodiwn ou 0~ ;aCI~ 10 nL~,~
cacodylate dc sodiwn) Exemple ~: E~pericnce d'autohybridation de 1' oligomère BSrU12 2 5 V- I Dosage des oligomères Concentra~ion dc ~SrU 12 = 0.351 mL~
V 7 COndJrjOnS d'~br~ Jon 6 uM (17,10 ~1) de I~SrUl~ sont n~s en presencc de 986.9 !11 dcs ta~npons d~bndanon ~ I
30 ~ iaCI 10 ~1 cacodylate de sodlwn ou 0.1 M NaCI, 10 mM cacodylate de sod~um Exemple Vl: St~bilite thermique Ju duple~ lldTs(SrT)dT6 1 BdC2A12C2 K7-1 Dosage des ollgom~res Concen~on de BdTs(SrT)dT6 = 1.33 mM
35 Concentrarion de BdC ~AI~C~ = 0.369 m.
V}-2~ondt~ons d'h.v~tdQuon FEUlLLE DE RE~PLAC`E~ EN~
wo 93/1609~ Pcr/FR93/oo11s r, 1 ,~, ., i ~J 64 lOu.~ (7.~9111) de BdTs(srT)dT6 et 10 ~M (77-5 ~1) de BdC~Al~C2 sont nU5 en presence de 970 ,ul dc tampon d'hybndanon 1~ ~iaCI. 10 IrL~1 cacodvlate dc sodium.
Exemple ~ Stabilite thermique du duple~ ~dT12 1 ~dC2A12C2 ~ 7~-1 Dosa~e des ollgomeres Concenlration dc BdTt~= 1.196 mM
Conctn~anon de ûdCtAltCt = 0.369 ~LM
~1-2 C`ondltlons d'h~brlda~lon 10 10 ~M (8~36 1~1) dc BdT1~ et 10 ~ 1) de ~C~A12C2 sont n~is en presence de 969.1 ul de tampon d~hybntation 1 M NaCI. 10 mM cacod~late de sodium.
~. PROPRIETES D'HYBRlDATlON DES 4'-S-AR~ ET OLIGOMERES ~ TES.
15 Les experiences d'hybridation sont mcnccs cn rcspectant la stoechiometric 1/1 cn~e les de~
blins complemen~res en ptesence d'un tampon 1 M NaCI. 10 mM cacod~latc dc sodlumline fortc conce~traaon cn ~aCl favorise e~ effet les app~rinents cn solvatant les ;hargcs neganves autour des atomes dc phosphorc dcs dcux oligonucleotites. ~ous a~ons et~ccrue ces expenences d'hybridation dans un autre tampo~ 0.1 ~ aCI, 10 mL~l cacod~.late de sodium.
RESULTATS ET DISC~ISSION.
2 5 Les cxpcricnces de ~3sion tes duplex:
[4 -Sr[~3~T6-4 -SrU3 I Pl 1] / pohlTA [~ i po~yrA]
SrU3~T6~ SrU; f Pl 13 / d(CtAI~C~ / d(C~AI?C~]
SrU3-dT6 4 ~SrU3 / P3PSsP3~ ~poly~ / polyrA~
14'-SrU3~dT6 4'~SrU3 I P3PSSP31 / d(CtA12Ct). [S / d~Ct.~l~C~)~
sont effectuccs à dew~ concen~rstlo~s en ~aCI ct permettcnt d'evalucr llntluence des 3 o liaisons phosphotothioates sur la stabilite d'hyb~ ion comparanvemenl alL~
oli~onucléotides avcc dcs liaisons phosphodiest normales (tablcau7 ) FEUILLE DE REMPLACEMENT
WO 93/1609S PCI/FR93/1)011 , , . ,.1 ~laCI conccntranon ~ Duplex _ I Tm ~C
I i .~ipolvrA I 45 . ~
I , ~ ! polv rA ;6 1 I S / d(C~A 1 7C~2 l 9 ~ ipoly rA ; ' 0.1 51 solv rA 2-l . _ . _ .
0.1 ~ / dlC7A1?C~) lO _ o ! s /d(C?~25~3 TABLEAU 7 Resultatsdes expericncesdc fi~ion.
