CA2129364A1 - Oligothionucleotides - Google Patents
OligothionucleotidesInfo
- Publication number
- CA2129364A1 CA2129364A1 CA002129364A CA2129364A CA2129364A1 CA 2129364 A1 CA2129364 A1 CA 2129364A1 CA 002129364 A CA002129364 A CA 002129364A CA 2129364 A CA2129364 A CA 2129364A CA 2129364 A1 CA2129364 A1 CA 2129364A1
- Authority
- CA
- Canada
- Prior art keywords
- radical
- compounds
- compounds according
- derivatives
- group
- Prior art date
- Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
- Abandoned
Links
Classifications
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
- C12N15/09—Recombinant DNA-technology
- C12N15/11—DNA or RNA fragments; Modified forms thereof; Non-coding nucleic acids having a biological activity
- C12N15/113—Non-coding nucleic acids modulating the expression of genes, e.g. antisense oligonucleotides; Antisense DNA or RNA; Triplex- forming oligonucleotides; Catalytic nucleic acids, e.g. ribozymes; Nucleic acids used in co-suppression or gene silencing
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
- A61P31/00—Antiinfectives, i.e. antibiotics, antiseptics, chemotherapeutics
- A61P31/04—Antibacterial agents
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
- A61P31/00—Antiinfectives, i.e. antibiotics, antiseptics, chemotherapeutics
- A61P31/12—Antivirals
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
- A61P33/00—Antiparasitic agents
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07H—SUGARS; DERIVATIVES THEREOF; NUCLEOSIDES; NUCLEOTIDES; NUCLEIC ACIDS
- C07H21/00—Compounds containing two or more mononucleotide units having separate phosphate or polyphosphate groups linked by saccharide radicals of nucleoside groups, e.g. nucleic acids
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07H—SUGARS; DERIVATIVES THEREOF; NUCLEOSIDES; NUCLEOTIDES; NUCLEIC ACIDS
- C07H21/00—Compounds containing two or more mononucleotide units having separate phosphate or polyphosphate groups linked by saccharide radicals of nucleoside groups, e.g. nucleic acids
- C07H21/02—Compounds containing two or more mononucleotide units having separate phosphate or polyphosphate groups linked by saccharide radicals of nucleoside groups, e.g. nucleic acids with ribosyl as saccharide radical
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07H—SUGARS; DERIVATIVES THEREOF; NUCLEOSIDES; NUCLEOTIDES; NUCLEIC ACIDS
- C07H21/00—Compounds containing two or more mononucleotide units having separate phosphate or polyphosphate groups linked by saccharide radicals of nucleoside groups, e.g. nucleic acids
- C07H21/04—Compounds containing two or more mononucleotide units having separate phosphate or polyphosphate groups linked by saccharide radicals of nucleoside groups, e.g. nucleic acids with deoxyribosyl as saccharide radical
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
- C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
- C12Q1/68—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving nucleic acids
- C12Q1/6813—Hybridisation assays
- C12Q1/6816—Hybridisation assays characterised by the detection means
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N2310/00—Structure or type of the nucleic acid
- C12N2310/30—Chemical structure
- C12N2310/32—Chemical structure of the sugar
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N2310/00—Structure or type of the nucleic acid
- C12N2310/30—Chemical structure
- C12N2310/32—Chemical structure of the sugar
- C12N2310/322—2'-R Modification
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N2310/00—Structure or type of the nucleic acid
- C12N2310/30—Chemical structure
- C12N2310/33—Chemical structure of the base
- C12N2310/337—Chemical structure of the base in alpha-anomeric form
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N2310/00—Structure or type of the nucleic acid
- C12N2310/30—Chemical structure
- C12N2310/35—Nature of the modification
- C12N2310/353—Nature of the modification linked to the nucleic acid via an atom other than carbon
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N2310/00—Structure or type of the nucleic acid
- C12N2310/30—Chemical structure
- C12N2310/35—Nature of the modification
- C12N2310/353—Nature of the modification linked to the nucleic acid via an atom other than carbon
- C12N2310/3531—Hydrogen
Abstract
2129364 9316095 PCTABS00163 La présente invention a pour objet des composés chimiques constitués par un oligo-4'-thio-2'désoxyribonucléotide ou un oligo-4'-thioribonucléotide alpha ou bêta, caractérisés en ce qu'ils comportent un enchaînement de 4'-thio-2'désoxyribonucléotides ou 4'-thioribonucléotides respectivement, enchaînement pouvant être facultativement lié à un agent effecteur, notamment un radical correspondant à un agent d'intercalation ou un radical chimique ou photoactivable, tel qu'un radical porteur d'une fonction réagissant directement ou indirectement avec les chaînes de nucléotides ou un radical dont la présence permet une détection facile et sensible. Elle a également pour objet des procédés de préparations de ces composés et leurs applications thérapeutiques, diagnostiques ou à titre de réactifs de laboratoire.
Description
i ~ J ~ 9 PCI`/FR93/00115 WO 93/160gS ,~
OLIGOTHIONUCLEOTIDES
La présente invention concerne des composés chlmlques nouveaux, ainsi que leurs applications. Les composés chlmiques selon la présente invention sont des composés ollgonucléotides constltués au molns en partie par un oligo 4'-thlo-ribonucléotide ou un oligo 4'-thio-2'désoxy-ribonucléotide comportant un enchaînement de 4'thionucléotides.
Les composés selon l'invention peuvent présenter la configu-ration anomérique naturelle bêta ou la configuration anomérique non naturelle alpha.
Ainsi sont représentés par les formules (a) et (t,) respecti-vement des 4'-thionucléotldes alpha(a) et bêta(b) 1~ ( S')--O--CH2 (5')--~CH2 (a) ~ (b) O--(3') O--(3') (a) et (b) représenten~ des 4'-thlonucléosldes, il faut rajouter un phosphate en 5' pour obtenir des nucléotldes.
Dans ces conditlons~ de multiples utilisations à finalites biologiques et même pharmacologlques dejà connues pour les oli~onucleo-tides peuvent ~tre envisa~ées et ceci avec plus d'efficacité.
Plus precisément, la présente invention a pour objet des composés chimiques constitues par un oligo4'-thioribonucléotide ou un oligo-4'-thio-2'désoxyribonucleo~ide, caractérisés en ce qu'ils comportent un enchaînement de 4'-thiorlbonucléotides ou 4'-thio-2'désoxyribonucleo-tides respectivemen~, enchaînement pouvant être facultativcment lié à un a~ent effecteur, notamment un radical correspondant à un a~ent PCr/FR93/001 1 5 WO 93/1~095 d'in~ercalatlon ou un radical chimlque ou photoactivable, tel qu~un radical porteur d~une fonctlon réa~lssant direc~ement ou Indirectement avec les chaînes de nucléotides ou un radical dont la présence permet une detectlon facile es sensible.
En particulier, I'inventlon a pour objet les nouveaux dérlvés oligo-4'-thlonucléotides, leur préparatlon et leur emploi notamment comme sondes permettant la détection d'une séquence définie d'acides nuclélques, comme nucléases artificielles spécifiques de séquences d'ADN QU d'ARN ou bien comme agents de blocage sélectif de l'expression d'un gène qu'il solt endogène (par exemple, gène oncogène) ou exogène (par exemple ADN ou ARN de virus, de parasltes ou de bactéries).
Dans les demandes de brevet français FR 8301223 t2 540 122) et FR 84 11 795 (2 568 254) ont été décrits des composés chlmiques constitués par un oligonucléotide ou un oligodésoxynucléotide comportant un enchaînement de nucléotides naturels ou modifiés, c'est-à-dire des bêta-nucleotides, sur lesquel se trouve fixé par une liaison covalente au moins un groupe intercalant, qui possèdent la propriété de bloquer sélectivement l'expression d'un gène et qui, de ce fait, sont partlculière-ment utiles en thérapeutique comme substances antivirales, antibiotiques, antiparasitaires ou antitumorales.
Dans la demande internationale PCT WO 831014SI, a été
décrite une méthode pour bloquer la traduction de l'ARN messager (ARNm) en protéine par hybridation de l'ARNm avec un oligonucléotide ayant la séquence complémen~aire de l'ARNm, l'oligonucléotide étant stabilise sous
OLIGOTHIONUCLEOTIDES
La présente invention concerne des composés chlmlques nouveaux, ainsi que leurs applications. Les composés chlmiques selon la présente invention sont des composés ollgonucléotides constltués au molns en partie par un oligo 4'-thlo-ribonucléotide ou un oligo 4'-thio-2'désoxy-ribonucléotide comportant un enchaînement de 4'thionucléotides.
Les composés selon l'invention peuvent présenter la configu-ration anomérique naturelle bêta ou la configuration anomérique non naturelle alpha.
Ainsi sont représentés par les formules (a) et (t,) respecti-vement des 4'-thionucléotldes alpha(a) et bêta(b) 1~ ( S')--O--CH2 (5')--~CH2 (a) ~ (b) O--(3') O--(3') (a) et (b) représenten~ des 4'-thlonucléosldes, il faut rajouter un phosphate en 5' pour obtenir des nucléotldes.
Dans ces conditlons~ de multiples utilisations à finalites biologiques et même pharmacologlques dejà connues pour les oli~onucleo-tides peuvent ~tre envisa~ées et ceci avec plus d'efficacité.
Plus precisément, la présente invention a pour objet des composés chimiques constitues par un oligo4'-thioribonucléotide ou un oligo-4'-thio-2'désoxyribonucleo~ide, caractérisés en ce qu'ils comportent un enchaînement de 4'-thiorlbonucléotides ou 4'-thio-2'désoxyribonucleo-tides respectivemen~, enchaînement pouvant être facultativcment lié à un a~ent effecteur, notamment un radical correspondant à un a~ent PCr/FR93/001 1 5 WO 93/1~095 d'in~ercalatlon ou un radical chimlque ou photoactivable, tel qu~un radical porteur d~une fonctlon réa~lssant direc~ement ou Indirectement avec les chaînes de nucléotides ou un radical dont la présence permet une detectlon facile es sensible.
En particulier, I'inventlon a pour objet les nouveaux dérlvés oligo-4'-thlonucléotides, leur préparatlon et leur emploi notamment comme sondes permettant la détection d'une séquence définie d'acides nuclélques, comme nucléases artificielles spécifiques de séquences d'ADN QU d'ARN ou bien comme agents de blocage sélectif de l'expression d'un gène qu'il solt endogène (par exemple, gène oncogène) ou exogène (par exemple ADN ou ARN de virus, de parasltes ou de bactéries).
Dans les demandes de brevet français FR 8301223 t2 540 122) et FR 84 11 795 (2 568 254) ont été décrits des composés chlmiques constitués par un oligonucléotide ou un oligodésoxynucléotide comportant un enchaînement de nucléotides naturels ou modifiés, c'est-à-dire des bêta-nucleotides, sur lesquel se trouve fixé par une liaison covalente au moins un groupe intercalant, qui possèdent la propriété de bloquer sélectivement l'expression d'un gène et qui, de ce fait, sont partlculière-ment utiles en thérapeutique comme substances antivirales, antibiotiques, antiparasitaires ou antitumorales.
Dans la demande internationale PCT WO 831014SI, a été
décrite une méthode pour bloquer la traduction de l'ARN messager (ARNm) en protéine par hybridation de l'ARNm avec un oligonucléotide ayant la séquence complémen~aire de l'ARNm, l'oligonucléotide étant stabilise sous
2 5 f orme phosphotries~er.
Dans la demande internationale WO 88/04301 ont éte décrl~s des oligonucléotides de configuration anomérique alpha présentant des appariements parallèles avec des séquences complémentaires.
La Chimiothérapie par les oligonucléotides antisens concerne des cibles à ARN ou à ADN de tous les organismes vivants (cellules, bactéries, parasites, virus ou oncogènes).
L'utilisation d'oligonucléotides antisens synthetiques ayant la même structure que les acides nucléiques naturels se heurte principalement en milieu biologique à des problèmes de sensibilite aux nucleases et de }5 pénétration cellulaire.
PCl /FR9~/0011 WO 93~1609~
Pour palller ces limltes, des analo~ues ollgonucléotldlques susceptibles d'être plus réslstants vls à vls des nucléases et de mleux pénétrer dans les cellules à travers la membrane cytoplasmique on~ été
synthétisés.
11 a en effet été décrit dans la technique antérleure des dérivés de composés oligonucléotides resistant mieux aux dégradations enzymatiques dont la partle phosphate était modifiée en thiophosphate ou méthylphosphonate notamment. Toutefois ces dérivés présentent une chiralité au niveau du phosphate susceptible de générer des cliastéréolso-mères insslubleS.
La présente Invention fournit une nouvelle classe d'oligo-nucléotides chimères les 4'-thlo-oligonucléotides dans lesquels l'oxygène intrac~clique du cycle furannose a été remplacé par un atome de soufre.
Il a en effet maintenant été trouvé~ et c'est ce qui fait l'objet de la présente inventlon, que la substitution de l'oxygène par un soufre sur la partie sucre des nucléosides plutôt que sur le groupement phosphate d'une part, assure la solubllité des oligomères et, d'autre part, pourrait accro~tre leur pénétration dans la cellule cible, la substitution de l'oxy~ène par l'élément soufre rendant la molécule plus lipophile.
Les dérives de 4'-thionucléotides forment des complexes d'hybridation avec les séquences complémentaires d'ARN beaucoup plus stables que ceùx formés avec l'A~)N et que, vis-à-vis des ARNs, les derlYés de 4'-thionucléoti~es forment des complexes d'hybridation plus stables que les dérives de bêta-nucléotldes naturels.
Parmi les composes, selon la présente Invention, on peut clter plus particulièrement les composes oligomères bêta de formule S
dans laquelle:
WO 93/1609~ PCl /FR93/001 15 les radlcaux ~ peuvent être Identlques ou différents et représentent chacun une base d'un acide nuclélque éventuellement modifiée, activable et/ou comportant un groupement Intercalant;
les radicaux X peuvant être identiques ou différents et représentent chacun un oxoanion O , un thloanion S , un groupe alkyle, un groupe alcoxy, aryloxy, un groupe aminoalkyle, un groupe amlnoalcoxy, un groupe thioalkyle, un radical alkyle ou alcoxy substitué par un hétérocycle a~oté ou un groupement -Y-Z;
!, R et R', qui peuvent être Identiques ou différents, représen-tent chacun un atome d'hydrogène ou un groupement -Y-Z ou Y'-Z';
Y et Y' identlques ou differents représentent chacun un radical alcoylène droit ou ramifié -alk- ou un radical choisi parmi E E E
-C-alk-, -C-NH-alk~ S, 1l-U-alk, -Il~-alk-, alk-O-alk O O O O O
E E
-alk-C-N-alk-, -P-U-alk-X-Cll-alk- et -P-U-aik-C-IN-alk- avec U = O, S ou N
En particuller, Y et Y' représentent un radlcal cholsl parml -(d U~c~n~ t-~ I u}~CH2~n~ C~CH23n~ -C-NH~~CH2~
avec U = O, S ou N
E peut avoir les mêmes slgnifications que X excepte Y-Z ou Y'-Z';
L représente O, S ou -NH-;
n et n' représentent un nombre entier y compris 0;
J représente un atome d'hydrogène ou un groupe hydroxy;
Z et i:', identiques ou différents, représentent chacun OH ou WO 93/16095 ' ~ PCl/FR93/00115 un radical correspondant à un agent effecteur, notamment un radlcal correspondant à un a~ent d'intercalation ou un radlcal porteur d'une fonction qui réaglt directement ou Indirectement avec les chaînes de nucléotides ou un radical dont la présence permet une détectlon faclle et 5 sensible.
Dans cette formule 1, on utilise la représentation condensée des nucléotides sulvante:
SJ
-o ~_ \ .
qui corres~ond à la formule développée:
~5~ 2I~S
\~
J
O ~3 sur laquelle ont été mentionnées les extrémités (3') et (5').
Il convient de remarquer que la formule I représente un enchaînement de 4'-thionucléotldes qui peuvent être identiques ou 25 différents, de configuration D ou L, n indiquan~ simplement le nombre de nucléotides compris dans la molécule; n est de préférence un nombre compris entre 1 et 50, et de préférence encsre entre 1 et 25.
On cite en partlculier les produits pour lesquels L represente I'oxygène; R et R' représen~ent l'hydrogène et a une base nuclelque 30 naturelle, soit adénlne, thymine, cytosine ou guanine quand J = H et adénine, uracile, cytosine et guanlne quand J = OH.
Les agents d'intercalation sont des produits connus dans les techniques relatives aux acides nuclélques; ce sont des composés capables WO 93/16095 pcr/FR93/ool lr ~` ~ Q J~ f` r~ !
,~. ,, ;. ,. ,, J
de "s'lntercaler" dans la structure des ADN ou ~es ARN, c'est-à-dlre capables de s'msérer entre les plateaux de base des acldes nuclelques.
Les agents d'intercalation peuvent êtrê cholsis parml les composés polycycllques ayant une configuratlon plane tels que l'acridlne et 5 ses dérlvés, la furocoumarlne et ses dérivés, la daunomyclne et les autres dérlvés de l'anthracycline, la l,10-phénanthroline, la phénanthrldlne et ses dérlvés, la prsf lavine, les porphyrlnes, les dérivés du dipyrldo [ 1 ,2-a
Dans la demande internationale WO 88/04301 ont éte décrl~s des oligonucléotides de configuration anomérique alpha présentant des appariements parallèles avec des séquences complémentaires.
La Chimiothérapie par les oligonucléotides antisens concerne des cibles à ARN ou à ADN de tous les organismes vivants (cellules, bactéries, parasites, virus ou oncogènes).
L'utilisation d'oligonucléotides antisens synthetiques ayant la même structure que les acides nucléiques naturels se heurte principalement en milieu biologique à des problèmes de sensibilite aux nucleases et de }5 pénétration cellulaire.
PCl /FR9~/0011 WO 93~1609~
Pour palller ces limltes, des analo~ues ollgonucléotldlques susceptibles d'être plus réslstants vls à vls des nucléases et de mleux pénétrer dans les cellules à travers la membrane cytoplasmique on~ été
synthétisés.
11 a en effet été décrit dans la technique antérleure des dérivés de composés oligonucléotides resistant mieux aux dégradations enzymatiques dont la partle phosphate était modifiée en thiophosphate ou méthylphosphonate notamment. Toutefois ces dérivés présentent une chiralité au niveau du phosphate susceptible de générer des cliastéréolso-mères insslubleS.
La présente Invention fournit une nouvelle classe d'oligo-nucléotides chimères les 4'-thlo-oligonucléotides dans lesquels l'oxygène intrac~clique du cycle furannose a été remplacé par un atome de soufre.
Il a en effet maintenant été trouvé~ et c'est ce qui fait l'objet de la présente inventlon, que la substitution de l'oxygène par un soufre sur la partie sucre des nucléosides plutôt que sur le groupement phosphate d'une part, assure la solubllité des oligomères et, d'autre part, pourrait accro~tre leur pénétration dans la cellule cible, la substitution de l'oxy~ène par l'élément soufre rendant la molécule plus lipophile.
Les dérives de 4'-thionucléotides forment des complexes d'hybridation avec les séquences complémentaires d'ARN beaucoup plus stables que ceùx formés avec l'A~)N et que, vis-à-vis des ARNs, les derlYés de 4'-thionucléoti~es forment des complexes d'hybridation plus stables que les dérives de bêta-nucléotldes naturels.
Parmi les composes, selon la présente Invention, on peut clter plus particulièrement les composes oligomères bêta de formule S
dans laquelle:
WO 93/1609~ PCl /FR93/001 15 les radlcaux ~ peuvent être Identlques ou différents et représentent chacun une base d'un acide nuclélque éventuellement modifiée, activable et/ou comportant un groupement Intercalant;
les radicaux X peuvant être identiques ou différents et représentent chacun un oxoanion O , un thloanion S , un groupe alkyle, un groupe alcoxy, aryloxy, un groupe aminoalkyle, un groupe amlnoalcoxy, un groupe thioalkyle, un radical alkyle ou alcoxy substitué par un hétérocycle a~oté ou un groupement -Y-Z;
!, R et R', qui peuvent être Identiques ou différents, représen-tent chacun un atome d'hydrogène ou un groupement -Y-Z ou Y'-Z';
Y et Y' identlques ou differents représentent chacun un radical alcoylène droit ou ramifié -alk- ou un radical choisi parmi E E E
-C-alk-, -C-NH-alk~ S, 1l-U-alk, -Il~-alk-, alk-O-alk O O O O O
E E
-alk-C-N-alk-, -P-U-alk-X-Cll-alk- et -P-U-aik-C-IN-alk- avec U = O, S ou N
En particuller, Y et Y' représentent un radlcal cholsl parml -(d U~c~n~ t-~ I u}~CH2~n~ C~CH23n~ -C-NH~~CH2~
avec U = O, S ou N
E peut avoir les mêmes slgnifications que X excepte Y-Z ou Y'-Z';
L représente O, S ou -NH-;
n et n' représentent un nombre entier y compris 0;
J représente un atome d'hydrogène ou un groupe hydroxy;
Z et i:', identiques ou différents, représentent chacun OH ou WO 93/16095 ' ~ PCl/FR93/00115 un radical correspondant à un agent effecteur, notamment un radlcal correspondant à un a~ent d'intercalation ou un radlcal porteur d'une fonction qui réaglt directement ou Indirectement avec les chaînes de nucléotides ou un radical dont la présence permet une détectlon faclle et 5 sensible.
Dans cette formule 1, on utilise la représentation condensée des nucléotides sulvante:
SJ
-o ~_ \ .
qui corres~ond à la formule développée:
~5~ 2I~S
\~
J
O ~3 sur laquelle ont été mentionnées les extrémités (3') et (5').
Il convient de remarquer que la formule I représente un enchaînement de 4'-thionucléotldes qui peuvent être identiques ou 25 différents, de configuration D ou L, n indiquan~ simplement le nombre de nucléotides compris dans la molécule; n est de préférence un nombre compris entre 1 et 50, et de préférence encsre entre 1 et 25.
On cite en partlculier les produits pour lesquels L represente I'oxygène; R et R' représen~ent l'hydrogène et a une base nuclelque 30 naturelle, soit adénlne, thymine, cytosine ou guanine quand J = H et adénine, uracile, cytosine et guanlne quand J = OH.
Les agents d'intercalation sont des produits connus dans les techniques relatives aux acides nuclélques; ce sont des composés capables WO 93/16095 pcr/FR93/ool lr ~` ~ Q J~ f` r~ !
,~. ,, ;. ,. ,, J
de "s'lntercaler" dans la structure des ADN ou ~es ARN, c'est-à-dlre capables de s'msérer entre les plateaux de base des acldes nuclelques.
Les agents d'intercalation peuvent êtrê cholsis parml les composés polycycllques ayant une configuratlon plane tels que l'acridlne et 5 ses dérlvés, la furocoumarlne et ses dérivés, la daunomyclne et les autres dérlvés de l'anthracycline, la l,10-phénanthroline, la phénanthrldlne et ses dérlvés, la prsf lavine, les porphyrlnes, les dérivés du dipyrldo [ 1 ,2-a
3',2'-d] imidazole, I'ellipticlne ou l'ellipticinium et leurs dérivés et le diazapyrène et ses dérivés.
}_es radlcaux chlmlques réactifs peuvent être des radicaux pouvant réagir directement ou indlrectement avec une chaîne de nucléotides pour former une llaison covalente ou pour la modifier chlmiquement, ou pour la couper. De préférence, ces radicaux chimiques réactifs sont activables, par exemple, par voie chimique, biochimique ou 1 5 photochimique~
Les radicaux réactifs activables peuvent être choisis parml l'acide éthylène-diamine-tetraacétique, I'acide diéthylène-triamlne-pentaacétique, les porphyrlnes, la I, I 0-phénanthroline, I'azido-4 acéto-phénone, l'éthylènc-imine, la bêta-chloroéthylamine, le psoralène et leurs 20 dérivés, et les composés aromatlques absorbant les radiations du proche ultra-violet ou du visible ou pouvant réagir chimiquement avec les constltuants nucléiques.
Plus particulièremens, les radicaux chimiquement actlvables en présence d'ions métalliques, d'oxygène et d'un agent réducteur (aclde 25 éthylène-diamine-tétraacétique, aclde diéthylène-trl-amine-pentaacétlque, porphyrine, phénanthroline) mdulsent la coupure dans des sequences d'acides nucléiques situées dans leur volsinage.
Par irradiation dans le domalne du visible ou du proche ultra-violet, il est possible d'actlver les derivés qui absorbent ces radiatlons30 et de réaliser des reactions de ponta~e ou des reactions photo-induites (coupure et modif ication des bases nucleiques) des acides nucléiques sur lesquels est fixé l'oligothionucléotide porteur du ~roupement acuvable.
PCl`/FR93/001 1 5 ') 93/16095 Parml les radlcaux Z et Z' peuven2 etre plus partlcullèrement c ~ tés:
- les radlcaux dérlvés de l'aclde éthylène-dlamlne-tétra-acét~que de formule: -Il _ C-O-R
~ ,~, N ~_, -NH-C _~ i I
. Il O
O
- les radicaux dérlvés de l'aclde diéthylène-triamine-pentaacétlque, - les radicaux dérivés de la méthylpyrroporphyrine de formule:
CN3 C~3 .. ~ :
C~ ~ C~{
~ O ~ ~JC~ N~ C~Hs -~N~ L=f \~
C~3 C2~S
~5 - les radlcaux derives de la phénanthrollne de formule:
N~
WO 93/16095 PCr/FR93/001 1 ~ 8 - les radlcaux dérlvés de l'acrldlne:
H-tl' c; ~.~J
,, .
- les radicaux dérivés de la proflavlne R représentant un groupement amlno (NH2) ou azldo (N3) - les radicaux dérives de la blotlne -C, ~-c~l2)4 S
Q
- les radicaux dér~vés de l'azldo-4 acétophénone de formule:
'13 ~3,C~2-93/16095 ~ ~ ~ PCr/FR93/0011 Le radlcal ~ peut être, de préférence, choisi parm~ les bases nucléiques naturelles (thymine, adénine, cytosine, guanine, uraclle) mals ll est possible d'utiliser des bases nuclélques modifiées. Peuvent être cltés l'ammo-2 adénine et ses dérivés substltués, par exemple, sur l'atome 5 d'azote N6 par un radical aminoalkylène ou par un radica! azldophényl-alkylène, la guanine substituée sur l'atome d'oxygène o6, par exemple, par - un groupement (w-alkylène)-9-acridine, la (w-aminoalkyl)-amlno-8-adénme et ses dérivés substitués sur le radical amino en w par un groupe acrldlne, ou les dérivés halogénés ou azidés tels que le bromo-5 uracile, l'azido-8 10 adénine, la 7-déazaadénine, la 7-déazaguanine. Il est possible également d'utiliser des dérivés des bases nucléiques comportant un groupement Intercalant ou un groupement chimiquement ou photochlmlquement actlvable. `
Ainsi, la f onctlonnalisation de C ou T par un groupement 15 azlridine en position 4 conduit à la formation de pontages covalents CH2-CH2 entre les deux brins complémentalres sur respectivement G e~ A.
Donc, plus particulièrement, le radical B est alors choisi parml la
}_es radlcaux chlmlques réactifs peuvent être des radicaux pouvant réagir directement ou indlrectement avec une chaîne de nucléotides pour former une llaison covalente ou pour la modifier chlmiquement, ou pour la couper. De préférence, ces radicaux chimiques réactifs sont activables, par exemple, par voie chimique, biochimique ou 1 5 photochimique~
Les radicaux réactifs activables peuvent être choisis parml l'acide éthylène-diamine-tetraacétique, I'acide diéthylène-triamlne-pentaacétique, les porphyrlnes, la I, I 0-phénanthroline, I'azido-4 acéto-phénone, l'éthylènc-imine, la bêta-chloroéthylamine, le psoralène et leurs 20 dérivés, et les composés aromatlques absorbant les radiations du proche ultra-violet ou du visible ou pouvant réagir chimiquement avec les constltuants nucléiques.
Plus particulièremens, les radicaux chimiquement actlvables en présence d'ions métalliques, d'oxygène et d'un agent réducteur (aclde 25 éthylène-diamine-tétraacétique, aclde diéthylène-trl-amine-pentaacétlque, porphyrine, phénanthroline) mdulsent la coupure dans des sequences d'acides nucléiques situées dans leur volsinage.
Par irradiation dans le domalne du visible ou du proche ultra-violet, il est possible d'actlver les derivés qui absorbent ces radiatlons30 et de réaliser des reactions de ponta~e ou des reactions photo-induites (coupure et modif ication des bases nucleiques) des acides nucléiques sur lesquels est fixé l'oligothionucléotide porteur du ~roupement acuvable.
PCl`/FR93/001 1 5 ') 93/16095 Parml les radlcaux Z et Z' peuven2 etre plus partlcullèrement c ~ tés:
- les radlcaux dérlvés de l'aclde éthylène-dlamlne-tétra-acét~que de formule: -Il _ C-O-R
~ ,~, N ~_, -NH-C _~ i I
. Il O
O
- les radicaux dérlvés de l'aclde diéthylène-triamine-pentaacétlque, - les radicaux dérivés de la méthylpyrroporphyrine de formule:
CN3 C~3 .. ~ :
C~ ~ C~{
~ O ~ ~JC~ N~ C~Hs -~N~ L=f \~
C~3 C2~S
~5 - les radlcaux derives de la phénanthrollne de formule:
N~
WO 93/16095 PCr/FR93/001 1 ~ 8 - les radlcaux dérlvés de l'acrldlne:
H-tl' c; ~.~J
,, .
- les radicaux dérivés de la proflavlne R représentant un groupement amlno (NH2) ou azldo (N3) - les radicaux dérives de la blotlne -C, ~-c~l2)4 S
Q
- les radicaux dér~vés de l'azldo-4 acétophénone de formule:
'13 ~3,C~2-93/16095 ~ ~ ~ PCr/FR93/0011 Le radlcal ~ peut être, de préférence, choisi parm~ les bases nucléiques naturelles (thymine, adénine, cytosine, guanine, uraclle) mals ll est possible d'utiliser des bases nuclélques modifiées. Peuvent être cltés l'ammo-2 adénine et ses dérivés substltués, par exemple, sur l'atome 5 d'azote N6 par un radical aminoalkylène ou par un radica! azldophényl-alkylène, la guanine substituée sur l'atome d'oxygène o6, par exemple, par - un groupement (w-alkylène)-9-acridine, la (w-aminoalkyl)-amlno-8-adénme et ses dérivés substitués sur le radical amino en w par un groupe acrldlne, ou les dérivés halogénés ou azidés tels que le bromo-5 uracile, l'azido-8 10 adénine, la 7-déazaadénine, la 7-déazaguanine. Il est possible également d'utiliser des dérivés des bases nucléiques comportant un groupement Intercalant ou un groupement chimiquement ou photochlmlquement actlvable. `
Ainsi, la f onctlonnalisation de C ou T par un groupement 15 azlridine en position 4 conduit à la formation de pontages covalents CH2-CH2 entre les deux brins complémentalres sur respectivement G e~ A.
Donc, plus particulièrement, le radical B est alors choisi parml la
4-azldo-cytosinc ou la 4-azldo-thymlne.
De préférence, le radical X représente un oxoamon.
20 Cependant, le radical X peut représenter un radlcal alkyle contenant 1 à 7 atomes de carbone ~méthyle, éthyle, propyle), un radical alcoxy dont la partle alkyle con~ient 1 à 7 atomes de carbone (méthoxy, éthoxy, diméthyl-2,2 propyloxy), un radical aminoalkyle ou aminoalcoxy de formule générale RlR2N-alk-A- dans laquelle A représente une liaison ou un atome 25 d'oxy~sène, -alk- représente un radlcal alkylene contenant 1 à 10 atomes de carbonc et R î et R2, identlques ou dlfférents, reprcsentent un atome d'hydrogène ou un radical alkyle contenant I à 7 atomes de carbone ou forment ensemble avec l'atome d'azote auquel ils sont lies un héterocycle azoté saturé à S ou 6 chaînons, étant entendu que le groupemcns RIR~-30 peut être quaternarisé, ou un radical alcoylthio dont la partle alcoylecont~ent 1 à 7 atomes de carbone.
Dans la formule (1), le radical -alk- est de préférence un radical alcoylène droit ou ramifié ayant de 1 à 10 atomes de carbone.
De préférence, le radical X représente un oxoamon.
20 Cependant, le radical X peut représenter un radlcal alkyle contenant 1 à 7 atomes de carbone ~méthyle, éthyle, propyle), un radical alcoxy dont la partle alkyle con~ient 1 à 7 atomes de carbone (méthoxy, éthoxy, diméthyl-2,2 propyloxy), un radical aminoalkyle ou aminoalcoxy de formule générale RlR2N-alk-A- dans laquelle A représente une liaison ou un atome 25 d'oxy~sène, -alk- représente un radlcal alkylene contenant 1 à 10 atomes de carbonc et R î et R2, identlques ou dlfférents, reprcsentent un atome d'hydrogène ou un radical alkyle contenant I à 7 atomes de carbone ou forment ensemble avec l'atome d'azote auquel ils sont lies un héterocycle azoté saturé à S ou 6 chaînons, étant entendu que le groupemcns RIR~-30 peut être quaternarisé, ou un radical alcoylthio dont la partle alcoylecont~ent 1 à 7 atomes de carbone.
Dans la formule (1), le radical -alk- est de préférence un radical alcoylène droit ou ramifié ayant de 1 à 10 atomes de carbone.
5 PCl/FR93/0011' I O
En partlculier, à partlr des fonctlons alcool termmales 3~ ou 5~
de l'oligothionucléotlde, I'effec~eur 7. peut donc être lntrodult v la une chaîne (CH2)n liée à une fonctlonnalisatlon Z', de natures dlverses à la partie osidique de l'ol~gomère.
A partlr de la formule suivante:
ou -O-Z I -(CH2) -effecteur ~Z) 5~ , 1 0 on obtlendra, selon ce que représente Z l, par exemple - un phosphate ou méthyl phosphonate de formule gu - 0~ P ~ U ~(C~ ,2 ou C~l, U = O, N ou S
- un éther de formule générale o~ CHI ~ C~ J'~ ,Z
- un ester de formule générale:
-O ~ CO t~ C~ ~ t~
ou encore 30 - un carbamate de formule générale:
-O ~ CO NH t-t C~l '~nZ
3 5 En général, n' est comprls entre I et 10.
WO 93/16095 ~ P~/FR93/00115 La présente Inventlon concerne également les composes précédents sous forme de sel avec des bases ou des acldes, et les composés sous forme racémlque, ou sous forme d'isomètres R ou S optiques purifiés ou en mélange, de formule (I).
La présente invention concerne de préférence les composés précédents de formule (I) dans la série D.
On cite en particulier les produits composés D-oligothlonu-cléotide de formule générale:
:~-0 ~5 B
o X/ o ¦ ? -- ~ o ~
~H .
25 dans laquelle J et X sont déflnls cornme précédemment pour les composés de formule (1) et a représente une base nucléique naturelle.
Les oligonucléotldes selon la présente invention peuvent se présenter sous forme de séquences homogènes, comme dans les composés de formule (I) ou sous forme d'ollgomères mixtes, c'est-à-dire sous forme de 30 séquences particulières Incluses dans d'autres types d'oligonucleotldes de type ADN ou ARN, modifiés ou non au niveau de l'encha~nement phosphate, ces derniers corresondant à des composés de formule (1), dans lesquels l'oxygène intracyclique du cycle furannose est rétabli.
WO 93/1609~ PCI /FR93/()0115 - - ~ 1 2 La présente Inventlon a donc éga~ement pour objet des composés oligomères mixtes caractérisés en ce qu'ils sont constltués par des composes oligothionucléotides selon l'invention liés à des oligonucléotldes de type ADN ou ARN. On entend ici par "oligonucléotides de type ADN ou ARN" une séquence d'acides nucléiques de type ADN ou ARN modiflés ou non au nlveau de l'enchaînement phosphate et dans lesquels l'hétéroatome intracyclique du cycle furannose des nucléotides est l'oxygène.
La présente invention a notamment pour objet des composés oligomères mixtes constitués par une séquence oligothionucléotidique selon I'inventiont comprenant une séquence oligonucléotidique de type ADN ou ARN en son sein ou à une de ses extrémités.
Dans un mode de réalisation particulier, donc,- la séquence oligonucléotidique, de type ADN ou ARN, est encadrée par deux séquences d'oligothioribonucléQtides.
Les nouveaux protuits de formule générale (I) ou oligomères mixtes en comportant peuvent être préparés par voie chimique par des procédés connus et, en particuliert ceux qui sont décrits dans les demandes de procédés connus et, en particulier, ceux qui sont décrits dans les demandes de brevets français FR 8301223 (2 540 122) et FR 8411795 ~2 568 254), WO 88/04301 et FR 88 122648.
Les composés oligothionucléotides notamment de formule (I) peuvent être préparés par voie chimique par des procédés dans lesquels on appllque des synthèses au phosphodiester, au phospho~riester, au phospho-ramidite ou à l'hydrogenophosphonate classiques pour des oli~onucléotldes.
Dans ces procédes, on prépare tout d'abord la chaîne de 4'-thionucléotides, les différents groupements non mis en oeuvre étant protégés, puis on élimine enfin les groupements protecteurs pour obtenlr les produits recherchés.
On cite en partlculier un procédé de synthèse de composes oligothionucléotides selon l'invention sans a8ent effecteur, caractérlse en ce que on réalise une synthèse supportée selon la methode au phospho-roamidite comportant - une protection en 3' et 5' des 4'-thionucléotides ou oligo4'-thionucleo-tides de départ avec par exemple du diméthoxytrityl en 5' et du diisopropylaminophosphoramidite de méthyle en 3', WO 93/1609~
- la fonctlonnallsatlon d'un support sollde lncorporant un dérlvé 4'-thlo-nucléosidique par un lien par exemple succlnyle entre le groupement hydroxyle-3' du dérlvé 4'-thionucléosidique et un ~roupement arnlno du support solide, - l'élongation de la chaîne oligothionucléotldlque dans un réacteur synthétiseur, - enfin le décrochage, la déprotection et la purification de l'oligothlonu-cléotide prolon~é.
On cite également un procédé de synthèse de composés oligothionucléotides Incorporant un agent effecteur selon l'invention caractérisé en ce que l'on part d'un oligothionucléotide sans agent effecteur, ou d'un oligomère mixte en comprenant, protégé en 5', dont on fait réagir la terminalson OH 3' avec une fonction non protégée d'un bras difonctionnel dont I deuxième fonction est protégée et après déprotection I S du produit résultant, on lie ledit produit à l'a~ent effecteur par la deuxième fonction libre du bras difonctionnel.
La terminalson OH 3' de l'oligomère protégé en 5' peut être estérifiée avec un acide amlnohexanolque, dont la fonction amlne est protégée.
Un procédé de préparation en phase solide de séquences oligothionucléotides selon la méthode au phosphoramidite, objet dela présente invention, comporte les étapes essentielles suivantes:
- On immoblllse un dérivé 4'-thionucléoside protégé par l'intermédlalre d'une de ses fonctions hydroxyle en 3' ou, le cas échéant, 2' sur un support solide.
- On assemble sur ce support dans un réacteur synthétlseur manuel ou 3utomatique la chaîne d'oligothionucleotlde protégée par condensation de monomères constltues de 4'-thionucleosldes protégés substitués par des groupes phosphoraml~ltes en 3', le cas échéant, la fonctlon hydroxyle en 2' des riboses étant protégée par les groupes Ctmp ou TE~D lS.
- Les oligothlonucleotldes sont obtenus après décrochage de l'oligomère obtenu du support et éiimination des groupes protecteurs.
PCl`/FR93/001 1 5 ~ ~, ~ c - 1 4 De façon approprlée, I'assemblage de l'ollgothlonucléotlde se fait par condensation, en présence d'un agent activateur, desdlts monomères entre leur fonction en 3' et la fonctlon 5' du composé
4'-thionucléoside immobll~sé pour le premler monomère ou d'un composé
intermédiaire polythionucléotlde protégé fixé sur ledlt composé thlonu-cléoside immobilisé pour les monomères sulvants.
Notamment, I'agent actlvateur pour la condensation desdlts monomères peut être choisi parmi le tétrazole et ses dérivés, tels que le para-nltrophényl tétrazole.
Avantageusement, le groupe phosphoramidite en 3' desdits monomères est un groupe N,N dlalkylaminophosphoramidite de formule /N(RI)2 -P
avec R 1 qui représente un alkyle en C 1 à C7 éventuellement substitué
identique ou différent, tel que CH3, (CH3)2CH.
R2 qui représente un alkyle en Cl à C7 éventuellement substltué, tel que CH3~ CH2CH2CN.
En particulier, le groupe phosphoramidite en 3' desdits monomères est le diisopropylamlnophosphoramidite de méthyl (R 1 =
(CH3)2CH et R2 = CH3) ou le cyano-2 éthyl diisopropylamlnophosphlte (R 1 = (CH 3)2CH et R2 = CH2CH2CN).
De façon approprlée, les groupes hydroxyles desdits mono-2~ mères et dudit composé 4'-thlonucléoside immobilisé peuvent être pro.tégés en 5' par lë groupe DmTr.
Le cornposé 4'thlonucléoside immobilisé peut être fixé sur le support solide via un groupe dlvalent succinyle entre un de ses groupements OH en 2' ou 3' qui se trouve alnsl estérifié, et un groupement amlno du suppor~.
Le support solide peut être constitué par une longue chaîne alkylamine fixee sur un polymère, un gel de silice ou des billes de verre poreuses.
WO 93/16095 , , ~ , PCl/FR93/00115 . J ~J .~
On peut clter comme groupe fonctlonnel permettant la fixation ou étant lié sur support sollde doté d'un groupe amlno, le ~roupe de formule -C-(CH2) pCOR4 avec p - 1 à ~, dans lequel R4 représente H un ~roupe d'activation tel que C6C15 ou un radical NH lié à un support solide tel que le radical NH d'une chaîne 10 alkylamine fixée sur un polymère, gel de silice ou billes de verre poreuses.
Un lntérêt des composés homogènes ou mixte~s selon la présente invention, comprenant une chaîne d'oligo-thio-nucleotides, est aussi de pouvoir envisager leur utilisation indépendamment d'agents effecteurs, notamment d'agents intercalants, puisque ces nouvelles 15 substances oligonucléotides assurent la reconnaisance de ia séquence d'acide nucleique complémentaire, notammen~ d'ARN, avec une stabllité
très accrue; la fonction de l'a~ent intercalant étant d'augmenter la stabilité du complexe d'hybridation, sa présence n'est plus obligatoire.
Les composés selon l'invention, par leur grande afflnl~é
20 spécifique des séquences oligothionucléotidiques pour des séquences nucléiques complémentaires, sont en effet supérieurs aux oligonucléotldes actuels dont l'affinite pour les séquences complémentalres est plus falble.
Les composés~ selon la presente invention, sont donc utilisables de manière plus efficace, à titre de sondes d'hybridation, mals 25 également comme composants de purification pour des séquences dé~erminées d'ADN ou d'ARN.
Ces composés peuvent également etre utiiisés pour détecter des mutatlons au niveau d'un ADN ou d'un ARN de manière plus efflcace.
Les composés de la présente inventlon, par la proprlé~é des 30 séquences oli~othionucléotidiques de se fixer fortement sur la séquence nucléique complémentaire, puis d'induire la coupure de la chaîne d'acldes nucléiques en ce site, notamment lorsqu'ils sont couplés à un agent de coupure, sont utilisables à titrc de nucléases artificielles spéc~fiques de séquences. Ils peuvcr-t ~tre utilisés comme réactifs en biologie moléculalre 3~ ou en 8énie génétique.
~ a présence de la fonctlon hydroxyle en 2', le cas échéant, permet en outre d'envisager leur utilisation comme ribozymes artlficiels, que ce soit sous forme de séquences oli~othioribonucléotidiques homo~ènes ou mixtes~ c'est-à-dire associées à des oligonucléotides de type ADN ou 5 ARN.
L'objet de la présente invention est également l'application des composés selon l'invention pour réaliser le blocage spécifique des gènes cellulaires ou d'agents pathogènes préalablement choisis (virus, bactéries, parasites).
l 0 Les composés selon l'invention sont donc aussi utilisables à
titre de rnédicaments.
Les nouveaux produits de formule générale (I) selon l'invention et les prodults de formule générale (1~ dans laquelle L
représente un atome d'oxygène, R et R' représentent chacun un atome l 5 d'hydrogène et B représente une base nucléique naturelle forment des complexes d'hybridation avec les séquences complémentaires d'ARN
beaucoup plus stables que ceux qui sont formés avec l'ADN.
En particulier, les produits de formule (I) dans lesquels J = OH
(oligothioribonucléotides) s'apparient de manière plus stable avec des séquences d'ARN complémentaires que les produits de formule (I) dans lesquels J = H (oligothiodésoxyribonucléolides).
Compte tenu du falt que les cibles des molécules anti-sens en ~hérapies sont les gènes ARN messagers, cette propriété des oll~othio-ribonucléotides est tout à fai~ intéressante.
Cette différence de stabilité des complexes d'hybrldatlon permet une inhibition préférentlelle des ARNs messagers et des ARNs viraux sans risque important de provoquer des effets indésirables au nlveau de l'ADN du génome.
De plus, vis-à-vls des ARNs, les produits selon l'inventlon 3~ forment généralemcnt des cornplexes plus stables que ceux qui sont obtenus à partir des oligonucléotides naturels.
Les composés oligothioribonucléotides selon l'inventlon, notamment de formule (I) (J = OH), présentcnt en outre un certain nombre de caractéris~iques intéressantes, notamment pour une application comme 3S agent antisens:
WO 93/16095 PCI`/FR93/00115 - la confiE~uration bêta naturelle est respectée, - ils sont lsoélectriques des ARN naturels, - lls n~ont pas de chiralité au nlveau de la lialson phosphodiester~
- IIS sont plus lipophiles que les analogues naturels à cause de la présence 5 de l'atome de soufre.