Le dodecamère mixtc S présentan~ a la fois des liaisons inten~ucleo~idiques de ~pc phosphodiest ct phosphorodlioate (P3PS~P3) induit u~e diminu~on dc la aleur du Tm d'envlron ~C par lie~ pbosphorothioate. Par contrc~ l'oligomere 4 presentc des aleurs de Tm qui sont cqui~ tes à celles obtenues pour le dodecamcre ~rSI;12 avec les dewtsequenccs compleme~ta~s poly rA ct d(C2Al2C2). Ccs r~sultats (tablcau7 ~ mdi~uent quc les oligomcrcs dc se~ce m~ne 4 et ~ prcs~tent unc bon~e s~bilitc d~enn~quc a~ec des sequences d'AR~; compieme~t~ires.
PARTIE EXPRIMENTALE.
.~1ethodc G~nenle psur les e~perience~ d'hybriJ~tion .~ - Dusog~ des oligomcrcs complcm¢n~)res.
2 5 Afin dc rcaliser l'c~ence d~ybrid~o~ il cst necessure te co~tre la conccn~anon de chaquc oligoDle~c pour rcspec~r la stocchiometne l: l cntre les detL~ ~rins complemen~es Selon l~ loi dc BEER^LAMBE~T A - EIC. Ies ~bsorbances dcs oli~omères ont ete mcsurces à 8QC afi~ t'eli~i~ Ic phéaome~e d'cmpilcmc~t des bsscs crc~nt unc per~urbanon de l~yperchromicite dde i l'existc~ce dc stJuc~res terti~i~es~ On peut donc connaitrc les coefficicnts d'exanc~on mol~culiire des dod~c~mescs i 80C sclon une relanon semblable a 3 0 ~2~5(SrUl2)- l2 ~2h5(SrU).
B - Cond~uor~ d'ly~na~mo~
Les cxpenenccs t'hybrid~on son~ effccn~ees n~ u~ spcc~opho~ome~re UVlKON 8l0 (KO~iTROl~J), coupl~ i tm mictoordi~teut IBM comp~blc. I a umper-n~re est consolce 35 par un pro~ula~r tc tempnnnue HUBER PD 41S co~e i u~ bam thcm~osute (HUMER MI~IISTAT). Les cu~ U V. sont cn quu~ de I cm te lon~ c~ unc cu;ui~non ~EUILLE DE RMPLACEMENT
WO 93/16095 . PCI`/FR93/01)115 ., ~ 66 .onnnuelle d'a~ote est u~lisec pour les temperatures infericures à 20C .~vant l expcnence 3 u.~ (Exemplcs I à Iv) d'ollgom~eres complémentaires som mls cn presence dans une quann~c suffisante pour 1000 ul dc tampon I ~ ~aCI et 10 n~M cacodvlate de sodlum a!uste a pH t (Exemples I à ~ . Cc melange est chaufft a 80C pendant I hcu e. puls 5 re~oldlt jusqua ~ ~0C selon une pente de temp~mre de 0.5'C par mmute. Lcs ~aleurs d`absor~ance et de temperature sont collectees toutes les 30 secondes.
La meme expericncc est effeetuce en utilisant une qu~n~te suffisante pour 1000 ul de tampon d'hybridanon 0.1 ~ ~aCl. 10 mM cacodylate te sodium siUste a pH ~ ~Exemplcs I
et l~)afin d'evaJu la stabilise thenrllque du duplex dans cc tampon favonsant moms les appancments n Excmple 1: St~bilité thcrmique du dup~e~ 14'-SrU3-dT6^4'-Srlj3 / Plll / polvrA, / polvrA.
1-1 Dosage des ollgontètes 15 Conccnlrasion de ~ = 0.821 mM
Concensration de polyrA = 4.61 rnM
'ond~tlons d'hvbrlda(son , ~M ~3.65 ~1~ de 4 et 3 ~M (7.79 ,ul) te polyrA sont ~is en ~ence de 988.5 ul dcs tarnpons drhvbndasion (1 M ~JaCI. 10 m~t cscodylasc de sodium ou 0~ aCI. 10 n~l 20 cacot~,latc de sodium).