Les séquences des ollgothionucléotides, couplés ou non à un agent intercalant ou à un groupement activable chimlquement ou photochimiquement, comportant un enchaînement de nucléosldes pyrlml-diques sont capables de se fixer sur une double hélice d'ADN ou d'ARN
10 comportant une séquence de bases puriques adjacentes associées par lialson hydrogene à la séquence complémentaire des bases pyrimidiques. Cette fixation implique la formation locale d'une trlple hélice dans laquelle les bases oyrimidiques de l'oligothionucléotide forment des liaisons hydrogène (de type Hoogsteen ou Hoogsteen inversé~ avec les bases puriques de la 15 double hélice. Dans ce contcxte, les oligothionucléotides forment des complexes plus stables que les oligonucléotides correspondants et lls permettent d'induire des réactions irréversibles (pontage, modification ou coupure) sur une double hélice d'ARN ou d'ADN.
'~es nouveaux produits de formule générale (I) selon 20 I'invention et les produits de formule générale (I) dans laquelle L
représente un atome d'oxygène, R et R' représentent chacun un atome d'hydrogène et a représente une base nucléique naturelle, qui possèdent la propriété de se fixer fortement sur la séquence nucléique complémentalre, ou oligomères mixtes en comprenant, peuvent être utilisés comme sondes 25 pour detecter la présence d'une chaîne de nucléotides complémentalres.
Cet~e détection est facilitée par la présence d'un groupe fluorescent ou d'un groupe biotine dans ces molécules.
La structure non naturelle des oligothionucléotides confère des propriétés d'antigénicité rendant ainsi possible la preparatlon 30 d~anticorps specifiques dirigés con~re des oligothionucléotides éven~uel-lement couplés à un agent Intercalant ou contre leurs complexes avec un ADN ou un ARN naturels.
Dans un but diagnostique ou pronostique, les oligothlonu-cléotides, éventuellement couplés à un agent intercalant, ou oligommères ~5 mixtes en comprenant, peuvent être attachés de façon covalente à un WO 93J16095 PCr/FR9~/00115 ~ t i~ 1 8 support solide. Le couplage à un marqueur luminescen~ ou générateur d'une réaction colorée, lumlnescente ou fluorescente permet de les utlllser comme sondes de séquences d'ADN ou d'ARN dans un but dia~nostique ou pronostique.
Les oligothionucléotides selon l'lnvention sont beaucoup plus réslstants vis-à-vis des nucléases que les dérivés de nucléosides naturels.
Cette stabilité vis-à-vis de l'hydrolyse enzymatique permet l'utilisation des produits selon l'inventlon, notamment de formule générale (1), ou oligomères mixtes en comprenant, dans des expérlmentations in vivo ou m vitro en présence de nucléases. f)e ce fait, les oligothionucléotides selon l'invention présentent des avantages lncontestables sur les dérivés de bêta-nucléosides déjà connus.
Les composés oligothioribonucléotides de formule (I) pour lesquels J = OH sont plus résitants à la dégradation enzymatiques que les composés oligothiodésoxyribonucléotides de formule I pour lesquels J = H.
Dès lors, comme on l'a vu, un autre objet de la présente invention concerne l'application des nouveaux produits selon l'inventlon, notamment de formule générale (1), et des produits de formule générale (1) dans laquelle L représente un atome d'oxygène, R et R' représentent chacun un atome d'hydro~ène et E~ représente une base nucléique naturelle, en particulier les produits pour lesquels J = OH, ou oligomères mlxtes en comprenant, au blocage spéclfique de glènes cellulalres ou d'agents pathogènes préalablement choisis (virus, bactéries, parasites), en partlculler les ARNm.
Les nouveaux produits selon l'invention, notamment de formule générale (I), et les produits de formule générale (I) dans laquelle L
représente un atome d'oxygène, R et R' representent chacun un atome d'hydrogène et B représente une base nucléique na~urelle, en particuller les produits pour lesquels J = OH, ou oligomères mixtes en comprenant, sont particulièrement utiles comme médicaments permettant de bloquer les gènes indésirables exogènes ~virus, bactéries, paraslte~) ou endogènes (gènes cellulairess oncogènes), en particulier les ARNm. L'expression de ces gènes peut ~tre bloquée en a~ssant soit directement sur l'ADN ou l'ARN
porteur de l'information génétique, soit sur l'ARN messager, copie du gène, WO 93/16095 ~, PC~/FR93/00115 en bloquant alors toute traduc~lon par hybridation ou par hybridatlon pUlS
pontage ou modification ou coupure de l'ARN messager ou vlral chois comme cible.
Ce blocage peut être réallsé en utilisant un produit selon 5 I'lnvention, notamment de formule ~énérale (I), ou un produit de formule ~énérale ~I) dans laquelle L représente un atome d'oxygène, R et R' représentent chacun un atome d'hydrogène et ~ représente une base nucléique naturelle, en particulier les produits pour lesquels J = OH, ou oligomères mixtes en comprenant, dont la séquence est complémentaire de l0 celle d'une région non complexée d'un ARN ou d'un ADN et, en particulier, d'un ARN messager. L'hybridation, suivie ou non du ponta~e, de la modification ou de la coupure de l'ARN messager ou viral, empêche la synthèse de l'ARN ou de la proteine correspondante ou l'expression des fonctions virales ou parasitaires.
Si cet ARN ou cette protéine est vital pour le virus, la bactérie ou le parasite, les produits selon l'invention, notamment de formule générale (I), et les produits de formule générale (I) dans laquelle L
représente un atome d'oxygene, R et R' représentent chacun un atome d'hydrogène et B représente une base nucléique naturelle, en prticulier les 20 produits pour lesquels J = OH, ou oligomères mixtes en comprenant, constitueront des médicaments à activité antivirale, antibactérlenne ou antiparasitaire.
Si cet ARN ou cette protéine n'est pas vital pour l'organisme, il est possible d'en supprlmer sélectlvement les effets. Oans ce cas, les 25 produits selon l'invention, notamment de formule générale (I), et les produits de formule générale (I) dans laquelle L représente un atome d'oxygène, R et R' représentent chacun un atome d'hydrogène et B
représente une base nucléique naturelle, en particulier les prodults pour lesquels J = OH, ou oligomères mlxtes en comprenant, constltueront solt des 30 médicaments à activité antltumorale lorsque le gène visé ou son AR,N
messager code pour une protéine lmpliquée dans la transformatlon cellulaire, soit des médicaments capables de supprimer le caractère de résistance aux antiviraux, aux antibiotiques ou aux antiparasitaires lorsque la protéine codée est responsable de l'inactlvation des antibiotiques, des 35 antiviraux ou des antiparasitaires.
WO 93/16095 P~/FR93/00115 Des effets cytotoxiques spécifiques peuvent être obtenus par action d'un produit selon l'inventlon, notamment de formule (1), ou d'un produit de formule générale (I) dans laquelle L représente un atome d'oxygène, R et R' représentent chacun un atome d'hydrogène et B
représente une base naturelle, en particulier les produits pour lesquels J =
OH, ou oligomères mixtes en comprenant, sur une fonction cellulalre indispensable à la cellule cible.
Les oligomères mixtes d'oligothioribonucléotides selon l'invention, comprenant une séquence oligonucléotidique d'ADN où
I'oxygène intracyclique est rétabli, sont particulièrement intéressants dans une utilisation comme agent antisens~ Ces oligomères mixtes sont susceptibles d'être hautement sélectifs dans la mesure où la "fenêtre" de structure ADN est seule substrat de la RNAse H après appariement de l'antisens avec sa séquence cible complémentaire d'ARNm, la dite RNAse H
induisant alors la coupure du complexe ADN/ARN.
D'autres caracteristiques et avantages de la présente invention apparaîtront à la lumière des exemples qui vont suivre.
La Figure 1 représente la courbe de stabilité thermique du duplex betadT5(SrT)dT6/bêtadC2A12C2 comparativement à celle du duplex naturel bêtadT121bêtadC~A12C2.
La Figure 2 représente la courbe de digestion enzymatique de beta~Sr~)dT 1 1-Dans la description qui suit, l'abréviation rS ou Sr précède un thioribonucléo~ide.
. 30 WO 93/16095 ~ ~ ~ n ~ 1~ I PCr/FR93/0011~
. _ ,,, ., i, l-SYNTHESE DE THIONUCLEOTIDES.
I . 1~ Les premières synth~ses de thiosucrcs ont et~ effecnlee~ entre 1960 et 1970.
Dew~ e~cemples sont donnés:
I~ syn~hèse de derivés du ~thi~ribofura~no~e se fait selon le schéma 1:
CHO ~IO ¦ OCH~ HO OCH, ~c~or rO or P
I
oC~ - ¦ oC~ T-O ¦ oc~, ~~1 ~~1 ~~1 ~2~ 3~
RO Ol~ ` ' ~ ' IP ID
S S R O
~_ O~o -- ~ OR
~0 OA~s ~0 0~ Q'O -~
SCHEMA I
Ce compos~ est ob~ 8 ~pes à par~ du L-L~ncos~ a~roc u~ ~eDdcm0~ global de 6 ~.
- R. IL W~DSrL~, W. E. DICK, T. R. INGLE, R. M. R~iVELL et B. URBAS. l~ ~8 30 Ch~m., 1964, 22. 3~372S.
- 8. URB~S et R. L. WHISTLER, J. r8. Chcm., 1966, 31. 8l3~816.
- E. 1. REIST, D. E. GU~ROY ct L. GOODM~N, J. ~ Ch~ Soc., 196~, ~, S6S~S663.
^ R. L. W~SILER et J. N. BeMlLLER d~ ~ Mahods ~ C~r~r~ Ch~ustnl' . R.
35 L. V~STLER et M. L. WOLFROM, Ed~., A~de~c P~, l~c., Nc~ ~orlc. l962. Vol.
I.p.79.
FEU~L~ EM~L~'`MENT
WO 93/16095 PCI~FK93/0011 ~ , ~ 2 Les déri~é~ du 4-thio-2-désoxy-~ribofurannose ont été obtenus selon le schema ~:
~OCH ~OCH3 ~/ C~3 O~Z
H O9n H C~
~5 HS~ --~ ~OCH3 AcS OCH3 OCH 5 OBn H OBn 11 OH
FEUILLE DE REMPLA~EMENT
WO 93/16095 ", ~ , PCI'/FR93/001 15 Cette svstthèsc cn 14 étapes conduit au mcth~ desoxv 4-tllio-D-c~o-pentofurannoside a~ec un rendemcnt ~lobal de 8 'O
- ~1'. L. Fl: et M. BOBE};. J. Or~. Chem . 1976. 41, 3831 3834.
5 - '1 . L. Fl i et M. BOBE};. dans ' Nclelc .~f-d ~ `hemlstn ". L. TOWSE~D et R S
TlPSQ~.Eds.. 19~8. P~r~ I pp. 183 19~
- ~. G. ~'AYAK et R.L. WHISTLER Llehl~s Ann Chem.~ 19701 741. 131 138.
De fa~on scmblable~ Iff déri~es du 4~thi~rabinofursnnose ont e~e obtenus:
- R. L. WHISTLER U. G. NAYAK et A ~' PERKIN' ~r.. J. Or~.. Chem.. 1970. 3~. 519-10 j~ I, 1. '. Les nucleosides co~espondants ont ensuite etc synthe~ises:a~ En scrie 4'-thio-2'-daoxy-D~ribofur~nnose - Y. L. Fl~ et M. BOBEK dans n Nuclelc Acid Chem~s~ry `', L. TOWSE~'D. R. L.
TIPSO~. Eds.. John Wiley & Sons. New ~ or~ 1978. p.; 17.
b) En ~erie 4'-thio-D-ribofur~nnose F. ~. REIST, D. E. GUEFFROY et L. GOODMA~. J. Am. Ct~em.~oc196~. 8~.
5658~663.
- E. J. RElST~ D. E. GUEFFROY ct L. GOODMAN~ Chem. Ind.. 196~. 1;6~-1365 - B. URBAS et ~. L. WHlSTLER J. Or~. Chem.~ 19S6. 31~ 813-816.
- M. BOBEK. R. L. WHlSTLER et A. BLOCH. J. Med Chem.. 1970. 13. ~1 1~1;
- M. BOBEK~ A. BLOCH. R PARTHASARATHY et R. L. WHISTL~R J .~led ~hem.. 1975, ~8. 784- 787.
- M. BOBEK. R. L. WHlSTLER et A. Bl,OCH. J Med ~hem.. 197~. 15. 168-171 - !~'. 9TOTANI ~t R. L. WHISTLER J. Med. Chem.. 1974. 17. 535- S;' - M. W. PIClCERlNG. J. T WITKOWS~I et R. 1~. ROE~BI~S. J. Med. (`hem 1976 9. 84 1 -842.
-A K M.ANlSUZAM~'et!~I D .4MI~`. J. Ban~ladeshAcad Scl.. 1978.'. 59-64 3Q - D. J HOFFMAN ct R~ L WHISTLER Blochemlsm~. 1970. 9. ~;6- - 'i7Q
c) Dans d'autre~ ~enes:
- R.G.S. RITCHI~ et W. A. SZ~REK J Chem. Soc Chem. Commu~. 1973. 686 - E J. REIST. L. V. FISCHER ct L. GOODMAN. J. Org Chem ~ 1968. 33~ 189-- R. L. WHISTLER L~ U' DONER et 1,' G. I\;AYA~ J~ Or~. Chem . 19 71. 36~ 108-110.
FEUILLE DE REMPLACEMENT
WO 93/160~5 PCl/FR93/00115 Ces nucleosides sont obtenus par les voies traditionnelles de la s~nthèse des nucleosides en sene oxvgenee.
Soit par 19 methode aux sel~ de mé~Jlux lourds:
Traitement de l'hcterocycle chloromcrcun4uc avcc le cl~o~osucrc correspondant - ~1. BOBE};. R. L. WHISTLER et A. BLOCH. J. Me~l. Chem., 1972. 15. 168-171 - D. E. GI~EFFROY et L. GOODM~. Chem. & lnd.. 1~64, l364-1365.
- E. J. REIST. M. BOBEK. R. L. WHISTLER et A. BLOCH~ J. Med Chem.. 1970. 13. 1 1 1-413.
- E. ~. RElST. D. E. GUEFFROY et L. GOODMAN, J. Am. Chem.Soc.. 1964. 86. 56~8-5663.
- E. J. REIST. L. V. FISCHER ct L. GOOD~ l, J. Org. Chem.. 1968. 33. 189 19' Soit p~r b m~thode de HILBERT et JOHNSON, 15 ~ par contensation dc 18 base pyrimidiniquc avec le dliochlorosucre co~cspond~nt.
- B. I~RBAS et R L. WHISl'LER J. Org. Chem.~ 1966, 3I~ 813-816.
- par condensation des denves silyles des bascs et tes thiochlo~osucres co~cspondants - ~1. BOBEK A. BLOCH~ R. PARTHASARATHY ct R. L. WHISTLER J. .~t~t. ( `hem .
19~S. t8~ ~84 787.
- R. L. WHISTLER L. W. DONER et U. G. NAYAK J. Org. Chem.. 19~1. 36. 108-110 2û - ~. OTOTANI et R. L. WHISTLER J. Med. Chem.~ 1974. 17. 535-5i7 - p~r b re ction de fu~ion du 3-cyano 1.2.4 triazole e~ du 1.~.3.5 teaa-O-acer l- l-thio-D-nbofuran~osc.
- ~. V. PICKERING. ~. T. WITK(:)WS~;l ct R. K. ROBI~S~ J. Me~l. Chem . 1976. 19. 8~ 1^
842.
~ psr IB méthode de VORBRUGGEI~i et Nll :DBALLA par condcnsanon de l'adeninc cs du 1,2,3.S te~ O-accryl thionbofurannosc en presence de catalvseur FRIEDEL
et CRAFTS.
- A. K. M. ANlSU&~i et ~vl. D AMIN, J. Bangladesh Acad. Scl.~ 1978. 2. ~9-6 Depuis peu~ 19 synthe de thionuclh ides ~ de nouve-u connu de l'int~ret .~insi. }c 2'.3'.5' tri-Q-bcnzyl 4'-tho~ -xvlofilJannosyl uracile a ete obtenu par une ~ole onginale selon le schema 3:
M W BREDNKAMP C W HOLZAPFEL et A D. SWANEPOEL Telrohe~ron 1.~11 .
199~. 31. ~S9-2~62.
- M. W. BREDENKAMP. C ~h. HOLZAPFEL A. O. SWA~EPC)EL. ~ r J (`n~
3~ t991. ~4. 31-33.
FEUILLE DE REMPLACEMENT
WO 93/16095 PCl`/FR93/00115 .. ~ . .-- ,,~ ~ " .~
. . ~ . . t ;s~/sBn ~, S~sar ~
~ 3~ B2 HO ~ ~ zO _ ~ ~ MsO-- MsC
3zO/ BlO~ 6zO/
\ ,. `
\i O
azo~ S (Y~ ~Z~l `
''~ ~hOAc i = oxyde dc dibutyl étain; ii = MsCI; iii = E~nCl: iv = iodure de tetra-butvlammon~um.
carbonate de barium; v = Hg(OAc)2 t AcOH; vi = Methode d'HlL8ERT JO~SO~;
25 modifiée.) La svnthèse d'analo~ues pynmidiniques de 4'-thio 2'-desoxv nucleosides a ete publiee - ~. R. DYSON. P. L. COE et R. T. WALKER J. Med. Chem.. 1991, 3~. ?78?-~786 par la med~ode de HORTON et MAR}COVS.
- D. HORTON et R. A. MARKOVS, Carboh.vdr~)e ~es.~ 1980, 80.356.
Elle cst illus~c pa~ le scbema 4:
FEUILLE DE REMPLACEMENl-WO 93/16095 P~/FR93JOOIlS
~6 ,~
r~
~n ~-- S /
, ~ Sa~ , ~nO~
3n`J ~f~' ~i = H~CI~. CdC03) D'une façon s~nblable~ les 2'-desoxy-4'-d~iocv~idine, 2'-désoxv-4'-thiouridine et 4-thiothv~idine ont he obtenus par J. A. SECRlST III et Coll. (J. A. SECRlST. };. !~;.
15 TIU'ARL J. M. RlORDA~ et J. A. MONTGOMERY. J. Med. Chem.. 1991. 3~. ~361-'~366?; ( J. A. MO~T&OMERY et J. A. SECRIST 111. PCT Int. Appl. U'O 910~$.0;~ ) à
parnr du 2-desoxy~4-thio-B-D-ery~ro~pentofurannose svnthétise selon BOBEK et Coll. (`s .
L. F~. M. BOBE~ J. Org. Chem.. 19?6, 41~ 3831-3834.) en utilisant le T!vlSTf comme catalvseur de coupla~e.
La s~thèse du 4'-thio 2'-désoxv-D- ribofurannose a fai~ l'objet d'un brevet ct de publlcanons - European Patcnt Applicanon. 0421 777 A I . R. T. WAL~;ER
- M. R. DYSON. P. L. COE et R. T. WALKER J. Chem. Soc. Chem. Comm. 1991.741-74~
- M R. DYSO~, P. L. COE et R. T WAL~;ER Carbohvdrale Res . 1991. 216. ';7-~48 Elle est decrite sur le schema ~:
FEUILLE DE REMPl_hCEMENT
WO 93/16095 ~ ! PCI`/FR93/00115 CHO
r)~ nO~
I r rLr~ anO
'~"2`J
0~ SBn ( ~ SBn ( v ` ~7 ~n anC~~( 9 0 ~ n OB~ OBn ~n i~ (vii) ~nO--~ ( viii, ix x ~ ~OAt ~nO RO
(i = HCl / MeOH. ii = BDBr I THF, iii = 8nSH / HCL iv = Ph3P / DEAD / BzOH i THF~ v =
McONa / MeOH / CH~C12~ vi = MsCl / Pyr.. vii -= Nal / CO3Ba / Acctone. ~ln - BC13 CH ~C12~ ix = p-toluovlCI~ x = Ac~O / H2S04) SCHEMA S
FEUILLE DE REMPLACEMENT
WO 93/16095 pcrtFR93/ool 15 J'1 Des ribothionucleosides dérivés des py~imidines ont fait l'objet du même brevet. Mais la svnthèse du thioribofi~rannose de depart a été realisee selon la methodc de E. ~. REIST.
- E J. REIST, D. E. GUEFFROY et L. GOODMAN. J. Am. Chem. Soc.~ 1964~ 84~ 5658.
5 1. 3.SYNTHESE DES SY~THONS DU 4'-THIO-BETA-D-RIBOFURA~OSE
NECESSAIRES A L'OBTENTlON DE THlOOLlGOMERES.
On a realisé la synthèse du L-thioLyxofurannose et du D-thioRibofuranslose en 7 etapes a pamr du D-ribose et du L-lyxose respectivement avec 29 et 21 % de rendemen~
respectivement. Cette synthèsc est illustree sur le schema 6.
Cuo ~0~ ' ~~ n ~_ 3nG~ C--r' 20~ 3nO OBn 2 o ~ ~ _ O
3nC OAc ~
3~ 09n 9r!C r~n '3 (i = MeOH, HCI~ BnBr~ KOH; iii = HCL.H~O.dioxane; iv = BnSH. HCI. ~ = ~tesCL.
pyr.: vi = NBu41. BaCO3; ~ni = Hg(OAc)2) FEUILLE DE REMPLA~EMENT
WO 93/1609~ PCr/FR93/00 Ls synthè~e pour obtenir le thio-D-ribofur~nno~e utilise le L~ o~e comme produit de départ comme d~n~ b ~nthese de WHISTLER ( page l9). Ce~te strstegie e~t appelée strategie C1--C4 . En effet. I'stomc de soufre e~t tout d'abord introduit en position anomère et une substitution nucleophile SN2 entre l'~tome de soufre porté par le5 carbone anomère (Cl) et le c~rbone C4 porteur d'u~ OH activé par un groupementMe~yl (Ms) ess en3uite e~fectuée. Cette str~tegie sppliquée ~ 1~ synthèse du ~thio-D-ribofurannose et du 4-thio-lrlyxofursnnose rsemble i celle que WALKER a utilisépour parvenir i la série 2~ o~y-D-ri~ofursnno~e ( Brevet ~ur. Pat. 0421 777 A 1 psge
En partlculier, à partlr des fonctlons alcool termmales 3~ ou 5~
de l'oligothionucléotlde, I'effec~eur 7. peut donc être lntrodult v la une chaîne (CH2)n liée à une fonctlonnalisatlon Z', de natures dlverses à la partie osidique de l'ol~gomère.
A partlr de la formule suivante:
ou -O-Z I -(CH2) -effecteur ~Z) 5~ , 1 0 on obtlendra, selon ce que représente Z l, par exemple - un phosphate ou méthyl phosphonate de formule gu - 0~ P ~ U ~(C~ ,2 ou C~l, U = O, N ou S
- un éther de formule générale o~ CHI ~ C~ J'~ ,Z
- un ester de formule générale:
-O ~ CO t~ C~ ~ t~
ou encore 30 - un carbamate de formule générale:
-O ~ CO NH t-t C~l '~nZ
3 5 En général, n' est comprls entre I et 10.
WO 93/16095 ~ P~/FR93/00115 La présente Inventlon concerne également les composes précédents sous forme de sel avec des bases ou des acldes, et les composés sous forme racémlque, ou sous forme d'isomètres R ou S optiques purifiés ou en mélange, de formule (I).
La présente invention concerne de préférence les composés précédents de formule (I) dans la série D.
On cite en particulier les produits composés D-oligothlonu-cléotide de formule générale:
:~-0 ~5 B
o X/ o ¦ ? -- ~ o ~
~H .
25 dans laquelle J et X sont déflnls cornme précédemment pour les composés de formule (1) et a représente une base nucléique naturelle.
Les oligonucléotldes selon la présente invention peuvent se présenter sous forme de séquences homogènes, comme dans les composés de formule (I) ou sous forme d'ollgomères mixtes, c'est-à-dire sous forme de 30 séquences particulières Incluses dans d'autres types d'oligonucleotldes de type ADN ou ARN, modifiés ou non au niveau de l'encha~nement phosphate, ces derniers corresondant à des composés de formule (1), dans lesquels l'oxygène intracyclique du cycle furannose est rétabli.
WO 93/1609~ PCI /FR93/()0115 - - ~ 1 2 La présente Inventlon a donc éga~ement pour objet des composés oligomères mixtes caractérisés en ce qu'ils sont constltués par des composes oligothionucléotides selon l'invention liés à des oligonucléotldes de type ADN ou ARN. On entend ici par "oligonucléotides de type ADN ou ARN" une séquence d'acides nucléiques de type ADN ou ARN modiflés ou non au nlveau de l'enchaînement phosphate et dans lesquels l'hétéroatome intracyclique du cycle furannose des nucléotides est l'oxygène.
La présente invention a notamment pour objet des composés oligomères mixtes constitués par une séquence oligothionucléotidique selon I'inventiont comprenant une séquence oligonucléotidique de type ADN ou ARN en son sein ou à une de ses extrémités.
Dans un mode de réalisation particulier, donc,- la séquence oligonucléotidique, de type ADN ou ARN, est encadrée par deux séquences d'oligothioribonucléQtides.
Les nouveaux protuits de formule générale (I) ou oligomères mixtes en comportant peuvent être préparés par voie chimique par des procédés connus et, en particuliert ceux qui sont décrits dans les demandes de procédés connus et, en particulier, ceux qui sont décrits dans les demandes de brevets français FR 8301223 (2 540 122) et FR 8411795 ~2 568 254), WO 88/04301 et FR 88 122648.
Les composés oligothionucléotides notamment de formule (I) peuvent être préparés par voie chimique par des procédés dans lesquels on appllque des synthèses au phosphodiester, au phospho~riester, au phospho-ramidite ou à l'hydrogenophosphonate classiques pour des oli~onucléotldes.
Dans ces procédes, on prépare tout d'abord la chaîne de 4'-thionucléotides, les différents groupements non mis en oeuvre étant protégés, puis on élimine enfin les groupements protecteurs pour obtenlr les produits recherchés.
On cite en partlculier un procédé de synthèse de composes oligothionucléotides selon l'invention sans a8ent effecteur, caractérlse en ce que on réalise une synthèse supportée selon la methode au phospho-roamidite comportant - une protection en 3' et 5' des 4'-thionucléotides ou oligo4'-thionucleo-tides de départ avec par exemple du diméthoxytrityl en 5' et du diisopropylaminophosphoramidite de méthyle en 3', WO 93/1609~
- la fonctlonnallsatlon d'un support sollde lncorporant un dérlvé 4'-thlo-nucléosidique par un lien par exemple succlnyle entre le groupement hydroxyle-3' du dérlvé 4'-thionucléosidique et un ~roupement arnlno du support solide, - l'élongation de la chaîne oligothionucléotldlque dans un réacteur synthétiseur, - enfin le décrochage, la déprotection et la purification de l'oligothlonu-cléotide prolon~é.
On cite également un procédé de synthèse de composés oligothionucléotides Incorporant un agent effecteur selon l'invention caractérisé en ce que l'on part d'un oligothionucléotide sans agent effecteur, ou d'un oligomère mixte en comprenant, protégé en 5', dont on fait réagir la terminalson OH 3' avec une fonction non protégée d'un bras difonctionnel dont I deuxième fonction est protégée et après déprotection I S du produit résultant, on lie ledit produit à l'a~ent effecteur par la deuxième fonction libre du bras difonctionnel.
La terminalson OH 3' de l'oligomère protégé en 5' peut être estérifiée avec un acide amlnohexanolque, dont la fonction amlne est protégée.
Un procédé de préparation en phase solide de séquences oligothionucléotides selon la méthode au phosphoramidite, objet dela présente invention, comporte les étapes essentielles suivantes:
- On immoblllse un dérivé 4'-thionucléoside protégé par l'intermédlalre d'une de ses fonctions hydroxyle en 3' ou, le cas échéant, 2' sur un support solide.
- On assemble sur ce support dans un réacteur synthétlseur manuel ou 3utomatique la chaîne d'oligothionucleotlde protégée par condensation de monomères constltues de 4'-thionucleosldes protégés substitués par des groupes phosphoraml~ltes en 3', le cas échéant, la fonctlon hydroxyle en 2' des riboses étant protégée par les groupes Ctmp ou TE~D lS.
- Les oligothlonucleotldes sont obtenus après décrochage de l'oligomère obtenu du support et éiimination des groupes protecteurs.
PCl`/FR93/001 1 5 ~ ~, ~ c - 1 4 De façon approprlée, I'assemblage de l'ollgothlonucléotlde se fait par condensation, en présence d'un agent activateur, desdlts monomères entre leur fonction en 3' et la fonctlon 5' du composé
4'-thionucléoside immobll~sé pour le premler monomère ou d'un composé
intermédiaire polythionucléotlde protégé fixé sur ledlt composé thlonu-cléoside immobilisé pour les monomères sulvants.
Notamment, I'agent actlvateur pour la condensation desdlts monomères peut être choisi parmi le tétrazole et ses dérivés, tels que le para-nltrophényl tétrazole.
Avantageusement, le groupe phosphoramidite en 3' desdits monomères est un groupe N,N dlalkylaminophosphoramidite de formule /N(RI)2 -P
avec R 1 qui représente un alkyle en C 1 à C7 éventuellement substitué
identique ou différent, tel que CH3, (CH3)2CH.
R2 qui représente un alkyle en Cl à C7 éventuellement substltué, tel que CH3~ CH2CH2CN.
En particulier, le groupe phosphoramidite en 3' desdits monomères est le diisopropylamlnophosphoramidite de méthyl (R 1 =
(CH3)2CH et R2 = CH3) ou le cyano-2 éthyl diisopropylamlnophosphlte (R 1 = (CH 3)2CH et R2 = CH2CH2CN).
De façon approprlée, les groupes hydroxyles desdits mono-2~ mères et dudit composé 4'-thlonucléoside immobilisé peuvent être pro.tégés en 5' par lë groupe DmTr.
Le cornposé 4'thlonucléoside immobilisé peut être fixé sur le support solide via un groupe dlvalent succinyle entre un de ses groupements OH en 2' ou 3' qui se trouve alnsl estérifié, et un groupement amlno du suppor~.
Le support solide peut être constitué par une longue chaîne alkylamine fixee sur un polymère, un gel de silice ou des billes de verre poreuses.
WO 93/16095 , , ~ , PCl/FR93/00115 . J ~J .~
On peut clter comme groupe fonctlonnel permettant la fixation ou étant lié sur support sollde doté d'un groupe amlno, le ~roupe de formule -C-(CH2) pCOR4 avec p - 1 à ~, dans lequel R4 représente H un ~roupe d'activation tel que C6C15 ou un radical NH lié à un support solide tel que le radical NH d'une chaîne 10 alkylamine fixée sur un polymère, gel de silice ou billes de verre poreuses.
Un lntérêt des composés homogènes ou mixte~s selon la présente invention, comprenant une chaîne d'oligo-thio-nucleotides, est aussi de pouvoir envisager leur utilisation indépendamment d'agents effecteurs, notamment d'agents intercalants, puisque ces nouvelles 15 substances oligonucléotides assurent la reconnaisance de ia séquence d'acide nucleique complémentaire, notammen~ d'ARN, avec une stabllité
très accrue; la fonction de l'a~ent intercalant étant d'augmenter la stabilité du complexe d'hybridation, sa présence n'est plus obligatoire.
Les composés selon l'invention, par leur grande afflnl~é
20 spécifique des séquences oligothionucléotidiques pour des séquences nucléiques complémentaires, sont en effet supérieurs aux oligonucléotldes actuels dont l'affinite pour les séquences complémentalres est plus falble.
Les composés~ selon la presente invention, sont donc utilisables de manière plus efficace, à titre de sondes d'hybridation, mals 25 également comme composants de purification pour des séquences dé~erminées d'ADN ou d'ARN.
Ces composés peuvent également etre utiiisés pour détecter des mutatlons au niveau d'un ADN ou d'un ARN de manière plus efflcace.
Les composés de la présente inventlon, par la proprlé~é des 30 séquences oli~othionucléotidiques de se fixer fortement sur la séquence nucléique complémentaire, puis d'induire la coupure de la chaîne d'acldes nucléiques en ce site, notamment lorsqu'ils sont couplés à un agent de coupure, sont utilisables à titrc de nucléases artificielles spéc~fiques de séquences. Ils peuvcr-t ~tre utilisés comme réactifs en biologie moléculalre 3~ ou en 8énie génétique.
~ a présence de la fonctlon hydroxyle en 2', le cas échéant, permet en outre d'envisager leur utilisation comme ribozymes artlficiels, que ce soit sous forme de séquences oli~othioribonucléotidiques homo~ènes ou mixtes~ c'est-à-dire associées à des oligonucléotides de type ADN ou 5 ARN.
L'objet de la présente invention est également l'application des composés selon l'invention pour réaliser le blocage spécifique des gènes cellulaires ou d'agents pathogènes préalablement choisis (virus, bactéries, parasites).
l 0 Les composés selon l'invention sont donc aussi utilisables à
titre de rnédicaments.
Les nouveaux produits de formule générale (I) selon l'invention et les prodults de formule générale (1~ dans laquelle L
représente un atome d'oxygène, R et R' représentent chacun un atome l 5 d'hydrogène et B représente une base nucléique naturelle forment des complexes d'hybridation avec les séquences complémentaires d'ARN
beaucoup plus stables que ceux qui sont formés avec l'ADN.
En particulier, les produits de formule (I) dans lesquels J = OH
(oligothioribonucléotides) s'apparient de manière plus stable avec des séquences d'ARN complémentaires que les produits de formule (I) dans lesquels J = H (oligothiodésoxyribonucléolides).
Compte tenu du falt que les cibles des molécules anti-sens en ~hérapies sont les gènes ARN messagers, cette propriété des oll~othio-ribonucléotides est tout à fai~ intéressante.
Cette différence de stabilité des complexes d'hybrldatlon permet une inhibition préférentlelle des ARNs messagers et des ARNs viraux sans risque important de provoquer des effets indésirables au nlveau de l'ADN du génome.
De plus, vis-à-vls des ARNs, les produits selon l'inventlon 3~ forment généralemcnt des cornplexes plus stables que ceux qui sont obtenus à partir des oligonucléotides naturels.
Les composés oligothioribonucléotides selon l'inventlon, notamment de formule (I) (J = OH), présentcnt en outre un certain nombre de caractéris~iques intéressantes, notamment pour une application comme 3S agent antisens:
WO 93/16095 PCI`/FR93/00115 - la confiE~uration bêta naturelle est respectée, - ils sont lsoélectriques des ARN naturels, - lls n~ont pas de chiralité au nlveau de la lialson phosphodiester~
- IIS sont plus lipophiles que les analogues naturels à cause de la présence 5 de l'atome de soufre.
Les séquences des ollgothionucléotides, couplés ou non à un agent intercalant ou à un groupement activable chimlquement ou photochimiquement, comportant un enchaînement de nucléosldes pyrlml-diques sont capables de se fixer sur une double hélice d'ADN ou d'ARN
10 comportant une séquence de bases puriques adjacentes associées par lialson hydrogene à la séquence complémentaire des bases pyrimidiques. Cette fixation implique la formation locale d'une trlple hélice dans laquelle les bases oyrimidiques de l'oligothionucléotide forment des liaisons hydrogène (de type Hoogsteen ou Hoogsteen inversé~ avec les bases puriques de la 15 double hélice. Dans ce contcxte, les oligothionucléotides forment des complexes plus stables que les oligonucléotides correspondants et lls permettent d'induire des réactions irréversibles (pontage, modification ou coupure) sur une double hélice d'ARN ou d'ADN.
'~es nouveaux produits de formule générale (I) selon 20 I'invention et les produits de formule générale (I) dans laquelle L
représente un atome d'oxygène, R et R' représentent chacun un atome d'hydrogène et a représente une base nucléique naturelle, qui possèdent la propriété de se fixer fortement sur la séquence nucléique complémentalre, ou oligomères mixtes en comprenant, peuvent être utilisés comme sondes 25 pour detecter la présence d'une chaîne de nucléotides complémentalres.
Cet~e détection est facilitée par la présence d'un groupe fluorescent ou d'un groupe biotine dans ces molécules.
La structure non naturelle des oligothionucléotides confère des propriétés d'antigénicité rendant ainsi possible la preparatlon 30 d~anticorps specifiques dirigés con~re des oligothionucléotides éven~uel-lement couplés à un agent Intercalant ou contre leurs complexes avec un ADN ou un ARN naturels.
Dans un but diagnostique ou pronostique, les oligothlonu-cléotides, éventuellement couplés à un agent intercalant, ou oligommères ~5 mixtes en comprenant, peuvent être attachés de façon covalente à un WO 93J16095 PCr/FR9~/00115 ~ t i~ 1 8 support solide. Le couplage à un marqueur luminescen~ ou générateur d'une réaction colorée, lumlnescente ou fluorescente permet de les utlllser comme sondes de séquences d'ADN ou d'ARN dans un but dia~nostique ou pronostique.
Les oligothionucléotides selon l'lnvention sont beaucoup plus réslstants vis-à-vis des nucléases que les dérivés de nucléosides naturels.
Cette stabilité vis-à-vis de l'hydrolyse enzymatique permet l'utilisation des produits selon l'inventlon, notamment de formule générale (1), ou oligomères mixtes en comprenant, dans des expérlmentations in vivo ou m vitro en présence de nucléases. f)e ce fait, les oligothionucléotides selon l'invention présentent des avantages lncontestables sur les dérivés de bêta-nucléosides déjà connus.
Les composés oligothioribonucléotides de formule (I) pour lesquels J = OH sont plus résitants à la dégradation enzymatiques que les composés oligothiodésoxyribonucléotides de formule I pour lesquels J = H.
Dès lors, comme on l'a vu, un autre objet de la présente invention concerne l'application des nouveaux produits selon l'inventlon, notamment de formule générale (1), et des produits de formule générale (1) dans laquelle L représente un atome d'oxygène, R et R' représentent chacun un atome d'hydro~ène et E~ représente une base nucléique naturelle, en particulier les produits pour lesquels J = OH, ou oligomères mlxtes en comprenant, au blocage spéclfique de glènes cellulalres ou d'agents pathogènes préalablement choisis (virus, bactéries, parasites), en partlculler les ARNm.
Les nouveaux produits selon l'invention, notamment de formule générale (I), et les produits de formule générale (I) dans laquelle L
représente un atome d'oxygène, R et R' representent chacun un atome d'hydrogène et B représente une base nucléique na~urelle, en particuller les produits pour lesquels J = OH, ou oligomères mixtes en comprenant, sont particulièrement utiles comme médicaments permettant de bloquer les gènes indésirables exogènes ~virus, bactéries, paraslte~) ou endogènes (gènes cellulairess oncogènes), en particulier les ARNm. L'expression de ces gènes peut ~tre bloquée en a~ssant soit directement sur l'ADN ou l'ARN
porteur de l'information génétique, soit sur l'ARN messager, copie du gène, WO 93/16095 ~, PC~/FR93/00115 en bloquant alors toute traduc~lon par hybridation ou par hybridatlon pUlS
pontage ou modification ou coupure de l'ARN messager ou vlral chois comme cible.
Ce blocage peut être réallsé en utilisant un produit selon 5 I'lnvention, notamment de formule ~énérale (I), ou un produit de formule ~énérale ~I) dans laquelle L représente un atome d'oxygène, R et R' représentent chacun un atome d'hydrogène et ~ représente une base nucléique naturelle, en particulier les produits pour lesquels J = OH, ou oligomères mixtes en comprenant, dont la séquence est complémentaire de l0 celle d'une région non complexée d'un ARN ou d'un ADN et, en particulier, d'un ARN messager. L'hybridation, suivie ou non du ponta~e, de la modification ou de la coupure de l'ARN messager ou viral, empêche la synthèse de l'ARN ou de la proteine correspondante ou l'expression des fonctions virales ou parasitaires.
Si cet ARN ou cette protéine est vital pour le virus, la bactérie ou le parasite, les produits selon l'invention, notamment de formule générale (I), et les produits de formule générale (I) dans laquelle L
représente un atome d'oxygene, R et R' représentent chacun un atome d'hydrogène et B représente une base nucléique naturelle, en prticulier les 20 produits pour lesquels J = OH, ou oligomères mixtes en comprenant, constitueront des médicaments à activité antivirale, antibactérlenne ou antiparasitaire.
Si cet ARN ou cette protéine n'est pas vital pour l'organisme, il est possible d'en supprlmer sélectlvement les effets. Oans ce cas, les 25 produits selon l'invention, notamment de formule générale (I), et les produits de formule générale (I) dans laquelle L représente un atome d'oxygène, R et R' représentent chacun un atome d'hydrogène et B
représente une base nucléique naturelle, en particulier les prodults pour lesquels J = OH, ou oligomères mlxtes en comprenant, constltueront solt des 30 médicaments à activité antltumorale lorsque le gène visé ou son AR,N
messager code pour une protéine lmpliquée dans la transformatlon cellulaire, soit des médicaments capables de supprimer le caractère de résistance aux antiviraux, aux antibiotiques ou aux antiparasitaires lorsque la protéine codée est responsable de l'inactlvation des antibiotiques, des 35 antiviraux ou des antiparasitaires.
WO 93/16095 P~/FR93/00115 Des effets cytotoxiques spécifiques peuvent être obtenus par action d'un produit selon l'inventlon, notamment de formule (1), ou d'un produit de formule générale (I) dans laquelle L représente un atome d'oxygène, R et R' représentent chacun un atome d'hydrogène et B
représente une base naturelle, en particulier les produits pour lesquels J =
OH, ou oligomères mixtes en comprenant, sur une fonction cellulalre indispensable à la cellule cible.
Les oligomères mixtes d'oligothioribonucléotides selon l'invention, comprenant une séquence oligonucléotidique d'ADN où
I'oxygène intracyclique est rétabli, sont particulièrement intéressants dans une utilisation comme agent antisens~ Ces oligomères mixtes sont susceptibles d'être hautement sélectifs dans la mesure où la "fenêtre" de structure ADN est seule substrat de la RNAse H après appariement de l'antisens avec sa séquence cible complémentaire d'ARNm, la dite RNAse H
induisant alors la coupure du complexe ADN/ARN.
D'autres caracteristiques et avantages de la présente invention apparaîtront à la lumière des exemples qui vont suivre.
La Figure 1 représente la courbe de stabilité thermique du duplex betadT5(SrT)dT6/bêtadC2A12C2 comparativement à celle du duplex naturel bêtadT121bêtadC~A12C2.
La Figure 2 représente la courbe de digestion enzymatique de beta~Sr~)dT 1 1-Dans la description qui suit, l'abréviation rS ou Sr précède un thioribonucléo~ide.
. 30 WO 93/16095 ~ ~ ~ n ~ 1~ I PCr/FR93/0011~
. _ ,,, ., i, l-SYNTHESE DE THIONUCLEOTIDES.
I . 1~ Les premières synth~ses de thiosucrcs ont et~ effecnlee~ entre 1960 et 1970.
Dew~ e~cemples sont donnés:
I~ syn~hèse de derivés du ~thi~ribofura~no~e se fait selon le schéma 1:
CHO ~IO ¦ OCH~ HO OCH, ~c~or rO or P
I
oC~ - ¦ oC~ T-O ¦ oc~, ~~1 ~~1 ~~1 ~2~ 3~
RO Ol~ ` ' ~ ' IP ID
S S R O
~_ O~o -- ~ OR
~0 OA~s ~0 0~ Q'O -~
SCHEMA I
Ce compos~ est ob~ 8 ~pes à par~ du L-L~ncos~ a~roc u~ ~eDdcm0~ global de 6 ~.
- R. IL W~DSrL~, W. E. DICK, T. R. INGLE, R. M. R~iVELL et B. URBAS. l~ ~8 30 Ch~m., 1964, 22. 3~372S.
- 8. URB~S et R. L. WHISTLER, J. r8. Chcm., 1966, 31. 8l3~816.
- E. 1. REIST, D. E. GU~ROY ct L. GOODM~N, J. ~ Ch~ Soc., 196~, ~, S6S~S663.
^ R. L. W~SILER et J. N. BeMlLLER d~ ~ Mahods ~ C~r~r~ Ch~ustnl' . R.
35 L. V~STLER et M. L. WOLFROM, Ed~., A~de~c P~, l~c., Nc~ ~orlc. l962. Vol.
I.p.79.
FEU~L~ EM~L~'`MENT
WO 93/16095 PCI~FK93/0011 ~ , ~ 2 Les déri~é~ du 4-thio-2-désoxy-~ribofurannose ont été obtenus selon le schema ~:
~OCH ~OCH3 ~/ C~3 O~Z
H O9n H C~
~5 HS~ --~ ~OCH3 AcS OCH3 OCH 5 OBn H OBn 11 OH
FEUILLE DE REMPLA~EMENT
WO 93/16095 ", ~ , PCI'/FR93/001 15 Cette svstthèsc cn 14 étapes conduit au mcth~ desoxv 4-tllio-D-c~o-pentofurannoside a~ec un rendemcnt ~lobal de 8 'O
- ~1'. L. Fl: et M. BOBE};. J. Or~. Chem . 1976. 41, 3831 3834.
5 - '1 . L. Fl i et M. BOBE};. dans ' Nclelc .~f-d ~ `hemlstn ". L. TOWSE~D et R S
TlPSQ~.Eds.. 19~8. P~r~ I pp. 183 19~
- ~. G. ~'AYAK et R.L. WHISTLER Llehl~s Ann Chem.~ 19701 741. 131 138.
De fa~on scmblable~ Iff déri~es du 4~thi~rabinofursnnose ont e~e obtenus:
- R. L. WHISTLER U. G. NAYAK et A ~' PERKIN' ~r.. J. Or~.. Chem.. 1970. 3~. 519-10 j~ I, 1. '. Les nucleosides co~espondants ont ensuite etc synthe~ises:a~ En scrie 4'-thio-2'-daoxy-D~ribofur~nnose - Y. L. Fl~ et M. BOBEK dans n Nuclelc Acid Chem~s~ry `', L. TOWSE~'D. R. L.
TIPSO~. Eds.. John Wiley & Sons. New ~ or~ 1978. p.; 17.
b) En ~erie 4'-thio-D-ribofur~nnose F. ~. REIST, D. E. GUEFFROY et L. GOODMA~. J. Am. Ct~em.~oc196~. 8~.
5658~663.
- E. J. RElST~ D. E. GUEFFROY ct L. GOODMAN~ Chem. Ind.. 196~. 1;6~-1365 - B. URBAS et ~. L. WHlSTLER J. Or~. Chem.~ 19S6. 31~ 813-816.
- M. BOBEK. R. L. WHlSTLER et A. BLOCH. J. Med Chem.. 1970. 13. ~1 1~1;
- M. BOBEK~ A. BLOCH. R PARTHASARATHY et R. L. WHISTL~R J .~led ~hem.. 1975, ~8. 784- 787.