E~emple 11: Stabilit~ thermique du duples 4'-SrU3-tT6-4'-Sr~3 / Ptl / dC2.~1-C-,1 / dC2~12C2 2 5 11-1 Dosage ~es oltgomèrcs Concensra~ol~ de 4 - 0,82l mM
Conccn~non de tC2AI~C~ = 0.369 mM
11-2 Contilions d'~ybndanon ; ~,U (3 6S ~1) de 4 ~s 3 ~lM (8~ 1) de dC2A12C2 sons mis en ptèsence de 9~8. ' ul des 30 tampons d~ybrid~on (I M ~iaCL 10 mM cacodylatc de sodium ou 0.1 ~1 ~aCI. 10 n~l cacodvlatc dc sodium) E~empk 111: St~bilite ~hermique du duple~ 14~-SrU3 JT6 4 -SrU3 I P3PSsP31 / polvr.
S I pol~rA
35 111-1 D~sa~c tes ~llgomcres FEUILLE DE REMPL~CEMEN
Conccn~oo de po~A - 4.61 mM. ISAIEP
WO 93/16095 , ~ ~ PCl~FR93/00115 111-2 Cond~l~or~ d't~vbndonon 3 uM (7~5 ~1) de 5 e~ 3 ~lM (7.~9 ~1) de polvrA sont n~s en prcsencc de 984~7 ~11 des tampons dllybndanon (I ~ ~aCI. 10 n~ cacodylate de sodium ou 0.1 M ~iaCI. 10 n cacodylatc de sodium) E~esnple 1~: St~bilité ~hermique du duples Srl~3-dT6~ Srl!3 / P3PSSP3J / dC~A12C2~ S / polyrA
1~:1 Dosage des ol~omères Conccmsanon dc S = 0.40 mM
10 Concentraoon de dC~A]~C~ = 0.369 mM
1~:2 Con~i~-ons d'hl~br~dorJon i ~lM (~.5 1ll) dc S ct 3 ~M (8.11 1ll) de dC2A12C2 sont mis cn prcs~ncc de 98~ I dcs tampons d~yb~dation (I M N~CI. 10 mM cscodybte dc sodium ou 0.1 !~/1 NaCI. lO ~1cacodylaltc dc sodium).
Yl. ETUDES ENZYM~TIQITE:S
La rccomlaissa~cc des acides nucleiqucs p~r tes c~es cst cn majeure pame dordre 2 o structural. Lc rcmplaccsl~ent de lrhetoatome nan~rel du sucFe d'un oligonucleonde confere a celui-~i une for~e rcsi~nce à la de~non par les nucle~scs L'en~dc de l~ydrolyse des 4' thio oli~oribonucleorides B par ces nuclesses pcnnct de confirmer quc lc r~mpl~ccmcnt dc l'oxygtnc i~ltrscycliquc par un atomc dc soufre confère bicn une mcillcurc s~bilit~ c~zym~que.
S
E~emple 1: ~tud~ de b d~r~dation enzym~tique du dod~o~ère ~(SrT)dTl 1 p~r 1-phosphodiatéra~e dc rste de v~u.
La phssphotiest~ de r~te de vca~ est Ime exo~ucle~ ui dc~ade lcs otlQomeres a 3 0 p~ de Ic~s extrcmités S' libre lib~t ~nsi dcs nucleotides 3' phosph~se.
Cette cNde nous pcrme~ d'évalu~ 1~ rèsis~ance à 1~ de~ioo enzym~que mdulte par la ptcsc~cc cn posi~on S' d'une unitt 4'-thionuclc~tidique dJns l'oligomcte ~SrT)dT
comp~il/eme~t i la ~ion ~que tc l~omolo~uc ~el oxy~ènè ~dT I ~
La stabilitt compuati~e des teux dodecuncrcs BdT12 et B(StT)dl 11 envers l'h~drohsc par la phospbodintcr se te ~tc tc ve~u cst ~tt~ d~ns Ic t~blc~u 8.