- M. BOBEK. R. L. WHlSTLER et A. Bl,OCH. J Med ~hem.. 197~. 15. 168-171 - !~'. 9TOTANI ~t R. L. WHISTLER J. Med. Chem.. 1974. 17. 535- S;' - M. W. PIClCERlNG. J. T WITKOWS~I et R. 1~. ROE~BI~S. J. Med. (`hem 1976 9. 84 1 -842.
-A K M.ANlSUZAM~'et!~I D .4MI~`. J. Ban~ladeshAcad Scl.. 1978.'. 59-64 3Q - D. J HOFFMAN ct R~ L WHISTLER Blochemlsm~. 1970. 9. ~;6- - 'i7Q
c) Dans d'autre~ ~enes:
- R.G.S. RITCHI~ et W. A. SZ~REK J Chem. Soc Chem. Commu~. 1973. 686 - E J. REIST. L. V. FISCHER ct L. GOODMAN. J. Org Chem ~ 1968. 33~ 189-- R. L. WHISTLER L~ U' DONER et 1,' G. I\;AYA~ J~ Or~. Chem . 19 71. 36~ 108-110.
FEUILLE DE REMPLACEMENT
WO 93/160~5 PCl/FR93/00115 Ces nucleosides sont obtenus par les voies traditionnelles de la s~nthèse des nucleosides en sene oxvgenee.
Soit par 19 methode aux sel~ de mé~Jlux lourds:
Traitement de l'hcterocycle chloromcrcun4uc avcc le cl~o~osucrc correspondant - ~1. BOBE};. R. L. WHISTLER et A. BLOCH. J. Me~l. Chem., 1972. 15. 168-171 - D. E. GI~EFFROY et L. GOODM~. Chem. & lnd.. 1~64, l364-1365.
- E. J. REIST. M. BOBEK. R. L. WHISTLER et A. BLOCH~ J. Med Chem.. 1970. 13. 1 1 1-413.
- E. ~. RElST. D. E. GUEFFROY et L. GOODMAN, J. Am. Chem.Soc.. 1964. 86. 56~8-5663.
- E. J. REIST. L. V. FISCHER ct L. GOOD~ l, J. Org. Chem.. 1968. 33. 189 19' Soit p~r b m~thode de HILBERT et JOHNSON, 15 ~ par contensation dc 18 base pyrimidiniquc avec le dliochlorosucre co~cspond~nt.
- B. I~RBAS et R L. WHISl'LER J. Org. Chem.~ 1966, 3I~ 813-816.
- par condensation des denves silyles des bascs et tes thiochlo~osucres co~cspondants - ~1. BOBEK A. BLOCH~ R. PARTHASARATHY ct R. L. WHISTLER J. .~t~t. ( `hem .
19~S. t8~ ~84 787.
- R. L. WHISTLER L. W. DONER et U. G. NAYAK J. Org. Chem.. 19~1. 36. 108-110 2û - ~. OTOTANI et R. L. WHISTLER J. Med. Chem.~ 1974. 17. 535-5i7 - p~r b re ction de fu~ion du 3-cyano 1.2.4 triazole e~ du 1.~.3.5 teaa-O-acer l- l-thio-D-nbofuran~osc.
- ~. V. PICKERING. ~. T. WITK(:)WS~;l ct R. K. ROBI~S~ J. Me~l. Chem . 1976. 19. 8~ 1^
842.
~ psr IB méthode de VORBRUGGEI~i et Nll :DBALLA par condcnsanon de l'adeninc cs du 1,2,3.S te~ O-accryl thionbofurannosc en presence de catalvseur FRIEDEL
et CRAFTS.
- A. K. M. ANlSU&~i et ~vl. D AMIN, J. Bangladesh Acad. Scl.~ 1978. 2. ~9-6 Depuis peu~ 19 synthe de thionuclh ides ~ de nouve-u connu de l'int~ret .~insi. }c 2'.3'.5' tri-Q-bcnzyl 4'-tho~ -xvlofilJannosyl uracile a ete obtenu par une ~ole onginale selon le schema 3:
M W BREDNKAMP C W HOLZAPFEL et A D. SWANEPOEL Telrohe~ron 1.~11 .
199~. 31. ~S9-2~62.
- M. W. BREDENKAMP. C ~h. HOLZAPFEL A. O. SWA~EPC)EL. ~ r J (`n~
3~ t991. ~4. 31-33.
FEUILLE DE REMPLACEMENT
WO 93/16095 PCl`/FR93/00115 .. ~ . .-- ,,~ ~ " .~
. . ~ . . t ;s~/sBn ~, S~sar ~
~ 3~ B2 HO ~ ~ zO _ ~ ~ MsO-- MsC
3zO/ BlO~ 6zO/
\ ,. `
\i O
azo~ S (Y~ ~Z~l `
''~ ~hOAc i = oxyde dc dibutyl étain; ii = MsCI; iii = E~nCl: iv = iodure de tetra-butvlammon~um.
carbonate de barium; v = Hg(OAc)2 t AcOH; vi = Methode d'HlL8ERT JO~SO~;
25 modifiée.) La svnthèse d'analo~ues pynmidiniques de 4'-thio 2'-desoxv nucleosides a ete publiee - ~. R. DYSON. P. L. COE et R. T. WALKER J. Med. Chem.. 1991, 3~. ?78?-~786 par la med~ode de HORTON et MAR}COVS.
- D. HORTON et R. A. MARKOVS, Carboh.vdr~)e ~es.~ 1980, 80.356.
Elle cst illus~c pa~ le scbema 4:
FEUILLE DE REMPLACEMENl-WO 93/16095 P~/FR93JOOIlS
~6 ,~
r~
~n ~-- S /
, ~ Sa~ , ~nO~
3n`J ~f~' ~i = H~CI~. CdC03) D'une façon s~nblable~ les 2'-desoxy-4'-d~iocv~idine, 2'-désoxv-4'-thiouridine et 4-thiothv~idine ont he obtenus par J. A. SECRlST III et Coll. (J. A. SECRlST. };. !~;.
15 TIU'ARL J. M. RlORDA~ et J. A. MONTGOMERY. J. Med. Chem.. 1991. 3~. ~361-'~366?; ( J. A. MO~T&OMERY et J. A. SECRIST 111. PCT Int. Appl. U'O 910~$.0;~ ) à
parnr du 2-desoxy~4-thio-B-D-ery~ro~pentofurannose svnthétise selon BOBEK et Coll. (`s .
L. F~. M. BOBE~ J. Org. Chem.. 19?6, 41~ 3831-3834.) en utilisant le T!vlSTf comme catalvseur de coupla~e.
La s~thèse du 4'-thio 2'-désoxv-D- ribofurannose a fai~ l'objet d'un brevet ct de publlcanons - European Patcnt Applicanon. 0421 777 A I . R. T. WAL~;ER
- M. R. DYSON. P. L. COE et R. T. WALKER J. Chem. Soc. Chem. Comm. 1991.741-74~
- M R. DYSO~, P. L. COE et R. T WAL~;ER Carbohvdrale Res . 1991. 216. ';7-~48 Elle est decrite sur le schema ~:
FEUILLE DE REMPl_hCEMENT
WO 93/16095 ~ ! PCI`/FR93/00115 CHO
r)~ nO~
I r rLr~ anO
'~"2`J
0~ SBn ( ~ SBn ( v ` ~7 ~n anC~~( 9 0 ~ n OB~ OBn ~n i~ (vii) ~nO--~ ( viii, ix x ~ ~OAt ~nO RO
(i = HCl / MeOH. ii = BDBr I THF, iii = 8nSH / HCL iv = Ph3P / DEAD / BzOH i THF~ v =
McONa / MeOH / CH~C12~ vi = MsCl / Pyr.. vii -= Nal / CO3Ba / Acctone. ~ln - BC13 CH ~C12~ ix = p-toluovlCI~ x = Ac~O / H2S04) SCHEMA S
FEUILLE DE REMPLACEMENT
WO 93/16095 pcrtFR93/ool 15 J'1 Des ribothionucleosides dérivés des py~imidines ont fait l'objet du même brevet. Mais la svnthèse du thioribofi~rannose de depart a été realisee selon la methodc de E. ~. REIST.
- E J. REIST, D. E. GUEFFROY et L. GOODMAN. J. Am. Chem. Soc.~ 1964~ 84~ 5658.
5 1. 3.SYNTHESE DES SY~THONS DU 4'-THIO-BETA-D-RIBOFURA~OSE
NECESSAIRES A L'OBTENTlON DE THlOOLlGOMERES.
On a realisé la synthèse du L-thioLyxofurannose et du D-thioRibofuranslose en 7 etapes a pamr du D-ribose et du L-lyxose respectivement avec 29 et 21 % de rendemen~
respectivement. Cette synthèsc est illustree sur le schema 6.
Cuo ~0~ ' ~~ n ~_ 3nG~ C--r' 20~ 3nO OBn 2 o ~ ~ _ O
3nC OAc ~
3~ 09n 9r!C r~n '3 (i = MeOH, HCI~ BnBr~ KOH; iii = HCL.H~O.dioxane; iv = BnSH. HCI. ~ = ~tesCL.
pyr.: vi = NBu41. BaCO3; ~ni = Hg(OAc)2) FEUILLE DE REMPLA~EMENT
WO 93/1609~ PCr/FR93/00 Ls synthè~e pour obtenir le thio-D-ribofur~nno~e utilise le L~ o~e comme produit de départ comme d~n~ b ~nthese de WHISTLER ( page l9). Ce~te strstegie e~t appelée strategie C1--C4 . En effet. I'stomc de soufre e~t tout d'abord introduit en position anomère et une substitution nucleophile SN2 entre l'~tome de soufre porté par le5 carbone anomère (Cl) et le c~rbone C4 porteur d'u~ OH activé par un groupementMe~yl (Ms) ess en3uite e~fectuée. Cette str~tegie sppliquée ~ 1~ synthèse du ~thio-D-ribofurannose et du 4-thio-lrlyxofursnnose rsemble i celle que WALKER a utilisépour parvenir i la série 2~ o~y-D-ri~ofursnno~e ( Brevet ~ur. Pat. 0421 777 A 1 psge
6). Par e~emple, le produit S (Schema S) de WALKER est semblable à notre produit 10 (Schema 6) en serie L-L~xofurannose.
~G ~nO~ ~ ;
OA~ 1 Base ~ B
éterocyclique \~
~ n EnO OBn 13 ~ - I t~3, 14 -B - U 15~, 15B
B = ~ 16~, 16B
B - A 11~ ,n `~
(i = BSA T~SSTf~CH3CN; ii = BBr3, CH Cl~
La svnthèse des thionucleosides de l'uracilc ~ de la thvm~ne et de la cvtosine a ete effectuee en utilisant le bis-lruncthylsilvl acctamite (BSA) conune a~ent silvlant ct Ic tnmcthvlsihl trifluoromethanc sulfGnate (TMSTfl comme agent de couplage. Les nucleosides O et B ont eté obtenus avec 74 . 77 et 7Q % de .~udement rcspectivcmcnt ~ La s~thcse des thionucleosides de l'adenine a è~e rea1iscc pu le SnC14 dans l'acctorutrile. ~es nucleosldes O
35 et B sont obtcnus avcc 58 % de rendement (Schema 7)~
Il. SYNTHESE D'OLlGO-l~llONUCLEOTlDES SUR SUPPORT SOLIDE.
FElJlL~E DE f~El~Pl.ACEhlENT
WO g3/16095 PCI`/FR93/00115 ~ s . ~ 1 3 o La s~nthèse supportée des B oli~o-thionbonuclcoodes a cte effecn~ee à l aldc d un s~nthe~seur GENE modèle APPLIED BIOSYSTEM 31 8A sclon la mcthode aw phosphorsmidites Elle est semblable à cclle dccrite pour la scric ~ oligodesoxy~ibo~ucleonde naturelle par 5 CARUTHERS ct Coll (S~ L BEAUCAGE et M H CARUTHERS. Jélrahedron Lel~.
1981. 22. 18S9 1862; L ~. Mc BRlDE ct M H CARUTHERS, Tetr~hedron Letl.. 1983. 24.
~45-248.) ct a celle decnte par USM~i et Coll pour les oligoribonucleatidcs (~ l,'SI~
OGILVIE. M Y. JlANG et R J. CEDERGRE~'. J An~ Chem. Soc.. 1987. 109. 7845-7854.3 Cette ~ynthèse a nécessite 1) Ls ~r~on de synthons B d~ioribonucleoside phosphoramidites S correspondant aux bascs T. U. C, A et G.
I13 La fonc~onnalisation du support solide inco~porant un dcnve B
thionbo~ucléosidique .
m) L'élonp~on te la chai~c oligothioribonuclcondi4ue à }'aide d`un svnthcnseur automatique~
IV) Enfin, au telme tu Dombre requis de cycles de sy~thèse~ l'oligothionucleo~ide a etc decroche dc so~ suppor~ deprotege et purifie Il.1 - SyDtb~e du pbosphonmidite de~ bê~-thioribonucleoside 26 a-d.
Il 1 I Syn~èse d,es den~es 5'-DmTr-2'~TBDMS (Schéma 8) Le probleme maje~ da~s la s~thesc chimlque des oligonbonuclcosidcs cst la presence de l~ydroxyle en 2' t~s lc cyclc ribosc ou thioribosc ~ui da~ande une protection selecnve La sclcc~ao~ d'un groupcmcnt protec~cur pour l~ydroxyle en 2' doit colTespondrc a plusleurs critères, il doi~ être st~b}e:
- sous les w~diaoDs dc couplage pendant la deprotec~oo des ~roupements protecteurs en 5' pour pennenre l'extension de 1~1 chaine - pendant l'oxytuion d~s le cas dc la methode aux phosphites tnesters - pcntant le masquagc qui SUit le coupla~e.
- pend~nt b tcprosecsion dcs groupements protectcurs dcs ~mincs cxoc~cllqucs - pendant la dcprotcction tes phospbatcs.
- et d~s Ic cas des s~mthcses sur supp~r~ solide pcndant Ic cli~ragc de l`olleomcre du suppor~.
FEUILLE DE REMPLA~EMENT
WO 93/16095 ~ PCI /FR93/OOl lS
Fma~ement ce groupement pro~ccteur doit ctre cnleve sous dcs co~ditions très douces pow ev~ter une attaquc de la fonc~ion hydroxyle en 2' lib~ree sur la liuson phosphodiester adjacente.
5 ~ n nom~rc impor~nt dc stratégics p~ur protcger les hydroxyles en 2' ODt ete dcveloppees et illus~rcnt les tifficultes ~ans lc choix tu schema de protecnon tes groupemcnts hvdroxvles.
IC. B. REESE. Nucleosides Nvcleolldes. 1985, 4. 117-127; R. }CIER~ECK. M. H.
CARUTHERS. C. E. LONGFEI_LOW. D. SW~NTON. D. H. TURNIER et S. M. FREIER
Blochem~slrv. 1986. 2S, 7840-7846; S. IU'AI et E. OHTSUIC~ Nucleic Acids Res.. 19~8.
16~ 9443-9456;
10 C. LEHMA~. Y. Z. XU. C. CHRlSTOWULOU. Z. K. TAN et M. ~. G.UT. ~vucletc Ac~ es.. 1989, 17. 2379-2390; T. TANAKA~ S. TAMATSUICU~l. et M. IKEHAR~
h~ucleicAcids Res.. 1986, 14, 626S-62?9.).
L'uilis tion dc groupements protectc~s alkylsilyl et not~nmcnt le ler~-butyldimethvlsil~l ~TBDMS) pour l~ytroxy!e en 2' a facilité la sy~thèse des oligoribonucleotides. Le ~oupement TBDMS est suffis~ment st~blc duls des contitio~s acides ou basiques et est facilemcnt c~leve pu le fluorurc te ~ctro bu~yl ~o~ium d~s le I~IF pour être utilise dl~ns la strategic cn phase solide (N. USMAN, K. K. OGILVIE, M. Y. JU.~Ci ct R. L.
LEDERGEN~ J. An~ Che~ Soc.~ 1987. 109, 784S-78S4; N. USMAN~ K. NICOGHOSIA~.
R. L. CEDERGl~EN et K. K. OGlLVIE, Proc. Na~L Sct. USA, 1988, 8S, S764-S768.; S. A.
SCANNGE. C. F. FRANC~Cl,Y~ et N. USMAN. ~uclcic Acids Res., 1990~ 18~ 5433-S441.;K. K. OGlLVIE et M. J. NEMER re~ cdron Len., 1980, 21, 41S9: R T. PO~ et K. K. OGILVIE~ Nucleosides Nucfeondes~ 1984~ 3~ 48S: R. T. PON et ~. K. OGll VIE~
~ra~edron Le~., 1984, 2S~ 713.) On a donc appliqué en scric B oligothioribonucleo~de le schema de protccrion utilise pour les nucléosites oxyge~es (Schema 8).
A savoir lcs protec~oDs:
zoyl pour l'adcDinc et la c~osine~ isoButyl po~ la guani~c en tant que protccoondes groupeme~ ino exocycliques - Dime~oxy~ityl (DmTr) pour prote~er les hydroxyles pr~ires en 5`.
- ~ert-butyldimé~ymsi}yl (TBDMS) pour prote~er l~ydroxyle sccondaire en ' - Me~oxy po~ la protecion des phosphates~
La premie ~pe permet de prote~ 1 bydroxyle libre en 5' pu u~ ~upcment aclde labile le DmTr (Scbema ~).Ainsi le denve nucleosidique ~ est trute par le chlorure de dim~box~itylc ( 1.27 cqt~ivalcnts mol~r:es~ d~s la pyTid~ne Jnhydrc sous a~nosphere 3~ incste. Aprcs t~cnt usuel du mel~ge ~o~el, le dcnvc dim~thoxv~i~vle 23 est p~fie p~r chrom togr phie sur ~el dc silice et isolc avec tcs rcndements ~uisnt de 70 8Q %.
FEUILLE DE REMPLA~EMENT
wo 43/t60s~ PCr/FR93/00 iJ 3~
Les caractéristiques physico-chimiqucs de ces denvés 23 ( R.M.N.~ Masse~ sont en accord avec les strurure^ proposees.
( i ) ~ 24~-i ' I
~û ~ Hr` 3Li 22 ~-~J 23 c~ r~l B
~ ~ .
n ~3~ 0 OH
25 o-d ( i = DmTrCI. p~. ii = TBDMSCI. p~
Les abre~iuions on~ les si~nifica~ions sulvantes:
a~ B = T = Th~une b- B = U = ~uraGile.
c B = CE~z - N-Bc~zoyl~Cvtosine.
25 d- B = AB~ = N Benzoyl~Adenine.
e- B - GPal = N-Palmitoyl~2-G~ ine.
tr = Dimét~oxy 4,4'-ttityl. iPr = Isopro~yl. Bz - Benzoyl. TBD~lS = tert-butyldimedlylsilyl. (iP~)2P(Cl)OMe = Chloro. (~ ~1 diisopropyl~o.metho~vphospllme SCHl~MA 8 La tewueme éu~e (Schema 8) conslste cn la protection te l~ydroxvle secondalre en ' Or.
tura~ la silyla~on U~l mélan~e de ~ silyl ~4 et dc SOD re~oisomè~e ;'-~-sll~l 'S est obtenu ( K. K~ OGlLV~E ct D. W. E~TWlSl-LE~ Carbo~d ~es.. 1981. 89. '0;-210. K KOGILVIE~ A. L. SCHIFMA~ ct C. L. PE~NEY. Can. J. C~m.~ 19~9. 57. U;0. G H
HAKIMELAHI. Z. A. PROBA et IC. ~;. OGIL~IE. Can J. Chem.. 1982. 60. 110~ ~ Ces isomè~es toiv~t e~e scp~res avec beaucoup de soins sur coloDne de ~el de slllce afm ~EUILLE DE REMPLACEME~NT
WO 93/16095 Pcr/FRs3/oo1l5 I~ ~ r ~ , s ~
d'ob~cnir le denvc 2'-O-TBDMS 24 avec une purete superieure a 99.95 /O mesuree par CLPH.
En cffe~ si ce n'cst pas le cas. les etapes ultericures nous conduiront à des melan~es d'oli~othionucleotite S'-3' attendus avec l'lsomere indes~rable 5' 2'.
5 En conseque~ce~ la pureté du 5'-O-DmTr-2'-O-silyl 24 est primordiale pour unc borme svnthèse.
Ainsi. l'obten~on des composes 5'-DrnTr-2'-~TBDMS 24 a tout d'abort eté réalisee selon la methode d'OGILVIE et Coll. (~;. K. C)GlLVlE. A. L. SCHIFMAN et C. L. PE~E`~.
(`an. J. Chem.. 1979..S7. 2230.) qul consis~e à condenser 23 avcc du chlosure de l~rl-10 butyldiméthylsilyle (TBDMSCl) (1.2 equivalent molure) tans la py~idi~e en presenced'in~itazole (2.6 eqwvalenu molures). En fm de reaction~ on obtient un melan~c de den~e 2'-O-TBDMS 24 et te son isomere ;'-O-TBDMS 2S. Le compose anendu X4 est sèpare du melange par chromuographic sur colonne de ~el te silice.
Il est ensuite possible par une reaction d'equilibration d'obt~ir 24 à pamr dc son isomerc ~'-15 O-TBDMS ~ (S. S. JONES et C. B. REESE. J. Chem. Soc. Perl~7n Trans 1. 1979. 2762.).
Cette ~grasiorl tu groupement TBDMS est iD~moleculaire et s'effecnle la un intenncdiaire possedant un atome de silicium pentavalent. L'isomerisation tu dcnve ;'-O-TBDMS obtenu p.recédemment apres une prcmicre sepa~ano~ chromato~raphque cst effcctuec tans l'éthanol à temperature ambiante pcnd~t une nutt. Les dcux isomères de position ùnsi obtenus sont à nouveau sct~ares par c~romato8raphie sur colonne de ~el de 20 silice. Cettc op~ ion d'isomensation sui~rie d'unc p~ific~on est repetee trois fois Cependant les rentemc~ts en 5' DmTr-2'~0-TBDMS ~4 obtenus par cette methode ~ ~0 a ~0 % selon les bases) nc nous ont pas puu sstisfaisants. Nous en avons utilise une au~re. plus recente~ mise au point pu OGIL~IE ( G. H. HAKIMELAHI. Z. .~. PROB.~ et l; ~
OGILVIE~ Con. J. C~em.. 198. 60. 1106.) 4ui pcrmet l'introduction prefcrcnnellc du 25 TBDMS en positton ~' dcs ribo~ucleosides B. Ce~te tec~ique preconise l'utilisat~oo de sels d'argcnts.
Ainsi le S'~ hoxyaityl 23 est condense avec du chlomre de TBDMS ( l.3 equlvalents molaircs) en prescncc de iitratc d'argcnt ( 1.2 eguivalen~ molaires~ et dc 3.7 equl~alents de pvridinc dar~s lc THF anhydre. Après punfication par chromatographie sur coloMe de ~el de 30 silicc on ob~ent S6 % de rendement en W et '~7 .~O en 5'-DmTr-3'-O-TBDMS 2~
En consequence. Ic S`-DmTr-2'4-TBD~S 24 est obtenu dans ces nouvelles condmons en une seule hape avec u~ meillew rendemen~ mùs la selecti~ e d'introducDon du groupement TBDMS en 2' n'est pas amelioree .
11.1.2 Syntbes des denves pbosphoralDIdi~es ~ ~Scbema 9) FEUtLLE Q~: R~MPL~CEMENT
WO 93/16095 PCl`tFR93/00115 n ~ r ~, Les quatre B thioribonucleosides phosphoramidites l\i-proteges 26 R~i sont ensuite obtcnus a pamr des 5'-DmTr-2'-O-TBDMS B thioribonucléosides ~-protéges colTespondants 2 (Schema 9~.
Le derive nucleosidi~ue 24 a éte trate par du chJoro N. N diisopropylamino methoxv 5 phosphine ( '.5 equivalents molaires~ en psésence de ~.~.N diisopropyl éthylamine (DIE.
dans ~e dichloromethane sous atmosphère intc. Lc d~ivé phosphoramidite 26 a ete purifie par chromato~rap~ie sur gel de silice ct Iyopbilise dans le bcnzènc~ les phosphoramidites 26 a-d sont obtenus avec des rendements vanant de 78 à 80 % selon la nature dle la base.
:,~Trr`-- S 3 , . ~ r~mTrO-- -~
~Q ~T~J~S ( jPr)2N \ ~ VTE~US
24^-d ' 26 !\/leC
i = (iPr) ~P(CI)OMe~ DEA DMAP~ CH ~C12) SCHEMA ~
Les analv~cs dcs spectrcs de RM~ du 31P et du lH de 26 montrent clslrement quc nous obtenons une seule paire de di~stereoisomères ce qui etablit la puretc rc~ioisomènque des 25 compo~es obtenus.
En e~et. ~uelqucs wteuJs (R. ~CIER~EK M. H. CARUTHERS. C. E. LOl`iGFELLO~. D.
SWWON, D. H. TURNER et S. M. FREER BlochemJs~n~, 1986. 2S~ 7840~78~6 ~ a~slcnt emis l~ypoth~se que lcs groupemcnts silyles en position 2' n'etaicnt pas stables dans les condioons de la phosph~ylaoon. Cependant~ il B cte mODt~ (W, K. 1;OHLER ~
SCHLOSSERM, G. CHARUBALA et W PFLEIDLERER Chemlsln~ and Blolo~ of 30 ,~cleosldes and Nucleo~ides~ Academic Press, ~lew York. 1978~ pp 347 ;58: }i. ~
OGILVIE Ct D. W. E~STLE~ Carbo~trate Res.~ 198E 89~ 20;-210: ~ ~S~t.~;. ~;.
~;. OGILVIE M. Y. JLANG Ct R J. CEDERGRE~. J. Am. Ch~ Soc.. 1987. 109. 7845-7854.~ qUC leS 8rOl~pCS ~IS;1VIeS m;~t danS kS SOI~tS PrOnqUeS COmme le methanO1OU d~S 1CS SOIU~OnS aqUCUSCS COmme 1e mC1an8C p~ nC/eaU. ~S CeS ~OUPementS
35 Sj1Y1CS SOnt S~bleS danS 1eS SOI~tS ~hydreS et nOt~Cnt ~1eS baSeS nOn PrOnqUeS
COmme 1a pyrid~C ~hydrC (~;~ }C. OG1LVIE~ D. W. ENTV~STLE~ Carboh dra~ s.
1981. 89 203-210; W. KOHLER W. SCHLOSSER G. CHARUBAL.~ e~
FEUIL~E DE REMPLA~EMENT
WO 93/16095 "~ PCl /FR93/00115 PFLEIDERER Chemis~ry and Blology of ~lucleosides ond ~ucleot-des, Acadcmic Press.
Ncw York, 1978, pp 347-3S8.). D'autre par~ il a cté clairemcnt démontre cn scne ribonucléotidc que l'utilisation dcs 2'-O-silyl ribonuclcosides tans la synthèsed'oligoribonucltotidcs conduit exclusivcmcnt à des liusons 5'-3' (K~ K. OGILVIE. M. J.
5 ~iEMER Telrahedron Lett.. 1980. 21. 4159: R. T. PON ct K, K OGILVIE. Terrahedron Len., 1984, 2S~ 713; R T PO~. a K. K. OGILVIE, Nuclcosides Nucleondes. 1984. 3.
48S;P. J. GAREGG. 1. L~DH. I. STAWI~SKL et R STROMBERG. Tetrahedron Le~
1986, 27. 40SS-40S8). La synd~cse de phosphoranuditcs n'est pas stéreospccifique ct la fonoaoon en 4u~mtcs egales des deux diastercoisomeres est tue à la chiralitc de l'atomc dc phosphore de configur tion R ou S. La formation dc ces dcux produits n'est pas genante 10 duls b mcsure où les iéactions d'oxydation ulterieures sup~nt ce~te chir~lite.
Il. 2. PARTE EXPER~IENTALE
M6thodc gencnk pour la prcparation des 5'~dimctboxvtrityl N--cyi 4'-thio-~D-15 r~bonuckosid~23 -d.
A u~c solu~on dc N-wyl ~dliofibonucleoside 23 a-d ( lmmole) dans la py~itine anhydre (S~6ml) est ~jouté du chlon~re de d~méthoxym~rle (1.2?mmole, 430mg). Le mel~e réac~olmcl est gité i ~e ambiulte sous a~Dosphèrc ine~tc pend nt 90 a 120 n~in puis du mé~ol (lml) cst ~jouté. Après 10 minutcs t'~tion suppléme~taire. Ie mel~e 20 rc ctionnd est versé sur une solu~oD aqueuse s~ec te bic rbonate de sodium (~Sml) et Ics produits sont ex~its avcc du dichlorometh~e (2 x 20ml), Les phases or~anlques sont lavecs avec dc l'c u (2 x 100ml) puis secbees sur sulfate dc sodit~D et filtrees. Le filtsat cst evaporc sous pression reduite et le rcsidu ob~u est chrom-togr~hié sur une colonne de ~el de silice, L'eh~ ef~ecnlee avec un mél~ge CH2C12/MeOH 98n en presencc de tAe~ylu~ e 1%; lcs ~o~s cont~n~nt le protuit sont.evaporees i sec et les nucleosides 25 23 ~-d sont obteDus sous fomle d'une huile.
1-14'-th~5'~dim~tbo~trltyle~ nnnosyl~Thymine Relldc~en~ 68 %.
Spcctromé~ie dc m~ sse FAB>0 NOBA mJz = 577 [M+Hl~ 303 lDmTrl ~
30 RM~ IH tDMSOd6. 360MHz) ~ 24~ ( s. 1 H~ NH); 7.44~ ( s~ I H~ H6): 6.87-7~30~ t m.
13H~HArom~iques);S,83,(d,1H,Hl~,Jl~2~=7,0~;S.S3,(d.1H~OH~.JoH~ =5.8);
5 3O` ( d~ l H` oH3~ JoH~3~ ~ 4~ 4~l4~ ~ td~ l H~ H2~ J2~ 6~9~ ~l7~ 3~ = 3 o); ~ oo ~
H~ H3', J3',2' ~ 3.0~ J3',4' ~ 3~0); 3~69~ ( s~ 6 H, OMe); 3.30, ( dd lH. H4~ m. 7 ~1.
Hs~, Hs~); 1,60, ( s, 3 H, CH3)~
1-14'.1hio S-~}di~tbo~ytriqle l~ n~ no~ Uncile ~.
Re~ nt 70%.
FEUILI_E DE REMPL~SEMENT
WO 93/1609~ PCl`/FR93/00115 . .. _ . . ~ ., _ R~ lH (DMSOd6, 360 MH2) ~ 11.31~ (s. I H. NH~; 7.70. (d, 1 H, H6. J6,S = 8 0)~ 7 40 6 89. (ITL 13 H. H aromatiques du groupement dmTr); 5.84 (~ I H. H~ 1 ?' = S 7). 5.~3 1 H- OH2~. JoH2~ 5.6), 5.48. (d~ I H. Hs. J5.6 ~ 8.0); 5.26, (d, 1 H, OH3. JoH3 3 =~45):4.02.(m.2H.H~.H3~);3.74~ts.6H.OMe).3.31.(~3H.~4~.Hs.Hs ) 5 Spec~ome~c de m~sse FAB~O NOBA ~ z = S63 ~+H~+, 303 [DmTr~-1-14'-~hio S'-O dimetho~rtrityle ~D ribofur~nno~yllN~beDzoylCyto~ine 23 c Rendcmcnt 69 %.
R~ ' lH (D~lSOt6. 2SO M~:lz) o 11.32. ~s. lH. NH); 8.40. (~ lH. H6. J6.s = 7.5); 8.01.
(~ 2H, Ho du ~oup~ment bc~lzoylc): 7.63. (~ lH, HS. IS.6 - 7.3); 7 44. (~L 17H. H
10 aroma~ques tu gJoupemcnt DmTr ct Hm.p du groupne~t benzoyle); S.88.(~ lH. H1Jl ?~ = 4.1); S.73, (d~ IH~ OH2~ JoH ~ = S.2); 5.27.~4 IH, OH3~. ~O~.H3' = 5.7). 4 06.~m.
~H. H~J2~ 1~ = 4 0- ]2',3' = 3 7 J2'.0H = S.2); 4.03.~m~ lH, H3~, l3~ 2~ = 3 7. ~; ~ = S.;.
~3~.0H - 5.7); 3.76.(s. 6H. OCH3 du ~oupcmcnt DmTr); 3.43.(m. 3H. H4 ~ Hs~ct H~ ).
15 S~ométrie d~ massc }:AB>O NOBA m/z = 666 [M+HI+, 51~ [M+H-0CONH~]+~
303 lDmTrl +
1~14'~thiD 5'~dim~thosytrityle ~ribofbnDno~ N6-be~oyl~dénine 23 d Rcndement 70 %
R~I~' lH (DMSOd6~ 2SO MHz) ~ 11.25,( s. IH. NH); 8.63, (s, lH, Hg); 8.57, (s. lH. ~
20 8 04. (t. 2H. Ho du groupemc~t b~oylc~; 7.Sl, (m. 13H. H aromstiqucs du ~roupement DmTr): 6.92. (d~ 3~ Hm.p du group~mcnt benzoyle); 5.98. (d. lH. H~ = S 8). S.75.
~d- lH OH~ JOH,2~=3~);S4S.(d~ IH.OH3,JoH3~=2.5):470.(nL IH.H~ 6.(n~
lH. H3~); 3.74,( s~ 6}1, OCH3 du ~Foupemcnt DmTr~; 3.53. (m~ 3H. H4~.Hs~ e~ H
Spec~mc~ne de massc FAB>0 NOBA m/z = 690 lM I Hl~. 303 ~DmTrl+
5 M~th~e gen~nle pour b pr~p~ntion d~ 2'~ bu~ldim~th~ ih~1-4'-thio-S'~
dim~tho~ ql~N~cyl~ribon~Jcteo~id ~ el de leur i~o~ère 3'-l~D~S 25 A une sohtio~l de S'~dimethox~ilvl 4'-thio ~J-acyl B-~ribonucleoside ~3 ~-d ( Immole~
dans le THF ~n~ydrc (lOml) est ajoutc du mtrate d'~r8ent (1.2mmole~ 203m~). Lc mel-n~c 30 rcactioDnel est alors ~gitc S miDu~cs à tem~turc ambi~tc a~t l'atdi~on du chlonue de lerl-buryldimethylsilyle (TBDMSCl. 1.3mmole. 195mg) et de la py~idine anh~r~c (3.7mmole. 0.193ml). L`~itatioD à temperan~re u~bi~te est lors prolon~ce pendant 2~ h puis la soltmon hete~ogene est filtree av-nt d'ctre versee d~s unc solu~on a4ueusc de biwbonate de sodium i S% (30mJ). Lcs ptoduits SOD cx~its avec tu ~iebloromethanc(3x20ml) et ks ph~s otE~niques sont lavecs avec de l'eau puis secbees sur sulfate de 3~ sodium ct fil~es. Le Sltrat est cvapo* à scc et le residu est c~ographie sur uDe colonne dc gel de silice cn utilisant commc cluant un meb~e dc CH~Cl ~/AcOEt: 9~ S puls I:EUILLE DE REMPLACEMENT
WO 93~16095 PCl'/FR93/00115 f~ ~ r~ ,~
,., ,~, ~. , , ` , de C~?Cl~/AcOEt:80/20 . Les ~acaons contenant le produit desire (2'-O-TBDMS 24 a-d) sont reE~oupccs et évaporécs à sec. L'isomere 3'-O-TBDMS 2S a-d est ensuite obtenu.
1 -12'-0-tert-but~ldiméthylsilvl-4'-thio-5'-0-diméthox~trin~l-~D-ribofursnnosyl 5 Thymine ~.
Rendemcnt: 33 %.
Speclrome~ie dc masse F~>0 ~OBA mlz = 691 lM+H)+, 713 lM~ia]+.
R~T lH (DMSOd6, 300MHz): ~ 11.36, ( s. 1 H. NH); 7.58, ( s~ 1 H, H6): 7~33-6.90. ( m.
13 H. H Aroma~iques): ~.89~ ~ s. 1 H. H] . Jl ? = 6.1); 5.27, ( nL 1 H. OH3): 4.20. ( dd. I
H. H?. J~ = 6.10, ~?,3~= 3,5~: 3.97. ( m. 1 H. H3~); 3.73, ( s, 6 H. OMe): 3.36. ( m. 1 H.
10 H4):3.~5.(~2H.~s~.Hs~);1.58.(s.3H.CH3);0.81.(s.9H.tert-butvl):0Ø(d.6H.
!~Ae ~Si).
1-12'-0-iert-butyldiméthy!~ilyl~ thio-5'-0-dimétho~ytrityl~ ribofurannosvl 15 Ijracile 24 b.
Rcndement 56% .
Tf = 1 14~C.
RMN lH (DMSOd6, 360 MHz): ~ 11.20, (s. 1 H, NH); 7.81. (d. 1 H, H6. J6 5 = 8.1 ); 7.30-6.89. (m, 13 H, H asoma~iques du ~roupemcnt dmTr) 5.84, (~ 1 H. H~ ~ Jl' ~ = 5 ~); 5 50 (~ I H. Hs, ~5,6 = 8.1); 5.23. (d~ 1 H, OH3, JoH3 ,3 = 4.7), 4.11, (4 I H. H~ J~ 1~ = 5.5.
20 ~?~ 3 ~ = ;.5): 3.95. (m~ 1 H. H3~); ;.74. (s. 6 H. OMe); 3.38. (m, 2 H. H4. H5~ J~ ~ = 3.?8.
(~L 1 H. Hs~); 0.82, (s. 9 H. ~ert-butvl); 0.05, (~ 6 H. Me ~Si).
Spec~ome~c de masse FAB~0 NOBA n-lz = 677 [M ~ H) . 619 lM I H-ten-butane~-. 303[dmTr)-I-12'-0~ but~rldiméthylsiiyl~ thio-5'-0-diméthon~trityl-~D-ribofur~nnos~lI
!~i4 benxoylC~to~ine 24 c.
Rendement 32%.
H (DMSOd6~ 250 MHz): ~ 11.31. (s. IH, ~H); 8.51. (d~ 1~. H6~ J6.s = ~.3): 8.01.
(~ 2H. Ho du ~roupement benzoyle) 7.Sl. (rn 14H. H aromaoques du ~oupemcnt Dm~r et Hs): 6.93,( ~ 3H, Hm.p du ~roupemcnt bcnzoyle): 5.93.(~ lH. Hl . Jl ~ = ~ 0~: 5.20.(d.
lH. OH3~, JoH H3~ = 5.0); 4.14.(~ lH. H ~ 4.00.(~ lH H3 ); 3 76 ~s. 6H. OCH~ du ~roupement DmTr); 3.38.~ 3H. H4 . Hs~et Hs ~): 0.86. ~s. 9H. rerf-bu~l): 0 60. ~ 6H.
Me ~Si!
SpectrometTie dc masse FAB~0 NOBA mlz ?80 lM+HI~, 303 [DmTr)~
1-12'-0-ter.f-butyldim~thylsilvl-4'-thio-~'-0-dimetho%~ D-ribofur~nnos~ l ~6 benwyl~deni~e 24 d.
Ren~ement 3S %
FEUILLE DE REMPLACEMENT
WO 93/16095 PCI`/FR93/OOllS
R~ IH (DMSOd6, 2S0 ~z): ~ 11.2S,( s. lH~ NH); 8.64, (s~ lH, Hg); 8.61, (s~ lH~ H2)~
8.04. ~d. 2H, Ho du groupcment benzoyle). 7.51, (n~ 13H~ H ~rom~iqucs du groupement DmTr): 6.95, (d, 3H, Hm,p du groupemcnt ~nzoyle); 6.01, (d. IH, Hl~. Jl'.2' = 5 8); 5.48.
(~ lH, OH3~, JoH,3~ = 2.S); 4.70~ (nu lH. H~ ); 4.26, (m, IH, H3~); 3.75.( s. 6H. OCH3 du groupe~ncnt DmTr); 3~S3, (n~ 3H, H4~.11S n Hs~); 0.82~ (s. 9H, lerl-butyl); 0.50, (~ 6H.
MC2Sj) Spec~omc~c tc masse FAB>O NOBA m/z 804 [M+H]+, 303 lM l H] ' 1-13'-O tat-butyldimeth~l~ilyl-4'-thio-S'-O-dim~tho~ytrityl B-D-ribohnnno~yll , Th~mine 2S ~.
Re~dement 13%.
RM~ lH (DMSOd6, 360 M}lz): ~ 11.34, (5, lH; NH); 7.46, (s~ IH~ H6); 7.89-7.30~ Im.
13H.Harom~qucs);5.87.(d~ IH.Hl,J~ =7.8);S.46.(d~ lH.OH2~,JoH~=5.1):4 1,.
Im~ IH~ H3~): 4~11,(m, lH, H~, 32~ 1~ = 7.8, JoH,2` = 5.1); 3.73, (s. 6H~ OMe); 1.66~ (s~ 3H~
CH3); 0~84.(s. 9H. Ier~-butyl); 0.50,(d~ 6H.Me2Si).
1~l3~tat-buqldim~ tbio-s~ m~tho~ytriq~ ribohnnnos~
linciIe 2S b.
Re~demeslt 2r~
Tf = 109C.
RMN lH (DMS~ 360 MHz): S 11.30,(s. I H, ~H); 7.70, (d, 1 H~ H6~ J6 5 = 8.0): 7.30-6.89~ (13 H~ H a~om~i~ues du groupe-ment dmTr): 5.84, ~d~ 1 H, Hl~. Jl'.2' = 7.3): 5.57~ (d.
1 ~ H5~ JS.6 ~ 8~0); 5.46, (d~ I H. OH~. JoH2~2~ = 5 1): 4.12~ (~ I H- H3 J; ~
J3~4~ = 3~ 4~03~ (m, I H~ H2~); 3.74, (s. 6 H. OMe); 3.41. lnL 1 H. H4); ;.'1. (m~ ' H.
Hs~ Hs~); 0.08~ (s, 9 H, tert-butyl); 0.02. (~ 6 ~ Me2Si).
Spectromc~ie de ~sse FAB~O NOBA m~z 677 [M+~ 619 [M~H-tert-butane)-. 303 ~dmTr)t.
Cc composc a ~ mis eD prcscnce avec une soluion e~noVme~ylamine 0.25~o (~
pendant unc 12 h i t~ re ~mbia~te pour don~er en propor~on eg~le un melan~e ct 2S b.
1-13'~tat-butyldim~thyl~ilyl~ thio-5'~0 dim~tho~rit~ ribofur-nno~l 1'~4~be~o~1 cy~int ~.
Rcndement 31 ~/o.
RMN lH (DMSOd6, 2S0 MHz~: ~ 11.33. (s. lH. NH); 8.40. (d~ lH. H6. ~6 ~ = 7 4): 8 01.
(L 2~ Ho du grou~xment benzovle~; 7.60, (m, I4H. H uom~oques du ~roupement DmTr e~ Hs~; 6.92~ ( d, 3H, Hmp du groupement benz~yle); S.92,(d. lH. Hl, Jl'.'' = ~ 3);
5.60~(d, IH OH2~. JoH ~ s 5.0); 4.1S,(nL 2H~ H ~, H3~); 3.~S,(s~ 6H. OCH3 du IFoupement DmTr); 3.38.(~ 3H. H4: Hs~et Hs~); 0.79. (s. 9H, Jert~butyl); 0 00, ~d, 6H. Me-Si!.
Spectrom;c~ie dc massc FAB>0 NOBA m/z 780 ~M+H]+. 303 ~DmTr FEUILLE DE REMPLACEMENT
WO 93/16095 PCl~/FR93/00115 r l .t 1-13'-0-tcrt-but~yldimethgl~ilyl-4'-thio-S'~dim~tho~ytritvl ll-D-ribofur~nno~yl ~6-benzoyl ~d~nine ~.
Rendcment 29% .
R~ lH (DMSOd6~ 2S0 MHz~ 5,( s~ lH. NH); 8.64. (s. lH, Hg); 8.61, (s~ lH. H2);
5 8 04~ 2H. Ho du groupement ber~oylc)~ 7.51~ (nL 13H. H ~rom~ques du groupement DmTr): 6.9S. (d. 3H. Hm.p du ~roupement balzoyle); 6.01~ (d. IH~ Hl~. Jl~ ~ = S 8): S 79~
(d~ IH~ OH~. JoH~r ~ 3.S); 4 70. (~ lH. H~); 4.26. ~m~ IH. H3~); 3.7S~( s. 6H. OCH3 du ~ment ~Tr); 3.S3. (m. 3H. H4~.HS~ et Hs~ 0.82~ (s, 9H, Icrl-butyl); 0.01. ~ 6H.
!~c~Si).
Spectrometnc de m~ssc FAB>0 NOE~A m/z 804 lM~H] ' . 303 IM+H
Met~de ~ener~le de p~retion dff ~D nbonucl~o~ide phosphor~m;ditn 26 ~-d~
A une solu~ion des composes 24 ~-d (1 mmole) d~s du dichlorome~ne ~nhvdrc (3 8ml~
sont ~outes sous ~e inffte d' rgoll la N~N,N diiso~letbylulune (4 mmoles 15 0 7~ b~ chloro N~N~iiso~l_~_ (2 S~mole) 0 48ml) a la ~
(0 2~ole, 24 4mg) Le me~8e ~ctioDnel es~ ~itc de ~0 à
-- 90 ~ nbunte puis est dilue ~vec te I'~ate d'ethvlc (35ml) La solL~ cst l~vee s~lec de la s~umure (4~S0ml) puis ~vec dc l'e-u ('~xS0ml) La ph~orgal~ique est sechee sur sulf~te de sodium~ fih~ée et evaporee sous pression reduite Lc residu est cb_~hie sur colo~e de gel de silice et l'elutioo est re lisee i l' ide 20 d`un melu~ge de cyclobex~ne~ de dicbloromét~nc et de tnethylunine ~100/0/0 1 i SOIS010 1) Les produits 26 d soDt ob~e~us sous b fonne d'u~e poudrc blanchc apres Iyophilis tion d ns le b~ne 1-12'~rt-butyldim~thylsilyl-3'-N~N-diisopropylmétho~rphosphor~midite-4'thio-S' O-2 diméthorytrityle-~ribofursnnosyllThymine ~ (melange diastercoisomerique Rendcment 89%.