FE:U~LL E~ N~r r 1 La différence de componement entre les deux dodécamères est importante. en effetseulement 23/~ de l'oligomere B(SrT)dT I 1 a été bydrolysc en 25 mmutes alors que dans le meme laps de temps le 12-mer 3dTI~ a ete degradé a 93% .
_ .
¦Dodecasncre ¦ _Dc~ eD 0 ~ nDeE~radation en ~5 mm BdT ~ 1 0% 93%
1 _ ~
B(SrT)dT m I % ~3%
~ . _ _ Tablcau 8 Cinetique de dc~rad~tion de BdTI~ ct B(SrT~dTl l par la phospbodiestérase de rate de ~,eau 0 L cvolution au cours du tcmps de la dégradation cnzvmatiquc des dcux dodccameres a ete suivie par CLHP. Nous avons pu tracer la courbc de digestion enzym~que de B(SrT)dTI I
en fonction du tcmps: A = Ao c-kt (Figure 2. A) où:
-~o cst l'aire ~lùtiale du 12-mèr -.~ est l`aire du 12-mer à l'instant t -t est le temps 15 -k est la constante de ~itesse de prcmier ortre de la dcgr~ aon Cctte courbe (Figurc 2) nous pennet dc calcul, en utilisant le lo~iciel de re~resslon c~iligne EUREKA. k = 0.016min-1 et le temps dc demi-~ie du dodecamere tl - = In '.k =
~3 min De la meme fa~on, la courbe de digestion enzymatique de BdTI~ en fcnction du temps .'~ =
Ao e-kt a pu etre tracce. (Figure 2). On constatc que la cinetique de de~radation de BdTI~
est beaucoup plus rapide que celle de B(SrT)dT l l; en effel le temps de demi-vie s ctablit a I ~ute pour le dodecamèrc nan rel.
Ls cinétique de d~gradDtion enrym~tique de l'ol;gomére modifi~ B(SrT)dTl 1 par S 1' extremi~ 5' pre~ente un temp~ de demi-vie nenement ~uperieur à celui de la degrqdation du I~SrU~2. Ca re~ultat~ mon~rent que l'introduction d'une unite thio-ribomlcleo~idique ~ I'c~trémit~ 5' d'un oligomère stabili~ ce dernier vis 9 vis de 1 pho~phod;e~ter~e de r~te de ve~u.
lune solution d'oligonucleotide (20 ,ul. 3 unites d'absorb~mce à 260 nm) est diluee dans un 30 tampon Acetate d'ammoniusn O.I~S M (pH 7.0), d'EDTA 2.5mM et de Tween 80 0.06 ~5o (80 ~lL). Orl ajoute unc solution co~T~ncrciale de phosphodiesterase de rate de ~eau ~
conccn~ta~on finale 0.008 t~utciml) et le mel~nge est tncu~e à 37C .~ dcs tcmpsdetcrmines. des ~actions aliquotes sont ptelcvees (5 ~ chauffees à 100C pendant une ~unu~è a analvsces par CLHP.
Condll~ons d'analyse CLHP.
Les analyses ont ésc cffectuccs sur une colonDe PVDI ( Poly~inylimidazole SFCC-Shandoo) ptotégcc par une précolonne et un prcfiltrc~ L'elu~ion est re lisee selon un ~adlent llnealre FEUILLE D~ REt~APLAC`EMEN~
ISAIEP
WO 93/16095 ~ PCl'/FR93/00115 en 20 minutes de 01 M à 0~4 M KCI dans 20 mM KH2P04 à pH 6 contenant 2Wo d'acetonitrile Le debit était fixe à I mlfllun et la detec~ion U V à 260 mn EXEMPLE 11 Etude da acti~ites de type substnt dn hes-mèra 4'-Sr~6~ 4'-SrlJ6-3'n-prOH eompantivement au~ c~rsctèrff substr-ts de~ hes~mèra ~rU6 et arlJ6 vis-S i vis de différenles nucléas purifiees.
Qua~e nucleases typiques ont éte uilisees - L'endonuclease Sl~ specifiQue du simple brin d'AD~I hydrolyse les liaisons phosp~otiesters de façon alea~oire 10 ~ La phosphodiesterase de rate de veau (CSP) est une 5'-exonuclease qui deE~ade les oligonucleoides à parar de Ieur extremite S' et libere des nucleotides 3'-phosphates - Ea phospbodiesterase te venin de se~pent (VSP) est une 3` exonuclease-3' q u libere des nucleondes S'-phospbate après avoir tegrade l'oligomère par son exlretnite 3' - La ribonuclease A degrade un oligoribonucleoide ap~ès les residus pvri~udiquesCes quatre enz~nnes on~ ete obtenus aupres de BoehriDg MaDnheim De f*on gener~le uDe unite de densite optique à 260 Dm de cba4ue bexamere est ~us en presence d'uDe certaine concentration t'eDzyme co~sideree puis est diluee en quann~e suffisante pour 1000,ul te tampon te digestion enzym~ique Differents tampons de digestioD ODt ete utilises en fonction de la nature de l'enz~ne ~Tableau 9 ) Concentration finale en I Tampon de digesnon Enzy~sle enz~nne (unites d'activite enzyma~ique enz~nanaue I ml) _~ ~ I EDTA 0 025 n~l CSP 13 10~3 pH 7 AcONHd 0 12S nL~1 _ _ ITris HCI01~;
VSP 6 10-4 pH = 9~4 ~ i MgCl~ O 01 ~1 Sl 20 NaCl 0.3 M pH ~ 7 AcZn O~
_ ~aCl 300mM
RNAse A 2. lo-2 Tns~ HCI lO mM pH 7 EDTA 5 n~1 .
Tableau 9 Co~ centranons en enzy~ne et t~lpODS de di~estion utiliscs L'echantillon mère est di~nse en 10 ~u~ons dc 100 ~ v~t d'e~e con~elc à -18~C
Une fi~on sliquote de 100 ~11 est prele~ree e~ incubèc i rttuve sèche thennostatee a; ^C
~ ~ pend nt untanPstp~ n uulyseep-r CLHP ~LEUeDE R~EMPLAc`EMEN-i Wo 93/1609~ pcr/FR93/ooll5 . ~ ~, . , ., .~
7o L'etudc de l'aire du si~nal colTespondant a l~examere pe~nct de mesurcr une cmctlquc de de~radanon dont le tcmps dc demi-~ie CSt calcule (Tableau 10) .
Tcmps de de~-vle (mm) ~iuclcases ! arU~ ~rU6 1 ~Sr(,'~, ûSr~'6 3'(CH2)30H
.
5'-exonuclease Phosphodicsterase de ratc dc vcau _ I3900 3'-exonucleasc Phosphodiestertse dc venin de serpent 110 I _ 76 _ ~S0 Endonucleasc Sl ~ 120930 . _ 10Ri~onucleasc A ~ <1670 _. __ _ , _ .
Aucunc dcgrads~on observee après 4 jours d'incubaisn Tablcaul 0: DéEradanons cnzyman4ues.
L~cxamère 4'-SrU6. 2 p*sente urle 8rande *sistance cDzyma~que cornparee à cclle du ,B
15 rU6 ~s à ~is de q~tre nucleases (CSP. S 1, RN~se-A et VSP).
La rcsistance à la 3' exonucléase est fortement augmente~ pu l'ultroduction d'une halson phosphotiest prop~nol sur l'c~te 3' du 4'-SrU6 3'n-prOH, 3.
CONCLl iSION
Les enldes ont montre quc:
a) les 4'-thio-oligosi~onucléoodes homogencs ou n~ixtes, sc lient avec unc bonne s~ablllte thc~mo~amique ~vcc un ARN complcmcntsirc.
~5 b) la subs~ on dc l'oxygcne eyclique par un atome dc sou~e intuit unc forte reslstancc a la dé~datio~ ~que ( cf. Ia comp~saison tes ~cmps de dem~e-vie dc B-rU6 et I~S-r~s ) L'enscmblc te ces do~ees implique quc les 4'-thio-oligon~onucleotidcs peu~ ent è~e 30 considcr~s comme ~gcnts an~sens sous fonne de sequences homogèncs ou mclus dans des oli~omeres n~ixtes. De phls. la prescncc de la fonction hydroxyle en 2' pennet d'en~1saser leur ualisa~on comme nbozymes ar~ficiels que cc soi~ sous formc dc sequences bomoccnes ou ~s associecs i dcs oli~onucleondes de rypc di~ers AD~J ou AR~ modlfics ou non au nive~u dc l'c~cbainement pbosphue.