R~N31P~Cl)3CN) ~lSI,32etlS003 RM~ 1H 8 7 99, (s, 1 H, NH), ~ 6S, (~ 1 H, H6~; 7,3S-6 80 (m 13 H H uomaoques ~;S 97~ (~ I H H1~); 4,2S, (~ 1 H H~); 4 13 (~L 1 H H3~); 3 78 (s~ 6 H OMe); i 68 I H H4~); 3 S4~ (nL 2 H Hs~ Hs~); 3 35 (m~ 3 H McO du groupe~nent phosphorunJdltc 30 3 '5, (~ 2 H CH dcs ~roupements isopropyle); 1~60, (m 3 H CH3); I lS lm 12 H CH~
des groupements isopropyle); 0~86, (s 9 H #rt-butyl); 0 0S, (D~ 6 H~ Me ~Si) Spec~ome~ne de m~se F~0 NOBA m/z ~ 8S2 lM-H~
1-12'~1di~tbyl ibl-3'~N~-dii opropyl~ho~ypbospboro-midi-e-4'tllio S'-O~ ribohnnnosyllUncik~ gedi s#reoison~nque~
35 ~ R~Ddcm~78%.
RMN 31P~CDC13): ~ IS0.65 a ISO.S0.
FEUILLE DE REMPLACEI AENT
Wo 93/16095 pcr/FR93/ooll5 . i ,~ n ~, ~0 1 40 R~ IH (CD3CN,250 MHz): ~ 7.99~ (s~ 1 H. NH). 7.22, (m. I H. H6): 7.30-6.89. ~m. 13 H. H aromanques du groupcmcnt DmTr): 5.90. (m. 1 H, Hl~); 5.50. (m. 1 H. Hs); 4.13. ~m.
H. H2. H3~); 3.80, (s, 6 H, OMe du ~roupe DmTr); 3.58~ (m, 3 H, H4. Hs~ Hs ); 3.4 lm. ' H. ? CH des ~roupements isopropyle); 3.30 (m~ 3 H. MeO du ~roupement DmTr)~
5 1.19. (m. 1~ H. CH3 des ~oupements isopropyle); 0.84. (s. 9 H. Ierl-but~ 0.05. (m. S H.
Me~Si).
Spectrometne de masse FAB>0 NOBA mlz = 534 [MtH-DmTrHI+
I -12`-0-tcrt-but~ldimethylsilyl-3'-N,N-diisopropylmethosyphosphoro-midite-~1'shio-5'-O-dimethoxytrityle-l~D-ribofur~nnosyll !~4-benzoyl Cyto~ine 26 c.
10 Rendcment 7~% .
RM~' 31P (CD3C~): 8 1Sl~30 et 150.05 Spectrometric de masse FAB>O PEG mJz 941 [M+H~, 637 IM+H-DmTrH) 303 ~DmTr]~
1-12'-0-tert-butyldiméthylsilyl-3'-N,N-diisopropvlmethoxyphosphoroamidi~ 1'thi~'-O-diméthoxytrityle-~D-ribofurannosyll r~i~benzoyl Adenine 26 d Rendement 71% .
RM~ 31P (CDC13): ~ ISI.26 et 150,01 Spectromct~ie dc masse FAB~O PEG nuz 964 ~M+H~-~ 600 ~M ' H-DmTrH] 303 ~DmTr]~.
Il. 3 Fonctionalis~tion du support solide (Schema 10).
Le support solide ou LCA-CPG ( LoDg Chain Alkylamine Controllcd Pore Glass) P-l a tout 20 d`abord etc acive par une solution d'acide trichloroacetique à 3 % dans le dich~oromethane à
temperature ambiante pendsDt 2 à 3 heures afin de liberer le plus grand nombrc de ~roupements amino. ce qui cnnduit au maximum de sites reactifs sur la surfacc des billes de verre. Le supporl ainsi active P-2 est a~ors fonctiormalise par coupla~e avec de l'anhvdride succinique dans ia pyridine en préscnce de 4-DMAP ce qui conduit à P-3. Dans l`etape suivante. Ie nuclcoside 3'-silyle 25 est utilise puisqu' il a éte obtenu penàant la reacnon de 25 silylation des thioribonucleosides et n'est pas necessaire pour la svnthèse d'oli~othionucleohdcs co~tenant la liaison phosphodiester 3`-5'. Ainsi. P-3 acti~,e par le l-(3-dime~ylaminopropyl~ 3-ethylcarbodiimide (~)EC) en presence de 4-~MAP est rnis en reactioD dans la pyridine anhy~re avec le 5'-O-DmTr-3`-OTBDMS ~thioribonucleoside 2~. Les sites non uilis~es du suppon sont masques à l`aide de pipcridine. Une derniere etape 30 de masquage à l'ar~vdride aceique en presence de collidine dans le THF conduit à P-6. La quas~tite de nucleoside fixee sur le suppon est dcterminee par spec~ophotometrie V. ~ . en mesurant la quan~ate de cation dimethox~itvle libere après un ~aitement par une solution a 10 % d'acide tric~oroacetique dans le dichloromcthane. Lc dene de fonctionnallsation ~arie de 21 à 38 ,~unole par gran~nc dc suppon suivant la nan~re de la basc nuclcosidique.
.
FEUILLE OE REMPLACEMENT
WO 93/1609~i ~ PCI`/FR93/00115 ,., ~., . . ~
(~\~NH ( i )~A~ ( ii )~NH-C(O)-(c~12) s ?2 ~3 ( 'ii ) o DmirO B DmTrO
1~/ iv lST~0MS0 0(0)C ~h~ T~OMSO 0(0)C w~~
Cl C~ ,~J ~J
CI(~OlC-(CHl)-C(O)-HN~p5 HO2C-(CHl)-C(O)-Hh~
20 Cl Cl v, vi 0mTrOl S
~,/ \~/
~I
I aDMSO O(O)C ~,~
CN-O2C-(CH2)-C(O)-HN~ P6 ( i = TCA3/~, CH2C:12; ii = anhydride succinique. DMAP, Pyr.; iii = S'~DmTr~'~ 3 l~DMS~ nbo~ucléositc, DMAP, NEt3, DEC Pyr.; i~r = pe~t~chlorophenoh v = pipcridine; vi = Ac20 O.SM da~s THF ) W O 93/16095 PCl`/FR93/OOllS
Il. 4. Svnthe~e sutomati~ee des thiooiigonucl~otide~ (Schem~ 11).
Les thiooligonucleo~idcs ont ete svnthe~ses sur un s~nthetiseu~ a AD~ (Applied ~iosvstems modele ;81 .~). Le c~clc d'elon~anon compor~e quat~re etapes importantes: -Desntvlarion du nucleoside ou de l`oli~onucleotide fixe sur le suppon solidc.
Condensation du phosphoramidi~e acnve par le tetr~ole sur l'hvdroxvle 5` libre du nucleoside ou de l'oli~onucleonde.
Aasqua~e des foncDons 5'-hvdroxvles qui n'ont ,~as rea~i.
Oxvdanon des foncions phosphte~cstcr en phvspbotricster.
WO 93/16095 L~ PCl`/FR93/00115 ,`., . , ~ ~ . , ,~
~... o_~z ~Y m ~ LL' O
CL~ ~ ~ ~ V~
¢
~: m ,~
:C ~ ~.. o ~ u o ~a O ~ ~................ o~
U ~ ,"o i3 ¢ Z
E- ~"
Z
O
E- ~ ~
C ~ V ~ C ~ ~Z
~ fi ~ o~ ~
:E (~) Q (~) m~ O ~~~ . o Y"~
Q
~ !
FEUlllE~ DE REMPLACEMENT
WO 93/16095 PCI'/FRg3/00115 '` r~ ~ 4 4 r ~ `J ,t _, :
O a~
Q
E C
O ' ;~ '~
r~ . ~ r.,~ I
a~ O r .-1 -- E
:~ Q _ c tn ~ ~o~
_ ~ ~
Cl C ~
,~)'-~ i ~-/-9 _ .. _, ~, o ~ !
_1 c~ _ _~ _ ~FUILLE DE REMPLACEMENT
wO 93/16095 ~ pcr/FR93/ool15 Chaque synthese a etc effecnlee sur une colonnc contenant 40 mg de support solJde Le rendement de chaque incorporation cst dc 98 % évalue en mcsurant la concen~anon des canons dunethox,~tyles recuperes apres chaque coupbgc par traitement du suppon al'acide ~ichloroacetique.
Des lavages sont cffcctues entre chaque eulpc. et la durée t'un cycle d'elon~anon est dc 21.1 minutes pour la s,vnthese de l~omododccamerc 4'-thio~ ribonucleondc I BrS~
( Tablcau I ).
.
~umero I Etape ! Temps ~scc.3 I_ Solvant et Reacnfs I ¦Sechageet Lavage ! _ 24 _ MeC~ non ~ ¦ Detri~lat~on _ 8û TCA à 3% dans CH~CI~
3 ! Secha~e et Lava~e 74 _ ~ ~cC~-Argon _ ~ Couplage 915 amidite 0. IM(2 ~eq. )-~lcC~
tetrazole O.SM( lOeq. )~
.
_ Sechage _ ~5 _ A~80n 6 M~squagc ~3 Methyli~udazole-THF
?0 - - -- ---- Ac~Otlutitine/THF 1 1 8
~G ~nO~ ~ ;
OA~ 1 Base ~ B
éterocyclique \~
~ n EnO OBn 13 ~ - I t~3, 14 -B - U 15~, 15B
B = ~ 16~, 16B
B - A 11~ ,n `~
(i = BSA T~SSTf~CH3CN; ii = BBr3, CH Cl~
La svnthèse des thionucleosides de l'uracilc ~ de la thvm~ne et de la cvtosine a ete effectuee en utilisant le bis-lruncthylsilvl acctamite (BSA) conune a~ent silvlant ct Ic tnmcthvlsihl trifluoromethanc sulfGnate (TMSTfl comme agent de couplage. Les nucleosides O et B ont eté obtenus avec 74 . 77 et 7Q % de .~udement rcspectivcmcnt ~ La s~thcse des thionucleosides de l'adenine a è~e rea1iscc pu le SnC14 dans l'acctorutrile. ~es nucleosldes O
35 et B sont obtcnus avcc 58 % de rendement (Schema 7)~
Il. SYNTHESE D'OLlGO-l~llONUCLEOTlDES SUR SUPPORT SOLIDE.
FElJlL~E DE f~El~Pl.ACEhlENT
WO g3/16095 PCI`/FR93/00115 ~ s . ~ 1 3 o La s~nthèse supportée des B oli~o-thionbonuclcoodes a cte effecn~ee à l aldc d un s~nthe~seur GENE modèle APPLIED BIOSYSTEM 31 8A sclon la mcthode aw phosphorsmidites Elle est semblable à cclle dccrite pour la scric ~ oligodesoxy~ibo~ucleonde naturelle par 5 CARUTHERS ct Coll (S~ L BEAUCAGE et M H CARUTHERS. Jélrahedron Lel~.
1981. 22. 18S9 1862; L ~. Mc BRlDE ct M H CARUTHERS, Tetr~hedron Letl.. 1983. 24.
~45-248.) ct a celle decnte par USM~i et Coll pour les oligoribonucleatidcs (~ l,'SI~
OGILVIE. M Y. JlANG et R J. CEDERGRE~'. J An~ Chem. Soc.. 1987. 109. 7845-7854.3 Cette ~ynthèse a nécessite 1) Ls ~r~on de synthons B d~ioribonucleoside phosphoramidites S correspondant aux bascs T. U. C, A et G.
I13 La fonc~onnalisation du support solide inco~porant un dcnve B
thionbo~ucléosidique .
m) L'élonp~on te la chai~c oligothioribonuclcondi4ue à }'aide d`un svnthcnseur automatique~
IV) Enfin, au telme tu Dombre requis de cycles de sy~thèse~ l'oligothionucleo~ide a etc decroche dc so~ suppor~ deprotege et purifie Il.1 - SyDtb~e du pbosphonmidite de~ bê~-thioribonucleoside 26 a-d.
Il 1 I Syn~èse d,es den~es 5'-DmTr-2'~TBDMS (Schéma 8) Le probleme maje~ da~s la s~thesc chimlque des oligonbonuclcosidcs cst la presence de l~ydroxyle en 2' t~s lc cyclc ribosc ou thioribosc ~ui da~ande une protection selecnve La sclcc~ao~ d'un groupcmcnt protec~cur pour l~ydroxyle en 2' doit colTespondrc a plusleurs critères, il doi~ être st~b}e:
- sous les w~diaoDs dc couplage pendant la deprotec~oo des ~roupements protecteurs en 5' pour pennenre l'extension de 1~1 chaine - pendant l'oxytuion d~s le cas dc la methode aux phosphites tnesters - pcntant le masquagc qui SUit le coupla~e.
- pend~nt b tcprosecsion dcs groupements protectcurs dcs ~mincs cxoc~cllqucs - pendant la dcprotcction tes phospbatcs.
- et d~s Ic cas des s~mthcses sur supp~r~ solide pcndant Ic cli~ragc de l`olleomcre du suppor~.
FEUILLE DE REMPLA~EMENT
WO 93/16095 ~ PCI /FR93/OOl lS
Fma~ement ce groupement pro~ccteur doit ctre cnleve sous dcs co~ditions très douces pow ev~ter une attaquc de la fonc~ion hydroxyle en 2' lib~ree sur la liuson phosphodiester adjacente.
5 ~ n nom~rc impor~nt dc stratégics p~ur protcger les hydroxyles en 2' ODt ete dcveloppees et illus~rcnt les tifficultes ~ans lc choix tu schema de protecnon tes groupemcnts hvdroxvles.
IC. B. REESE. Nucleosides Nvcleolldes. 1985, 4. 117-127; R. }CIER~ECK. M. H.
CARUTHERS. C. E. LONGFEI_LOW. D. SW~NTON. D. H. TURNIER et S. M. FREIER
Blochem~slrv. 1986. 2S, 7840-7846; S. IU'AI et E. OHTSUIC~ Nucleic Acids Res.. 19~8.
16~ 9443-9456;
10 C. LEHMA~. Y. Z. XU. C. CHRlSTOWULOU. Z. K. TAN et M. ~. G.UT. ~vucletc Ac~ es.. 1989, 17. 2379-2390; T. TANAKA~ S. TAMATSUICU~l. et M. IKEHAR~
h~ucleicAcids Res.. 1986, 14, 626S-62?9.).
L'uilis tion dc groupements protectc~s alkylsilyl et not~nmcnt le ler~-butyldimethvlsil~l ~TBDMS) pour l~ytroxy!e en 2' a facilité la sy~thèse des oligoribonucleotides. Le ~oupement TBDMS est suffis~ment st~blc duls des contitio~s acides ou basiques et est facilemcnt c~leve pu le fluorurc te ~ctro bu~yl ~o~ium d~s le I~IF pour être utilise dl~ns la strategic cn phase solide (N. USMAN, K. K. OGILVIE, M. Y. JU.~Ci ct R. L.
LEDERGEN~ J. An~ Che~ Soc.~ 1987. 109, 784S-78S4; N. USMAN~ K. NICOGHOSIA~.
R. L. CEDERGl~EN et K. K. OGlLVIE, Proc. Na~L Sct. USA, 1988, 8S, S764-S768.; S. A.
SCANNGE. C. F. FRANC~Cl,Y~ et N. USMAN. ~uclcic Acids Res., 1990~ 18~ 5433-S441.;K. K. OGlLVIE et M. J. NEMER re~ cdron Len., 1980, 21, 41S9: R T. PO~ et K. K. OGILVIE~ Nucleosides Nucfeondes~ 1984~ 3~ 48S: R. T. PON et ~. K. OGll VIE~
~ra~edron Le~., 1984, 2S~ 713.) On a donc appliqué en scric B oligothioribonucleo~de le schema de protccrion utilise pour les nucléosites oxyge~es (Schema 8).
A savoir lcs protec~oDs:
zoyl pour l'adcDinc et la c~osine~ isoButyl po~ la guani~c en tant que protccoondes groupeme~ ino exocycliques - Dime~oxy~ityl (DmTr) pour prote~er les hydroxyles pr~ires en 5`.
- ~ert-butyldimé~ymsi}yl (TBDMS) pour prote~er l~ydroxyle sccondaire en ' - Me~oxy po~ la protecion des phosphates~
La premie ~pe permet de prote~ 1 bydroxyle libre en 5' pu u~ ~upcment aclde labile le DmTr (Scbema ~).Ainsi le denve nucleosidique ~ est trute par le chlorure de dim~box~itylc ( 1.27 cqt~ivalcnts mol~r:es~ d~s la pyTid~ne Jnhydrc sous a~nosphere 3~ incste. Aprcs t~cnt usuel du mel~ge ~o~el, le dcnvc dim~thoxv~i~vle 23 est p~fie p~r chrom togr phie sur ~el dc silice et isolc avec tcs rcndements ~uisnt de 70 8Q %.
FEUILLE DE REMPLA~EMENT
wo 43/t60s~ PCr/FR93/00 iJ 3~
Les caractéristiques physico-chimiqucs de ces denvés 23 ( R.M.N.~ Masse~ sont en accord avec les strurure^ proposees.
( i ) ~ 24~-i ' I
~û ~ Hr` 3Li 22 ~-~J 23 c~ r~l B
~ ~ .
n ~3~ 0 OH
25 o-d ( i = DmTrCI. p~. ii = TBDMSCI. p~
Les abre~iuions on~ les si~nifica~ions sulvantes:
a~ B = T = Th~une b- B = U = ~uraGile.
c B = CE~z - N-Bc~zoyl~Cvtosine.
25 d- B = AB~ = N Benzoyl~Adenine.
e- B - GPal = N-Palmitoyl~2-G~ ine.
tr = Dimét~oxy 4,4'-ttityl. iPr = Isopro~yl. Bz - Benzoyl. TBD~lS = tert-butyldimedlylsilyl. (iP~)2P(Cl)OMe = Chloro. (~ ~1 diisopropyl~o.metho~vphospllme SCHl~MA 8 La tewueme éu~e (Schema 8) conslste cn la protection te l~ydroxvle secondalre en ' Or.
tura~ la silyla~on U~l mélan~e de ~ silyl ~4 et dc SOD re~oisomè~e ;'-~-sll~l 'S est obtenu ( K. K~ OGlLV~E ct D. W. E~TWlSl-LE~ Carbo~d ~es.. 1981. 89. '0;-210. K KOGILVIE~ A. L. SCHIFMA~ ct C. L. PE~NEY. Can. J. C~m.~ 19~9. 57. U;0. G H
HAKIMELAHI. Z. A. PROBA et IC. ~;. OGIL~IE. Can J. Chem.. 1982. 60. 110~ ~ Ces isomè~es toiv~t e~e scp~res avec beaucoup de soins sur coloDne de ~el de slllce afm ~EUILLE DE REMPLACEME~NT
WO 93/16095 Pcr/FRs3/oo1l5 I~ ~ r ~ , s ~
d'ob~cnir le denvc 2'-O-TBDMS 24 avec une purete superieure a 99.95 /O mesuree par CLPH.
En cffe~ si ce n'cst pas le cas. les etapes ultericures nous conduiront à des melan~es d'oli~othionucleotite S'-3' attendus avec l'lsomere indes~rable 5' 2'.
5 En conseque~ce~ la pureté du 5'-O-DmTr-2'-O-silyl 24 est primordiale pour unc borme svnthèse.
Ainsi. l'obten~on des composes 5'-DrnTr-2'-~TBDMS 24 a tout d'abort eté réalisee selon la methode d'OGILVIE et Coll. (~;. K. C)GlLVlE. A. L. SCHIFMAN et C. L. PE~E`~.
(`an. J. Chem.. 1979..S7. 2230.) qul consis~e à condenser 23 avcc du chlosure de l~rl-10 butyldiméthylsilyle (TBDMSCl) (1.2 equivalent molure) tans la py~idi~e en presenced'in~itazole (2.6 eqwvalenu molures). En fm de reaction~ on obtient un melan~c de den~e 2'-O-TBDMS 24 et te son isomere ;'-O-TBDMS 2S. Le compose anendu X4 est sèpare du melange par chromuographic sur colonne de ~el te silice.
Il est ensuite possible par une reaction d'equilibration d'obt~ir 24 à pamr dc son isomerc ~'-15 O-TBDMS ~ (S. S. JONES et C. B. REESE. J. Chem. Soc. Perl~7n Trans 1. 1979. 2762.).
Cette ~grasiorl tu groupement TBDMS est iD~moleculaire et s'effecnle la un intenncdiaire possedant un atome de silicium pentavalent. L'isomerisation tu dcnve ;'-O-TBDMS obtenu p.recédemment apres une prcmicre sepa~ano~ chromato~raphque cst effcctuec tans l'éthanol à temperature ambiante pcnd~t une nutt. Les dcux isomères de position ùnsi obtenus sont à nouveau sct~ares par c~romato8raphie sur colonne de ~el de 20 silice. Cettc op~ ion d'isomensation sui~rie d'unc p~ific~on est repetee trois fois Cependant les rentemc~ts en 5' DmTr-2'~0-TBDMS ~4 obtenus par cette methode ~ ~0 a ~0 % selon les bases) nc nous ont pas puu sstisfaisants. Nous en avons utilise une au~re. plus recente~ mise au point pu OGIL~IE ( G. H. HAKIMELAHI. Z. .~. PROB.~ et l; ~
OGILVIE~ Con. J. C~em.. 198. 60. 1106.) 4ui pcrmet l'introduction prefcrcnnellc du 25 TBDMS en positton ~' dcs ribo~ucleosides B. Ce~te tec~ique preconise l'utilisat~oo de sels d'argcnts.
Ainsi le S'~ hoxyaityl 23 est condense avec du chlomre de TBDMS ( l.3 equlvalents molaircs) en prescncc de iitratc d'argcnt ( 1.2 eguivalen~ molaires~ et dc 3.7 equl~alents de pvridinc dar~s lc THF anhydre. Après punfication par chromatographie sur coloMe de ~el de 30 silicc on ob~ent S6 % de rendement en W et '~7 .~O en 5'-DmTr-3'-O-TBDMS 2~
En consequence. Ic S`-DmTr-2'4-TBD~S 24 est obtenu dans ces nouvelles condmons en une seule hape avec u~ meillew rendemen~ mùs la selecti~ e d'introducDon du groupement TBDMS en 2' n'est pas amelioree .
11.1.2 Syntbes des denves pbosphoralDIdi~es ~ ~Scbema 9) FEUtLLE Q~: R~MPL~CEMENT
WO 93/16095 PCl`tFR93/00115 n ~ r ~, Les quatre B thioribonucleosides phosphoramidites l\i-proteges 26 R~i sont ensuite obtcnus a pamr des 5'-DmTr-2'-O-TBDMS B thioribonucléosides ~-protéges colTespondants 2 (Schema 9~.
Le derive nucleosidi~ue 24 a éte trate par du chJoro N. N diisopropylamino methoxv 5 phosphine ( '.5 equivalents molaires~ en psésence de ~.~.N diisopropyl éthylamine (DIE.
dans ~e dichloromethane sous atmosphère intc. Lc d~ivé phosphoramidite 26 a ete purifie par chromato~rap~ie sur gel de silice ct Iyopbilise dans le bcnzènc~ les phosphoramidites 26 a-d sont obtenus avec des rendements vanant de 78 à 80 % selon la nature dle la base.
:,~Trr`-- S 3 , . ~ r~mTrO-- -~
~Q ~T~J~S ( jPr)2N \ ~ VTE~US
24^-d ' 26 !\/leC
i = (iPr) ~P(CI)OMe~ DEA DMAP~ CH ~C12) SCHEMA ~
Les analv~cs dcs spectrcs de RM~ du 31P et du lH de 26 montrent clslrement quc nous obtenons une seule paire de di~stereoisomères ce qui etablit la puretc rc~ioisomènque des 25 compo~es obtenus.
En e~et. ~uelqucs wteuJs (R. ~CIER~EK M. H. CARUTHERS. C. E. LOl`iGFELLO~. D.
SWWON, D. H. TURNER et S. M. FREER BlochemJs~n~, 1986. 2S~ 7840~78~6 ~ a~slcnt emis l~ypoth~se que lcs groupemcnts silyles en position 2' n'etaicnt pas stables dans les condioons de la phosph~ylaoon. Cependant~ il B cte mODt~ (W, K. 1;OHLER ~
SCHLOSSERM, G. CHARUBALA et W PFLEIDLERER Chemlsln~ and Blolo~ of 30 ,~cleosldes and Nucleo~ides~ Academic Press, ~lew York. 1978~ pp 347 ;58: }i. ~
OGILVIE Ct D. W. E~STLE~ Carbo~trate Res.~ 198E 89~ 20;-210: ~ ~S~t.~;. ~;.
~;. OGILVIE M. Y. JLANG Ct R J. CEDERGRE~. J. Am. Ch~ Soc.. 1987. 109. 7845-7854.~ qUC leS 8rOl~pCS ~IS;1VIeS m;~t danS kS SOI~tS PrOnqUeS COmme le methanO1OU d~S 1CS SOIU~OnS aqUCUSCS COmme 1e mC1an8C p~ nC/eaU. ~S CeS ~OUPementS
35 Sj1Y1CS SOnt S~bleS danS 1eS SOI~tS ~hydreS et nOt~Cnt ~1eS baSeS nOn PrOnqUeS
COmme 1a pyrid~C ~hydrC (~;~ }C. OG1LVIE~ D. W. ENTV~STLE~ Carboh dra~ s.
1981. 89 203-210; W. KOHLER W. SCHLOSSER G. CHARUBAL.~ e~
FEUIL~E DE REMPLA~EMENT
WO 93/16095 "~ PCl /FR93/00115 PFLEIDERER Chemis~ry and Blology of ~lucleosides ond ~ucleot-des, Acadcmic Press.
Ncw York, 1978, pp 347-3S8.). D'autre par~ il a cté clairemcnt démontre cn scne ribonucléotidc que l'utilisation dcs 2'-O-silyl ribonuclcosides tans la synthèsed'oligoribonucltotidcs conduit exclusivcmcnt à des liusons 5'-3' (K~ K. OGILVIE. M. J.
5 ~iEMER Telrahedron Lett.. 1980. 21. 4159: R. T. PON ct K, K OGILVIE. Terrahedron Len., 1984, 2S~ 713; R T PO~. a K. K. OGILVIE, Nuclcosides Nucleondes. 1984. 3.
48S;P. J. GAREGG. 1. L~DH. I. STAWI~SKL et R STROMBERG. Tetrahedron Le~
1986, 27. 40SS-40S8). La synd~cse de phosphoranuditcs n'est pas stéreospccifique ct la fonoaoon en 4u~mtcs egales des deux diastercoisomeres est tue à la chiralitc de l'atomc dc phosphore de configur tion R ou S. La formation dc ces dcux produits n'est pas genante 10 duls b mcsure où les iéactions d'oxydation ulterieures sup~nt ce~te chir~lite.
Il. 2. PARTE EXPER~IENTALE
M6thodc gencnk pour la prcparation des 5'~dimctboxvtrityl N--cyi 4'-thio-~D-15 r~bonuckosid~23 -d.
A u~c solu~on dc N-wyl ~dliofibonucleoside 23 a-d ( lmmole) dans la py~itine anhydre (S~6ml) est ~jouté du chlon~re de d~méthoxym~rle (1.2?mmole, 430mg). Le mel~e réac~olmcl est gité i ~e ambiulte sous a~Dosphèrc ine~tc pend nt 90 a 120 n~in puis du mé~ol (lml) cst ~jouté. Après 10 minutcs t'~tion suppléme~taire. Ie mel~e 20 rc ctionnd est versé sur une solu~oD aqueuse s~ec te bic rbonate de sodium (~Sml) et Ics produits sont ex~its avcc du dichlorometh~e (2 x 20ml), Les phases or~anlques sont lavecs avec dc l'c u (2 x 100ml) puis secbees sur sulfate dc sodit~D et filtrees. Le filtsat cst evaporc sous pression reduite et le rcsidu ob~u est chrom-togr~hié sur une colonne de ~el de silice, L'eh~ ef~ecnlee avec un mél~ge CH2C12/MeOH 98n en presencc de tAe~ylu~ e 1%; lcs ~o~s cont~n~nt le protuit sont.evaporees i sec et les nucleosides 25 23 ~-d sont obteDus sous fomle d'une huile.
1-14'-th~5'~dim~tbo~trltyle~ nnnosyl~Thymine Relldc~en~ 68 %.
Spcctromé~ie dc m~ sse FAB>0 NOBA mJz = 577 [M+Hl~ 303 lDmTrl ~
30 RM~ IH tDMSOd6. 360MHz) ~ 24~ ( s. 1 H~ NH); 7.44~ ( s~ I H~ H6): 6.87-7~30~ t m.
13H~HArom~iques);S,83,(d,1H,Hl~,Jl~2~=7,0~;S.S3,(d.1H~OH~.JoH~ =5.8);
5 3O` ( d~ l H` oH3~ JoH~3~ ~ 4~ 4~l4~ ~ td~ l H~ H2~ J2~ 6~9~ ~l7~ 3~ = 3 o); ~ oo ~
H~ H3', J3',2' ~ 3.0~ J3',4' ~ 3~0); 3~69~ ( s~ 6 H, OMe); 3.30, ( dd lH. H4~ m. 7 ~1.
Hs~, Hs~); 1,60, ( s, 3 H, CH3)~
1-14'.1hio S-~}di~tbo~ytriqle l~ n~ no~ Uncile ~.
Re~ nt 70%.
FEUILI_E DE REMPL~SEMENT
WO 93/1609~ PCl`/FR93/00115 . .. _ . . ~ ., _ R~ lH (DMSOd6, 360 MH2) ~ 11.31~ (s. I H. NH~; 7.70. (d, 1 H, H6. J6,S = 8 0)~ 7 40 6 89. (ITL 13 H. H aromatiques du groupement dmTr); 5.84 (~ I H. H~ 1 ?' = S 7). 5.~3 1 H- OH2~. JoH2~ 5.6), 5.48. (d~ I H. Hs. J5.6 ~ 8.0); 5.26, (d, 1 H, OH3. JoH3 3 =~45):4.02.(m.2H.H~.H3~);3.74~ts.6H.OMe).3.31.(~3H.~4~.Hs.Hs ) 5 Spec~ome~c de m~sse FAB~O NOBA ~ z = S63 ~+H~+, 303 [DmTr~-1-14'-~hio S'-O dimetho~rtrityle ~D ribofur~nno~yllN~beDzoylCyto~ine 23 c Rendcmcnt 69 %.
R~ ' lH (D~lSOt6. 2SO M~:lz) o 11.32. ~s. lH. NH); 8.40. (~ lH. H6. J6.s = 7.5); 8.01.
(~ 2H, Ho du ~oup~ment bc~lzoylc): 7.63. (~ lH, HS. IS.6 - 7.3); 7 44. (~L 17H. H
10 aroma~ques tu gJoupemcnt DmTr ct Hm.p du groupne~t benzoyle); S.88.(~ lH. H1Jl ?~ = 4.1); S.73, (d~ IH~ OH2~ JoH ~ = S.2); 5.27.~4 IH, OH3~. ~O~.H3' = 5.7). 4 06.~m.
~H. H~J2~ 1~ = 4 0- ]2',3' = 3 7 J2'.0H = S.2); 4.03.~m~ lH, H3~, l3~ 2~ = 3 7. ~; ~ = S.;.
~3~.0H - 5.7); 3.76.(s. 6H. OCH3 du ~oupcmcnt DmTr); 3.43.(m. 3H. H4 ~ Hs~ct H~ ).
15 S~ométrie d~ massc }:AB>O NOBA m/z = 666 [M+HI+, 51~ [M+H-0CONH~]+~
303 lDmTrl +
1~14'~thiD 5'~dim~thosytrityle ~ribofbnDno~ N6-be~oyl~dénine 23 d Rcndement 70 %
R~I~' lH (DMSOd6~ 2SO MHz) ~ 11.25,( s. IH. NH); 8.63, (s, lH, Hg); 8.57, (s. lH. ~
20 8 04. (t. 2H. Ho du groupemc~t b~oylc~; 7.Sl, (m. 13H. H aromstiqucs du ~roupement DmTr): 6.92. (d~ 3~ Hm.p du group~mcnt benzoyle); 5.98. (d. lH. H~ = S 8). S.75.
~d- lH OH~ JOH,2~=3~);S4S.(d~ IH.OH3,JoH3~=2.5):470.(nL IH.H~ 6.(n~
lH. H3~); 3.74,( s~ 6}1, OCH3 du ~Foupemcnt DmTr~; 3.53. (m~ 3H. H4~.Hs~ e~ H
Spec~mc~ne de massc FAB>0 NOBA m/z = 690 lM I Hl~. 303 ~DmTrl+
5 M~th~e gen~nle pour b pr~p~ntion d~ 2'~ bu~ldim~th~ ih~1-4'-thio-S'~
dim~tho~ ql~N~cyl~ribon~Jcteo~id ~ el de leur i~o~ère 3'-l~D~S 25 A une sohtio~l de S'~dimethox~ilvl 4'-thio ~J-acyl B-~ribonucleoside ~3 ~-d ( Immole~
dans le THF ~n~ydrc (lOml) est ajoutc du mtrate d'~r8ent (1.2mmole~ 203m~). Lc mel-n~c 30 rcactioDnel est alors ~gitc S miDu~cs à tem~turc ambi~tc a~t l'atdi~on du chlonue de lerl-buryldimethylsilyle (TBDMSCl. 1.3mmole. 195mg) et de la py~idine anh~r~c (3.7mmole. 0.193ml). L`~itatioD à temperan~re u~bi~te est lors prolon~ce pendant 2~ h puis la soltmon hete~ogene est filtree av-nt d'ctre versee d~s unc solu~on a4ueusc de biwbonate de sodium i S% (30mJ). Lcs ptoduits SOD cx~its avec tu ~iebloromethanc(3x20ml) et ks ph~s otE~niques sont lavecs avec de l'eau puis secbees sur sulfate de 3~ sodium ct fil~es. Le Sltrat est cvapo* à scc et le residu est c~ographie sur uDe colonne dc gel de silice cn utilisant commc cluant un meb~e dc CH~Cl ~/AcOEt: 9~ S puls I:EUILLE DE REMPLACEMENT
WO 93~16095 PCl'/FR93/00115 f~ ~ r~ ,~
,., ,~, ~. , , ` , de C~?Cl~/AcOEt:80/20 . Les ~acaons contenant le produit desire (2'-O-TBDMS 24 a-d) sont reE~oupccs et évaporécs à sec. L'isomere 3'-O-TBDMS 2S a-d est ensuite obtenu.
1 -12'-0-tert-but~ldiméthylsilvl-4'-thio-5'-0-diméthox~trin~l-~D-ribofursnnosyl 5 Thymine ~.
Rendemcnt: 33 %.
Speclrome~ie dc masse F~>0 ~OBA mlz = 691 lM+H)+, 713 lM~ia]+.
R~T lH (DMSOd6, 300MHz): ~ 11.36, ( s. 1 H. NH); 7.58, ( s~ 1 H, H6): 7~33-6.90. ( m.
13 H. H Aroma~iques): ~.89~ ~ s. 1 H. H] . Jl ? = 6.1); 5.27, ( nL 1 H. OH3): 4.20. ( dd. I
H. H?. J~ = 6.10, ~?,3~= 3,5~: 3.97. ( m. 1 H. H3~); 3.73, ( s, 6 H. OMe): 3.36. ( m. 1 H.
10 H4):3.~5.(~2H.~s~.Hs~);1.58.(s.3H.CH3);0.81.(s.9H.tert-butvl):0Ø(d.6H.
!~Ae ~Si).
1-12'-0-iert-butyldiméthy!~ilyl~ thio-5'-0-dimétho~ytrityl~ ribofurannosvl 15 Ijracile 24 b.
Rcndement 56% .
Tf = 1 14~C.
RMN lH (DMSOd6, 360 MHz): ~ 11.20, (s. 1 H, NH); 7.81. (d. 1 H, H6. J6 5 = 8.1 ); 7.30-6.89. (m, 13 H, H asoma~iques du ~roupemcnt dmTr) 5.84, (~ 1 H. H~ ~ Jl' ~ = 5 ~); 5 50 (~ I H. Hs, ~5,6 = 8.1); 5.23. (d~ 1 H, OH3, JoH3 ,3 = 4.7), 4.11, (4 I H. H~ J~ 1~ = 5.5.
20 ~?~ 3 ~ = ;.5): 3.95. (m~ 1 H. H3~); ;.74. (s. 6 H. OMe); 3.38. (m, 2 H. H4. H5~ J~ ~ = 3.?8.
(~L 1 H. Hs~); 0.82, (s. 9 H. ~ert-butvl); 0.05, (~ 6 H. Me ~Si).
Spec~ome~c de masse FAB~0 NOBA n-lz = 677 [M ~ H) . 619 lM I H-ten-butane~-. 303[dmTr)-I-12'-0~ but~rldiméthylsiiyl~ thio-5'-0-diméthon~trityl-~D-ribofur~nnos~lI
!~i4 benxoylC~to~ine 24 c.
Rendement 32%.
H (DMSOd6~ 250 MHz): ~ 11.31. (s. IH, ~H); 8.51. (d~ 1~. H6~ J6.s = ~.3): 8.01.
(~ 2H. Ho du ~roupement benzoyle) 7.Sl. (rn 14H. H aromaoques du ~oupemcnt Dm~r et Hs): 6.93,( ~ 3H, Hm.p du ~roupemcnt bcnzoyle): 5.93.(~ lH. Hl . Jl ~ = ~ 0~: 5.20.(d.
lH. OH3~, JoH H3~ = 5.0); 4.14.(~ lH. H ~ 4.00.(~ lH H3 ); 3 76 ~s. 6H. OCH~ du ~roupement DmTr); 3.38.~ 3H. H4 . Hs~et Hs ~): 0.86. ~s. 9H. rerf-bu~l): 0 60. ~ 6H.
Me ~Si!
SpectrometTie dc masse FAB~0 NOBA mlz ?80 lM+HI~, 303 [DmTr)~
1-12'-0-ter.f-butyldim~thylsilvl-4'-thio-~'-0-dimetho%~ D-ribofur~nnos~ l ~6 benwyl~deni~e 24 d.
Ren~ement 3S %
FEUILLE DE REMPLACEMENT
WO 93/16095 PCI`/FR93/OOllS
R~ IH (DMSOd6, 2S0 ~z): ~ 11.2S,( s. lH~ NH); 8.64, (s~ lH, Hg); 8.61, (s~ lH~ H2)~
8.04. ~d. 2H, Ho du groupcment benzoyle). 7.51, (n~ 13H~ H ~rom~iqucs du groupement DmTr): 6.95, (d, 3H, Hm,p du groupemcnt ~nzoyle); 6.01, (d. IH, Hl~. Jl'.2' = 5 8); 5.48.
(~ lH, OH3~, JoH,3~ = 2.S); 4.70~ (nu lH. H~ ); 4.26, (m, IH, H3~); 3.75.( s. 6H. OCH3 du groupe~ncnt DmTr); 3~S3, (n~ 3H, H4~.11S n Hs~); 0.82~ (s. 9H, lerl-butyl); 0.50, (~ 6H.
MC2Sj) Spec~omc~c tc masse FAB>O NOBA m/z 804 [M+H]+, 303 lM l H] ' 1-13'-O tat-butyldimeth~l~ilyl-4'-thio-S'-O-dim~tho~ytrityl B-D-ribohnnno~yll , Th~mine 2S ~.
Re~dement 13%.
RM~ lH (DMSOd6, 360 M}lz): ~ 11.34, (5, lH; NH); 7.46, (s~ IH~ H6); 7.89-7.30~ Im.
13H.Harom~qucs);5.87.(d~ IH.Hl,J~ =7.8);S.46.(d~ lH.OH2~,JoH~=5.1):4 1,.
Im~ IH~ H3~): 4~11,(m, lH, H~, 32~ 1~ = 7.8, JoH,2` = 5.1); 3.73, (s. 6H~ OMe); 1.66~ (s~ 3H~
CH3); 0~84.(s. 9H. Ier~-butyl); 0.50,(d~ 6H.Me2Si).
1~l3~tat-buqldim~ tbio-s~ m~tho~ytriq~ ribohnnnos~
linciIe 2S b.
Re~demeslt 2r~
Tf = 109C.
RMN lH (DMS~ 360 MHz): S 11.30,(s. I H, ~H); 7.70, (d, 1 H~ H6~ J6 5 = 8.0): 7.30-6.89~ (13 H~ H a~om~i~ues du groupe-ment dmTr): 5.84, ~d~ 1 H, Hl~. Jl'.2' = 7.3): 5.57~ (d.
1 ~ H5~ JS.6 ~ 8~0); 5.46, (d~ I H. OH~. JoH2~2~ = 5 1): 4.12~ (~ I H- H3 J; ~
J3~4~ = 3~ 4~03~ (m, I H~ H2~); 3.74, (s. 6 H. OMe); 3.41. lnL 1 H. H4); ;.'1. (m~ ' H.
Hs~ Hs~); 0.08~ (s, 9 H, tert-butyl); 0.02. (~ 6 ~ Me2Si).
Spectromc~ie de ~sse FAB~O NOBA m~z 677 [M+~ 619 [M~H-tert-butane)-. 303 ~dmTr)t.
Cc composc a ~ mis eD prcscnce avec une soluion e~noVme~ylamine 0.25~o (~
pendant unc 12 h i t~ re ~mbia~te pour don~er en propor~on eg~le un melan~e ct 2S b.
1-13'~tat-butyldim~thyl~ilyl~ thio-5'~0 dim~tho~rit~ ribofur-nno~l 1'~4~be~o~1 cy~int ~.
Rcndement 31 ~/o.
RMN lH (DMSOd6, 2S0 MHz~: ~ 11.33. (s. lH. NH); 8.40. (d~ lH. H6. ~6 ~ = 7 4): 8 01.
(L 2~ Ho du grou~xment benzovle~; 7.60, (m, I4H. H uom~oques du ~roupement DmTr e~ Hs~; 6.92~ ( d, 3H, Hmp du groupement benz~yle); S.92,(d. lH. Hl, Jl'.'' = ~ 3);
5.60~(d, IH OH2~. JoH ~ s 5.0); 4.1S,(nL 2H~ H ~, H3~); 3.~S,(s~ 6H. OCH3 du IFoupement DmTr); 3.38.(~ 3H. H4: Hs~et Hs~); 0.79. (s. 9H, Jert~butyl); 0 00, ~d, 6H. Me-Si!.
Spectrom;c~ie dc massc FAB>0 NOBA m/z 780 ~M+H]+. 303 ~DmTr FEUILLE DE REMPLACEMENT
WO 93/16095 PCl~/FR93/00115 r l .t 1-13'-0-tcrt-but~yldimethgl~ilyl-4'-thio-S'~dim~tho~ytritvl ll-D-ribofur~nno~yl ~6-benzoyl ~d~nine ~.
Rendcment 29% .
R~ lH (DMSOd6~ 2S0 MHz~ 5,( s~ lH. NH); 8.64. (s. lH, Hg); 8.61, (s~ lH. H2);
5 8 04~ 2H. Ho du groupement ber~oylc)~ 7.51~ (nL 13H. H ~rom~ques du groupement DmTr): 6.9S. (d. 3H. Hm.p du ~roupement balzoyle); 6.01~ (d. IH~ Hl~. Jl~ ~ = S 8): S 79~
(d~ IH~ OH~. JoH~r ~ 3.S); 4 70. (~ lH. H~); 4.26. ~m~ IH. H3~); 3.7S~( s. 6H. OCH3 du ~ment ~Tr); 3.S3. (m. 3H. H4~.HS~ et Hs~ 0.82~ (s, 9H, Icrl-butyl); 0.01. ~ 6H.
!~c~Si).
Spectrometnc de m~ssc FAB>0 NOE~A m/z 804 lM~H] ' . 303 IM+H
Met~de ~ener~le de p~retion dff ~D nbonucl~o~ide phosphor~m;ditn 26 ~-d~
A une solu~ion des composes 24 ~-d (1 mmole) d~s du dichlorome~ne ~nhvdrc (3 8ml~
sont ~outes sous ~e inffte d' rgoll la N~N,N diiso~letbylulune (4 mmoles 15 0 7~ b~ chloro N~N~iiso~l_~_ (2 S~mole) 0 48ml) a la ~
(0 2~ole, 24 4mg) Le me~8e ~ctioDnel es~ ~itc de ~0 à
-- 90 ~ nbunte puis est dilue ~vec te I'~ate d'ethvlc (35ml) La solL~ cst l~vee s~lec de la s~umure (4~S0ml) puis ~vec dc l'e-u ('~xS0ml) La ph~orgal~ique est sechee sur sulf~te de sodium~ fih~ée et evaporee sous pression reduite Lc residu est cb_~hie sur colo~e de gel de silice et l'elutioo est re lisee i l' ide 20 d`un melu~ge de cyclobex~ne~ de dicbloromét~nc et de tnethylunine ~100/0/0 1 i SOIS010 1) Les produits 26 d soDt ob~e~us sous b fonne d'u~e poudrc blanchc apres Iyophilis tion d ns le b~ne 1-12'~rt-butyldim~thylsilyl-3'-N~N-diisopropylmétho~rphosphor~midite-4'thio-S' O-2 diméthorytrityle-~ribofursnnosyllThymine ~ (melange diastercoisomerique Rendcment 89%.
R~N31P~Cl)3CN) ~lSI,32etlS003 RM~ 1H 8 7 99, (s, 1 H, NH), ~ 6S, (~ 1 H, H6~; 7,3S-6 80 (m 13 H H uomaoques ~;S 97~ (~ I H H1~); 4,2S, (~ 1 H H~); 4 13 (~L 1 H H3~); 3 78 (s~ 6 H OMe); i 68 I H H4~); 3 S4~ (nL 2 H Hs~ Hs~); 3 35 (m~ 3 H McO du groupe~nent phosphorunJdltc 30 3 '5, (~ 2 H CH dcs ~roupements isopropyle); 1~60, (m 3 H CH3); I lS lm 12 H CH~
des groupements isopropyle); 0~86, (s 9 H #rt-butyl); 0 0S, (D~ 6 H~ Me ~Si) Spec~ome~ne de m~se F~0 NOBA m/z ~ 8S2 lM-H~
1-12'~1di~tbyl ibl-3'~N~-dii opropyl~ho~ypbospboro-midi-e-4'tllio S'-O~ ribohnnnosyllUncik~ gedi s#reoison~nque~
35 ~ R~Ddcm~78%.
RMN 31P~CDC13): ~ IS0.65 a ISO.S0.
FEUILLE DE REMPLACEI AENT
Wo 93/16095 pcr/FR93/ooll5 . i ,~ n ~, ~0 1 40 R~ IH (CD3CN,250 MHz): ~ 7.99~ (s~ 1 H. NH). 7.22, (m. I H. H6): 7.30-6.89. ~m. 13 H. H aromanques du groupcmcnt DmTr): 5.90. (m. 1 H, Hl~); 5.50. (m. 1 H. Hs); 4.13. ~m.
H. H2. H3~); 3.80, (s, 6 H, OMe du ~roupe DmTr); 3.58~ (m, 3 H, H4. Hs~ Hs ); 3.4 lm. ' H. ? CH des ~roupements isopropyle); 3.30 (m~ 3 H. MeO du ~roupement DmTr)~
5 1.19. (m. 1~ H. CH3 des ~oupements isopropyle); 0.84. (s. 9 H. Ierl-but~ 0.05. (m. S H.
Me~Si).
Spectrometne de masse FAB>0 NOBA mlz = 534 [MtH-DmTrHI+
I -12`-0-tcrt-but~ldimethylsilyl-3'-N,N-diisopropylmethosyphosphoro-midite-~1'shio-5'-O-dimethoxytrityle-l~D-ribofur~nnosyll !~4-benzoyl Cyto~ine 26 c.
10 Rendcment 7~% .
RM~' 31P (CD3C~): 8 1Sl~30 et 150.05 Spectrometric de masse FAB>O PEG mJz 941 [M+H~, 637 IM+H-DmTrH) 303 ~DmTr]~
1-12'-0-tert-butyldiméthylsilyl-3'-N,N-diisopropvlmethoxyphosphoroamidi~ 1'thi~'-O-diméthoxytrityle-~D-ribofurannosyll r~i~benzoyl Adenine 26 d Rendement 71% .
RM~ 31P (CDC13): ~ ISI.26 et 150,01 Spectromct~ie dc masse FAB~O PEG nuz 964 ~M+H~-~ 600 ~M ' H-DmTrH] 303 ~DmTr]~.
Il. 3 Fonctionalis~tion du support solide (Schema 10).
Le support solide ou LCA-CPG ( LoDg Chain Alkylamine Controllcd Pore Glass) P-l a tout 20 d`abord etc acive par une solution d'acide trichloroacetique à 3 % dans le dich~oromethane à
temperature ambiante pendsDt 2 à 3 heures afin de liberer le plus grand nombrc de ~roupements amino. ce qui cnnduit au maximum de sites reactifs sur la surfacc des billes de verre. Le supporl ainsi active P-2 est a~ors fonctiormalise par coupla~e avec de l'anhvdride succinique dans ia pyridine en préscnce de 4-DMAP ce qui conduit à P-3. Dans l`etape suivante. Ie nuclcoside 3'-silyle 25 est utilise puisqu' il a éte obtenu penàant la reacnon de 25 silylation des thioribonucleosides et n'est pas necessaire pour la svnthèse d'oli~othionucleohdcs co~tenant la liaison phosphodiester 3`-5'. Ainsi. P-3 acti~,e par le l-(3-dime~ylaminopropyl~ 3-ethylcarbodiimide (~)EC) en presence de 4-~MAP est rnis en reactioD dans la pyridine anhy~re avec le 5'-O-DmTr-3`-OTBDMS ~thioribonucleoside 2~. Les sites non uilis~es du suppon sont masques à l`aide de pipcridine. Une derniere etape 30 de masquage à l'ar~vdride aceique en presence de collidine dans le THF conduit à P-6. La quas~tite de nucleoside fixee sur le suppon est dcterminee par spec~ophotometrie V. ~ . en mesurant la quan~ate de cation dimethox~itvle libere après un ~aitement par une solution a 10 % d'acide tric~oroacetique dans le dichloromcthane. Lc dene de fonctionnallsation ~arie de 21 à 38 ,~unole par gran~nc dc suppon suivant la nan~re de la basc nuclcosidique.
.
FEUILLE OE REMPLACEMENT
WO 93/1609~i ~ PCI`/FR93/00115 ,., ~., . . ~
(~\~NH ( i )~A~ ( ii )~NH-C(O)-(c~12) s ?2 ~3 ( 'ii ) o DmirO B DmTrO
1~/ iv lST~0MS0 0(0)C ~h~ T~OMSO 0(0)C w~~
Cl C~ ,~J ~J
CI(~OlC-(CHl)-C(O)-HN~p5 HO2C-(CHl)-C(O)-Hh~
20 Cl Cl v, vi 0mTrOl S
~,/ \~/
~I
I aDMSO O(O)C ~,~
CN-O2C-(CH2)-C(O)-HN~ P6 ( i = TCA3/~, CH2C:12; ii = anhydride succinique. DMAP, Pyr.; iii = S'~DmTr~'~ 3 l~DMS~ nbo~ucléositc, DMAP, NEt3, DEC Pyr.; i~r = pe~t~chlorophenoh v = pipcridine; vi = Ac20 O.SM da~s THF ) W O 93/16095 PCl`/FR93/OOllS
Il. 4. Svnthe~e sutomati~ee des thiooiigonucl~otide~ (Schem~ 11).
Les thiooligonucleo~idcs ont ete svnthe~ses sur un s~nthetiseu~ a AD~ (Applied ~iosvstems modele ;81 .~). Le c~clc d'elon~anon compor~e quat~re etapes importantes: -Desntvlarion du nucleoside ou de l`oli~onucleotide fixe sur le suppon solidc.
Condensation du phosphoramidi~e acnve par le tetr~ole sur l'hvdroxvle 5` libre du nucleoside ou de l'oli~onucleonde.
Aasqua~e des foncDons 5'-hvdroxvles qui n'ont ,~as rea~i.
Oxvdanon des foncions phosphte~cstcr en phvspbotricster.
WO 93/16095 L~ PCl`/FR93/00115 ,`., . , ~ ~ . , ,~
~... o_~z ~Y m ~ LL' O
CL~ ~ ~ ~ V~
¢
~: m ,~
:C ~ ~.. o ~ u o ~a O ~ ~................ o~
U ~ ,"o i3 ¢ Z
E- ~"
Z
O
E- ~ ~
C ~ V ~ C ~ ~Z
~ fi ~ o~ ~
:E (~) Q (~) m~ O ~~~ . o Y"~
Q
~ !
FEUlllE~ DE REMPLACEMENT
WO 93/16095 PCI'/FRg3/00115 '` r~ ~ 4 4 r ~ `J ,t _, :
O a~
Q
E C
O ' ;~ '~
r~ . ~ r.,~ I
a~ O r .-1 -- E
:~ Q _ c tn ~ ~o~
_ ~ ~
Cl C ~
,~)'-~ i ~-/-9 _ .. _, ~, o ~ !
_1 c~ _ _~ _ ~FUILLE DE REMPLACEMENT
wO 93/16095 ~ pcr/FR93/ool15 Chaque synthese a etc effecnlee sur une colonnc contenant 40 mg de support solJde Le rendement de chaque incorporation cst dc 98 % évalue en mcsurant la concen~anon des canons dunethox,~tyles recuperes apres chaque coupbgc par traitement du suppon al'acide ~ichloroacetique.
Des lavages sont cffcctues entre chaque eulpc. et la durée t'un cycle d'elon~anon est dc 21.1 minutes pour la s,vnthese de l~omododccamerc 4'-thio~ ribonucleondc I BrS~
( Tablcau I ).
.
~umero I Etape ! Temps ~scc.3 I_ Solvant et Reacnfs I ¦Sechageet Lavage ! _ 24 _ MeC~ non ~ ¦ Detri~lat~on _ 8û TCA à 3% dans CH~CI~
3 ! Secha~e et Lava~e 74 _ ~ ~cC~-Argon _ ~ Couplage 915 amidite 0. IM(2 ~eq. )-~lcC~
tetrazole O.SM( lOeq. )~
.
_ Sechage _ ~5 _ A~80n 6 M~squagc ~3 Methyli~udazole-THF
?0 - - -- ---- Ac~Otlutitine/THF 1 1 8
7 SCch~e j 11 A~on _ _
8 Oxyda~on 1 ~3 ¦1~ 0.1~ dans THF P~T H'O
1 140tlO/
_
1 140tlO/
_
9 eC~ -2S TABLEAIJ' 1~ Cycle d'élonga~on unllse pour la synthcsc du ~rSU12.
3û
FEUILLE DE REMPLACEMENT
WO 93/16095 PCl`/FR93/0()11 ? r ~
r~ ~ r .. ~ ~ ~J ,t Il. ~. Decrochage, Déprotection et Purific~l~ion du thiooligomère.
.~pres avoir realisc les etapes de deprotccnon dcs methox~phosphatc dicsters au thiophenol.
Ic decrochage du dodecarnère du support solide par l'am~noniaque. Ia deprotectlon des 5 hvdroxyles par le TBAF. Ie thiooli~omere a ete dessalé sur unc colonne d'cxclusion G-'5 DEAE Sephadex ou sur une colonne iontque A-25 Sephadex DEAE et purifie par CLHP en phase inverse.
11.6.. P.~RTIE EXPERIMENTALE.
Exemple 1: S~rnthese de l'homododec~mère ûrSU12.
1-1 S,vn~ese du support. solide:
15 Le support solide P-l (2~415 g~ est mis en suspeDsion avec une solu~ion (50 ml~ d'aclde trichloroacctique a 3 % dans CH2C12 anhydrc. Après 4 h IS d'a~ation. 50 ml d`unesolu~aon de tnethylamine et de diisopropylamine ~9:1~ est ajoutec e~ après ~ mn d'aestanon la solution cst fil~e. Le support solide P-2 ainsi obteslu est lave par du tichloromethane ~ ' 50 ml) puis par te l'eth ~0 ml) et mis à secher.
Le support solide P-2 est ensu~tc mls en suspension dans de la pyridine anhvdre I 1-1.5 ml ~ en ~0 prèsence t'anhytride succ~que (0.48 g! et de DMAP (0~080S g~. La suspenslon est a~tce pentant 20 heurcs puis fil~e. Le support solide P-3 est alors lavc avec dc la p~ndme anhydre ~50 ml~ du dichloromcthane (2 x ~0 ml,) e~ de l'ether (2 x S0 ml) pUI5 IlUS a jecher sous ~lide.
Condens~tton du ~uppor~ ~olide P-3 sveC le 1-13'-O-tat-bu~ldime~hyhilvl-2'-h~drosv-4`thio-S'~dîm~tho~ytrityle~ ribofur-nno~l~Ur~cile 25 b l,'n mcla~ge dc P-3 (2~415 g) de 1-[3`~ rl-butyltiméthyl~ilyl-2`-hvdrox~`th~C'-O-dimethoxy~tvle-i~ribofi~raDDosylll,'tacile ~S b (333 m~ 1 eq.) dc la D~P ('4.~ msn~
0~5 eq.) de la tncthylamine (0~146 m~ 202 ,uh 0~003 eq.) et du DEC (920 mL 10 eq ~ d,ans 30 ~9 ml dc pyridirle anhydre cst a~te 3 ~ours à temperan~re ambiante~
On ajoute ensuitc du pcntachlorophenol ~321 mg~ 2.S eq.) et on liisse sous a~taoon '~
heures supplcmentures. Le suppott solide est alors filtre. nncc avec de 1~ p,~ndme anh dre (2 x S0 ml) puis avec du dichJoromethanc (2 x S0 ml) de l'ethcr (2 x S0 ml) Immediatcment après~ 'on tra~te Ic suppon solide ~-S par 25 ml de plpendme ~presa~ta~ion à ~cmperamre ambiantc pendant 24 heures~ le support solide est fil~e. Ia~e pu du 35 dvichlorometh~ne (2 x S0 ml) puis dc l'è~er (2 x50 ml) et ~us a sech sous ~lde F:EUILLE DE REMPLACEMEN~
WO 93t16095 ~ t PCl/FR93/00115 ~, ,, , , i, ~
Le support solidc scc (2.415 g) est mls en presence d'u~c solution d'anhvdndc accn~ue 10.5 ~1) dans le THF ( 1~ ml! et d'une solution de collidme (0~5 .~) dans le THF ( 15 rnl) .~pres ~
heures dc reaction~ le support solidc est lavc a~ec de la py~idme anhydre ~' x 50 ml). du dich~oromethanc (2 x 50 ml). du THF ~ ' ~ 50 rn~ ) e~ dc l'ether (~ x 50 ml 5 P-6 amsi obtenu est n~is a sechcr sous vide.
1-2) Delem~ma~ion du taw~ de fonctionnalisanon du support solide P-6.
Cette tcte~ination s'cffectue par dosa~e des ~roupemeDts DmTr liberes en milieu ac~dc On pèse exactement 38~0 m8 de P-6 qui sont mis en suspension dans 3.4 ml d'unc solunon
3û
FEUILLE DE REMPLACEMENT
WO 93/16095 PCl`/FR93/0()11 ? r ~
r~ ~ r .. ~ ~ ~J ,t Il. ~. Decrochage, Déprotection et Purific~l~ion du thiooligomère.
.~pres avoir realisc les etapes de deprotccnon dcs methox~phosphatc dicsters au thiophenol.
Ic decrochage du dodecarnère du support solide par l'am~noniaque. Ia deprotectlon des 5 hvdroxyles par le TBAF. Ie thiooli~omere a ete dessalé sur unc colonne d'cxclusion G-'5 DEAE Sephadex ou sur une colonne iontque A-25 Sephadex DEAE et purifie par CLHP en phase inverse.
11.6.. P.~RTIE EXPERIMENTALE.
Exemple 1: S~rnthese de l'homododec~mère ûrSU12.
1-1 S,vn~ese du support. solide:
15 Le support solide P-l (2~415 g~ est mis en suspeDsion avec une solu~ion (50 ml~ d'aclde trichloroacctique a 3 % dans CH2C12 anhydrc. Après 4 h IS d'a~ation. 50 ml d`unesolu~aon de tnethylamine et de diisopropylamine ~9:1~ est ajoutec e~ après ~ mn d'aestanon la solution cst fil~e. Le support solide P-2 ainsi obteslu est lave par du tichloromethane ~ ' 50 ml) puis par te l'eth ~0 ml) et mis à secher.
Le support solide P-2 est ensu~tc mls en suspension dans de la pyridine anhvdre I 1-1.5 ml ~ en ~0 prèsence t'anhytride succ~que (0.48 g! et de DMAP (0~080S g~. La suspenslon est a~tce pentant 20 heurcs puis fil~e. Le support solide P-3 est alors lavc avec dc la p~ndme anhydre ~50 ml~ du dichloromcthane (2 x ~0 ml,) e~ de l'ether (2 x S0 ml) pUI5 IlUS a jecher sous ~lide.
Condens~tton du ~uppor~ ~olide P-3 sveC le 1-13'-O-tat-bu~ldime~hyhilvl-2'-h~drosv-4`thio-S'~dîm~tho~ytrityle~ ribofur-nno~l~Ur~cile 25 b l,'n mcla~ge dc P-3 (2~415 g) de 1-[3`~ rl-butyltiméthyl~ilyl-2`-hvdrox~`th~C'-O-dimethoxy~tvle-i~ribofi~raDDosylll,'tacile ~S b (333 m~ 1 eq.) dc la D~P ('4.~ msn~
0~5 eq.) de la tncthylamine (0~146 m~ 202 ,uh 0~003 eq.) et du DEC (920 mL 10 eq ~ d,ans 30 ~9 ml dc pyridirle anhydre cst a~te 3 ~ours à temperan~re ambiante~
On ajoute ensuitc du pcntachlorophenol ~321 mg~ 2.S eq.) et on liisse sous a~taoon '~
heures supplcmentures. Le suppott solide est alors filtre. nncc avec de 1~ p,~ndme anh dre (2 x S0 ml) puis avec du dichJoromethanc (2 x S0 ml) de l'ethcr (2 x S0 ml) Immediatcment après~ 'on tra~te Ic suppon solide ~-S par 25 ml de plpendme ~presa~ta~ion à ~cmperamre ambiantc pendant 24 heures~ le support solide est fil~e. Ia~e pu du 35 dvichlorometh~ne (2 x S0 ml) puis dc l'è~er (2 x50 ml) et ~us a sech sous ~lde F:EUILLE DE REMPLACEMEN~
WO 93t16095 ~ t PCl/FR93/00115 ~, ,, , , i, ~
Le support solidc scc (2.415 g) est mls en presence d'u~c solution d'anhvdndc accn~ue 10.5 ~1) dans le THF ( 1~ ml! et d'une solution de collidme (0~5 .~) dans le THF ( 15 rnl) .~pres ~
heures dc reaction~ le support solidc est lavc a~ec de la py~idme anhydre ~' x 50 ml). du dich~oromethanc (2 x 50 ml). du THF ~ ' ~ 50 rn~ ) e~ dc l'ether (~ x 50 ml 5 P-6 amsi obtenu est n~is a sechcr sous vide.
1-2) Delem~ma~ion du taw~ de fonctionnalisanon du support solide P-6.
Cette tcte~ination s'cffectue par dosa~e des ~roupemeDts DmTr liberes en milieu ac~dc On pèse exactement 38~0 m8 de P-6 qui sont mis en suspension dans 3.4 ml d'unc solunon
10 d'acide paro-toluenc sulfonique (0.1 ~) dans l'acctonitrile. Lc melange est ag~te 15 mn pUlS
sonique pendant 2 mn.
On ajuste alors le volume à 10 rnl avec la solutio~ 0.1 M d'acidc pa~-toluène sulfon~que dans l'acetoni~nle. On prelève 0.3 ml dc cette solution à laqucllc on a~outc ~ ml de la solution û~l M d'tcidep~ra-tolucre sulfonique. La lecNre de la DO (0.;1? un~te de DO) a 15 500 nm nous pesmct de calculer le de~re dc fonctionnalisa~on du suppon P-6 ~ul est dans ce cas de 21 llmolciEramme dc support solide.
1-3) Svnthèsc automa~see de l~omodod;ecamere arSU12.
La svnthèse est cffcctuee sur une coloDe contenant 39.8 m~ de suppon solide foncnonna 20 lise à ~1 ~molcl~ de rcsine. soit 0.835 ~mole ( 1 eq) de 4'-thioundine.
Chaque cvcle d'elongar~on necessite un exces de synthon phosphora~udite (20 llmole. 24 eq) soi~ 24û ~mole au total pour la svnthèse du dodcc;lmère. Le synthenscur prele~ant 200,ul d`une solunon 0~1 M tc synthon dans l`acctom~rile par inco~poration.
La duree d'u~ cyclc t'clongation est de 21.1 rnn (Tableau 1).
L'etape de coupl~gc a eté considerablement au~mentee (900 s contre 45 s dans le ;as dun desoxynucleosidc) à ~sc de la mo~ndre reac~ e du svnthon nbonucleoode Le dos~ge des caDo~s timethox~ les libercs à chaque etape de ~ètnr;lanon a penrus d'eva~ucr le rcn~m~t moyen d'incorporanon dc l'unite dliolibonuclcotidique à 98~ %.
1~) Decrocha8e. teprotect~on et punficaoon du thio homododccamère a,~u~-Le suppon solide portant le thlo-bomododecame QrSI;12 est ~ute par S ml d`une solunon de thiophenol. ~ètbyl m~ne. dioxane 1. ~ (1!3'~) pend~t une dcmi-heure a temperanre ambiante.
La solution dc thiopbcnol est alors filtrcc et le support tave par une solunon d ~rnrnonlaque 3~ % tans l'ethu~ol 9S (311: v~v) ~; ~ S00~LI) pout dccroches le thio-homododccamcre du 35 support solide. La solution a~nsl obtenuc cs~ ev~poree~ ise par 500 ul deau pUlS
Ivophilisec.
FEUILLE DE REMPLA~EMENT
r ~
L'oligomere est alors dissout dans 300 ~I d'u~c solution dc TBAF ( 1,1 M) dans le THF Le melan~c reactionnel est laissé sous a~itation pendant 24 heures. La reaction cst alors stoppee a~ec 300 111 d'une solution aqucusc d'acetate d'a~unonium (0~0S M).
La solution est évaporec a sec. coevaporee 3 fois avec de I'eau ct le residu chromato~raph~e 5 sur colonne de gel d'exclusion Sephadex G 25. Les ~actions contcnant le ~ioohgomere sont rassemblees. evaporees à scc ct analysces par CLPH.
.~nalvse et Purifica~ion du thio-oligomère BrSU12 obtcnu.
L'analyse CLPH du thiooligomère a ete ef~ectuée sur une colonne Bec~nan C-18 RP ~ u 10 LODS Ul~aspherc dans les conditions de ~radicnt suiv~tes:
,~ 10 D~o d'acetonitrilc dans USIC solunon aqucuse 0,05 M d'scetate te tnethylammon~um.
8: 15 /O d'acétonitnle ~ans une solution aqueusc 0.05 M d'~cet~te de ~iethvlammomum Gradien~:
B .--A
~' 10' S' 5 Temps d'analyse: ;0' Dans ccs conditions on constate que Ic ~iooligomè~rc est pur à 92~73 %.
On ef~ectuc alors u~c punfication de ûrSUI~ sur colonne semi-preparative ~;ucleos~-l a~-ec un Eradicnt:
A--B----B-----A
15' 10' 5' OD obticnt dans ccs conditions le ~rSU12 avec une puretc de 94~4~ % suffisante pour les ètudes ultcnèures.
Exemple 11: Synthe~ du dodèc~mère ~ ~ SrT)l dTI 1
sonique pendant 2 mn.
On ajuste alors le volume à 10 rnl avec la solutio~ 0.1 M d'acidc pa~-toluène sulfon~que dans l'acetoni~nle. On prelève 0.3 ml dc cette solution à laqucllc on a~outc ~ ml de la solution û~l M d'tcidep~ra-tolucre sulfonique. La lecNre de la DO (0.;1? un~te de DO) a 15 500 nm nous pesmct de calculer le de~re dc fonctionnalisa~on du suppon P-6 ~ul est dans ce cas de 21 llmolciEramme dc support solide.
1-3) Svnthèsc automa~see de l~omodod;ecamere arSU12.
La svnthèse est cffcctuee sur une coloDe contenant 39.8 m~ de suppon solide foncnonna 20 lise à ~1 ~molcl~ de rcsine. soit 0.835 ~mole ( 1 eq) de 4'-thioundine.
Chaque cvcle d'elongar~on necessite un exces de synthon phosphora~udite (20 llmole. 24 eq) soi~ 24û ~mole au total pour la svnthèse du dodcc;lmère. Le synthenscur prele~ant 200,ul d`une solunon 0~1 M tc synthon dans l`acctom~rile par inco~poration.
La duree d'u~ cyclc t'clongation est de 21.1 rnn (Tableau 1).
L'etape de coupl~gc a eté considerablement au~mentee (900 s contre 45 s dans le ;as dun desoxynucleosidc) à ~sc de la mo~ndre reac~ e du svnthon nbonucleoode Le dos~ge des caDo~s timethox~ les libercs à chaque etape de ~ètnr;lanon a penrus d'eva~ucr le rcn~m~t moyen d'incorporanon dc l'unite dliolibonuclcotidique à 98~ %.
1~) Decrocha8e. teprotect~on et punficaoon du thio homododccamère a,~u~-Le suppon solide portant le thlo-bomododecame QrSI;12 est ~ute par S ml d`une solunon de thiophenol. ~ètbyl m~ne. dioxane 1. ~ (1!3'~) pend~t une dcmi-heure a temperanre ambiante.
La solution dc thiopbcnol est alors filtrcc et le support tave par une solunon d ~rnrnonlaque 3~ % tans l'ethu~ol 9S (311: v~v) ~; ~ S00~LI) pout dccroches le thio-homododccamcre du 35 support solide. La solution a~nsl obtenuc cs~ ev~poree~ ise par 500 ul deau pUlS
Ivophilisec.
FEUILLE DE REMPLA~EMENT
r ~
L'oligomere est alors dissout dans 300 ~I d'u~c solution dc TBAF ( 1,1 M) dans le THF Le melan~c reactionnel est laissé sous a~itation pendant 24 heures. La reaction cst alors stoppee a~ec 300 111 d'une solution aqucusc d'acetate d'a~unonium (0~0S M).
La solution est évaporec a sec. coevaporee 3 fois avec de I'eau ct le residu chromato~raph~e 5 sur colonne de gel d'exclusion Sephadex G 25. Les ~actions contcnant le ~ioohgomere sont rassemblees. evaporees à scc ct analysces par CLPH.
.~nalvse et Purifica~ion du thio-oligomère BrSU12 obtcnu.
L'analyse CLPH du thiooligomère a ete ef~ectuée sur une colonne Bec~nan C-18 RP ~ u 10 LODS Ul~aspherc dans les conditions de ~radicnt suiv~tes:
,~ 10 D~o d'acetonitrilc dans USIC solunon aqucuse 0,05 M d'scetate te tnethylammon~um.
8: 15 /O d'acétonitnle ~ans une solution aqueusc 0.05 M d'~cet~te de ~iethvlammomum Gradien~:
B .--A
~' 10' S' 5 Temps d'analyse: ;0' Dans ccs conditions on constate que Ic ~iooligomè~rc est pur à 92~73 %.
On ef~ectuc alors u~c punfication de ûrSUI~ sur colonne semi-preparative ~;ucleos~-l a~-ec un Eradicnt:
A--B----B-----A
15' 10' 5' OD obticnt dans ccs conditions le ~rSU12 avec une puretc de 94~4~ % suffisante pour les ètudes ultcnèures.
Exemple 11: Synthe~ du dodèc~mère ~ ~ SrT)l dTI 1
11-1 ) S~rnthèse du suppor~ solidc.
Le support solide fo~ctionnalise à 1 ~mole pour 35 mg de resine de 2'~esox~ mldme ai~si quc lcs synthons 1-~ S'~ mTr-3'-O-N~ diisopropyl~o cya~oeth~l phosphme. ' -desox~ ribofimnnosyl thvmine sont commercialises par Applied 13ios,vstcms II-2) Svnt~cse automatisee de û ( SrT)l dTI 1.
La syndlèse est cf~cctuee sur une colonne conteDant 35 m~ te support solide solt I umole de ~'-desoxyth~midine. Chaque c~;cle d'clongation ncccssitc un exces de synthons phos~horamiditc ~20 l~moles~ 20 cq) soit 220 ~mole de s,~nthons 2'-dcsox~ nudme es ~0 ~5 llmoles de syllthoD 4'-thi~th~ dinc ~. Le synthcsseur p~elcYan~ ~00 umoics pas incorpotation t`une solution 0~1 ~ de cha4uc synthon dans l'acctonitnle. La durec d`un ~EUILL~ PJ~PL~:EMENT
WO 93~16095 ~ ` , ` .t PCT/FR93/001 15 cvcle d'incorporation d'une unité désoxythv~udine est de 5.5 mn .Alors qu'elle est de . 0.1 mn pour un cvcle d'incorporation du svnthon 4'-thioth,v~udine.
L'au~nentation de la duree du cycle d'incorporation du synthon chimère est due a l etape de couplage de 909 ` contre 36 ' pour le svnthon ''-desoxvth,vmidine 5 Le dosa~e des cations diméthox,~rityles liberes à cha4ue ctape de detnt,vlanon a permls d'évalucr le rendement moven d'incorporation de l'unite ~'-desoxv~hvn~idine a 98.S O et 9~.
~o pour le sy thon i'-thiothvTrudine.
11-3) Décrochage.deprotection et purification du B (SrT)l dTI I
10 Le support solide portant l'olieomcre ~ (SrT)l dTl I est traite par une solunon d'ammoniaque (32 %) dans l'cthanol 95 (3/1~ v/v) (3 x 500 ,ul) pcndant 3 cvcles de ~) mn chacun afin de decrocher l'olieomère de son support~ puis le dodecarnere est incube pendan~
' hr dans une etuve sèche dans lc mèmc melan~e a~n dc deproteger les foncnons c~ anoeth~ l et methoxv.
15 L'oligomèrc cst ensuitc evaporc sous vide~ repris par 500 111 d'eau et Iyophilise.
La deprotection tes ~roupements TBDMS est effectuee selon le protocolc mis au pOlSlt dans : I`exemple 1.
Le tésidu obtenu cst chromato8raphie sur colonne de gd de DEAE Sephadex .',-" Les f~actions contenant l'oligomère sont rasscmblees~ evaporees à sec et analvsees par CLPH
20 Analvse et Purificanon du ~ (SrT)l dTt 1 par CLPH.
L'anal,vse CLPH de l'oli~omère a etè effectuee sur une eolonne Beckman C 18 RP ~ u ltrasphère dans les conditions de gradjent suivantcs:
.~: 6 % d'acctonitrilc dans un tampon acetate de tncthyl armnoniurn 0.05 ~
25 B: ~0 /o d'acetonitrile dans un tampon acetate dc triethyl ammorlium 0.05 ~1.
--B~ B
15' 1~' Temps d'anaJyse: 'S mn.
Dans ces conditions. l'oli~omère est pur à 49~3 %
30 une purificanon dc ~ ( SrT)l dTI 1 est alors effectuce par CLPH semi-preparan~e a~ e; une colonne ~ucleosvl dans les condlnons de ~radicnt su~vantcs:
.~--- ----- - B~ B
15' S`
Le 1 ~-mer presentc aJors un temps dc retcnoon dc 1~ mn et unc purete supeneur~ a 99 ~, 11.4.: Syn~hàe du dodecamère ~ dTS (SrT) dT6 FEUIL~E DE REMPl AC`EMENT
ISAIEP
wo 93t16095 pcr/FR93toolts ~o 11~ 1) S~hese du support solide.
Le suppor~ sol~dc defini dans l'excmple ll a esc unlise.
5 Il- l ~) S~,nthèse automansce de ~ dTS (SrT) dT6.
Les memes condinons de svnthèse mises au pOU t pOUS la synthèse dc ~ ( SrT)~ dTI 1 ont ete utiiisccs.
Le dosage des canons dime~ox~iryles liberes a chaque etape dc detnrylanon a pe~us d'evaluer le reDdemeM moyen t'inco~poranon dc l'unite 2' dcsoxy~vnut~ne a 99. ~ O e~ a 10 96. l ~0 pour le s,~n~hon 4' thiothvmltine.
11~.3~ Decrochage punfic~oon du ~ dTS (SrT) dT~, Le traitcment te cet oligomcre ~ ete ef~ecnlc sclon le protocole mis ~u poult tans l'exemple 15 Il. L'analyse ct la purification CLHP~ rcalisee da~s lcs memff conti~aons dc ~dtent revele u~ temps de retcn~ion te 13.18 minutes et u~c purete spectrophotomc~i4ue a '60nm de ~00 o~o 111. SY~THESE AUTOMATIS~E DE 4'-THIO-OLIGORIBONl~'CLEOTIDES ET
OLIGOMERES MIXTES.
On decnt la s~nthèse d'un 4'~thio-ri~o oligom~ homogene 1 tin~e sur la scquence d'epissage ace~ce du ~ene lat du HIV. O~l mon~c qu'il est cnsulte posslble d'obtemr des oli~omcs mixtcs eomprc~ant u~c scquc~cc limi~cc t'AD~I prescntant des llausons phosphodicstcrs ~e 4) ou pbosphor~thioa~cs ~scqueDce 5) De ~cllc~ ~eque&~ mi~e~ S~ S-ARN I ADN l 4-S-A~3` 4 et ~ p~ent ètre uulisee~
2 5 tan~ une appr~eho an~ c~ som susceptible~ t~ h~emont ~l~ d~ la me~e où
la "~ ro" t~ ~uc~ ADN ~era s~le sub~ras to ~ 40 H ~ tppuiement dc 1'~ aveo w~s c bb complemem~. Il cst à noter que l~ ADN (phosphodic~et ou pho~phorothio~o) p~ ~ d~ lon~ucur ~l~ - d~ lc~ ~ 4 e~ 5 il y a six de~oxynud~tite~ . ~t quo cett~ "fcn~ pcut ~ ulchuo ~ nqmpon~ qucUe position dc 3 o l'oligom~ m*no ux ~mit~ S' et / ou 3'.
Complh~eD~uement~ cctsc possib'll~'t~ ou~Te la vole ~1~ co~cepoon de nboz~mes amfic~cls ~homo~e~es ou non) compon~t dcs scquenccs d'oligo~nbonuclèo~des ~ R~
On ~ synthe~sc un ca~ nombre de 4:thio oli~oribont~cleotides homo~enes l~
35 sur un syD~edsct~ i A.D~ ~Applied E~iosystaDs mo~ele 381A) eD unhs;~t le procede gcn~l d~c~it prJ~t.
C'cst le c~s no~unent: FEUILLE DE REMPLAC`EMENT
ISAJEP
W O 93/16095 ~ PCT/FR93/00115 ., 1 . . , ~; ,~
du~'-Sr-~A-C-A-C-C-C-A-A-~-U-C-U)l du4'-Sr-t~-U-U-U-U-O.(4'-SrU6),2 etdu~'-Sr-(~-U-U-U-U-U-3'-P-CH2-CH2-CH~-OH~,(4'-SrU6-3'n-p~DH)3.
L'expression 4'-Sr vcut dirc: oligoribonucléotidc de configuration ~ où l'oxv~ènc du cvcle furannosc des sucres est rcmplace par un atome de sou~e.
3'n-prOH siynifie qu'unc fonction n-propanol est fixce sur Ic ~roupemcnt phosphatc introtuit à l'extrcmite 3' de l'oligoribonuclcoride.
De plus. des oligomes mixtes comprenant des se~uences d'oligodesoxvnucleondes pbosphodicster ou phosphorothioates ont ete obtenus et les modifications apportees au cvcle d'elongation sont decrites cn prenunt comme cxemple les sequenccs suivantes 4'-Sr-(U-U-U~d(T-T-T-T-T-T~4'-Sr-~U-U-U) I P11, ~'-SrU3~dT6-4-SrU3 / Plll ~
et4'-Sr~U-U-U~d(T-T-T-T-T~ 4'-Sr~U-U-U~P3PSsP3, 14'-SrU3-dT6~'- SrU3/P3PSsP31 S
ou 4'-Sr 8 deja cte tefini comme precetem~ent, Px corrcspond au nombrc de liaisons phospbodicster enere les unites nucleotidiques et PSy au nombre de lia~sons phosphorothioate entre les unites nuclgotidiques.
Les thio-oligonbonucleotites ont ete syn~etises sur un synthetiseur a .4D~ pplied Biosys~ems modèle 381 A).
J S.~nlhese des ~'-thloollgorlb~ cleotldes ~ Sr-(A-C-A-C-C-C-A-A-~
~'-SrU6. 2. el ~'-SrU6-3'n-prOH 3 Lc cvclc d' elongstion comporte qua~c etapes importantes " .
' 5 a) Détrityla~on du nucleoside ou de l'oligonucléotide fixe sur le suppo~ solide tans lec~ de4'-SrU6etde 4'-Sr~A-C-A~C-CdC~A-~-U-U-C-U),.ou bien de~n~ la~on du b~as D-props~nol fixe sur le suppor~ solitc ou de l`oligonucleotide fixe sur le llen n-propa~ol dans le cas de 4'-SrU6-3'n-prOH.
3 0 b) Co~densation du pbospboramidite active par le te~azole sur l~ydroxylc 5' libre du nucleoside ou de l'oli~onucleo~ide.dans lc cas de 4'-SrU6 et de 4-Sr-~A-C-A-C-C-C~ U-U C-U).ou bien sur l~ydroxyle libre du bras D-propanol ou sur l~ydroxvle en 5' de roligonucleotide dans le cas de 4'-SrU6-3'n-prOH.
c) Masqua~e des fonc~ions 5`-hydroxyles qui n'ont pas reap.
IL~E DE~5RA~ME~T
WO 93/16095 PCI`/FR93/OOtl~i n ~' 1 Chaquc svnthesc a ete cffectuee sur une colonnc conte~ant 40 m~ de suppon sol~de. Le rendcment de chaque mco~poranon est de 98 O evalue en mcsurant la denslte opnque des eanons dlmethoxy~tyles liberes apres chaque couplase par ~raltemcnt du support a l aclde ~nchloroacetique.
5 Des la-ages sont ef~ccsues enFe chaque etape. et la durce d'un cycle d'elon2anon e5t de ' I.16 m~nutes pour la s~lnshese dcs ~ois ollgomeres prec~tcs. ( Tableau;~l .
ETAPES ~ 1PS ~econde~) I SOLVANTS ET RE:ACTlFS
Lava~e~sechage ~ CH~CN I .~
Couplage 915~ucleoside pbosphoram~dlsc 0.1 .
~1 (20 eq.) dans CH3C~ ~
. tesrazole O,S ~t ( lO eq. ) dans L - _ . . CH~C~I. l L vage-sech~c ¦ ~l _CH3CN ~ GO~
Oxyd-non ¦ ;6 12(0.1 M)dansTHF/ PY H20 I (40/lO~l).
_ . _ .
LavaQe-scchage _ 1 59 I CH~C~ I ARGO~
~vlasquagc ~3Methylimidazolc~THF I
Ac~O/luadine/~ 1 18 1.
_ l Lava~ ? I ~CH~C~ / ARGO~.
2 ûDem lanon 98 _TC.~ à 3~O~a~
~ _ ! CH~C~i ~ ARGO~;
TA~LEAU 2 Cycle d'élonga~o~ u~se po~ la syn~ès~e te4'-Sr~A~C-A-C C-C-.~.~ V-2 5 U-C-l~') l, ~'-Sr~$ 2, et 4' Srl~'6 3'n-prOH. 3.
II~-2 Syn~h~K ~ oli~o~tcs mi~cs: ~t'.Sr~ U3 ~ P~ s~u~ J~
Srl-'3/P3PSf~3 111- '-I OI~gonucléotlde ~:SrU3-dT6 ~:5rC. 3 P
La svathèse automa~sce tc cct oli~onucleo~ide reprend les qua~e etapes decntes au l l- l Ch~que s,vnt~c# ~ cté cffcctuee sur unc coloDne contcn nt ~0 m~ te support sollde Le rendement de chaquc ~ncolporat~olL es~ dc 98 %. La duree d'un cyclc d'cloncaoon par monomère 4' Sr~U est de 21.43 mmutes contrc 6.73 mmutes pour un monomcrc dr Ccrse 3; dif~erencc est due i ru~cn~on du temps dc couplage d'unc entitè 4'-Sr U qul ei~ ~e ~1 s~contcs con~c 36 sccondcs pour unc u~utc dT.(t blc~u 3).
F~EUILLE DE RE M PLJ~CEM ENT
.
WO 93/16095/ ~ PCl /FR93/00115 ET.4.PES ~ ps~s~condes) I SOLVANTS ET I
¦ REACTlFS
j Lava~e-sechaee 1 '5 I CHlC~ I ARGO~;_ Coupla~e ~' Sr l_ I 915 I!~iuclcoside phosphoramldlle¦ 10.1 M ~_0 eq.) dans CH;CN
dT ' 36 ~ tetrazole 0.5 M ( 10 eq.
l da~l5 CH C~i.
¦Lavaee-secha~e L - 4 ! I CH~C.~ RGON
Oxvd~lon I -6 12 (0~1 M~ dans THF / P~T
_ _I . H ~O (40/10/1).
¦Lav~e sècha~e_ ! 59 ¦ CH~C~ 'ARGOI~
IMasquage ! ~; Methylinudaz,ole THF: I
_ ~ IAc OAundinc/lHF 1/118 1 L La~a~e-secha~c 1 71 ! CH3C~ ,' ARGO~
j Detnrvl~non ~ 98 ! TCA à 3% ~ns C}~Cl~
15 ~
T.~BLE.~I ' 3: Cyclc d'elonga~ion u~lisc pour la synthèse de 4'-Srl;3-dT~ Sr~ 3 J Pl 1 ~.
2 ~ O~lgonu~leollde 4 '-Sr~;3-d~6-~'-Sr~'~ P3PSSP3.~
Les memes condinons de s~lnthese automanscc ont e~e appliquees à ce dodecamerc nu~te compo~ a la fois des liaisons phosphodlestcrs et phospborothioates.
L3 svnthese a elc effecn~ce a l'echelle d'une ~lmole soit sur une colonne contenant en~on 5 ~0 m~ de support solide fo~caon~lalise a 21 ,umole ! ~, Lc rendement mo~ven d ncorporanon es~dc98%.
Lors dc l'iDtroduc~on d'une liaison intcrnucleondique de ~pe phospho~othioate. lctzpe d`oxvdanoD definie au paragraphc ~ l (etape 4. Table3u3 ) a ete remplacce par une etape de sulfurisation dc Sl sccondes u~ilisant le reactif de Bcauca~e ( ~rives de sulfon3 c~r~thioanhydri~de d~ benz~ne'~ dissout dasls l'acèton~tnlc a une 3 concen~anon d~ 0.0S ~.
Lcs autres etapes tu c~cle d`elonga~on demeurent inchan~ees.
fJ~-3 D~croch~c, Dcprotcction c~ Purif~c~non dcs 4 ~-thiooli~or~onYclcotidcs (4'~1~.
3~
FEUILLE DE REMPLA~EMENT
WO 93/16095 PCI'/FR93/00115 ,., ~ . ~ ,.. .
Après avoLr réalisé les etapes de déprotection des méthoxyphosphotnesters en phosphodiesters pa,r traitement au thiopheno~. les 4-thioQligoribonucleo~ides ont ete separes des supports solides par un traitement à l'arnrnon~aque. Les groupements TBDMS ~ntroduits sur les hydroxyles en ~' ont ete deproteges par une solu~ion de TB~F dans le THF. Les 5 thiooligomères sont ensuite dessalés sur une colonne d'exclusion DEAE Sephadex G-~5 p ~is purifiés par CLHP en phase inverse.
111-4 PARTIE EXPERIMENT~LE.
~` 10 Exemple l: Synthè~e des hesamèr ~ SrU6 2 et 4'-SrU6-3'n-prO~, 3.
1-1 Synt/~csc d~s suppor~s sol des:
15 Le suppor~ soUde néca~ire ~ la synthèse de 4'-SrU~. 2 est le même quc celui utilise pour la s~nth~se de BrSUl~.
La synd~# de 4-SrU6-3'n-prOH 3 necessite l'utilisa~on du support soUde u~vcrscl:
/^\
~ ~ ~ 21~
' / \CH/ ~C/ ``'--/
2~ 0 A pa~ir de l'intennedia~re P-3 decrit dan~ le Brevet n 9~ 01275 un melan~e de l -O-DmTr-propanol-3 ( l eq.), de DMAP (29,5 mg, 0 5 eq.), de triethylamine (O, l46 mg 0 003 éq.? de DEC (920 mg, 10 eq.) et de P-3 (2 4I5 8) est agité dans 29 ml de pyridinc 30 anhydre pendant trois jours à temperature ambias~te~ Du pentachlorophcnol (321 mg, 2 5 cq ) est ajouté et l'agitation du melange reactionnel est poursuivie pcndant 24 heures supplcmentaires. Le support solide est alors filtre, nnce avec dc la pyridine anhydre (~ ~ 50 ml) puis avcc du dichlorométhanc (2 x 50 ml) et de l'ether (2 x 50 ml).
Le support solite est ensl~ite traite pa~ la pipe~ e, pu~ p~ u~e solution d'anhvtride 5 uetique e~t do coUidi~e d~s k THF sclo~ le ptotocole t~fi~i pr~ment~
Ce~e dhmi~on a éte effectuee e~ ulilisaut le mode op~oire tecnt precedemment. Lc tUL~C de foDc~oD~lis~o~l du supp~ solide a ete evalue i 16,4 llmole de n-propanol par grammc de ~e. FEUlLLE DE REMPLAlCEMENT
W0 93/16095 ~ PCl'/FR93~00115 ,~ .
1-3-) S~ ntll ese ~utomo~isc~ des h~Qmcr~s 4 '-5rl,!6 2 et 4 '-Sr JU 6-3 ~n-proH 3.
1-3-1~ S~n~hèse a2 loma~lsee de l'he~omere 4'-Sr~ 6 _ 5 La svnthèse cst effeetuee sur unc colonnc conte~nt 39.4 m~ dc support sollde fonctio~alisc à ~ mole/g de rcstne~ sott 0.8~7 ~lmole (I eq) dc 4'-thiou~td~ne Chaque c~clc d'elon~arion necessite un exces de svnthon phosphor~midite ( 1~.75 llsnole. 'O.i eq~
soit 100.5 ~mole au total CD solution 0.1 .~1 dans l'ace~o~ ile.La duree du c clc d'clon~anon definic danS Ic tableau 1 est dc ~1.46 nunuus.
Le tosa~c dcs canons dimethox~ttylcs libcres à c~aque et~c de de~itvlatlon a pennts 10 d cvaluer lc rcndcment moycn d'incorporanon t'une ~ite thioribonuci;eotidique a 98.; O
1-3~ n~hèse auton-allsee de l'hexamère ~ rU6-3'n-prOH3.
La svnthèsc est cffesruce sur une colo~nc coate~nt 36.2 mg dc support solldc 15 fonctioanalise a 16~4 l~mole ~c n-propa~ol par EFamme te resine soit 0~82 ~lmolc ~ I eq ) dc n-orooano~.
La synth~e totsl~ de 4'-SrU6-3'n-prOEI, 3 necctsite 95,9 m8 dc synthon phosphoramiditc ( I 14.8 ~mole. 20 eq~) tissout dans 1. 14 m~ t'acetonitrilc.La durec d'un cvclc d elon~anon est de 21.46 m~utcs.
Le rendcment moyen par eouplagc est de 98~3 %~
~) Décrochagc, d~pro~ p~lr}fca~ion t2 4~r~ 2 ~ 4'~Sr~6-3'n-pr(~f 3.
Le ~ent u~lisa~t successivcmc~t du dliophenoL de l'anu~o~iaquc et une soluoon deTB.~F. commu~ u~ dewlc hcxamcrcs est tecnt precedemment.