~EUILLE DE REMPLACEMENT
Claims (24)
1. Composés chimiques constitués par un oligo-4'-thio-2'déso-xyribonucléotide ou un oligo 4'-thioribonucléotide, caractérisés en ce qu'ils comportent un enchaînement de 4'-thio-2'désoxyribonucléotides ou 4'-thioribonucléotides respectivement, enchaînement pouvant être facul-tativement lié à un agent effecteur, notamment un radical correspondant à
un agent d'intercalation ou un radical chimique ou photoactivable, tel qu'un radical porteur d'une fonction réagissant directement ou indirectement avec les chaînes de nucléotides ou un radical dont la présence permet une détection facile et sensible.
un agent d'intercalation ou un radical chimique ou photoactivable, tel qu'un radical porteur d'une fonction réagissant directement ou indirectement avec les chaînes de nucléotides ou un radical dont la présence permet une détection facile et sensible.
2. Composés chimiques selon la revendication 1 constitués par un oligo 4'-thioribonucléotide ou un oligo 4'-thio-2'-désoxyribonucléotide, caractérisés en ce qu'ils comportent un enchaînement de 4-thioribonu-cléotides ou 4-thio-2'-déoxyribonucléotides respectivement non lié à un radical effecteur.
3. Composés selon la revendication 1 ou 2 caractérisés en ce qu'ils ont pour formule:
(I ) dans laquelle :
les radicaux B peuvent être identiques ou différents et représentent chacun une base d'un acide nucléique éventuellement modifiée, activable et/ou comportant un groupement intercalant et rattachée au cycle glycosidique selon une configuration anomérique alpha non naturelle ;
les radicaux X peuvent être identiques ou différentes et représentent chacun un oxoanion O -, un thioanion S -, un groupe alkyle, un groupe alcoxy, un groupe thioalkyle, un radical alkyle ou alcoxy substitué par un hétérocycle azoté ou un groupement -Y-Z ;
R et R', qui peuvent être identiques ou différents, représen-tent chacun un atome d'hydrogène ou un groupement -Y-Z ou Y'-Z' ;
Y et Y' identiques ou différents représentent chacun un radical alcoylène droit ou ramifié -alk- ou un radical cholsi parm , , , , , alk-O-alk , et avec U = O, S ou N
E peut avoir les mêmes significations que X excepté Y-Z ou Y'-Z' ;
J représente un atome d'hydrogène ou un groupe hydroxy :
Z et Z', identiques ou différents, représentent chacun OH ou un radical correspondant à un agent effecteur, notamment un radical correspondant à un agent d'intercalation ou un radical porteur d'u ne fonction qui réagit directement ou indirectement avec les chaînes de nucléotides ou un radical dont la présence permet une détection facile et sensible.
n est un nombre entier y compris 0 ;
L représente un atome d'oxygène, un atome de soufre ou un groupe -NH-.
(I ) dans laquelle :
les radicaux B peuvent être identiques ou différents et représentent chacun une base d'un acide nucléique éventuellement modifiée, activable et/ou comportant un groupement intercalant et rattachée au cycle glycosidique selon une configuration anomérique alpha non naturelle ;
les radicaux X peuvent être identiques ou différentes et représentent chacun un oxoanion O -, un thioanion S -, un groupe alkyle, un groupe alcoxy, un groupe thioalkyle, un radical alkyle ou alcoxy substitué par un hétérocycle azoté ou un groupement -Y-Z ;
R et R', qui peuvent être identiques ou différents, représen-tent chacun un atome d'hydrogène ou un groupement -Y-Z ou Y'-Z' ;
Y et Y' identiques ou différents représentent chacun un radical alcoylène droit ou ramifié -alk- ou un radical cholsi parm , , , , , alk-O-alk , et avec U = O, S ou N
E peut avoir les mêmes significations que X excepté Y-Z ou Y'-Z' ;
J représente un atome d'hydrogène ou un groupe hydroxy :
Z et Z', identiques ou différents, représentent chacun OH ou un radical correspondant à un agent effecteur, notamment un radical correspondant à un agent d'intercalation ou un radical porteur d'u ne fonction qui réagit directement ou indirectement avec les chaînes de nucléotides ou un radical dont la présence permet une détection facile et sensible.
n est un nombre entier y compris 0 ;
L représente un atome d'oxygène, un atome de soufre ou un groupe -NH-.