2 5 / ~ I J An~yse er Puritieanon de l 'hexamère ~ :Sr~'6 2~
L'a~Jyx CL~H du thiooligomere a etè effeemee sulr u~e colon~e SFCC ~;uclcos~l C-18 5 'P 789 d~s les condi~ons te zradient suiv~ntes:
10 ,'o d'acttoiitrilc d~s une solu~on aqueuse 0.05 M t'actute de ~ritthylammo~um 3 o B: IS % t'aceton~trile d~s une solunon aqueuse O~OS M d'acet~te de ~edlvlammomwn Gtadicslt:
A----~0'-- B--10'---- B
> >
Temps d'~dyse: 30 miDutes~ dgbit: 1 ml I mill.
FEUILLE DE REMPLA~EMENT
WO 93/16095 PCI`/FR93/00115 r .~l ~ S 6 Dans ces condiuons, I~hcxamère ~-SrU6, 2 présente unc purete spe.~rophotomètriquc à '60 nmde95,3 %.
Unc purification en CLPH preparative sur une COIOMc nucleosyl semi-prcparative avec un debit de 2 ml I min a un éluant isocratique de 12 % d'acétonitnle dans une solution aqueuse 5 d~ace~tase de tricthylammonium 0,05 ~I nou~ permct d'obtenir le 4'-SrU6, 2 avec une purete spcc~troscopique dc 97,7 %.
nalyse eJ purrficatlon de l'hexamere ~'-SrU6 3'n-prOH 3.
Lanalvse est cffcctucc dans les mèmes conditions dc colonnc et dc ~radient que pour 10 l'hcxamcre ~'-SrU6 Le 4'-SrU6-3'~prO~ 3 a etc obtcnu avec une puretc spectro~copiquo à 260 nm de 51.6 'o Certc puretc cst portec i 92 % apres punfication par CLPH preparativc effecsuee dans un eradient tc 10 'o a 13 ,'o t'acctonitrilc rl~nc unc solution aqucusc d acctate de rsicth~lammonium O.OS !~1 cn IS n~inutcs. swhn d'un palli a 13 % d'aceton~le dans unc l 5 solution aqueusc d'acct~e te trict~vbm~noDium O.OS M pentant 10 m~nutes.
Exemple ll: Synth~e du dodèc~mère mis~e: 4' SrU3-dT6~ SrU3 / Pl 1 ~.
IJ~I~ Synth~sc ~u s~ppor~ sofidc 2 o Le support solite u~lisc pour ccr~e sy~thès~ est ideD~quc à celui nccessalre a la synthesc du ûrS- 12 11-2) Synt~lcs~ ~to~scc dw 4'-SrU3-clT~ Srl~3 / P~ ~ 4.
La s~ntbcse du to~écamere est e~ectuec sur unc colo~e contcnant ;9.i m~ de juppor~
~5 solite soit 0~819 l~mok de 4-thiou~idine. Chaque cyclc t'clonp~on necessltc un e~;es dc s,~nthoDs 4' d~ioundi~e phosphoramidite (16.~S ~moles~ ~0.3 eq) soit lO0 ~ umole dc s,~nthons 4'-thio uriti~e dissout d~s 1.2 ml d'ueto~litrile (0.083 ~l) un exces de jynthon dcsox,~h~d~e phospbo mitite ~20 eq.. l6.38 ~mole~ soit 98.28 ~moie te dT en solunon 0.1 !1 ta~ cetonit~ile. L~ dur~e d'u~l cycle d'inco~on d'une tu~i~e deso~th~ud~e30 est dc 6.73 m~L alon qu'elle est de ~1.43 m~ pour un cycle d'~corpotanon du synthon ~`
thionbou idine~
Lc dos ge des c~o~ med~o~tvles lib~rès à c~que tupe de dèm~lanon a Dennis de~alu Ic re~tement moyen d'mcolpo~tlon i 98.0 %.
11 3) D~crocll~d~pro ~ a p~tirco~ ~ 4'-SrU3~T~4' Srl:3 / P~ I
FEUILLE DE REMPLACEMENT
Wo 93/16095 pcr/FRs3/oolls ~ ,~ t , . ..
Les e~apes de dccrochage dc l'oligomere du suppon solide et de tcprotecnon dcs llalsons Ln~e~ucleondiqucs phospho~cster au thlophcnol sont Idennques à celles decntes dans I e~emple 1 5 11-3- IJ Anal~se er Purrficolton d~ Sr~ 3-d~6-~ '-SrC 3 PJ ~ 4 par CLPH.
L'analyse CLPH de roUgomcre 4 2 éte effecn ec sur une colonnc SFCC ~ucleos~l C I ~ S
'P789 tans u~ gradient a 10 % a 15 % d'acctom~ile dans unc solunoD aqueuse d'acetatc dc tnethvlammonium O.OS ~I pentant 20 mmutes (debit: I ml Imin~ tcmps d'anal~se . ~0 ~un) Dans ces contitions~ le dotccame-e mlxte presentc une purete spcc~rophotome~4uc a '60 10 ~ de9~.Sb.
I~ne pu~ificanon p~r CLPH sc~u preparative sur u~c coloD~e ~iucleosyl avec Im deblt de ' rnl / m~n dans le memc gradicnt augmente la purete spcc~ophotomè~4ue de la sequence mixt~ 4'-SrU3-dT~4'-SrU~ I Pl~, 4 à 99,5 %.
15 EXEMPL 111- Synthe~e ~utom~ti~ee du 4'-SrU3-dT6-4'-SrU3 1 1~3PS5P3 S.
11~-13 Sy~nthcs~ du suppon solidc Lc support solide uilise est le mèmc que celu~ desnt dans l'cxemple l.
2) S~ndles~ Qutom~s~ ~ 4'-5~1;3~6 4 -S~IJ3 ~ P~PSsP3 ~
La s,~nthèsc du dodeamcrc es~ cffec~uee sur une coloDne contenant 39~S mQ de suppon foncnonnalise soit 0,831 ~mole ~ I eq) de 4'-thiouridinc. Chaquc cycle d'eloo~ancn necess~e un excés de ~ 4'~ioundi~c p~osphoro~dite ~16~75 ~mole. 20~3 eq.) So~ 5 25 umole te 4' Sr U ~ tot-l a u~ exces dc ?0 eq. ( 16.38 ~imolc) de s,~nthon desox~ rudme soit 98.28 ~mole pour b sy~cse cnaere La dw~e d'u~ cycle d'~corpot~on d w~c dèsoxythymidine est de 7.7 m~nutes con~e ' 1.~;
minutes pour l'i~corpo~on d~ ouridine. Le dos~c des c~ons dlmetho~ntnr~les libcs Indique u~ dement move~ t Incorporaoon tes syntho~ te 98~ ~
111-3) D~crocb~g~ dcpr~c~ c~ pur~ficot~on t~l ~' StU3 dt6~-St~`3 ~ p3p~ssp3 ~
Lc t~ eme~t te cet oligomcre e~t ~dcntique i celui tè~i d~s l'cxemplc 1. L anal se et la purifi~on Cl HP. r~alisee sur unc coloMe SFCC Nucle~l Ct8 ~ S 'P789 dans un ~ient te lo % ~ 20 % d' cetonilrile d0s une solu~ion ~queusc t`accs~tc de 35 me~ylu~onium QOS M pe~t ~0 m~utes (débit: I ml /mi~ temps d'a~alyse 30 mm) mon~c unc p~e 5p~0phFtEmucltnLqLeE~ l2~E~mREM5pLAC`EMENT
IS~VEP
wo 93/16095 PCr/FR93/00115 .'~ . '' ~ '` ' ,1 ;"
La punficanon par CLPH semi-preparatlve sur une colonnc ~ucleos~l seml preparanve avec un dcbit de ~ ml / mi~ d~ns dcs condinons Isocranques a 19 % d'acctorusnle dans une s~lunon aqueuse d'acetate de tnethylarnmomum 0.05 ~1 augmcnte la puresé de l'oligomère à
99.1 o.
Exemple 1~: Svn~hè~c du d~damèrc ~nti"ta~":
~'-Sr-~A-C-.~-C-C C-A-~-U-~-C-~')I.
1~' 1J Synthcsc ~lu s~ ppOrf sohd~
10 Le suppon solite utilisc pour ce~te synthesc automa~isee cst idc~nque à celul decnt da~s l'e~<emplc 1 2J ~nthc~c al~om~is~c tv dodcc~mcrc ~nt'to~":
~-s~A~c~A~c~c-c~A~A~ c-~? l~
La s.~,nthese de cct hctododecamere compleme~t ire tu site accepuur d'eplssa~c du ~ene a~ du ~tlH est effectue~e sur une colonnc co~teDant 38.S m~ de suppott solide foncnoMallsc soit s~r 0,808 ~mole de 4'-thioundi~c ~1 eq~). Chaque cyclc d'clonga~on u~lisc un e~<ces dc 'S~4 eq (20~4 ~molc) en s,~tbon 4' thioadenosinc phosphorosmidite. 13.5 cq ~10.9, ~0 ~mole) en s,vnthon 4' thi~di~eet 30 eq~ (24.2S ~mole) en synthon 4'-thioundmeLa duree d'un cycle d'i~co~pora~on est te 20,~1 minu~es et le dosaQe des ;anons di~nc~ho~tyles i~diquc un rentement moyen d'incospor~non des s~nthons phosphoram~dites dc 93~6 %.
t~'-3) D~crocho~. d~rota~ crputif~ on du 4'-Sr-(A-C-A-C-C C-A-A-~ C l,) f.
Le support solidc pon~t le dodecunerc ~'-Sr~C-A~C-C-C A A U U~C-U)~lest ~ute par S ml d'unc solu~ te thiophenol ~ ~lethyl~ne f dioxsne (11211) pcndant une dcml heure i tc~ran~ biantc. La solutlon te thiophenol est alors filtrce et le 5UppOt~ SOhde CSt lave avcc 3 x 3 ml de ~ct~a~ol. puls p~r uDe solurion d'ammoni~4uc 32 /O dans l'c~hanol ~3/1: ~lv) (3 x 500 ~l~ afin de decrocher l'oli~omère te son suppo~ La solu~on ob~e~uc est mlse i incuber d~s u~c etuve seche thmost~cc à S5 C pc~d~t S heures at~n de deprotcg les ~roupements protcc~curs tes b ses bètcrocycliqucs. Elle es ensulte evaporee, rcpnsc d~s 500 ,ul d'cau et Iyophlllsee~ L'oligome ly~c cst alors dissout dans 300 ul d`une solu~ion de TBAF (1.1 ~1) d~s le THF. Le mclu~gc r~onnel cst l~sse a 3S tem~c ambiYlte pe~ 4 hc~es. L~ re~ctio~ cst alon stoppec ~rcc 300 ul dune - solu~ion ~ueuse d'~et~te d'~mmomum QOS M. L~ solu~lion cs~ e~porec i sec. co e~poree ~vec 3 por~oDs dc 500 ~ t`esu e~ 1~ rcsidu cst dess-le sur u~e colo~e te ~el d c~ ;luslo~
FEUILLE DE REMPLA~EMENT
~:
wo 93/1609~ pcr/FRs3/oo1 15 t L ~
,. ' ~ J
DE.~E Sephadcx G-25. Lcs ~ac~ons contenant Ic 4'-thiooligomcre sont rassemblees~c~aporees a sec~ red~ssoutes dans 1.2 ml deau et fil~e sur filtre milliporc avant d'e~e anal-see par CLPH.
5 1~' J) Anal~ se et pur~fcat~on du 4 '~Sr-/A-C~A-C C-C-A-A-~ -C~
L'analyse CLPH analy~quc du doteearnere I a ésé éf~e~tuee ~r une colonne SFCC Nucleosyl C18 N125 2P789 dan~ gradient de 10% à 15 % d'acétoritrile tans une solution aqucuse d'acetate de tri~hylammsniwn 0,05 M a~ec un tébit de I ml ~ e~ temps d'analyse de 30 sninutcs. Le chromatogramme indiquc unc purc~é spt~ophotomémque à 260 nm de ~4,9 %.
~Une puri~cado~ par CLPH s~-prépara~ive sur une coloMe Nucleosyl C18 semi-prepara~ive en utiL;s~t le meme gradi~nt av un t~it de 2 ml ~ ot un temps t'analyse de 30 ~unuta amènc 1~ pur~té spec~oscopiquc du 4'-Sr~(A-C-A-CC-C-A-A-U-U-C-U), I à 100 ~O
IV . PROPRIETE D'HYBRlDATlON l)ES ~ OLICONOCLEO~IDES.
La spectrophotome~c Ij. V. pmet d'etudi Ics acides nuclciques ct tc mes~c en e~ldence la fonnatio~ de duplex. la tcmperature tc fusion ct~nt u~c des caractcnstiques d'un duplex L'cmpilcmcnt et l'appancment des bases dcs acides nucleiques sont accompa~es d une diminution de l'absorb~on ~ V. (H~rpochro~uàte). Ai~si par spectrophotomesne U.V. il 20 est possiblc de con~oler la fo~natlon ou la tissociation d'un duplex. ~f S~`lGER
Prlnclples of ~luc~elc Ac~d Strucnre~ Spnnger Verlag..~icw-Yorlt 1984. pp 1~ 9 Lorsque la tcm~e d'une solutloo conten~t une doublc helice (ADN ou AR~) es~
len~cmeDt a~entec. l'absorb~on l,.V. croit nettement tout au long de la tlssoclanon. Le pomt d'inflcxio~ t~ la cour~c d'allure sygmoYdale de la vana~on d'absorbancc en fonc~on dc la tcmp~ est ~ppclcc tcmpamre de ~usio~ ou Tm et co~espond a la co-e~stcnce2 5 dc bn~s ~es ct te brins appanes tans un rapport SO / ~0.
I 'analysc tes cou~cs dc ~s~on tes duplex ~4' thiooligoribonucleonde / ~
oligodéso%yri~o~ucleo~ide e~ ooligonbonucleon~e / ~oligoribonucleonde pennc~3 de tcfi~ir la s~bilitt ~quc dc tels duplex p~ i8 mcswc dc îa tcmperaturc àe nlslon.
Ces ex~c~ces d~ tion son~ mc~ees e~ respcct~nt uQe ~toecl~iome~e I I I en~e les 30 dcux brins complementaircs. cn prcxnce d'un tampon 1 M ~taCt. 10 n~ cacod l~tc de sodiu~n. Unc fonc concen~on cn ~aCl favorise en effe~ Ics appuiements en soI~aw~t les cb~rges ntp~ves autour des a~omcs de phosphote des tew~ oli~onuc~eonde ~ous a~fons do~c cffcffut ces expenences dhvbrida~on ~ u~ ~u~ ampon: 0.1 M l~JaCI . 10 m1~ cacodyl~# de sodium.
35 IV. 1. RESULTATS ET DlSCl,SS10 E~emph~ I et 11: E~penences de fusion da duple~ as.u~2 Ipoqr~
FEUILLE DE REMPLACEMENT
Wo 93/I6095 pcr/FRs3/oolls et ~rl~ 1 2 / pol~rA.
Ces expencnces permettent dc meme en ev-dcnce l'influcnce de l'atome de soufre en poslnon ~` du dodecamcre modifie sur la stabilitc thcn~uque du duplex cn comparanl les Tm ob~cnus avec ceux du duplcx nan rel.
Le tableau 4 reswnc les temperamrcs dc fusion obtenues dans les deux expenences Concentraoon ¦ BSr~ I ? / polvrA 'C Brli l2 / polvrA ac en ~aCI H~.~ochron~icitc '0 Hypochromieite O
_ _ I _ _ _ -1~1 1 46^C '5% _ en cours 100.1 = t5'o ~ en cours _ _ __ _ ~ __ _ , Tablcau 4 Temperan~rcs de fUSlOD des duplcx de todecamcres Concemrat~on; ~ l en cha4ue oligomèrc.
15 Lanalysc de ces rcsuita~s mon~reM quc le duplex 6SrUI2 / polyrA presente unc bonne stabilite thesmique represen~ce par le Tm dc 46C obtcnu à unc concentranon de I l~l en ~;a(~
Exemple~ lll et l~': E~perience~ dc fu~ion de~ duple~ I~Srl~l2 l BdC2Al.C. et ~rUl-I BdC2A12C~-to Les ~empcratures de fusion obtcnues dans les de~; expcriences sont rcsumees dans le tableau S~
_ _ Conccn~aQon BSr~ adC_.~l~Ct oCl Brl~l2 ' BdCt.~l~Co C
en NaCl H~ochrorn~c~te % I. Hvpochromicl~e o 2 5 _ . ~
lM ~?C 9 3% ¦en cours . _ ~
0. IM 5'C ~.6io en cours _~ . _ _ _ _ . _ _ Tabl~ 5 Tempcran~res de ~sion des duplex dc dodecames Concentraslon 3 ~lM cn chaque olisomcres E~emple IV: E~perience d'autohvbridation de l'oligomere ~SrUI~.
.~fin de verifi les rtsultats preccdents. il est ntcessaire dc s'assurer quc le dodecamere 3Srl;lt ne conduit à aucune autohybndation. Pour ceh on a effccruè une c~penenccd'auto-hybrida~o~ tu totecamcre BSrl, It i deux concentr~ons en ~aCl ( I ~t et 0 1 ~
Les cour'oes d'hybnta~on ne presentcnt pas l'allurc sigmoïdalc caractensn4ue mals ob~issent à l'tquation A = k-T où A cs~ I'zbsor~ancc i 260 nm. T la ~emperanlre et ~ une co~stante. Aucun point d'inflex~oo ne peut etre ~risualisc sur une ~ellc drolte Nous ~ou~ons donc conclure que Ic dod~camcte Bsr~ I t nc s'auto ~pparic pas.
FEUILLE DE REMPLACEMENT
WO 93/16095 ~ f ¦ pcr/FRs3/ooll5 .. ~ ,.. .... .
La comp~raison d tempér~tures de fusion dn duplex ~Srljl2 / ~dC2A12C2 (Tablc~u S) et BSr~:l2 / polvrA (Tableau 4) montre une stabilité thermique de l'homoduplex .~R~/AR~' (Tm = ~6 C) nettement supérieure à celle de l'he~eroduplc~ AR~ DI~, (Tm = 27 c) d'autre psrt, aucune ~uto-hybridation de BSrl;12 n'a é~é conststée.
Exemple ~l et ~ Expérience de fusion des duplex ~dTs(SrT)dT6 / ~dC~Al-C~ e BdT~ dc~Al2c2 Cette experience permct d'evalucr la stabilité thennique du duplex ~dTs(SrT!dT6 / ~dC?.~I~C~ comparanvement à celle du duplex naturel BdTI~ l 3dlC~AI~C~
iO (Fi~ure 1) Les temperatures dc fusion de ces duplcx SODt indiquees dans le tableau 6.
_ _ Concen~ration BdTs(SrT)dT6/BdC2AI~C~ C l BdTI~ / BdCa.~l~C~ ^C
en ~;aCI Hvoochromicitc % HvpochromiciIe ~O
1 c , .... _ _ .
1~3 40C 18 % ~5 C '0 ~ %
. _ _ Tableau 6 Temperature de fusion des duplex BdTs(SrT)dT6 / BdC >AI~C~
et BdTI~ / BdC~AI~C~
Concentrasion en chaquc oli~omère 10 ~M
Au vu de ces resultats~ il apparait que la stabili~e the~n~ique du duplex modifie cst infeneure à celle du duplex naturel. Cependant la di~ér~nce de 5~C existante entre les delLx temperanlres de fusion est tlQp faible pour conclure à un mesappar~ement. En effet. ce~ns auteurs ~Y.KAWASE~ S.IWAI~ H.I~OI TE~ K.Mn,lRA et E.OKTSUK ~ ucle~c Acld R~search~ 1986, 14, 772~) ont mon~e que l'existence d'un seul mesappanement dans un ~5 du~lex de 13 unites nucleotidjques se traduisait par une timinuDon dc Tm supèneure a I oac~
On peut donc conclure que l'unite 4'-thio-nucléotidique s'~ppsrie bien avec l~ 2'-desoxysdénosine msb ~ec une ~ffinite inférieure i celle de b 2'-deson~thymidine 3 ~ comme le confirme 19 tifference de Tm de S C obtenue ~T~ble-u 6)~
1~'. 2. PARTIE WERIME~TALE
!.1ethode G~ner~le pour l experiences d'h~brid~tion 3~
FEUILLE DE I~EMPLACEMENT
Wo 93/l6095 pcrlFRs3/ool 15 r ", ~, J ~ 6 ~
.~ - Dosage des ollgomères complemen~alres ,~fn dc reallscr l`expencncc d'h~bndanon. il est neccssalre de cormaitre la conccn~ranon en chaque oli~omcrc pour rcspecter la stoechometne l: l cntre les de~ bnns 5 complementaLrcs. Selon la loi de BEER-L.~lE3ERT A = EIC. IeS absorbances dcs oligomeres ont etc mesurees a 80C afin d'elinuner le phenomenc d'cmpllement des bases crcan~ une pemlrbanon de l'h~rperchromlcite duc à l'cxistence de strucnlrcs ~emalres On peut donc connaitrc les coefficients d'exnncnon moléculure des dodecameres à 80-C ,elon la relanon ~ 265(Srl t ~) = 12~ 265~rl.
B - ~ vndlt~ons d'hvbr~datton.
Les expericnces d'hybndanon sont cffectuees avec un spectrophotome~e U~l~;O~ 810~CO?~TRO~I). couple a un nucroor~inateur IBM compa~bk. La temperarure e5t con~rolce par un programatcur de tempcrature HlJ'BER PD 415 con~ecte a un bain Ihcrmosta~e15 (HliMER MI~IISTAT). Les cuves l V. sont cn qu~re de I cm de long ct unc clrculanon coninuel~e d'azote est utilisce pour les tem~tures infeneures a '0-C ~ant l'exper.encc~; ~M (Exemples I a V) ou 10 IlM (Exemples Vl et ~,11) d'oll20mcres complementaires sont m~s en prcscnce dans une quan~te suffisan~e pour 1000 ul detampon 1 M ~`iaCl et 10 mM cacodvlate de s~um. ajustc a pH 7 (Exemples I a ~11) Ce melange est chauffe à 80C pendant 1 heure~ puis re~oidit jusqu'à - tOC selon une pente 20 de temperan~re de 0.5C par mmute. Les valeurs *absorbance et de temperamre sont collectees toutes les 30 secondes.
La memc e~cpesie~ce est effec~uce cn unlisant une quannte suffisante pour 1000 ul de tampon d~ybnda~on 0.1 ~ ~aCI. 10 rnM cacod~late de sodium aJuste a pH ~ a~n d'eYaluer la stabilite thn~lquc du duplex dans ce tampon favonsant molns les ariemc~
E~emple 1: St~bilit~ thennique du duple~ BSrlil2 / polyrA
1-1 Dosage tes o/~gomcres ConcentTarion de BSrl ' l~ = 0 3S ln~l 3 o Concentra~on de polvrA = 4~$1 l-2 ~ ondlnons d'h~brt~llon 3 ~M (8~SS ~ dc BSrUI~ et 3 ~ 7.79 ~11) tc pol,~rrA sont mis en presence dc ~ 6 ul des ~ampons tl~ybritation (I ~1 ~aCl. 10 n~l cacodylate de sodium ou 0.1 ~ ~aCI. I0 mM cacodylate tc sodium3 E~emple 11: St~bilit~ ~hermique du duple~ ~rl;l2 / polvrA
l:EUILLE DE REMPLACEMENT
WO 93/16095 ~ PCl /FR93/00115 , . . .
en cours Exemple 111: Stsbilite thermique du duplex ~SrU12 / ~dC2Al2C7 5 111-1 Dosa~e ~es ollgomeres Concentra~ion de BSrlJ 1~ = 0.351 mM
Concentration de BdC~AI~C~ = 0.;69 mM
111-'~`ondlt~ons d'hvbrldatlon 1(8.5~ ul) dc BSrlJI~ et 3 ~1~1 (8.11 ~1) de BdC2A12C~ sont Il~is cn presence de 98;, !11 des tampons d~ybridation ( I vt ~iaCI. 10 mM cacodylatc de sodium ou 0.1 ~1 ~aCI. 10 nL~l cacodylate de sodium) Exemple IV: Stabilité thermique du duplex ~rU12 I BdC2A12C2 ~en cour5) IV.I Dosa~e des ol~gomères 5 Concentranon de Brl i 1~ =
Concen~anon de BdC2Al~C~ - 0.369 mM
' Con~lt~ons d'hybridatl~n 3 ~ 1) dc BrU 1 ~ et 3 ~lM (8.1 1 ~1) de BdC2A12C2 sont mis en presence de ul des tampons d~ybridation (1 M NaCL 10 mM cacodylate de sodiwn ou 0~ ;aCI~ 10 nL~,~
cacodylate dc sodiwn) Exemple ~: E~pericnce d'autohybridation de 1' oligomère BSrU12 2 5 V- I Dosage des oligomères Concentra~ion dc ~SrU 12 = 0.351 mL~
V 7 COndJrjOnS d'~br~ Jon 6 uM (17,10 ~1) de I~SrUl~ sont n~s en presencc de 986.9 !11 dcs ta~npons d~bndanon ~ I
30 ~ iaCI 10 ~1 cacodylate de sodlwn ou 0.1 M NaCI, 10 mM cacodylate de sod~um Exemple Vl: St~bilite thermique Ju duple~ lldTs(SrT)dT6 1 BdC2A12C2 K7-1 Dosage des ollgom~res Concen~on de BdTs(SrT)dT6 = 1.33 mM
35 Concentrarion de BdC ~AI~C~ = 0.369 m.
V}-2~ondt~ons d'h.v~tdQuon FEUlLLE DE RE~PLAC`E~ EN~
wo 93/1609~ Pcr/FR93/oo11s r, 1 ,~, ., i ~J 64 lOu.~ (7.~9111) de BdTs(srT)dT6 et 10 ~M (77-5 ~1) de BdC~Al~C2 sont nU5 en presence de 970 ,ul dc tampon d'hybndanon 1~ ~iaCI. 10 IrL~1 cacodvlate dc sodium.
Exemple ~ Stabilite thermique du duple~ ~dT12 1 ~dC2A12C2 ~ 7~-1 Dosa~e des ollgomeres Concenlration dc BdTt~= 1.196 mM
Conctn~anon de ûdCtAltCt = 0.369 ~LM
~1-2 C`ondltlons d'h~brlda~lon 10 10 ~M (8~36 1~1) dc BdT1~ et 10 ~ 1) de ~C~A12C2 sont n~is en presence de 969.1 ul de tampon d~hybntation 1 M NaCI. 10 mM cacod~late de sodium.
~. PROPRIETES D'HYBRlDATlON DES 4'-S-AR~ ET OLIGOMERES ~ TES.
15 Les experiences d'hybridation sont mcnccs cn rcspectant la stoechiometric 1/1 cn~e les de~
blins complemen~res en ptesence d'un tampon 1 M NaCI. 10 mM cacod~latc dc sodlumline fortc conce~traaon cn ~aCl favorise e~ effet les app~rinents cn solvatant les ;hargcs neganves autour des atomes dc phosphorc dcs dcux oligonucleotites. ~ous a~ons et~ccrue ces expenences d'hybridation dans un autre tampo~ 0.1 ~ aCI, 10 mL~l cacod~.late de sodium.
RESULTATS ET DISC~ISSION.
2 5 Les cxpcricnces de ~3sion tes duplex:
[4 -Sr[~3~T6-4 -SrU3 I Pl 1] / pohlTA [~ i po~yrA]
SrU3~T6~ SrU; f Pl 13 / d(CtAI~C~ / d(C~AI?C~]
SrU3-dT6 4 ~SrU3 / P3PSsP3~ ~poly~ / polyrA~
14'-SrU3~dT6 4'~SrU3 I P3PSSP31 / d(CtA12Ct). [S / d~Ct.~l~C~)~
sont effectuccs à dew~ concen~rstlo~s en ~aCI ct permettcnt d'evalucr llntluence des 3 o liaisons phosphotothioates sur la stabilite d'hyb~ ion comparanvemenl alL~
oli~onucléotides avcc dcs liaisons phosphodiest normales (tablcau7 ) FEUILLE DE REMPLACEMENT
WO 93/1609S PCI/FR93/1)011 , , . ,.1 ~laCI conccntranon ~ Duplex _ I Tm ~C
I i .~ipolvrA I 45 . ~
I , ~ ! polv rA ;6 1 I S / d(C~A 1 7C~2 l 9 ~ ipoly rA ; ' 0.1 51 solv rA 2-l . _ . _ .
0.1 ~ / dlC7A1?C~) lO _ o ! s /d(C?~25~3 TABLEAU 7 Resultatsdes expericncesdc fi~ion.
Le dodecamère mixtc S présentan~ a la fois des liaisons inten~ucleo~idiques de ~pc phosphodiest ct phosphorodlioate (P3PS~P3) induit u~e diminu~on dc la aleur du Tm d'envlron ~C par lie~ pbosphorothioate. Par contrc~ l'oligomere 4 presentc des aleurs de Tm qui sont cqui~ tes à celles obtenues pour le dodecamcre ~rSI;12 avec les dewtsequenccs compleme~ta~s poly rA ct d(C2Al2C2). Ccs r~sultats (tablcau7 ~ mdi~uent quc les oligomcrcs dc se~ce m~ne 4 et ~ prcs~tent unc bon~e s~bilitc d~enn~quc a~ec des sequences d'AR~; compieme~t~ires.
PARTIE EXPRIMENTALE.
.~1ethodc G~nenle psur les e~perience~ d'hybriJ~tion .~ - Dusog~ des oligomcrcs complcm¢n~)res.
2 5 Afin dc rcaliser l'c~ence d~ybrid~o~ il cst necessure te co~tre la conccn~anon de chaquc oligoDle~c pour rcspec~r la stocchiometne l: l cntre les detL~ ~rins complemen~es Selon l~ loi dc BEER^LAMBE~T A - EIC. Ies ~bsorbances dcs oli~omères ont ete mcsurces à 8QC afi~ t'eli~i~ Ic phéaome~e d'cmpilcmc~t des bsscs crc~nt unc per~urbanon de l~yperchromicite dde i l'existc~ce dc stJuc~res terti~i~es~ On peut donc connaitrc les coefficicnts d'exanc~on mol~culiire des dod~c~mescs i 80C sclon une relanon semblable a 3 0 ~2~5(SrUl2)- l2 ~2h5(SrU).
B - Cond~uor~ d'ly~na~mo~
Les cxpenenccs t'hybrid~on son~ effccn~ees n~ u~ spcc~opho~ome~re UVlKON 8l0 (KO~iTROl~J), coupl~ i tm mictoordi~teut IBM comp~blc. I a umper-n~re est consolce 35 par un pro~ula~r tc tempnnnue HUBER PD 41S co~e i u~ bam thcm~osute (HUMER MI~IISTAT). Les cu~ U V. sont cn quu~ de I cm te lon~ c~ unc cu;ui~non ~EUILLE DE RMPLACEMENT
WO 93/16095 . PCI`/FR93/01)115 ., ~ 66 .onnnuelle d'a~ote est u~lisec pour les temperatures infericures à 20C .~vant l expcnence 3 u.~ (Exemplcs I à Iv) d'ollgom~eres complémentaires som mls cn presence dans une quann~c suffisante pour 1000 ul dc tampon I ~ ~aCI et 10 n~M cacodvlate de sodlum a!uste a pH t (Exemples I à ~ . Cc melange est chaufft a 80C pendant I hcu e. puls 5 re~oldlt jusqua ~ ~0C selon une pente de temp~mre de 0.5'C par mmute. Lcs ~aleurs d`absor~ance et de temperature sont collectees toutes les 30 secondes.
La meme expericncc est effeetuce en utilisant une qu~n~te suffisante pour 1000 ul de tampon d'hybridanon 0.1 ~ ~aCl. 10 mM cacodylate te sodium siUste a pH ~ ~Exemplcs I
et l~)afin d'evaJu la stabilise thenrllque du duplex dans cc tampon favonsant moms les appancments n Excmple 1: St~bilité thcrmique du dup~e~ 14'-SrU3-dT6^4'-Srlj3 / Plll / polvrA, / polvrA.
1-1 Dosage des ollgontètes 15 Conccnlrasion de ~ = 0.821 mM
Concensration de polyrA = 4.61 rnM
'ond~tlons d'hvbrlda(son , ~M ~3.65 ~1~ de 4 et 3 ~M (7.79 ,ul) te polyrA sont ~is en ~ence de 988.5 ul dcs tarnpons drhvbndasion (1 M ~JaCI. 10 m~t cscodylasc de sodium ou 0~ aCI. 10 n~l 20 cacot~,latc de sodium).
E~emple 11: Stabilit~ thermique du duples 4'-SrU3-tT6-4'-Sr~3 / Ptl / dC2.~1-C-,1 / dC2~12C2 2 5 11-1 Dosage ~es oltgomèrcs Concensra~ol~ de 4 - 0,82l mM
Conccn~non de tC2AI~C~ = 0.369 mM
11-2 Contilions d'~ybndanon ; ~,U (3 6S ~1) de 4 ~s 3 ~lM (8~ 1) de dC2A12C2 sons mis en ptèsence de 9~8. ' ul des 30 tampons d~ybrid~on (I M ~iaCL 10 mM cacodylatc de sodium ou 0.1 ~1 ~aCI. 10 n~l cacodvlatc dc sodium) E~empk 111: St~bilite ~hermique du duple~ 14~-SrU3 JT6 4 -SrU3 I P3PSsP31 / polvr.
S I pol~rA
35 111-1 D~sa~c tes ~llgomcres FEUILLE DE REMPL~CEMEN
Conccn~oo de po~A - 4.61 mM. ISAIEP
WO 93/16095 , ~ ~ PCl~FR93/00115 111-2 Cond~l~or~ d't~vbndonon 3 uM (7~5 ~1) de 5 e~ 3 ~lM (7.~9 ~1) de polvrA sont n~s en prcsencc de 984~7 ~11 des tampons dllybndanon (I ~ ~aCI. 10 n~ cacodylate de sodium ou 0.1 M ~iaCI. 10 n cacodylatc de sodium) E~esnple 1~: St~bilité ~hermique du duples Srl~3-dT6~ Srl!3 / P3PSSP3J / dC~A12C2~ S / polyrA
1~:1 Dosage des ol~omères Conccmsanon dc S = 0.40 mM
10 Concentraoon de dC~A]~C~ = 0.369 mM
1~:2 Con~i~-ons d'hl~br~dorJon i ~lM (~.5 1ll) dc S ct 3 ~M (8.11 1ll) de dC2A12C2 sont mis cn prcs~ncc de 98~ I dcs tampons d~yb~dation (I M N~CI. 10 mM cscodybte dc sodium ou 0.1 !~/1 NaCI. lO ~1cacodylaltc dc sodium).
Yl. ETUDES ENZYM~TIQITE:S
La rccomlaissa~cc des acides nucleiqucs p~r tes c~es cst cn majeure pame dordre 2 o structural. Lc rcmplaccsl~ent de lrhetoatome nan~rel du sucFe d'un oligonucleonde confere a celui-~i une for~e rcsi~nce à la de~non par les nucle~scs L'en~dc de l~ydrolyse des 4' thio oli~oribonucleorides B par ces nuclesses pcnnct de confirmer quc lc r~mpl~ccmcnt dc l'oxygtnc i~ltrscycliquc par un atomc dc soufre confère bicn une mcillcurc s~bilit~ c~zym~que.
S
E~emple 1: ~tud~ de b d~r~dation enzym~tique du dod~o~ère ~(SrT)dTl 1 p~r 1-phosphodiatéra~e dc rste de v~u.
La phssphotiest~ de r~te de vca~ est Ime exo~ucle~ ui dc~ade lcs otlQomeres a 3 0 p~ de Ic~s extrcmités S' libre lib~t ~nsi dcs nucleotides 3' phosph~se.
Cette cNde nous pcrme~ d'évalu~ 1~ rèsis~ance à 1~ de~ioo enzym~que mdulte par la ptcsc~cc cn posi~on S' d'une unitt 4'-thionuclc~tidique dJns l'oligomcte ~SrT)dT
comp~il/eme~t i la ~ion ~que tc l~omolo~uc ~el oxy~ènè ~dT I ~
La stabilitt compuati~e des teux dodecuncrcs BdT12 et B(StT)dl 11 envers l'h~drohsc par la phospbodintcr se te ~tc tc ve~u cst ~tt~ d~ns Ic t~blc~u 8.
FE:U~LL E~ N~r r 1 La différence de componement entre les deux dodécamères est importante. en effetseulement 23/~ de l'oligomere B(SrT)dT I 1 a été bydrolysc en 25 mmutes alors que dans le meme laps de temps le 12-mer 3dTI~ a ete degradé a 93% .
_ .
¦Dodecasncre ¦ _Dc~ eD 0 ~ nDeE~radation en ~5 mm BdT ~ 1 0% 93%
1 _ ~
B(SrT)dT m I % ~3%
~ . _ _ Tablcau 8 Cinetique de dc~rad~tion de BdTI~ ct B(SrT~dTl l par la phospbodiestérase de rate de ~,eau 0 L cvolution au cours du tcmps de la dégradation cnzvmatiquc des dcux dodccameres a ete suivie par CLHP. Nous avons pu tracer la courbc de digestion enzym~que de B(SrT)dTI I
en fonction du tcmps: A = Ao c-kt (Figure 2. A) où:
-~o cst l'aire ~lùtiale du 12-mèr -.~ est l`aire du 12-mer à l'instant t -t est le temps 15 -k est la constante de ~itesse de prcmier ortre de la dcgr~ aon Cctte courbe (Figurc 2) nous pennet dc calcul, en utilisant le lo~iciel de re~resslon c~iligne EUREKA. k = 0.016min-1 et le temps dc demi-~ie du dodecamere tl - = In '.k =
~3 min De la meme fa~on, la courbe de digestion enzymatique de BdTI~ en fcnction du temps .'~ =
Ao e-kt a pu etre tracce. (Figure 2). On constatc que la cinetique de de~radation de BdTI~
est beaucoup plus rapide que celle de B(SrT)dT l l; en effel le temps de demi-vie s ctablit a I ~ute pour le dodecamèrc nan rel.
Ls cinétique de d~gradDtion enrym~tique de l'ol;gomére modifi~ B(SrT)dTl 1 par S 1' extremi~ 5' pre~ente un temp~ de demi-vie nenement ~uperieur à celui de la degrqdation du I~SrU~2. Ca re~ultat~ mon~rent que l'introduction d'une unite thio-ribomlcleo~idique ~ I'c~trémit~ 5' d'un oligomère stabili~ ce dernier vis 9 vis de 1 pho~phod;e~ter~e de r~te de ve~u.
lune solution d'oligonucleotide (20 ,ul. 3 unites d'absorb~mce à 260 nm) est diluee dans un 30 tampon Acetate d'ammoniusn O.I~S M (pH 7.0), d'EDTA 2.5mM et de Tween 80 0.06 ~5o (80 ~lL). Orl ajoute unc solution co~T~ncrciale de phosphodiesterase de rate de ~eau ~
conccn~ta~on finale 0.008 t~utciml) et le mel~nge est tncu~e à 37C .~ dcs tcmpsdetcrmines. des ~actions aliquotes sont ptelcvees (5 ~ chauffees à 100C pendant une ~unu~è a analvsces par CLHP.
Condll~ons d'analyse CLHP.
Les analyses ont ésc cffectuccs sur une colonDe PVDI ( Poly~inylimidazole SFCC-Shandoo) ptotégcc par une précolonne et un prcfiltrc~ L'elu~ion est re lisee selon un ~adlent llnealre FEUILLE D~ REt~APLAC`EMEN~
ISAIEP
WO 93/16095 ~ PCl'/FR93/00115 en 20 minutes de 01 M à 0~4 M KCI dans 20 mM KH2P04 à pH 6 contenant 2Wo d'acetonitrile Le debit était fixe à I mlfllun et la detec~ion U V à 260 mn EXEMPLE 11 Etude da acti~ites de type substnt dn hes-mèra 4'-Sr~6~ 4'-SrlJ6-3'n-prOH eompantivement au~ c~rsctèrff substr-ts de~ hes~mèra ~rU6 et arlJ6 vis-S i vis de différenles nucléas purifiees.
Qua~e nucleases typiques ont éte uilisees - L'endonuclease Sl~ specifiQue du simple brin d'AD~I hydrolyse les liaisons phosp~otiesters de façon alea~oire 10 ~ La phosphodiesterase de rate de veau (CSP) est une 5'-exonuclease qui deE~ade les oligonucleoides à parar de Ieur extremite S' et libere des nucleotides 3'-phosphates - Ea phospbodiesterase te venin de se~pent (VSP) est une 3` exonuclease-3' q u libere des nucleondes S'-phospbate après avoir tegrade l'oligomère par son exlretnite 3' - La ribonuclease A degrade un oligoribonucleoide ap~ès les residus pvri~udiquesCes quatre enz~nnes on~ ete obtenus aupres de BoehriDg MaDnheim De f*on gener~le uDe unite de densite optique à 260 Dm de cba4ue bexamere est ~us en presence d'uDe certaine concentration t'eDzyme co~sideree puis est diluee en quann~e suffisante pour 1000,ul te tampon te digestion enzym~ique Differents tampons de digestioD ODt ete utilises en fonction de la nature de l'enz~ne ~Tableau 9 ) Concentration finale en I Tampon de digesnon Enzy~sle enz~nne (unites d'activite enzyma~ique enz~nanaue I ml) _~ ~ I EDTA 0 025 n~l CSP 13 10~3 pH 7 AcONHd 0 12S nL~1 _ _ ITris HCI01~;
VSP 6 10-4 pH = 9~4 ~ i MgCl~ O 01 ~1 Sl 20 NaCl 0.3 M pH ~ 7 AcZn O~
_ ~aCl 300mM
RNAse A 2. lo-2 Tns~ HCI lO mM pH 7 EDTA 5 n~1 .
Tableau 9 Co~ centranons en enzy~ne et t~lpODS de di~estion utiliscs L'echantillon mère est di~nse en 10 ~u~ons dc 100 ~ v~t d'e~e con~elc à -18~C
Une fi~on sliquote de 100 ~11 est prele~ree e~ incubèc i rttuve sèche thennostatee a; ^C
~ ~ pend nt untanPstp~ n uulyseep-r CLHP ~LEUeDE R~EMPLAc`EMEN-i Wo 93/1609~ pcr/FR93/ooll5 . ~ ~, . , ., .~
7o L'etudc de l'aire du si~nal colTespondant a l~examere pe~nct de mesurcr une cmctlquc de de~radanon dont le tcmps dc demi-~ie CSt calcule (Tableau 10) .
Tcmps de de~-vle (mm) ~iuclcases ! arU~ ~rU6 1 ~Sr(,'~, ûSr~'6 3'(CH2)30H
.
5'-exonuclease Phosphodicsterase de ratc dc vcau _ I3900 3'-exonucleasc Phosphodiestertse dc venin de serpent 110 I _ 76 _ ~S0 Endonucleasc Sl ~ 120930 . _ 10Ri~onucleasc A ~ <1670 _. __ _ , _ .
Aucunc dcgrads~on observee après 4 jours d'incubaisn Tablcaul 0: DéEradanons cnzyman4ues.
L~cxamère 4'-SrU6. 2 p*sente urle 8rande *sistance cDzyma~que cornparee à cclle du ,B
15 rU6 ~s à ~is de q~tre nucleases (CSP. S 1, RN~se-A et VSP).
La rcsistance à la 3' exonucléase est fortement augmente~ pu l'ultroduction d'une halson phosphotiest prop~nol sur l'c~te 3' du 4'-SrU6 3'n-prOH, 3.
CONCLl iSION
Les enldes ont montre quc:
a) les 4'-thio-oligosi~onucléoodes homogencs ou n~ixtes, sc lient avec unc bonne s~ablllte thc~mo~amique ~vcc un ARN complcmcntsirc.
~5 b) la subs~ on dc l'oxygcne eyclique par un atome dc sou~e intuit unc forte reslstancc a la dé~datio~ ~que ( cf. Ia comp~saison tes ~cmps de dem~e-vie dc B-rU6 et I~S-r~s ) L'enscmblc te ces do~ees implique quc les 4'-thio-oligon~onucleotidcs peu~ ent è~e 30 considcr~s comme ~gcnts an~sens sous fonne de sequences homogèncs ou mclus dans des oli~omeres n~ixtes. De phls. la prescncc de la fonction hydroxyle en 2' pennet d'en~1saser leur ualisa~on comme nbozymes ar~ficiels que cc soi~ sous formc dc sequences bomoccnes ou ~s associecs i dcs oli~onucleondes de rypc di~ers AD~J ou AR~ modlfics ou non au nive~u dc l'c~cbainement pbosphue.
~EUILLE DE REMPLACEMENT
Le support solide fo~ctionnalise à 1 ~mole pour 35 mg de resine de 2'~esox~ mldme ai~si quc lcs synthons 1-~ S'~ mTr-3'-O-N~ diisopropyl~o cya~oeth~l phosphme. ' -desox~ ribofimnnosyl thvmine sont commercialises par Applied 13ios,vstcms II-2) Svnt~cse automatisee de û ( SrT)l dTI 1.
La syndlèse est cf~cctuee sur une colonne conteDant 35 m~ te support solide solt I umole de ~'-desoxyth~midine. Chaque c~;cle d'clongation ncccssitc un exces de synthons phos~horamiditc ~20 l~moles~ 20 cq) soit 220 ~mole de s,~nthons 2'-dcsox~ nudme es ~0 ~5 llmoles de syllthoD 4'-thi~th~ dinc ~. Le synthcsseur p~elcYan~ ~00 umoics pas incorpotation t`une solution 0~1 ~ de cha4uc synthon dans l'acctonitnle. La durec d`un ~EUILL~ PJ~PL~:EMENT
WO 93~16095 ~ ` , ` .t PCT/FR93/001 15 cvcle d'incorporation d'une unité désoxythv~udine est de 5.5 mn .Alors qu'elle est de . 0.1 mn pour un cvcle d'incorporation du svnthon 4'-thioth,v~udine.
L'au~nentation de la duree du cycle d'incorporation du synthon chimère est due a l etape de couplage de 909 ` contre 36 ' pour le svnthon ''-desoxvth,vmidine 5 Le dosa~e des cations diméthox,~rityles liberes à cha4ue ctape de detnt,vlanon a permls d'évalucr le rendement moven d'incorporation de l'unite ~'-desoxv~hvn~idine a 98.S O et 9~.
~o pour le sy thon i'-thiothvTrudine.