4. Composés selon la revendication 3, caractérisés en ce que Y
et Y' représentent un radical choisi parmi , , , , avec U = O, S ou N et n' est un nombre entier notamment de 1 à 10.
et Y' représentent un radical choisi parmi , , , , avec U = O, S ou N et n' est un nombre entier notamment de 1 à 10.
5. Composés selon la revendication 3 caractérisés en ce que L
représente l'oxygène, R et R' représentent un atome d'hydrogène et B
représente une base nucléique naturelle.
représente l'oxygène, R et R' représentent un atome d'hydrogène et B
représente une base nucléique naturelle.
6. Composés selon l'une des revendications 3 à 5, caractérisés en ce que l'agent d'intercalation Z ou Z' est choisi parmi les composés polycycliques ayant une configuration plane.
7. Composés selon la revendication 6 caractérises en ce que l'agent d'intercalation Z ou Z' est choisi parmi l'acridine et ses dérivés, la furocoumarine et ses dérivés, la daunomycine et les autres dérivés de l'anthracycline, la 1,10-phénanthroline, la phénanthridine et ses dérives, la proflavine, les porphyrines, les dérivés du dipyrido [1,2-a:3'-d] imidazole, l'ellipticine ou l'ellipticinium et leurs dérivés et le diazapyrène et des dérivés.
8. Composés selon l'une des revendications 3 à 5, caractérisés en ce que les groupes chimiques réactifs Z ou Z' sont choisis parmi l'acide éthylène-diamine-tétraacétique, l'acide diéthylènetriaminepentaacétique, les porphyrines, la 1,10-phénanthrolince, l'azido-4 acétophénone, l'éthylène-imine, la bèta-chloroéthylamine, le psoralène et leurs dérivés.
9. Composés selon l'une des revendications 3 à 8, caractérisés en cc que le radical B est un radical correspondant à la thymine, l'adénine;
la 2-aminoadénine et ses dérivés substitués, la cytosine, la guanine et ses dérives substitués, l'uracile, le bromo-5 uracile, l'azido-8 adénine, la 7-déazaadénine, la 7-déazaguanine, la 4-azido-cytosine, la 4-azido-thymine et les dérivés de ces bases comportant un groupement intercalant et/ou un groupement chimiquement ou photochimiquement activable.
la 2-aminoadénine et ses dérivés substitués, la cytosine, la guanine et ses dérives substitués, l'uracile, le bromo-5 uracile, l'azido-8 adénine, la 7-déazaadénine, la 7-déazaguanine, la 4-azido-cytosine, la 4-azido-thymine et les dérivés de ces bases comportant un groupement intercalant et/ou un groupement chimiquement ou photochimiquement activable.
10. Composés selon l'une des revendications 1 à 9, caractérisés en ce qu'il s'agit de composés oligothioribonucléotides de formule I pour lesquels J = OH.
11. Composés oligomères mixtes caractérisés en ce que ils sont constitués par des composés selon l'une des revendications 1 à 10 liés à des oligonucléotides de type ADN ou ARN modifiés ou non au niveau de l'enchaînement phosphate et dans lesquels l'hétéroatome intracyclique du cycle furannose des nucléotides est l'oxygène.
12. Composés oligomères mixtes caractérisés en ce que ils sont constitués par un compose selon l'une des revendications 1 à 10, notamment de formule (1), comprenant, à une ou à chacune de ses extrémités, une séquence oligonucléotidique de type ADN ou ARN modifiée ou non au niveau de l'enchaînement phosphate, dans lequel l'hétéroatome du cycle furannose des nucléotides est l'oxygène.
13. Composés oligomères mixtes selon la revendication 12 caractérisés en ce que ils sont constitués par un composé oligothioribo-nucléotidique selon l'une des revendications 1 à 10, comprenant une séquence de type ADN modifiée ou non au niveau de l'enchaînement phosphate dans les nucléotides de laquelle l'hétéroatome du cycle furannose des nucléotides est l'oxygène.
14. Compose oligomère mixte selon la revendication 13, caractérisé en ce que ladite séquence d'ADN, dans laquelle l'hétéroatome du cycle furannose est l'oxygène, est encadré par deux séquences du type thioribonucléotidique.
15. Procédé de preparatlon de composés selon l'une des revendications 1 à 13, caractérisé en ce qu'on applique des synthèses au phosphodiester, phosphotriester, phosphoramidite ou hydrogénophosphonate en utilisant des 4thionucléosides pour des séquences oligothionucléoti-diques et en ce que l'on prépare les dérivés totalement protégés et que l'on élimine les groupements protecteurs.
16. Procédé de synthèse des composés sans agent effecteur selon l'une des revendications 2 à 13, caractérisé en ce que, pour préparer les séquences oligothionucléotidiques, on réalise une synthèse supportée selon la méthode au phospohoroamidite comportant - une protection en 3' et 5' des 4'thionucléotides ou oligo-4'thionucléotides de départ avec par exemple du diméthoxytrityl en 5' et du diisopropyla-minophosphoramidite de méthyle en 3', - la fonctionnalisation d'un support solide incorporant un dérivé 4'thio-nucléosidique par un lien par exemple succinyle entre le groupement hydroxyle-3' du dérivé 4'thionucléosidique et un groupement amino du support solide, - l'élongation de la chaîne oligothionucléotidique dans un réacteur synthétiseur, - enfin le décrochage, la déprotection et la purification de l'oligothio-nucléotide prolongé.
17. Procédé de synthèse de composés incorporant un agent effecteur selon l'une des revendications 3 à 10, caractérisé en ce que l'on part d'un oligothionucléotide sans agent effecteur, ou oligomère mixte en comprenant, protégé en 5', dont on fait réagir la terminaison OH 3' avec une fonction non protégée d'un bras difonctionnel dont la deuxième fonction est protégée et après déprotection du produit résultant, on lie ledit produit à l'agent effecteur par la deuxième fonction libre du bras difonctionnel.
18. Application des composés selon l'une des revendications 1 à 13, caractérisée en ce que lesdits composés sont utilisés à titre de sondes d'hybridation ou comme composants de purification pour des séquences déterminées d'ADN ou d'ARN en simple brin ou en double hélice dans un but diagnostique ou pronostique.
19. Application des composés selon l'une des revendications 1 à 13, caractérisée en ce que les composés sont utilisés pour détecter des mutations au niveau d'un ADN ou d'un ARN.
20. Application des composés selon l'une des revendications 1 à 13, caractérisée en ce que ces composés sont utilisés pour réaliser le blocage spécifique de gènes cellulaires ou d'agents pathogènes préalable-ment choisis, tels que des virus, bactéries ou des parasites.
21. Application d'un dérivé selon l'une des revendications 1 a 13 pour bloquer sélectivement l'expression d'un gène soit par hybridation, soit par coupure sélective, soit par modification chimique du gène ou de son ARN messager d'origine cellulaire, virale, bactérienne ou parasitaire.
22. Application d'un dérivé selon l'une des revendications 1 à
13 pour bloquer sélectivement l'expression d'un ARN viral soit par hybridation, soit par coupure, soit par modification chimique de l'ARN viral ou de sont ARN messager.
13 pour bloquer sélectivement l'expression d'un ARN viral soit par hybridation, soit par coupure, soit par modification chimique de l'ARN viral ou de sont ARN messager.
23. Application des composés selon l'une des revendications 1 à 13, caractérisée en ce qu'ils sont utilisables à titre de nucléases artificielles spécifiques de séquences ou ribozyme artificielle.
24. A titre de médicaments, des composés selon l'une des revendications 1 à 13, utilisables comme antiviraux, antitumoraux, antibiotiques ou antiparasitaires ou dans toute pathologie où un gène est anormalement exprimé soit par mutation, soit par dérégulation.
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