11-3) Décrochage.deprotection et purification du B (SrT)l dTI I
10 Le support solide portant l'olieomcre ~ (SrT)l dTl I est traite par une solunon d'ammoniaque (32 %) dans l'cthanol 95 (3/1~ v/v) (3 x 500 ,ul) pcndant 3 cvcles de ~) mn chacun afin de decrocher l'olieomère de son support~ puis le dodecarnere est incube pendan~
' hr dans une etuve sèche dans lc mèmc melan~e a~n dc deproteger les foncnons c~ anoeth~ l et methoxv.
15 L'oligomèrc cst ensuitc evaporc sous vide~ repris par 500 111 d'eau et Iyophilise.
La deprotection tes ~roupements TBDMS est effectuee selon le protocolc mis au pOlSlt dans : I`exemple 1.
Le tésidu obtenu cst chromato8raphie sur colonne de gd de DEAE Sephadex .',-" Les f~actions contenant l'oligomère sont rasscmblees~ evaporees à sec et analvsees par CLPH
20 Analvse et Purificanon du ~ (SrT)l dTt 1 par CLPH.
L'anal,vse CLPH de l'oli~omère a etè effectuee sur une eolonne Beckman C 18 RP ~ u ltrasphère dans les conditions de gradjent suivantcs:
.~: 6 % d'acctonitrilc dans un tampon acetate de tncthyl armnoniurn 0.05 ~
25 B: ~0 /o d'acetonitrile dans un tampon acetate dc triethyl ammorlium 0.05 ~1.
--B~ B
15' 1~' Temps d'anaJyse: 'S mn.
Dans ces conditions. l'oli~omère est pur à 49~3 %
30 une purificanon dc ~ ( SrT)l dTI 1 est alors effectuce par CLPH semi-preparan~e a~ e; une colonne ~ucleosvl dans les condlnons de ~radicnt su~vantcs:
.~--- ----- - B~ B
15' S`
Le 1 ~-mer presentc aJors un temps dc retcnoon dc 1~ mn et unc purete supeneur~ a 99 ~, 11.4.: Syn~hàe du dodecamère ~ dTS (SrT) dT6 FEUIL~E DE REMPl AC`EMENT
ISAIEP
wo 93t16095 pcr/FR93toolts ~o 11~ 1) S~hese du support solide.
Le suppor~ sol~dc defini dans l'excmple ll a esc unlise.
5 Il- l ~) S~,nthèse automansce de ~ dTS (SrT) dT6.
Les memes condinons de svnthèse mises au pOU t pOUS la synthèse dc ~ ( SrT)~ dTI 1 ont ete utiiisccs.
Le dosage des canons dime~ox~iryles liberes a chaque etape dc detnrylanon a pe~us d'evaluer le reDdemeM moyen t'inco~poranon dc l'unite 2' dcsoxy~vnut~ne a 99. ~ O e~ a 10 96. l ~0 pour le s,~n~hon 4' thiothvmltine.
11~.3~ Decrochage punfic~oon du ~ dTS (SrT) dT~, Le traitcment te cet oligomcre ~ ete ef~ecnlc sclon le protocole mis ~u poult tans l'exemple 15 Il. L'analyse ct la purification CLHP~ rcalisee da~s lcs memff conti~aons dc ~dtent revele u~ temps de retcn~ion te 13.18 minutes et u~c purete spectrophotomc~i4ue a '60nm de ~00 o~o 111. SY~THESE AUTOMATIS~E DE 4'-THIO-OLIGORIBONl~'CLEOTIDES ET
OLIGOMERES MIXTES.
On decnt la s~nthèse d'un 4'~thio-ri~o oligom~ homogene 1 tin~e sur la scquence d'epissage ace~ce du ~ene lat du HIV. O~l mon~c qu'il est cnsulte posslble d'obtemr des oli~omcs mixtcs eomprc~ant u~c scquc~cc limi~cc t'AD~I prescntant des llausons phosphodicstcrs ~e 4) ou pbosphor~thioa~cs ~scqueDce 5) De ~cllc~ ~eque&~ mi~e~ S~ S-ARN I ADN l 4-S-A~3` 4 et ~ p~ent ètre uulisee~
2 5 tan~ une appr~eho an~ c~ som susceptible~ t~ h~emont ~l~ d~ la me~e où
la "~ ro" t~ ~uc~ ADN ~era s~le sub~ras to ~ 40 H ~ tppuiement dc 1'~ aveo w~s c bb complemem~. Il cst à noter que l~ ADN (phosphodic~et ou pho~phorothio~o) p~ ~ d~ lon~ucur ~l~ - d~ lc~ ~ 4 e~ 5 il y a six de~oxynud~tite~ . ~t quo cett~ "fcn~ pcut ~ ulchuo ~ nqmpon~ qucUe position dc 3 o l'oligom~ m*no ux ~mit~ S' et / ou 3'.
Complh~eD~uement~ cctsc possib'll~'t~ ou~Te la vole ~1~ co~cepoon de nboz~mes amfic~cls ~homo~e~es ou non) compon~t dcs scquenccs d'oligo~nbonuclèo~des ~ R~
On ~ synthe~sc un ca~ nombre de 4:thio oli~oribont~cleotides homo~enes l~
35 sur un syD~edsct~ i A.D~ ~Applied E~iosystaDs mo~ele 381A) eD unhs;~t le procede gcn~l d~c~it prJ~t.
C'cst le c~s no~unent: FEUILLE DE REMPLAC`EMENT
ISAJEP
W O 93/16095 ~ PCT/FR93/00115 ., 1 . . , ~; ,~
du~'-Sr-~A-C-A-C-C-C-A-A-~-U-C-U)l du4'-Sr-t~-U-U-U-U-O.(4'-SrU6),2 etdu~'-Sr-(~-U-U-U-U-U-3'-P-CH2-CH2-CH~-OH~,(4'-SrU6-3'n-p~DH)3.
L'expression 4'-Sr vcut dirc: oligoribonucléotidc de configuration ~ où l'oxv~ènc du cvcle furannosc des sucres est rcmplace par un atome de sou~e.
3'n-prOH siynifie qu'unc fonction n-propanol est fixce sur Ic ~roupemcnt phosphatc introtuit à l'extrcmite 3' de l'oligoribonuclcoride.
De plus. des oligomes mixtes comprenant des se~uences d'oligodesoxvnucleondes pbosphodicster ou phosphorothioates ont ete obtenus et les modifications apportees au cvcle d'elongation sont decrites cn prenunt comme cxemple les sequenccs suivantes 4'-Sr-(U-U-U~d(T-T-T-T-T-T~4'-Sr-~U-U-U) I P11, ~'-SrU3~dT6-4-SrU3 / Plll ~
et4'-Sr~U-U-U~d(T-T-T-T-T~ 4'-Sr~U-U-U~P3PSsP3, 14'-SrU3-dT6~'- SrU3/P3PSsP31 S
ou 4'-Sr 8 deja cte tefini comme precetem~ent, Px corrcspond au nombrc de liaisons phospbodicster enere les unites nucleotidiques et PSy au nombre de lia~sons phosphorothioate entre les unites nuclgotidiques.
Les thio-oligonbonucleotites ont ete syn~etises sur un synthetiseur a .4D~ pplied Biosys~ems modèle 381 A).
J S.~nlhese des ~'-thloollgorlb~ cleotldes ~ Sr-(A-C-A-C-C-C-A-A-~
~'-SrU6. 2. el ~'-SrU6-3'n-prOH 3 Lc cvclc d' elongstion comporte qua~c etapes importantes " .
' 5 a) Détrityla~on du nucleoside ou de l'oligonucléotide fixe sur le suppo~ solide tans lec~ de4'-SrU6etde 4'-Sr~A-C-A~C-CdC~A-~-U-U-C-U),.ou bien de~n~ la~on du b~as D-props~nol fixe sur le suppor~ solitc ou de l`oligonucleotide fixe sur le llen n-propa~ol dans le cas de 4'-SrU6-3'n-prOH.
3 0 b) Co~densation du pbospboramidite active par le te~azole sur l~ydroxylc 5' libre du nucleoside ou de l'oli~onucleo~ide.dans lc cas de 4'-SrU6 et de 4-Sr-~A-C-A-C-C-C~ U-U C-U).ou bien sur l~ydroxyle libre du bras D-propanol ou sur l~ydroxvle en 5' de roligonucleotide dans le cas de 4'-SrU6-3'n-prOH.
c) Masqua~e des fonc~ions 5`-hydroxyles qui n'ont pas reap.
IL~E DE~5RA~ME~T
WO 93/16095 PCI`/FR93/OOtl~i n ~' 1 Chaquc svnthesc a ete cffectuee sur une colonnc conte~ant 40 m~ de suppon sol~de. Le rendcment de chaque mco~poranon est de 98 O evalue en mcsurant la denslte opnque des eanons dlmethoxy~tyles liberes apres chaque couplase par ~raltemcnt du support a l aclde ~nchloroacetique.
5 Des la-ages sont ef~ccsues enFe chaque etape. et la durce d'un cycle d'elon2anon e5t de ' I.16 m~nutes pour la s~lnshese dcs ~ois ollgomeres prec~tcs. ( Tableau;~l .
ETAPES ~ 1PS ~econde~) I SOLVANTS ET RE:ACTlFS
Lava~e~sechage ~ CH~CN I .~
Couplage 915~ucleoside pbosphoram~dlsc 0.1 .
~1 (20 eq.) dans CH3C~ ~
. tesrazole O,S ~t ( lO eq. ) dans L - _ . . CH~C~I. l L vage-sech~c ¦ ~l _CH3CN ~ GO~
Oxyd-non ¦ ;6 12(0.1 M)dansTHF/ PY H20 I (40/lO~l).
_ . _ .
LavaQe-scchage _ 1 59 I CH~C~ I ARGO~
~vlasquagc ~3Methylimidazolc~THF I
Ac~O/luadine/~ 1 18 1.
_ l Lava~ ? I ~CH~C~ / ARGO~.
2 ûDem lanon 98 _TC.~ à 3~O~a~
~ _ ! CH~C~i ~ ARGO~;
TA~LEAU 2 Cycle d'élonga~o~ u~se po~ la syn~ès~e te4'-Sr~A~C-A-C C-C-.~.~ V-2 5 U-C-l~') l, ~'-Sr~$ 2, et 4' Srl~'6 3'n-prOH. 3.
II~-2 Syn~h~K ~ oli~o~tcs mi~cs: ~t'.Sr~ U3 ~ P~ s~u~ J~
Srl-'3/P3PSf~3 111- '-I OI~gonucléotlde ~:SrU3-dT6 ~:5rC. 3 P
La svathèse automa~sce tc cct oli~onucleo~ide reprend les qua~e etapes decntes au l l- l Ch~que s,vnt~c# ~ cté cffcctuee sur unc coloDne contcn nt ~0 m~ te support sollde Le rendement de chaquc ~ncolporat~olL es~ dc 98 %. La duree d'un cyclc d'cloncaoon par monomère 4' Sr~U est de 21.43 mmutes contrc 6.73 mmutes pour un monomcrc dr Ccrse 3; dif~erencc est due i ru~cn~on du temps dc couplage d'unc entitè 4'-Sr U qul ei~ ~e ~1 s~contcs con~c 36 sccondcs pour unc u~utc dT.(t blc~u 3).
F~EUILLE DE RE M PLJ~CEM ENT
.
WO 93/16095/ ~ PCl /FR93/00115 ET.4.PES ~ ps~s~condes) I SOLVANTS ET I
¦ REACTlFS
j Lava~e-sechaee 1 '5 I CHlC~ I ARGO~;_ Coupla~e ~' Sr l_ I 915 I!~iuclcoside phosphoramldlle¦ 10.1 M ~_0 eq.) dans CH;CN
dT ' 36 ~ tetrazole 0.5 M ( 10 eq.
l da~l5 CH C~i.
¦Lavaee-secha~e L - 4 ! I CH~C.~ RGON
Oxvd~lon I -6 12 (0~1 M~ dans THF / P~T
_ _I . H ~O (40/10/1).
¦Lav~e sècha~e_ ! 59 ¦ CH~C~ 'ARGOI~
IMasquage ! ~; Methylinudaz,ole THF: I
_ ~ IAc OAundinc/lHF 1/118 1 L La~a~e-secha~c 1 71 ! CH3C~ ,' ARGO~
j Detnrvl~non ~ 98 ! TCA à 3% ~ns C}~Cl~
15 ~
T.~BLE.~I ' 3: Cyclc d'elonga~ion u~lisc pour la synthèse de 4'-Srl;3-dT~ Sr~ 3 J Pl 1 ~.
2 ~ O~lgonu~leollde 4 '-Sr~;3-d~6-~'-Sr~'~ P3PSSP3.~
Les memes condinons de s~lnthese automanscc ont e~e appliquees à ce dodecamerc nu~te compo~ a la fois des liaisons phosphodlestcrs et phospborothioates.
L3 svnthese a elc effecn~ce a l'echelle d'une ~lmole soit sur une colonne contenant en~on 5 ~0 m~ de support solide fo~caon~lalise a 21 ,umole ! ~, Lc rendement mo~ven d ncorporanon es~dc98%.
Lors dc l'iDtroduc~on d'une liaison intcrnucleondique de ~pe phospho~othioate. lctzpe d`oxvdanoD definie au paragraphc ~ l (etape 4. Table3u3 ) a ete remplacce par une etape de sulfurisation dc Sl sccondes u~ilisant le reactif de Bcauca~e ( ~rives de sulfon3 c~r~thioanhydri~de d~ benz~ne'~ dissout dasls l'acèton~tnlc a une 3 concen~anon d~ 0.0S ~.
Lcs autres etapes tu c~cle d`elonga~on demeurent inchan~ees.
fJ~-3 D~croch~c, Dcprotcction c~ Purif~c~non dcs 4 ~-thiooli~or~onYclcotidcs (4'~1~.
3~
FEUILLE DE REMPLA~EMENT
WO 93/16095 PCI'/FR93/00115 ,., ~ . ~ ,.. .
Après avoLr réalisé les etapes de déprotection des méthoxyphosphotnesters en phosphodiesters pa,r traitement au thiopheno~. les 4-thioQligoribonucleo~ides ont ete separes des supports solides par un traitement à l'arnrnon~aque. Les groupements TBDMS ~ntroduits sur les hydroxyles en ~' ont ete deproteges par une solu~ion de TB~F dans le THF. Les 5 thiooligomères sont ensuite dessalés sur une colonne d'exclusion DEAE Sephadex G-~5 p ~is purifiés par CLHP en phase inverse.
111-4 PARTIE EXPERIMENT~LE.
~` 10 Exemple l: Synthè~e des hesamèr ~ SrU6 2 et 4'-SrU6-3'n-prO~, 3.
1-1 Synt/~csc d~s suppor~s sol des:
15 Le suppor~ soUde néca~ire ~ la synthèse de 4'-SrU~. 2 est le même quc celui utilise pour la s~nth~se de BrSUl~.
La synd~# de 4-SrU6-3'n-prOH 3 necessite l'utilisa~on du support soUde u~vcrscl:
/^\
~ ~ ~ 21~
' / \CH/ ~C/ ``'--/
2~ 0 A pa~ir de l'intennedia~re P-3 decrit dan~ le Brevet n 9~ 01275 un melan~e de l -O-DmTr-propanol-3 ( l eq.), de DMAP (29,5 mg, 0 5 eq.), de triethylamine (O, l46 mg 0 003 éq.? de DEC (920 mg, 10 eq.) et de P-3 (2 4I5 8) est agité dans 29 ml de pyridinc 30 anhydre pendant trois jours à temperature ambias~te~ Du pentachlorophcnol (321 mg, 2 5 cq ) est ajouté et l'agitation du melange reactionnel est poursuivie pcndant 24 heures supplcmentaires. Le support solide est alors filtre, nnce avec dc la pyridine anhydre (~ ~ 50 ml) puis avcc du dichlorométhanc (2 x 50 ml) et de l'ether (2 x 50 ml).
Le support solite est ensl~ite traite pa~ la pipe~ e, pu~ p~ u~e solution d'anhvtride 5 uetique e~t do coUidi~e d~s k THF sclo~ le ptotocole t~fi~i pr~ment~
Ce~e dhmi~on a éte effectuee e~ ulilisaut le mode op~oire tecnt precedemment. Lc tUL~C de foDc~oD~lis~o~l du supp~ solide a ete evalue i 16,4 llmole de n-propanol par grammc de ~e. FEUlLLE DE REMPLAlCEMENT
W0 93/16095 ~ PCl'/FR93~00115 ,~ .
1-3-) S~ ntll ese ~utomo~isc~ des h~Qmcr~s 4 '-5rl,!6 2 et 4 '-Sr JU 6-3 ~n-proH 3.
1-3-1~ S~n~hèse a2 loma~lsee de l'he~omere 4'-Sr~ 6 _ 5 La svnthèse cst effeetuee sur unc colonnc conte~nt 39.4 m~ dc support sollde fonctio~alisc à ~ mole/g de rcstne~ sott 0.8~7 ~lmole (I eq) dc 4'-thiou~td~ne Chaque c~clc d'elon~arion necessite un exces de svnthon phosphor~midite ( 1~.75 llsnole. 'O.i eq~
soit 100.5 ~mole au total CD solution 0.1 .~1 dans l'ace~o~ ile.La duree du c clc d'clon~anon definic danS Ic tableau 1 est dc ~1.46 nunuus.
Le tosa~c dcs canons dimethox~ttylcs libcres à c~aque et~c de de~itvlatlon a pennts 10 d cvaluer lc rcndcment moycn d'incorporanon t'une ~ite thioribonuci;eotidique a 98.; O
1-3~ n~hèse auton-allsee de l'hexamère ~ rU6-3'n-prOH3.
La svnthèsc est cffesruce sur une colo~nc coate~nt 36.2 mg dc support solldc 15 fonctioanalise a 16~4 l~mole ~c n-propa~ol par EFamme te resine soit 0~82 ~lmolc ~ I eq ) dc n-orooano~.
La synth~e totsl~ de 4'-SrU6-3'n-prOEI, 3 necctsite 95,9 m8 dc synthon phosphoramiditc ( I 14.8 ~mole. 20 eq~) tissout dans 1. 14 m~ t'acetonitrilc.La durec d'un cvclc d elon~anon est de 21.46 m~utcs.
Le rendcment moyen par eouplagc est de 98~3 %~
~) Décrochagc, d~pro~ p~lr}fca~ion t2 4~r~ 2 ~ 4'~Sr~6-3'n-pr(~f 3.
Le ~ent u~lisa~t successivcmc~t du dliophenoL de l'anu~o~iaquc et une soluoon deTB.~F. commu~ u~ dewlc hcxamcrcs est tecnt precedemment.
2 5 / ~ I J An~yse er Puritieanon de l 'hexamère ~ :Sr~'6 2~
L'a~Jyx CL~H du thiooligomere a etè effeemee sulr u~e colon~e SFCC ~;uclcos~l C-18 5 'P 789 d~s les condi~ons te zradient suiv~ntes:
10 ,'o d'acttoiitrilc d~s une solu~on aqueuse 0.05 M t'actute de ~ritthylammo~um 3 o B: IS % t'aceton~trile d~s une solunon aqueuse O~OS M d'acet~te de ~edlvlammomwn Gtadicslt:
A----~0'-- B--10'---- B
> >
Temps d'~dyse: 30 miDutes~ dgbit: 1 ml I mill.
FEUILLE DE REMPLA~EMENT
WO 93/16095 PCI`/FR93/00115 r .~l ~ S 6 Dans ces condiuons, I~hcxamère ~-SrU6, 2 présente unc purete spe.~rophotomètriquc à '60 nmde95,3 %.
Unc purification en CLPH preparative sur une COIOMc nucleosyl semi-prcparative avec un debit de 2 ml I min a un éluant isocratique de 12 % d'acétonitnle dans une solution aqueuse 5 d~ace~tase de tricthylammonium 0,05 ~I nou~ permct d'obtenir le 4'-SrU6, 2 avec une purete spcc~troscopique dc 97,7 %.
nalyse eJ purrficatlon de l'hexamere ~'-SrU6 3'n-prOH 3.
Lanalvse est cffcctucc dans les mèmes conditions dc colonnc et dc ~radient que pour 10 l'hcxamcre ~'-SrU6 Le 4'-SrU6-3'~prO~ 3 a etc obtcnu avec une puretc spectro~copiquo à 260 nm de 51.6 'o Certc puretc cst portec i 92 % apres punfication par CLPH preparativc effecsuee dans un eradient tc 10 'o a 13 ,'o t'acctonitrilc rl~nc unc solution aqucusc d acctate de rsicth~lammonium O.OS !~1 cn IS n~inutcs. swhn d'un palli a 13 % d'aceton~le dans unc l 5 solution aqueusc d'acct~e te trict~vbm~noDium O.OS M pentant 10 m~nutes.
Exemple ll: Synth~e du dodèc~mère mis~e: 4' SrU3-dT6~ SrU3 / Pl 1 ~.
IJ~I~ Synth~sc ~u s~ppor~ sofidc 2 o Le support solite u~lisc pour ccr~e sy~thès~ est ideD~quc à celui nccessalre a la synthesc du ûrS- 12 11-2) Synt~lcs~ ~to~scc dw 4'-SrU3-clT~ Srl~3 / P~ ~ 4.
La s~ntbcse du to~écamere est e~ectuec sur unc colo~e contcnant ;9.i m~ de juppor~
~5 solite soit 0~819 l~mok de 4-thiou~idine. Chaque cyclc t'clonp~on necessltc un e~;es dc s,~nthoDs 4' d~ioundi~e phosphoramidite (16.~S ~moles~ ~0.3 eq) soit lO0 ~ umole dc s,~nthons 4'-thio uriti~e dissout d~s 1.2 ml d'ueto~litrile (0.083 ~l) un exces de jynthon dcsox,~h~d~e phospbo mitite ~20 eq.. l6.38 ~mole~ soit 98.28 ~moie te dT en solunon 0.1 !1 ta~ cetonit~ile. L~ dur~e d'u~l cycle d'inco~on d'une tu~i~e deso~th~ud~e30 est dc 6.73 m~L alon qu'elle est de ~1.43 m~ pour un cycle d'~corpotanon du synthon ~`
thionbou idine~
Lc dos ge des c~o~ med~o~tvles lib~rès à c~que tupe de dèm~lanon a Dennis de~alu Ic re~tement moyen d'mcolpo~tlon i 98.0 %.
11 3) D~crocll~d~pro ~ a p~tirco~ ~ 4'-SrU3~T~4' Srl:3 / P~ I
FEUILLE DE REMPLACEMENT
Wo 93/16095 pcr/FRs3/oolls ~ ,~ t , . ..
Les e~apes de dccrochage dc l'oligomere du suppon solide et de tcprotecnon dcs llalsons Ln~e~ucleondiqucs phospho~cster au thlophcnol sont Idennques à celles decntes dans I e~emple 1 5 11-3- IJ Anal~se er Purrficolton d~ Sr~ 3-d~6-~ '-SrC 3 PJ ~ 4 par CLPH.
L'analyse CLPH de roUgomcre 4 2 éte effecn ec sur une colonnc SFCC ~ucleos~l C I ~ S
'P789 tans u~ gradient a 10 % a 15 % d'acctom~ile dans unc solunoD aqueuse d'acetatc dc tnethvlammonium O.OS ~I pentant 20 mmutes (debit: I ml Imin~ tcmps d'anal~se . ~0 ~un) Dans ces contitions~ le dotccame-e mlxte presentc une purete spcc~rophotome~4uc a '60 10 ~ de9~.Sb.
I~ne pu~ificanon p~r CLPH sc~u preparative sur u~c coloD~e ~iucleosyl avec Im deblt de ' rnl / m~n dans le memc gradicnt augmente la purete spcc~ophotomè~4ue de la sequence mixt~ 4'-SrU3-dT~4'-SrU~ I Pl~, 4 à 99,5 %.
15 EXEMPL 111- Synthe~e ~utom~ti~ee du 4'-SrU3-dT6-4'-SrU3 1 1~3PS5P3 S.
11~-13 Sy~nthcs~ du suppon solidc Lc support solide uilise est le mèmc que celu~ desnt dans l'cxemple l.
2) S~ndles~ Qutom~s~ ~ 4'-5~1;3~6 4 -S~IJ3 ~ P~PSsP3 ~
La s,~nthèsc du dodeamcrc es~ cffec~uee sur une coloDne contenant 39~S mQ de suppon foncnonnalise soit 0,831 ~mole ~ I eq) de 4'-thiouridinc. Chaquc cycle d'eloo~ancn necess~e un excés de ~ 4'~ioundi~c p~osphoro~dite ~16~75 ~mole. 20~3 eq.) So~ 5 25 umole te 4' Sr U ~ tot-l a u~ exces dc ?0 eq. ( 16.38 ~imolc) de s,~nthon desox~ rudme soit 98.28 ~mole pour b sy~cse cnaere La dw~e d'u~ cycle d'~corpot~on d w~c dèsoxythymidine est de 7.7 m~nutes con~e ' 1.~;
minutes pour l'i~corpo~on d~ ouridine. Le dos~c des c~ons dlmetho~ntnr~les libcs Indique u~ dement move~ t Incorporaoon tes syntho~ te 98~ ~
111-3) D~crocb~g~ dcpr~c~ c~ pur~ficot~on t~l ~' StU3 dt6~-St~`3 ~ p3p~ssp3 ~
Lc t~ eme~t te cet oligomcre e~t ~dcntique i celui tè~i d~s l'cxemplc 1. L anal se et la purifi~on Cl HP. r~alisee sur unc coloMe SFCC Nucle~l Ct8 ~ S 'P789 dans un ~ient te lo % ~ 20 % d' cetonilrile d0s une solu~ion ~queusc t`accs~tc de 35 me~ylu~onium QOS M pe~t ~0 m~utes (débit: I ml /mi~ temps d'a~alyse 30 mm) mon~c unc p~e 5p~0phFtEmucltnLqLeE~ l2~E~mREM5pLAC`EMENT
IS~VEP
wo 93/16095 PCr/FR93/00115 .'~ . '' ~ '` ' ,1 ;"
La punficanon par CLPH semi-preparatlve sur une colonnc ~ucleos~l seml preparanve avec un dcbit de ~ ml / mi~ d~ns dcs condinons Isocranques a 19 % d'acctorusnle dans une s~lunon aqueuse d'acetate de tnethylarnmomum 0.05 ~1 augmcnte la puresé de l'oligomère à
99.1 o.
Exemple 1~: Svn~hè~c du d~damèrc ~nti"ta~":
~'-Sr-~A-C-.~-C-C C-A-~-U-~-C-~')I.
1~' 1J Synthcsc ~lu s~ ppOrf sohd~
10 Le suppon solite utilisc pour ce~te synthesc automa~isee cst idc~nque à celul decnt da~s l'e~<emplc 1 2J ~nthc~c al~om~is~c tv dodcc~mcrc ~nt'to~":
~-s~A~c~A~c~c-c~A~A~ c-~? l~
La s.~,nthese de cct hctododecamere compleme~t ire tu site accepuur d'eplssa~c du ~ene a~ du ~tlH est effectue~e sur une colonnc co~teDant 38.S m~ de suppott solide foncnoMallsc soit s~r 0,808 ~mole de 4'-thioundi~c ~1 eq~). Chaque cyclc d'clonga~on u~lisc un e~<ces dc 'S~4 eq (20~4 ~molc) en s,~tbon 4' thioadenosinc phosphorosmidite. 13.5 cq ~10.9, ~0 ~mole) en s,vnthon 4' thi~di~eet 30 eq~ (24.2S ~mole) en synthon 4'-thioundmeLa duree d'un cycle d'i~co~pora~on est te 20,~1 minu~es et le dosaQe des ;anons di~nc~ho~tyles i~diquc un rentement moyen d'incospor~non des s~nthons phosphoram~dites dc 93~6 %.
t~'-3) D~crocho~. d~rota~ crputif~ on du 4'-Sr-(A-C-A-C-C C-A-A-~ C l,) f.
Le support solidc pon~t le dodecunerc ~'-Sr~C-A~C-C-C A A U U~C-U)~lest ~ute par S ml d'unc solu~ te thiophenol ~ ~lethyl~ne f dioxsne (11211) pcndant une dcml heure i tc~ran~ biantc. La solutlon te thiophenol est alors filtrce et le 5UppOt~ SOhde CSt lave avcc 3 x 3 ml de ~ct~a~ol. puls p~r uDe solurion d'ammoni~4uc 32 /O dans l'c~hanol ~3/1: ~lv) (3 x 500 ~l~ afin de decrocher l'oli~omère te son suppo~ La solu~on ob~e~uc est mlse i incuber d~s u~c etuve seche thmost~cc à S5 C pc~d~t S heures at~n de deprotcg les ~roupements protcc~curs tes b ses bètcrocycliqucs. Elle es ensulte evaporee, rcpnsc d~s 500 ,ul d'cau et Iyophlllsee~ L'oligome ly~c cst alors dissout dans 300 ul d`une solu~ion de TBAF (1.1 ~1) d~s le THF. Le mclu~gc r~onnel cst l~sse a 3S tem~c ambiYlte pe~ 4 hc~es. L~ re~ctio~ cst alon stoppec ~rcc 300 ul dune - solu~ion ~ueuse d'~et~te d'~mmomum QOS M. L~ solu~lion cs~ e~porec i sec. co e~poree ~vec 3 por~oDs dc 500 ~ t`esu e~ 1~ rcsidu cst dess-le sur u~e colo~e te ~el d c~ ;luslo~
FEUILLE DE REMPLA~EMENT
~:
wo 93/1609~ pcr/FRs3/oo1 15 t L ~
,. ' ~ J
DE.~E Sephadcx G-25. Lcs ~ac~ons contenant Ic 4'-thiooligomcre sont rassemblees~c~aporees a sec~ red~ssoutes dans 1.2 ml deau et fil~e sur filtre milliporc avant d'e~e anal-see par CLPH.
5 1~' J) Anal~ se et pur~fcat~on du 4 '~Sr-/A-C~A-C C-C-A-A-~ -C~
L'analyse CLPH analy~quc du doteearnere I a ésé éf~e~tuee ~r une colonne SFCC Nucleosyl C18 N125 2P789 dan~ gradient de 10% à 15 % d'acétoritrile tans une solution aqucuse d'acetate de tri~hylammsniwn 0,05 M a~ec un tébit de I ml ~ e~ temps d'analyse de 30 sninutcs. Le chromatogramme indiquc unc purc~é spt~ophotomémque à 260 nm de ~4,9 %.
~Une puri~cado~ par CLPH s~-prépara~ive sur une coloMe Nucleosyl C18 semi-prepara~ive en utiL;s~t le meme gradi~nt av un t~it de 2 ml ~ ot un temps t'analyse de 30 ~unuta amènc 1~ pur~té spec~oscopiquc du 4'-Sr~(A-C-A-CC-C-A-A-U-U-C-U), I à 100 ~O
IV . PROPRIETE D'HYBRlDATlON l)ES ~ OLICONOCLEO~IDES.
La spectrophotome~c Ij. V. pmet d'etudi Ics acides nuclciques ct tc mes~c en e~ldence la fonnatio~ de duplex. la tcmperature tc fusion ct~nt u~c des caractcnstiques d'un duplex L'cmpilcmcnt et l'appancment des bases dcs acides nucleiques sont accompa~es d une diminution de l'absorb~on ~ V. (H~rpochro~uàte). Ai~si par spectrophotomesne U.V. il 20 est possiblc de con~oler la fo~natlon ou la tissociation d'un duplex. ~f S~`lGER
Prlnclples of ~luc~elc Ac~d Strucnre~ Spnnger Verlag..~icw-Yorlt 1984. pp 1~ 9 Lorsque la tcm~e d'une solutloo conten~t une doublc helice (ADN ou AR~) es~
len~cmeDt a~entec. l'absorb~on l,.V. croit nettement tout au long de la tlssoclanon. Le pomt d'inflcxio~ t~ la cour~c d'allure sygmoYdale de la vana~on d'absorbancc en fonc~on dc la tcmp~ est ~ppclcc tcmpamre de ~usio~ ou Tm et co~espond a la co-e~stcnce2 5 dc bn~s ~es ct te brins appanes tans un rapport SO / ~0.
I 'analysc tes cou~cs dc ~s~on tes duplex ~4' thiooligoribonucleonde / ~
oligodéso%yri~o~ucleo~ide e~ ooligonbonucleon~e / ~oligoribonucleonde pennc~3 de tcfi~ir la s~bilitt ~quc dc tels duplex p~ i8 mcswc dc îa tcmperaturc àe nlslon.
Ces ex~c~ces d~ tion son~ mc~ees e~ respcct~nt uQe ~toecl~iome~e I I I en~e les 30 dcux brins complementaircs. cn prcxnce d'un tampon 1 M ~taCt. 10 n~ cacod l~tc de sodiu~n. Unc fonc concen~on cn ~aCl favorise en effe~ Ics appuiements en soI~aw~t les cb~rges ntp~ves autour des a~omcs de phosphote des tew~ oli~onuc~eonde ~ous a~fons do~c cffcffut ces expenences dhvbrida~on ~ u~ ~u~ ampon: 0.1 M l~JaCI . 10 m1~ cacodyl~# de sodium.
35 IV. 1. RESULTATS ET DlSCl,SS10 E~emph~ I et 11: E~penences de fusion da duple~ as.u~2 Ipoqr~
FEUILLE DE REMPLACEMENT
Wo 93/I6095 pcr/FRs3/oolls et ~rl~ 1 2 / pol~rA.
Ces expencnces permettent dc meme en ev-dcnce l'influcnce de l'atome de soufre en poslnon ~` du dodecamcre modifie sur la stabilitc thcn~uque du duplex cn comparanl les Tm ob~cnus avec ceux du duplcx nan rel.
Le tableau 4 reswnc les temperamrcs dc fusion obtenues dans les deux expenences Concentraoon ¦ BSr~ I ? / polvrA 'C Brli l2 / polvrA ac en ~aCI H~.~ochron~icitc '0 Hypochromieite O
_ _ I _ _ _ -1~1 1 46^C '5% _ en cours 100.1 = t5'o ~ en cours _ _ __ _ ~ __ _ , Tablcau 4 Temperan~rcs de fUSlOD des duplcx de todecamcres Concemrat~on; ~ l en cha4ue oligomèrc.
15 Lanalysc de ces rcsuita~s mon~reM quc le duplex 6SrUI2 / polyrA presente unc bonne stabilite thesmique represen~ce par le Tm dc 46C obtcnu à unc concentranon de I l~l en ~;a(~
Exemple~ lll et l~': E~perience~ dc fu~ion de~ duple~ I~Srl~l2 l BdC2Al.C. et ~rUl-I BdC2A12C~-to Les ~empcratures de fusion obtcnues dans les de~; expcriences sont rcsumees dans le tableau S~
_ _ Conccn~aQon BSr~ adC_.~l~Ct oCl Brl~l2 ' BdCt.~l~Co C
en NaCl H~ochrorn~c~te % I. Hvpochromicl~e o 2 5 _ . ~
lM ~?C 9 3% ¦en cours . _ ~
0. IM 5'C ~.6io en cours _~ . _ _ _ _ . _ _ Tabl~ 5 Tempcran~res de ~sion des duplex dc dodecames Concentraslon 3 ~lM cn chaque olisomcres E~emple IV: E~perience d'autohvbridation de l'oligomere ~SrUI~.
.~fin de verifi les rtsultats preccdents. il est ntcessaire dc s'assurer quc le dodecamere 3Srl;lt ne conduit à aucune autohybndation. Pour ceh on a effccruè une c~penenccd'auto-hybrida~o~ tu totecamcre BSrl, It i deux concentr~ons en ~aCl ( I ~t et 0 1 ~
Les cour'oes d'hybnta~on ne presentcnt pas l'allurc sigmoïdalc caractensn4ue mals ob~issent à l'tquation A = k-T où A cs~ I'zbsor~ancc i 260 nm. T la ~emperanlre et ~ une co~stante. Aucun point d'inflex~oo ne peut etre ~risualisc sur une ~ellc drolte Nous ~ou~ons donc conclure que Ic dod~camcte Bsr~ I t nc s'auto ~pparic pas.
FEUILLE DE REMPLACEMENT
WO 93/16095 ~ f ¦ pcr/FRs3/ooll5 .. ~ ,.. .... .
La comp~raison d tempér~tures de fusion dn duplex ~Srljl2 / ~dC2A12C2 (Tablc~u S) et BSr~:l2 / polvrA (Tableau 4) montre une stabilité thermique de l'homoduplex .~R~/AR~' (Tm = ~6 C) nettement supérieure à celle de l'he~eroduplc~ AR~ DI~, (Tm = 27 c) d'autre psrt, aucune ~uto-hybridation de BSrl;12 n'a é~é conststée.
Exemple ~l et ~ Expérience de fusion des duplex ~dTs(SrT)dT6 / ~dC~Al-C~ e BdT~ dc~Al2c2 Cette experience permct d'evalucr la stabilité thennique du duplex ~dTs(SrT!dT6 / ~dC?.~I~C~ comparanvement à celle du duplex naturel BdTI~ l 3dlC~AI~C~
iO (Fi~ure 1) Les temperatures dc fusion de ces duplcx SODt indiquees dans le tableau 6.
_ _ Concen~ration BdTs(SrT)dT6/BdC2AI~C~ C l BdTI~ / BdCa.~l~C~ ^C
en ~;aCI Hvoochromicitc % HvpochromiciIe ~O
1 c , .... _ _ .
1~3 40C 18 % ~5 C '0 ~ %
. _ _ Tableau 6 Temperature de fusion des duplex BdTs(SrT)dT6 / BdC >AI~C~
et BdTI~ / BdC~AI~C~
Concentrasion en chaquc oli~omère 10 ~M
Au vu de ces resultats~ il apparait que la stabili~e the~n~ique du duplex modifie cst infeneure à celle du duplex naturel. Cependant la di~ér~nce de 5~C existante entre les delLx temperanlres de fusion est tlQp faible pour conclure à un mesappar~ement. En effet. ce~ns auteurs ~Y.KAWASE~ S.IWAI~ H.I~OI TE~ K.Mn,lRA et E.OKTSUK ~ ucle~c Acld R~search~ 1986, 14, 772~) ont mon~e que l'existence d'un seul mesappanement dans un ~5 du~lex de 13 unites nucleotidjques se traduisait par une timinuDon dc Tm supèneure a I oac~
On peut donc conclure que l'unite 4'-thio-nucléotidique s'~ppsrie bien avec l~ 2'-desoxysdénosine msb ~ec une ~ffinite inférieure i celle de b 2'-deson~thymidine 3 ~ comme le confirme 19 tifference de Tm de S C obtenue ~T~ble-u 6)~
1~'. 2. PARTIE WERIME~TALE
!.1ethode G~ner~le pour l experiences d'h~brid~tion 3~
FEUILLE DE I~EMPLACEMENT
Wo 93/l6095 pcrlFRs3/ool 15 r ", ~, J ~ 6 ~
.~ - Dosage des ollgomères complemen~alres ,~fn dc reallscr l`expencncc d'h~bndanon. il est neccssalre de cormaitre la conccn~ranon en chaque oli~omcrc pour rcspecter la stoechometne l: l cntre les de~ bnns 5 complementaLrcs. Selon la loi de BEER-L.~lE3ERT A = EIC. IeS absorbances dcs oligomeres ont etc mesurees a 80C afin d'elinuner le phenomenc d'cmpllement des bases crcan~ une pemlrbanon de l'h~rperchromlcite duc à l'cxistence de strucnlrcs ~emalres On peut donc connaitrc les coefficients d'exnncnon moléculure des dodecameres à 80-C ,elon la relanon ~ 265(Srl t ~) = 12~ 265~rl.
B - ~ vndlt~ons d'hvbr~datton.
Les expericnces d'hybndanon sont cffectuees avec un spectrophotome~e U~l~;O~ 810~CO?~TRO~I). couple a un nucroor~inateur IBM compa~bk. La temperarure e5t con~rolce par un programatcur de tempcrature HlJ'BER PD 415 con~ecte a un bain Ihcrmosta~e15 (HliMER MI~IISTAT). Les cuves l V. sont cn qu~re de I cm de long ct unc clrculanon coninuel~e d'azote est utilisce pour les tem~tures infeneures a '0-C ~ant l'exper.encc~; ~M (Exemples I a V) ou 10 IlM (Exemples Vl et ~,11) d'oll20mcres complementaires sont m~s en prcscnce dans une quan~te suffisan~e pour 1000 ul detampon 1 M ~`iaCl et 10 mM cacodvlate de s~um. ajustc a pH 7 (Exemples I a ~11) Ce melange est chauffe à 80C pendant 1 heure~ puis re~oidit jusqu'à - tOC selon une pente 20 de temperan~re de 0.5C par mmute. Les valeurs *absorbance et de temperamre sont collectees toutes les 30 secondes.
La memc e~cpesie~ce est effec~uce cn unlisant une quannte suffisante pour 1000 ul de tampon d~ybnda~on 0.1 ~ ~aCI. 10 rnM cacod~late de sodium aJuste a pH ~ a~n d'eYaluer la stabilite thn~lquc du duplex dans ce tampon favonsant molns les ariemc~
E~emple 1: St~bilit~ thennique du duple~ BSrlil2 / polyrA
1-1 Dosage tes o/~gomcres ConcentTarion de BSrl ' l~ = 0 3S ln~l 3 o Concentra~on de polvrA = 4~$1 l-2 ~ ondlnons d'h~brt~llon 3 ~M (8~SS ~ dc BSrUI~ et 3 ~ 7.79 ~11) tc pol,~rrA sont mis en presence dc ~ 6 ul des ~ampons tl~ybritation (I ~1 ~aCl. 10 n~l cacodylate de sodium ou 0.1 ~ ~aCI. I0 mM cacodylate tc sodium3 E~emple 11: St~bilit~ ~hermique du duple~ ~rl;l2 / polvrA
l:EUILLE DE REMPLACEMENT
WO 93/16095 ~ PCl /FR93/00115 , . . .
en cours Exemple 111: Stsbilite thermique du duplex ~SrU12 / ~dC2Al2C7 5 111-1 Dosa~e ~es ollgomeres Concentra~ion de BSrlJ 1~ = 0.351 mM
Concentration de BdC~AI~C~ = 0.;69 mM
111-'~`ondlt~ons d'hvbrldatlon 1(8.5~ ul) dc BSrlJI~ et 3 ~1~1 (8.11 ~1) de BdC2A12C~ sont Il~is cn presence de 98;, !11 des tampons d~ybridation ( I vt ~iaCI. 10 mM cacodylatc de sodium ou 0.1 ~1 ~aCI. 10 nL~l cacodylate de sodium) Exemple IV: Stabilité thermique du duplex ~rU12 I BdC2A12C2 ~en cour5) IV.I Dosa~e des ol~gomères 5 Concentranon de Brl i 1~ =
Concen~anon de BdC2Al~C~ - 0.369 mM
' Con~lt~ons d'hybridatl~n 3 ~ 1) dc BrU 1 ~ et 3 ~lM (8.1 1 ~1) de BdC2A12C2 sont mis en presence de ul des tampons d~ybridation (1 M NaCL 10 mM cacodylate de sodiwn ou 0~ ;aCI~ 10 nL~,~
cacodylate dc sodiwn) Exemple ~: E~pericnce d'autohybridation de 1' oligomère BSrU12 2 5 V- I Dosage des oligomères Concentra~ion dc ~SrU 12 = 0.351 mL~
V 7 COndJrjOnS d'~br~ Jon 6 uM (17,10 ~1) de I~SrUl~ sont n~s en presencc de 986.9 !11 dcs ta~npons d~bndanon ~ I
30 ~ iaCI 10 ~1 cacodylate de sodlwn ou 0.1 M NaCI, 10 mM cacodylate de sod~um Exemple Vl: St~bilite thermique Ju duple~ lldTs(SrT)dT6 1 BdC2A12C2 K7-1 Dosage des ollgom~res Concen~on de BdTs(SrT)dT6 = 1.33 mM
35 Concentrarion de BdC ~AI~C~ = 0.369 m.
V}-2~ondt~ons d'h.v~tdQuon FEUlLLE DE RE~PLAC`E~ EN~
wo 93/1609~ Pcr/FR93/oo11s r, 1 ,~, ., i ~J 64 lOu.~ (7.~9111) de BdTs(srT)dT6 et 10 ~M (77-5 ~1) de BdC~Al~C2 sont nU5 en presence de 970 ,ul dc tampon d'hybndanon 1~ ~iaCI. 10 IrL~1 cacodvlate dc sodium.
Exemple ~ Stabilite thermique du duple~ ~dT12 1 ~dC2A12C2 ~ 7~-1 Dosa~e des ollgomeres Concenlration dc BdTt~= 1.196 mM
Conctn~anon de ûdCtAltCt = 0.369 ~LM
~1-2 C`ondltlons d'h~brlda~lon 10 10 ~M (8~36 1~1) dc BdT1~ et 10 ~ 1) de ~C~A12C2 sont n~is en presence de 969.1 ul de tampon d~hybntation 1 M NaCI. 10 mM cacod~late de sodium.
~. PROPRIETES D'HYBRlDATlON DES 4'-S-AR~ ET OLIGOMERES ~ TES.
15 Les experiences d'hybridation sont mcnccs cn rcspectant la stoechiometric 1/1 cn~e les de~
blins complemen~res en ptesence d'un tampon 1 M NaCI. 10 mM cacod~latc dc sodlumline fortc conce~traaon cn ~aCl favorise e~ effet les app~rinents cn solvatant les ;hargcs neganves autour des atomes dc phosphorc dcs dcux oligonucleotites. ~ous a~ons et~ccrue ces expenences d'hybridation dans un autre tampo~ 0.1 ~ aCI, 10 mL~l cacod~.late de sodium.
RESULTATS ET DISC~ISSION.
2 5 Les cxpcricnces de ~3sion tes duplex:
[4 -Sr[~3~T6-4 -SrU3 I Pl 1] / pohlTA [~ i po~yrA]
SrU3~T6~ SrU; f Pl 13 / d(CtAI~C~ / d(C~AI?C~]
SrU3-dT6 4 ~SrU3 / P3PSsP3~ ~poly~ / polyrA~
14'-SrU3~dT6 4'~SrU3 I P3PSSP31 / d(CtA12Ct). [S / d~Ct.~l~C~)~
sont effectuccs à dew~ concen~rstlo~s en ~aCI ct permettcnt d'evalucr llntluence des 3 o liaisons phosphotothioates sur la stabilite d'hyb~ ion comparanvemenl alL~
oli~onucléotides avcc dcs liaisons phosphodiest normales (tablcau7 ) FEUILLE DE REMPLACEMENT
WO 93/1609S PCI/FR93/1)011 , , . ,.1 ~laCI conccntranon ~ Duplex _ I Tm ~C
I i .~ipolvrA I 45 . ~
I , ~ ! polv rA ;6 1 I S / d(C~A 1 7C~2 l 9 ~ ipoly rA ; ' 0.1 51 solv rA 2-l . _ . _ .
0.1 ~ / dlC7A1?C~) lO _ o ! s /d(C?~25~3 TABLEAU 7 Resultatsdes expericncesdc fi~ion.
Le dodecamère mixtc S présentan~ a la fois des liaisons inten~ucleo~idiques de ~pc phosphodiest ct phosphorodlioate (P3PS~P3) induit u~e diminu~on dc la aleur du Tm d'envlron ~C par lie~ pbosphorothioate. Par contrc~ l'oligomere 4 presentc des aleurs de Tm qui sont cqui~ tes à celles obtenues pour le dodecamcre ~rSI;12 avec les dewtsequenccs compleme~ta~s poly rA ct d(C2Al2C2). Ccs r~sultats (tablcau7 ~ mdi~uent quc les oligomcrcs dc se~ce m~ne 4 et ~ prcs~tent unc bon~e s~bilitc d~enn~quc a~ec des sequences d'AR~; compieme~t~ires.
PARTIE EXPRIMENTALE.
.~1ethodc G~nenle psur les e~perience~ d'hybriJ~tion .~ - Dusog~ des oligomcrcs complcm¢n~)res.
2 5 Afin dc rcaliser l'c~ence d~ybrid~o~ il cst necessure te co~tre la conccn~anon de chaquc oligoDle~c pour rcspec~r la stocchiometne l: l cntre les detL~ ~rins complemen~es Selon l~ loi dc BEER^LAMBE~T A - EIC. Ies ~bsorbances dcs oli~omères ont ete mcsurces à 8QC afi~ t'eli~i~ Ic phéaome~e d'cmpilcmc~t des bsscs crc~nt unc per~urbanon de l~yperchromicite dde i l'existc~ce dc stJuc~res terti~i~es~ On peut donc connaitrc les coefficicnts d'exanc~on mol~culiire des dod~c~mescs i 80C sclon une relanon semblable a 3 0 ~2~5(SrUl2)- l2 ~2h5(SrU).
B - Cond~uor~ d'ly~na~mo~
Les cxpenenccs t'hybrid~on son~ effccn~ees n~ u~ spcc~opho~ome~re UVlKON 8l0 (KO~iTROl~J), coupl~ i tm mictoordi~teut IBM comp~blc. I a umper-n~re est consolce 35 par un pro~ula~r tc tempnnnue HUBER PD 41S co~e i u~ bam thcm~osute (HUMER MI~IISTAT). Les cu~ U V. sont cn quu~ de I cm te lon~ c~ unc cu;ui~non ~EUILLE DE RMPLACEMENT
WO 93/16095 . PCI`/FR93/01)115 ., ~ 66 .onnnuelle d'a~ote est u~lisec pour les temperatures infericures à 20C .~vant l expcnence 3 u.~ (Exemplcs I à Iv) d'ollgom~eres complémentaires som mls cn presence dans une quann~c suffisante pour 1000 ul dc tampon I ~ ~aCI et 10 n~M cacodvlate de sodlum a!uste a pH t (Exemples I à ~ . Cc melange est chaufft a 80C pendant I hcu e. puls 5 re~oldlt jusqua ~ ~0C selon une pente de temp~mre de 0.5'C par mmute. Lcs ~aleurs d`absor~ance et de temperature sont collectees toutes les 30 secondes.
La meme expericncc est effeetuce en utilisant une qu~n~te suffisante pour 1000 ul de tampon d'hybridanon 0.1 ~ ~aCl. 10 mM cacodylate te sodium siUste a pH ~ ~Exemplcs I
et l~)afin d'evaJu la stabilise thenrllque du duplex dans cc tampon favonsant moms les appancments n Excmple 1: St~bilité thcrmique du dup~e~ 14'-SrU3-dT6^4'-Srlj3 / Plll / polvrA, / polvrA.
1-1 Dosage des ollgontètes 15 Conccnlrasion de ~ = 0.821 mM
Concensration de polyrA = 4.61 rnM
'ond~tlons d'hvbrlda(son , ~M ~3.65 ~1~ de 4 et 3 ~M (7.79 ,ul) te polyrA sont ~is en ~ence de 988.5 ul dcs tarnpons drhvbndasion (1 M ~JaCI. 10 m~t cscodylasc de sodium ou 0~ aCI. 10 n~l 20 cacot~,latc de sodium).
E~emple 11: Stabilit~ thermique du duples 4'-SrU3-tT6-4'-Sr~3 / Ptl / dC2.~1-C-,1 / dC2~12C2 2 5 11-1 Dosage ~es oltgomèrcs Concensra~ol~ de 4 - 0,82l mM
Conccn~non de tC2AI~C~ = 0.369 mM
11-2 Contilions d'~ybndanon ; ~,U (3 6S ~1) de 4 ~s 3 ~lM (8~ 1) de dC2A12C2 sons mis en ptèsence de 9~8. ' ul des 30 tampons d~ybrid~on (I M ~iaCL 10 mM cacodylatc de sodium ou 0.1 ~1 ~aCI. 10 n~l cacodvlatc dc sodium) E~empk 111: St~bilite ~hermique du duple~ 14~-SrU3 JT6 4 -SrU3 I P3PSsP31 / polvr.
S I pol~rA
35 111-1 D~sa~c tes ~llgomcres FEUILLE DE REMPL~CEMEN
Conccn~oo de po~A - 4.61 mM. ISAIEP
WO 93/16095 , ~ ~ PCl~FR93/00115 111-2 Cond~l~or~ d't~vbndonon 3 uM (7~5 ~1) de 5 e~ 3 ~lM (7.~9 ~1) de polvrA sont n~s en prcsencc de 984~7 ~11 des tampons dllybndanon (I ~ ~aCI. 10 n~ cacodylate de sodium ou 0.1 M ~iaCI. 10 n cacodylatc de sodium) E~esnple 1~: St~bilité ~hermique du duples Srl~3-dT6~ Srl!3 / P3PSSP3J / dC~A12C2~ S / polyrA
1~:1 Dosage des ol~omères Conccmsanon dc S = 0.40 mM
10 Concentraoon de dC~A]~C~ = 0.369 mM
1~:2 Con~i~-ons d'hl~br~dorJon i ~lM (~.5 1ll) dc S ct 3 ~M (8.11 1ll) de dC2A12C2 sont mis cn prcs~ncc de 98~ I dcs tampons d~yb~dation (I M N~CI. 10 mM cscodybte dc sodium ou 0.1 !~/1 NaCI. lO ~1cacodylaltc dc sodium).
Yl. ETUDES ENZYM~TIQITE:S
La rccomlaissa~cc des acides nucleiqucs p~r tes c~es cst cn majeure pame dordre 2 o structural. Lc rcmplaccsl~ent de lrhetoatome nan~rel du sucFe d'un oligonucleonde confere a celui-~i une for~e rcsi~nce à la de~non par les nucle~scs L'en~dc de l~ydrolyse des 4' thio oli~oribonucleorides B par ces nuclesses pcnnct de confirmer quc lc r~mpl~ccmcnt dc l'oxygtnc i~ltrscycliquc par un atomc dc soufre confère bicn une mcillcurc s~bilit~ c~zym~que.
S
E~emple 1: ~tud~ de b d~r~dation enzym~tique du dod~o~ère ~(SrT)dTl 1 p~r 1-phosphodiatéra~e dc rste de v~u.
La phssphotiest~ de r~te de vca~ est Ime exo~ucle~ ui dc~ade lcs otlQomeres a 3 0 p~ de Ic~s extrcmités S' libre lib~t ~nsi dcs nucleotides 3' phosph~se.
Cette cNde nous pcrme~ d'évalu~ 1~ rèsis~ance à 1~ de~ioo enzym~que mdulte par la ptcsc~cc cn posi~on S' d'une unitt 4'-thionuclc~tidique dJns l'oligomcte ~SrT)dT
comp~il/eme~t i la ~ion ~que tc l~omolo~uc ~el oxy~ènè ~dT I ~
La stabilitt compuati~e des teux dodecuncrcs BdT12 et B(StT)dl 11 envers l'h~drohsc par la phospbodintcr se te ~tc tc ve~u cst ~tt~ d~ns Ic t~blc~u 8.
FE:U~LL E~ N~r r 1 La différence de componement entre les deux dodécamères est importante. en effetseulement 23/~ de l'oligomere B(SrT)dT I 1 a été bydrolysc en 25 mmutes alors que dans le meme laps de temps le 12-mer 3dTI~ a ete degradé a 93% .
_ .
¦Dodecasncre ¦ _Dc~ eD 0 ~ nDeE~radation en ~5 mm BdT ~ 1 0% 93%
1 _ ~
B(SrT)dT m I % ~3%
~ . _ _ Tablcau 8 Cinetique de dc~rad~tion de BdTI~ ct B(SrT~dTl l par la phospbodiestérase de rate de ~,eau 0 L cvolution au cours du tcmps de la dégradation cnzvmatiquc des dcux dodccameres a ete suivie par CLHP. Nous avons pu tracer la courbc de digestion enzym~que de B(SrT)dTI I
en fonction du tcmps: A = Ao c-kt (Figure 2. A) où:
-~o cst l'aire ~lùtiale du 12-mèr -.~ est l`aire du 12-mer à l'instant t -t est le temps 15 -k est la constante de ~itesse de prcmier ortre de la dcgr~ aon Cctte courbe (Figurc 2) nous pennet dc calcul, en utilisant le lo~iciel de re~resslon c~iligne EUREKA. k = 0.016min-1 et le temps dc demi-~ie du dodecamere tl - = In '.k =
~3 min De la meme fa~on, la courbe de digestion enzymatique de BdTI~ en fcnction du temps .'~ =
Ao e-kt a pu etre tracce. (Figure 2). On constatc que la cinetique de de~radation de BdTI~
est beaucoup plus rapide que celle de B(SrT)dT l l; en effel le temps de demi-vie s ctablit a I ~ute pour le dodecamèrc nan rel.
Ls cinétique de d~gradDtion enrym~tique de l'ol;gomére modifi~ B(SrT)dTl 1 par S 1' extremi~ 5' pre~ente un temp~ de demi-vie nenement ~uperieur à celui de la degrqdation du I~SrU~2. Ca re~ultat~ mon~rent que l'introduction d'une unite thio-ribomlcleo~idique ~ I'c~trémit~ 5' d'un oligomère stabili~ ce dernier vis 9 vis de 1 pho~phod;e~ter~e de r~te de ve~u.
lune solution d'oligonucleotide (20 ,ul. 3 unites d'absorb~mce à 260 nm) est diluee dans un 30 tampon Acetate d'ammoniusn O.I~S M (pH 7.0), d'EDTA 2.5mM et de Tween 80 0.06 ~5o (80 ~lL). Orl ajoute unc solution co~T~ncrciale de phosphodiesterase de rate de ~eau ~
conccn~ta~on finale 0.008 t~utciml) et le mel~nge est tncu~e à 37C .~ dcs tcmpsdetcrmines. des ~actions aliquotes sont ptelcvees (5 ~ chauffees à 100C pendant une ~unu~è a analvsces par CLHP.
Condll~ons d'analyse CLHP.
Les analyses ont ésc cffectuccs sur une colonDe PVDI ( Poly~inylimidazole SFCC-Shandoo) ptotégcc par une précolonne et un prcfiltrc~ L'elu~ion est re lisee selon un ~adlent llnealre FEUILLE D~ REt~APLAC`EMEN~
ISAIEP
WO 93/16095 ~ PCl'/FR93/00115 en 20 minutes de 01 M à 0~4 M KCI dans 20 mM KH2P04 à pH 6 contenant 2Wo d'acetonitrile Le debit était fixe à I mlfllun et la detec~ion U V à 260 mn EXEMPLE 11 Etude da acti~ites de type substnt dn hes-mèra 4'-Sr~6~ 4'-SrlJ6-3'n-prOH eompantivement au~ c~rsctèrff substr-ts de~ hes~mèra ~rU6 et arlJ6 vis-S i vis de différenles nucléas purifiees.
Qua~e nucleases typiques ont éte uilisees - L'endonuclease Sl~ specifiQue du simple brin d'AD~I hydrolyse les liaisons phosp~otiesters de façon alea~oire 10 ~ La phosphodiesterase de rate de veau (CSP) est une 5'-exonuclease qui deE~ade les oligonucleoides à parar de Ieur extremite S' et libere des nucleotides 3'-phosphates - Ea phospbodiesterase te venin de se~pent (VSP) est une 3` exonuclease-3' q u libere des nucleondes S'-phospbate après avoir tegrade l'oligomère par son exlretnite 3' - La ribonuclease A degrade un oligoribonucleoide ap~ès les residus pvri~udiquesCes quatre enz~nnes on~ ete obtenus aupres de BoehriDg MaDnheim De f*on gener~le uDe unite de densite optique à 260 Dm de cba4ue bexamere est ~us en presence d'uDe certaine concentration t'eDzyme co~sideree puis est diluee en quann~e suffisante pour 1000,ul te tampon te digestion enzym~ique Differents tampons de digestioD ODt ete utilises en fonction de la nature de l'enz~ne ~Tableau 9 ) Concentration finale en I Tampon de digesnon Enzy~sle enz~nne (unites d'activite enzyma~ique enz~nanaue I ml) _~ ~ I EDTA 0 025 n~l CSP 13 10~3 pH 7 AcONHd 0 12S nL~1 _ _ ITris HCI01~;
VSP 6 10-4 pH = 9~4 ~ i MgCl~ O 01 ~1 Sl 20 NaCl 0.3 M pH ~ 7 AcZn O~
_ ~aCl 300mM
RNAse A 2. lo-2 Tns~ HCI lO mM pH 7 EDTA 5 n~1 .
Tableau 9 Co~ centranons en enzy~ne et t~lpODS de di~estion utiliscs L'echantillon mère est di~nse en 10 ~u~ons dc 100 ~ v~t d'e~e con~elc à -18~C
Une fi~on sliquote de 100 ~11 est prele~ree e~ incubèc i rttuve sèche thennostatee a; ^C
~ ~ pend nt untanPstp~ n uulyseep-r CLHP ~LEUeDE R~EMPLAc`EMEN-i Wo 93/1609~ pcr/FR93/ooll5 . ~ ~, . , ., .~
7o L'etudc de l'aire du si~nal colTespondant a l~examere pe~nct de mesurcr une cmctlquc de de~radanon dont le tcmps dc demi-~ie CSt calcule (Tableau 10) .
Tcmps de de~-vle (mm) ~iuclcases ! arU~ ~rU6 1 ~Sr(,'~, ûSr~'6 3'(CH2)30H
.
5'-exonuclease Phosphodicsterase de ratc dc vcau _ I3900 3'-exonucleasc Phosphodiestertse dc venin de serpent 110 I _ 76 _ ~S0 Endonucleasc Sl ~ 120930 . _ 10Ri~onucleasc A ~ <1670 _. __ _ , _ .
Aucunc dcgrads~on observee après 4 jours d'incubaisn Tablcaul 0: DéEradanons cnzyman4ues.
L~cxamère 4'-SrU6. 2 p*sente urle 8rande *sistance cDzyma~que cornparee à cclle du ,B
15 rU6 ~s à ~is de q~tre nucleases (CSP. S 1, RN~se-A et VSP).
La rcsistance à la 3' exonucléase est fortement augmente~ pu l'ultroduction d'une halson phosphotiest prop~nol sur l'c~te 3' du 4'-SrU6 3'n-prOH, 3.
CONCLl iSION
Les enldes ont montre quc:
a) les 4'-thio-oligosi~onucléoodes homogencs ou n~ixtes, sc lient avec unc bonne s~ablllte thc~mo~amique ~vcc un ARN complcmcntsirc.
~5 b) la subs~ on dc l'oxygcne eyclique par un atome dc sou~e intuit unc forte reslstancc a la dé~datio~ ~que ( cf. Ia comp~saison tes ~cmps de dem~e-vie dc B-rU6 et I~S-r~s ) L'enscmblc te ces do~ees implique quc les 4'-thio-oligon~onucleotidcs peu~ ent è~e 30 considcr~s comme ~gcnts an~sens sous fonne de sequences homogèncs ou mclus dans des oli~omeres n~ixtes. De phls. la prescncc de la fonction hydroxyle en 2' pennet d'en~1saser leur ualisa~on comme nbozymes ar~ficiels que cc soi~ sous formc dc sequences bomoccnes ou ~s associecs i dcs oli~onucleondes de rypc di~ers AD~J ou AR~ modlfics ou non au nive~u dc l'c~cbainement pbosphue.
~EUILLE DE REMPLACEMENT
Claims (24)
1. Composés chimiques constitués par un oligo-4'-thio-2'déso-xyribonucléotide ou un oligo 4'-thioribonucléotide, caractérisés en ce qu'ils comportent un enchaînement de 4'-thio-2'désoxyribonucléotides ou 4'-thioribonucléotides respectivement, enchaînement pouvant être facul-tativement lié à un agent effecteur, notamment un radical correspondant à
un agent d'intercalation ou un radical chimique ou photoactivable, tel qu'un radical porteur d'une fonction réagissant directement ou indirectement avec les chaînes de nucléotides ou un radical dont la présence permet une détection facile et sensible.
un agent d'intercalation ou un radical chimique ou photoactivable, tel qu'un radical porteur d'une fonction réagissant directement ou indirectement avec les chaînes de nucléotides ou un radical dont la présence permet une détection facile et sensible.
2. Composés chimiques selon la revendication 1 constitués par un oligo 4'-thioribonucléotide ou un oligo 4'-thio-2'-désoxyribonucléotide, caractérisés en ce qu'ils comportent un enchaînement de 4-thioribonu-cléotides ou 4-thio-2'-déoxyribonucléotides respectivement non lié à un radical effecteur.
3. Composés selon la revendication 1 ou 2 caractérisés en ce qu'ils ont pour formule:
(I ) dans laquelle :
les radicaux B peuvent être identiques ou différents et représentent chacun une base d'un acide nucléique éventuellement modifiée, activable et/ou comportant un groupement intercalant et rattachée au cycle glycosidique selon une configuration anomérique alpha non naturelle ;
les radicaux X peuvent être identiques ou différentes et représentent chacun un oxoanion O -, un thioanion S -, un groupe alkyle, un groupe alcoxy, un groupe thioalkyle, un radical alkyle ou alcoxy substitué par un hétérocycle azoté ou un groupement -Y-Z ;
R et R', qui peuvent être identiques ou différents, représen-tent chacun un atome d'hydrogène ou un groupement -Y-Z ou Y'-Z' ;
Y et Y' identiques ou différents représentent chacun un radical alcoylène droit ou ramifié -alk- ou un radical cholsi parm , , , , , alk-O-alk , et avec U = O, S ou N
E peut avoir les mêmes significations que X excepté Y-Z ou Y'-Z' ;
J représente un atome d'hydrogène ou un groupe hydroxy :
Z et Z', identiques ou différents, représentent chacun OH ou un radical correspondant à un agent effecteur, notamment un radical correspondant à un agent d'intercalation ou un radical porteur d'u ne fonction qui réagit directement ou indirectement avec les chaînes de nucléotides ou un radical dont la présence permet une détection facile et sensible.
n est un nombre entier y compris 0 ;
L représente un atome d'oxygène, un atome de soufre ou un groupe -NH-.
(I ) dans laquelle :
les radicaux B peuvent être identiques ou différents et représentent chacun une base d'un acide nucléique éventuellement modifiée, activable et/ou comportant un groupement intercalant et rattachée au cycle glycosidique selon une configuration anomérique alpha non naturelle ;
les radicaux X peuvent être identiques ou différentes et représentent chacun un oxoanion O -, un thioanion S -, un groupe alkyle, un groupe alcoxy, un groupe thioalkyle, un radical alkyle ou alcoxy substitué par un hétérocycle azoté ou un groupement -Y-Z ;
R et R', qui peuvent être identiques ou différents, représen-tent chacun un atome d'hydrogène ou un groupement -Y-Z ou Y'-Z' ;
Y et Y' identiques ou différents représentent chacun un radical alcoylène droit ou ramifié -alk- ou un radical cholsi parm , , , , , alk-O-alk , et avec U = O, S ou N
E peut avoir les mêmes significations que X excepté Y-Z ou Y'-Z' ;
J représente un atome d'hydrogène ou un groupe hydroxy :
Z et Z', identiques ou différents, représentent chacun OH ou un radical correspondant à un agent effecteur, notamment un radical correspondant à un agent d'intercalation ou un radical porteur d'u ne fonction qui réagit directement ou indirectement avec les chaînes de nucléotides ou un radical dont la présence permet une détection facile et sensible.
n est un nombre entier y compris 0 ;
L représente un atome d'oxygène, un atome de soufre ou un groupe -NH-.
4. Composés selon la revendication 3, caractérisés en ce que Y
et Y' représentent un radical choisi parmi , , , , avec U = O, S ou N et n' est un nombre entier notamment de 1 à 10.
et Y' représentent un radical choisi parmi , , , , avec U = O, S ou N et n' est un nombre entier notamment de 1 à 10.
5. Composés selon la revendication 3 caractérisés en ce que L
représente l'oxygène, R et R' représentent un atome d'hydrogène et B
représente une base nucléique naturelle.
représente l'oxygène, R et R' représentent un atome d'hydrogène et B
représente une base nucléique naturelle.
6. Composés selon l'une des revendications 3 à 5, caractérisés en ce que l'agent d'intercalation Z ou Z' est choisi parmi les composés polycycliques ayant une configuration plane.
7. Composés selon la revendication 6 caractérises en ce que l'agent d'intercalation Z ou Z' est choisi parmi l'acridine et ses dérivés, la furocoumarine et ses dérivés, la daunomycine et les autres dérivés de l'anthracycline, la 1,10-phénanthroline, la phénanthridine et ses dérives, la proflavine, les porphyrines, les dérivés du dipyrido [1,2-a:3'-d] imidazole, l'ellipticine ou l'ellipticinium et leurs dérivés et le diazapyrène et des dérivés.
8. Composés selon l'une des revendications 3 à 5, caractérisés en ce que les groupes chimiques réactifs Z ou Z' sont choisis parmi l'acide éthylène-diamine-tétraacétique, l'acide diéthylènetriaminepentaacétique, les porphyrines, la 1,10-phénanthrolince, l'azido-4 acétophénone, l'éthylène-imine, la bèta-chloroéthylamine, le psoralène et leurs dérivés.
9. Composés selon l'une des revendications 3 à 8, caractérisés en cc que le radical B est un radical correspondant à la thymine, l'adénine;
la 2-aminoadénine et ses dérivés substitués, la cytosine, la guanine et ses dérives substitués, l'uracile, le bromo-5 uracile, l'azido-8 adénine, la 7-déazaadénine, la 7-déazaguanine, la 4-azido-cytosine, la 4-azido-thymine et les dérivés de ces bases comportant un groupement intercalant et/ou un groupement chimiquement ou photochimiquement activable.
la 2-aminoadénine et ses dérivés substitués, la cytosine, la guanine et ses dérives substitués, l'uracile, le bromo-5 uracile, l'azido-8 adénine, la 7-déazaadénine, la 7-déazaguanine, la 4-azido-cytosine, la 4-azido-thymine et les dérivés de ces bases comportant un groupement intercalant et/ou un groupement chimiquement ou photochimiquement activable.
10. Composés selon l'une des revendications 1 à 9, caractérisés en ce qu'il s'agit de composés oligothioribonucléotides de formule I pour lesquels J = OH.
11. Composés oligomères mixtes caractérisés en ce que ils sont constitués par des composés selon l'une des revendications 1 à 10 liés à des oligonucléotides de type ADN ou ARN modifiés ou non au niveau de l'enchaînement phosphate et dans lesquels l'hétéroatome intracyclique du cycle furannose des nucléotides est l'oxygène.
12. Composés oligomères mixtes caractérisés en ce que ils sont constitués par un compose selon l'une des revendications 1 à 10, notamment de formule (1), comprenant, à une ou à chacune de ses extrémités, une séquence oligonucléotidique de type ADN ou ARN modifiée ou non au niveau de l'enchaînement phosphate, dans lequel l'hétéroatome du cycle furannose des nucléotides est l'oxygène.
13. Composés oligomères mixtes selon la revendication 12 caractérisés en ce que ils sont constitués par un composé oligothioribo-nucléotidique selon l'une des revendications 1 à 10, comprenant une séquence de type ADN modifiée ou non au niveau de l'enchaînement phosphate dans les nucléotides de laquelle l'hétéroatome du cycle furannose des nucléotides est l'oxygène.
14. Compose oligomère mixte selon la revendication 13, caractérisé en ce que ladite séquence d'ADN, dans laquelle l'hétéroatome du cycle furannose est l'oxygène, est encadré par deux séquences du type thioribonucléotidique.
15. Procédé de preparatlon de composés selon l'une des revendications 1 à 13, caractérisé en ce qu'on applique des synthèses au phosphodiester, phosphotriester, phosphoramidite ou hydrogénophosphonate en utilisant des 4thionucléosides pour des séquences oligothionucléoti-diques et en ce que l'on prépare les dérivés totalement protégés et que l'on élimine les groupements protecteurs.
16. Procédé de synthèse des composés sans agent effecteur selon l'une des revendications 2 à 13, caractérisé en ce que, pour préparer les séquences oligothionucléotidiques, on réalise une synthèse supportée selon la méthode au phospohoroamidite comportant - une protection en 3' et 5' des 4'thionucléotides ou oligo-4'thionucléotides de départ avec par exemple du diméthoxytrityl en 5' et du diisopropyla-minophosphoramidite de méthyle en 3', - la fonctionnalisation d'un support solide incorporant un dérivé 4'thio-nucléosidique par un lien par exemple succinyle entre le groupement hydroxyle-3' du dérivé 4'thionucléosidique et un groupement amino du support solide, - l'élongation de la chaîne oligothionucléotidique dans un réacteur synthétiseur, - enfin le décrochage, la déprotection et la purification de l'oligothio-nucléotide prolongé.
17. Procédé de synthèse de composés incorporant un agent effecteur selon l'une des revendications 3 à 10, caractérisé en ce que l'on part d'un oligothionucléotide sans agent effecteur, ou oligomère mixte en comprenant, protégé en 5', dont on fait réagir la terminaison OH 3' avec une fonction non protégée d'un bras difonctionnel dont la deuxième fonction est protégée et après déprotection du produit résultant, on lie ledit produit à l'agent effecteur par la deuxième fonction libre du bras difonctionnel.
18. Application des composés selon l'une des revendications 1 à 13, caractérisée en ce que lesdits composés sont utilisés à titre de sondes d'hybridation ou comme composants de purification pour des séquences déterminées d'ADN ou d'ARN en simple brin ou en double hélice dans un but diagnostique ou pronostique.
19. Application des composés selon l'une des revendications 1 à 13, caractérisée en ce que les composés sont utilisés pour détecter des mutations au niveau d'un ADN ou d'un ARN.
20. Application des composés selon l'une des revendications 1 à 13, caractérisée en ce que ces composés sont utilisés pour réaliser le blocage spécifique de gènes cellulaires ou d'agents pathogènes préalable-ment choisis, tels que des virus, bactéries ou des parasites.
21. Application d'un dérivé selon l'une des revendications 1 a 13 pour bloquer sélectivement l'expression d'un gène soit par hybridation, soit par coupure sélective, soit par modification chimique du gène ou de son ARN messager d'origine cellulaire, virale, bactérienne ou parasitaire.
22. Application d'un dérivé selon l'une des revendications 1 à
13 pour bloquer sélectivement l'expression d'un ARN viral soit par hybridation, soit par coupure, soit par modification chimique de l'ARN viral ou de sont ARN messager.
13 pour bloquer sélectivement l'expression d'un ARN viral soit par hybridation, soit par coupure, soit par modification chimique de l'ARN viral ou de sont ARN messager.
23. Application des composés selon l'une des revendications 1 à 13, caractérisée en ce qu'ils sont utilisables à titre de nucléases artificielles spécifiques de séquences ou ribozyme artificielle.
24. A titre de médicaments, des composés selon l'une des revendications 1 à 13, utilisables comme antiviraux, antitumoraux, antibiotiques ou antiparasitaires ou dans toute pathologie où un gène est anormalement exprimé soit par mutation, soit par dérégulation.
Applications Claiming Priority (5)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| FR92/01275 | 1992-02-05 | ||
| FR9201275A FR2686882B1 (fr) | 1992-02-05 | 1992-02-05 | Oligothionucleotides. |
| FR92/11103 | 1992-09-17 | ||
| FR9211103A FR2687679B1 (fr) | 1992-02-05 | 1992-09-17 | Oligothionucleotides. |
| PCT/FR1993/000115 WO1993016095A1 (fr) | 1992-02-05 | 1993-02-04 | Oligothionucleotides |
Publications (1)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| CA2129364A1 true CA2129364A1 (fr) | 1993-08-19 |
Family
ID=26229230
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| CA002129364A Abandoned CA2129364A1 (fr) | 1992-02-05 | 1993-02-04 | Oligothionucleotides |
Country Status (8)
| Country | Link |
|---|---|
| US (1) | US5639873A (fr) |
| EP (1) | EP0625986B1 (fr) |
| JP (1) | JPH07506345A (fr) |
| AT (1) | ATE147752T1 (fr) |
| CA (1) | CA2129364A1 (fr) |
| DE (1) | DE69307495T2 (fr) |
| FR (1) | FR2687679B1 (fr) |
| WO (1) | WO1993016095A1 (fr) |
Families Citing this family (690)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| US5688941A (en) * | 1990-07-27 | 1997-11-18 | Isis Pharmaceuticals, Inc. | Methods of making conjugated 4' desmethyl nucleoside analog compounds |
| US6335434B1 (en) | 1998-06-16 | 2002-01-01 | Isis Pharmaceuticals, Inc., | Nucleosidic and non-nucleosidic folate conjugates |
| US8153602B1 (en) | 1991-11-19 | 2012-04-10 | Isis Pharmaceuticals, Inc. | Composition and methods for the pulmonary delivery of nucleic acids |
| ATE247128T1 (de) | 1993-09-03 | 2003-08-15 | Isis Pharmaceuticals Inc | Aminoderivatisierte nukleoside und oligonukleoside |
| US5681940A (en) * | 1994-11-02 | 1997-10-28 | Icn Pharmaceuticals | Sugar modified nucleosides and oligonucleotides |
| US20040161777A1 (en) * | 1996-06-06 | 2004-08-19 | Baker Brenda F. | Modified oligonucleotides for use in RNA interference |
| US5898031A (en) * | 1996-06-06 | 1999-04-27 | Isis Pharmaceuticals, Inc. | Oligoribonucleotides for cleaving RNA |
| US20040171028A1 (en) * | 1996-06-06 | 2004-09-02 | Baker Brenda F. | Phosphorous-linked oligomeric compounds and their use in gene modulation |
| US20040171032A1 (en) * | 1996-06-06 | 2004-09-02 | Baker Brenda F. | Non-phosphorous-linked oligomeric compounds and their use in gene modulation |
| US7812149B2 (en) | 1996-06-06 | 2010-10-12 | Isis Pharmaceuticals, Inc. | 2′-Fluoro substituted oligomeric compounds and compositions for use in gene modulations |
| US20040161844A1 (en) * | 1996-06-06 | 2004-08-19 | Baker Brenda F. | Sugar and backbone-surrogate-containing oligomeric compounds and compositions for use in gene modulation |
| US9096636B2 (en) * | 1996-06-06 | 2015-08-04 | Isis Pharmaceuticals, Inc. | Chimeric oligomeric compounds and their use in gene modulation |
| US20050118605A9 (en) * | 1996-06-06 | 2005-06-02 | Baker Brenda F. | Oligomeric compounds having modified bases for binding to adenine and guanine and their use in gene modulation |
| US20070275921A1 (en) * | 1996-06-06 | 2007-11-29 | Isis Pharmaceuticals, Inc. | Oligomeric Compounds That Facilitate Risc Loading |
| US20050042647A1 (en) * | 1996-06-06 | 2005-02-24 | Baker Brenda F. | Phosphorous-linked oligomeric compounds and their use in gene modulation |
| US20030044941A1 (en) | 1996-06-06 | 2003-03-06 | Crooke Stanley T. | Human RNase III and compositions and uses thereof |
| US20040266706A1 (en) * | 2002-11-05 | 2004-12-30 | Muthiah Manoharan | Cross-linked oligomeric compounds and their use in gene modulation |
| US20040171030A1 (en) * | 1996-06-06 | 2004-09-02 | Baker Brenda F. | Oligomeric compounds having modified bases for binding to cytosine and uracil or thymine and their use in gene modulation |
| US6639062B2 (en) | 1997-02-14 | 2003-10-28 | Isis Pharmaceuticals, Inc. | Aminooxy-modified nucleosidic compounds and oligomeric compounds prepared therefrom |
| WO1999001579A1 (fr) | 1997-07-01 | 1999-01-14 | Isis Pharmaceuticals, Inc. | Compositions et procedes d'apport d'oligonucleotides par le tube digestif |
| US7321828B2 (en) * | 1998-04-13 | 2008-01-22 | Isis Pharmaceuticals, Inc. | System of components for preparing oligonucleotides |
| US20040186071A1 (en) | 1998-04-13 | 2004-09-23 | Bennett C. Frank | Antisense modulation of CD40 expression |
| US6841539B1 (en) | 1998-05-21 | 2005-01-11 | Isis Pharmaceuticals, Inc. | Compositions and methods for topical delivery of oligonucleotides |
| EP1080103A4 (fr) | 1998-05-21 | 2003-07-02 | Isis Pharmaceuticals Inc | Compositions et procedes pour l'administration non parenterale d'oligonucleotides |
| US6335439B1 (en) | 1998-06-11 | 2002-01-01 | Isis Pharmaceuticals, Inc. | Method of preparing phosphoramidites |
| US6743605B1 (en) * | 1998-06-24 | 2004-06-01 | Enzo Life Sciences, Inc. | Linear amplification of specific nucleic acid sequences |
| EP1105539A2 (fr) | 1998-08-21 | 2001-06-13 | Naxcor | Dosages utilisant des acides nucleiques reticulables immobilises |
| US6225293B1 (en) | 1998-09-02 | 2001-05-01 | Isis Pharmaceuticals, Inc. | Methods and compounds for tracking the biodistribution of macromolecule-carrier combinations |
| US6077709A (en) | 1998-09-29 | 2000-06-20 | Isis Pharmaceuticals Inc. | Antisense modulation of Survivin expression |
| US20040242521A1 (en) * | 1999-10-25 | 2004-12-02 | Board Of Regents, The University Of Texas System | Thio-siRNA aptamers |
| US6423493B1 (en) | 1998-10-26 | 2002-07-23 | Board Of Regents The University Of Texas System | Combinatorial selection of oligonucleotide aptamers |
| US20060172925A1 (en) * | 1998-10-26 | 2006-08-03 | Board Of Regents, The University Of Texas System | Thio-siRNA aptamers |
| US6492111B1 (en) | 1998-11-25 | 2002-12-10 | Isis Pharmaceuticals, Inc. | In situ binary synthesis of biologically effective molecules |
| US6300320B1 (en) | 1999-01-05 | 2001-10-09 | Isis Pharmaceuticals, Inc. | Modulation of c-jun using inhibitors of protein kinase C |
| US7098192B2 (en) | 1999-04-08 | 2006-08-29 | Isis Pharmaceuticals, Inc. | Antisense oligonucleotide modulation of STAT3 expression |
| US6656730B1 (en) | 1999-06-15 | 2003-12-02 | Isis Pharmaceuticals, Inc. | Oligonucleotides conjugated to protein-binding drugs |
| US6147200A (en) * | 1999-08-19 | 2000-11-14 | Isis Pharmaceuticals, Inc. | 2'-O-acetamido modified monomers and oligomers |
| US6617442B1 (en) | 1999-09-30 | 2003-09-09 | Isis Pharmaceuticals, Inc. | Human Rnase H1 and oligonucleotide compositions thereof |
| US7332275B2 (en) | 1999-10-13 | 2008-02-19 | Sequenom, Inc. | Methods for detecting methylated nucleotides |
| US6261840B1 (en) | 2000-01-18 | 2001-07-17 | Isis Pharmaceuticals, Inc. | Antisense modulation of PTP1B expression |
| US20020055479A1 (en) | 2000-01-18 | 2002-05-09 | Cowsert Lex M. | Antisense modulation of PTP1B expression |
| EP1274726B1 (fr) * | 2000-04-13 | 2009-12-23 | Thomas N. Wight | Composes therapeutiques et procedes associes |
| US6680172B1 (en) | 2000-05-16 | 2004-01-20 | Regents Of The University Of Michigan | Treatments and markers for cancers of the central nervous system |
| US20060166227A1 (en) * | 2000-06-20 | 2006-07-27 | Stephen Kingsmore | Protein expression profiling |
| US6323009B1 (en) * | 2000-06-28 | 2001-11-27 | Molecular Staging, Inc. | Multiply-primed amplification of nucleic acid sequences |
| US6958214B2 (en) | 2000-07-10 | 2005-10-25 | Sequenom, Inc. | Polymorphic kinase anchor proteins and nucleic acids encoding the same |
| US8568766B2 (en) | 2000-08-24 | 2013-10-29 | Gattadahalli M. Anantharamaiah | Peptides and peptide mimetics to treat pathologies associated with eye disease |
| AU2001296846B2 (en) | 2000-10-12 | 2007-07-05 | University Of Rochester | Compositions that inhibit proliferation of cancer cells |
| US7435390B2 (en) * | 2001-01-26 | 2008-10-14 | Third Wave Technologies, Inc. | Nucleic acid synthesizers |
| US6932943B1 (en) | 2001-01-26 | 2005-08-23 | Third Wave Technologies | Nucleic acid synthesizers |
| US20030072689A1 (en) * | 2001-08-15 | 2003-04-17 | Third Wave Technologies, Inc. | Polymer synthesizer |
| US7635571B2 (en) * | 2000-12-07 | 2009-12-22 | Siemens Healthcare Diagnostics Products Gmbh | Amplified signal in binding assays |
| US7767802B2 (en) | 2001-01-09 | 2010-08-03 | Alnylam Pharmaceuticals, Inc. | Compositions and methods for inhibiting expression of anti-apoptotic genes |
| US6573051B2 (en) * | 2001-03-09 | 2003-06-03 | Molecular Staging, Inc. | Open circle probes with intramolecular stem structures |
| CA2441071C (fr) | 2001-03-14 | 2010-06-22 | Myriad Genetics, Inc. | Interaction tsg101-gag et son utilisation |
| MXPA03011985A (es) | 2001-06-20 | 2004-03-26 | Genentech Inc | Composiciones y metodos para el diagnostico y tratamiento de tumores. |
| CA2451643C (fr) | 2001-06-21 | 2012-11-13 | Isis Pharmaceuticals, Inc. | Modulation anti-sens de l'expression de la superoxyde dismutase 1 soluble |
| US6964950B2 (en) | 2001-07-25 | 2005-11-15 | Isis Pharmaceuticals, Inc. | Antisense modulation of C-reactive protein expression |
| US7425545B2 (en) | 2001-07-25 | 2008-09-16 | Isis Pharmaceuticals, Inc. | Modulation of C-reactive protein expression |
| US20030096772A1 (en) | 2001-07-30 | 2003-05-22 | Crooke Rosanne M. | Antisense modulation of acyl CoA cholesterol acyltransferase-2 expression |
| US7407943B2 (en) | 2001-08-01 | 2008-08-05 | Isis Pharmaceuticals, Inc. | Antisense modulation of apolipoprotein B expression |
| US7227014B2 (en) | 2001-08-07 | 2007-06-05 | Isis Pharmaceuticals, Inc. | Antisense modulation of apolipoprotein (a) expression |
| DE10142643A1 (de) * | 2001-08-31 | 2003-04-24 | Clondiag Chip Tech Gmbh | Detektion von Wechselwirkungen auf Sonden-Arrays |
| ES2390531T3 (es) | 2001-09-18 | 2012-11-13 | Genentech, Inc. | Composiciones y procedimientos para el diagnósitco y tratamiento de tumor |
| US6750019B2 (en) | 2001-10-09 | 2004-06-15 | Isis Pharmaceuticals, Inc. | Antisense modulation of insulin-like growth factor binding protein 5 expression |
| NZ585001A (en) | 2001-10-09 | 2011-08-26 | Isis Pharmaceuticals Inc | Antisense modulation of insulin-like growth factor binding protein 5 expression |
| WO2003054143A2 (fr) * | 2001-10-25 | 2003-07-03 | Neurogenetics, Inc. | Genes et polymorphismes sur le chromosome 10, associes a la maladie d'alzheimer et a d'autres maladies neurodegeneratives |
| US20030224380A1 (en) * | 2001-10-25 | 2003-12-04 | The General Hospital Corporation | Genes and polymorphisms on chromosome 10 associated with Alzheimer's disease and other neurodegenerative diseases |
| US20030170678A1 (en) * | 2001-10-25 | 2003-09-11 | Neurogenetics, Inc. | Genetic markers for Alzheimer's disease and methods using the same |
| US20030162190A1 (en) * | 2001-11-15 | 2003-08-28 | Gorenstein David G. | Phosphoromonothioate and phosphorodithioate oligonucleotide aptamer chip for functional proteomics |
| US6965025B2 (en) | 2001-12-10 | 2005-11-15 | Isis Pharmaceuticals, Inc. | Antisense modulation of connective tissue growth factor expression |
| EP2067472A1 (fr) | 2002-01-02 | 2009-06-10 | Genentech, Inc. | Compositions et procédés pour le traitement et le diagnostic d'une tumeur |
| US7553619B2 (en) * | 2002-02-08 | 2009-06-30 | Qiagen Gmbh | Detection method using dissociated rolling circle amplification |
| US7169916B2 (en) * | 2002-04-01 | 2007-01-30 | Isis Pharmaceuticals, Inc. | Chloral-free DCA in oligonucleotide synthesis |
| NZ535925A (en) | 2002-04-16 | 2008-06-30 | Genentech Inc | An isolated antibody that binds to a particular polypeptide |
| US7199107B2 (en) | 2002-05-23 | 2007-04-03 | Isis Pharmaceuticals, Inc. | Antisense modulation of kinesin-like 1 expression |
| US20040092470A1 (en) * | 2002-06-18 | 2004-05-13 | Leonard Sherry A. | Dry powder oligonucleotide formualtion, preparation and its uses |
| CA2495478A1 (fr) | 2002-08-05 | 2004-02-12 | University Of Rochester | Proteines chimeres a domaine de transduction proteique/domaine desaminase, composes associes et utilisations correspondantes |
| AU2003263853A1 (en) * | 2002-08-16 | 2004-03-03 | Board Of Regents The University Of Texas System | Compositions and methods related to flavivirus envelope protein domain iii antigens |
| JP2005538186A (ja) | 2002-09-13 | 2005-12-15 | レプリコール インコーポレーティッド | 非配列相補性の抗ウイルス性オリゴヌクレオチド |
| JP2006500030A (ja) | 2002-09-20 | 2006-01-05 | イェール ユニバーシティ | リボスイッチ、その使用方法、ならびにリボスイッチとともに用いるための組成物 |
| EP1549767A4 (fr) | 2002-09-26 | 2006-06-07 | Amgen Inc | Modulation de l'expression du gene forkhead box o1a |
| EP1572978A4 (fr) * | 2002-10-16 | 2006-05-24 | Univ Texas | Banques combinatoires d'aptameres a groupes phosphorothioate et phosphorodithioate oligonucleotidiques lies a des billes |
| EP1560839A4 (fr) | 2002-11-05 | 2008-04-23 | Isis Pharmaceuticals Inc | Composes oligomere chimeres et leur utilisation dans la modulation genique |
| US9150605B2 (en) * | 2002-11-05 | 2015-10-06 | Isis Pharmaceuticals, Inc. | Compositions comprising alternating 2′-modified nucleosides for use in gene modulation |
| US9150606B2 (en) * | 2002-11-05 | 2015-10-06 | Isis Pharmaceuticals, Inc. | Compositions comprising alternating 2'-modified nucleosides for use in gene modulation |
| AU2003291753B2 (en) * | 2002-11-05 | 2010-07-08 | Isis Pharmaceuticals, Inc. | Polycyclic sugar surrogate-containing oligomeric compounds and compositions for use in gene modulation |
| EP1578765A4 (fr) * | 2002-11-05 | 2008-04-23 | Isis Pharmaceuticals Inc | Composes oligomeres contenant un substitut de sucre et compositions a utiliser dans la modulation genique |
| EP1569695B1 (fr) | 2002-11-13 | 2013-05-15 | Genzyme Corporation | Modulation antisens de l'expression d'apolipoproteine b |
| DK2336318T3 (da) | 2002-11-13 | 2013-07-15 | Genzyme Corp | Antisense-modulering af apolipoprotein b-ekspression |
| WO2004046330A2 (fr) * | 2002-11-15 | 2004-06-03 | Morphotek, Inc. | Methodes de generation d'une quantite elevee d'anticorps a partir d'hybridomes crees par immunisation in vitro |
| JP4915980B2 (ja) | 2002-11-15 | 2012-04-11 | エムユーエスシー ファウンデーション フォー リサーチ デベロップメント | 補体レセプター２標的化補体調節因子 |
| US7557092B2 (en) | 2002-11-21 | 2009-07-07 | University Of Utah Research Foundation | Purinergic modulation of smell |
| US7144999B2 (en) | 2002-11-23 | 2006-12-05 | Isis Pharmaceuticals, Inc. | Modulation of hypoxia-inducible factor 1 alpha expression |
| US20040121338A1 (en) * | 2002-12-19 | 2004-06-24 | Alsmadi Osama A. | Real-time detection of rolling circle amplification products |
| CA2510587A1 (fr) | 2002-12-20 | 2004-07-15 | Qiagen Gmbh | Amplification de l'acide nucleique |
| US9487823B2 (en) | 2002-12-20 | 2016-11-08 | Qiagen Gmbh | Nucleic acid amplification |
| CA2515484C (fr) | 2003-02-11 | 2011-09-20 | Antisense Therapeutics Ltd | Modulation de l'expression du recepteur du facteur de croissance i analogue a l'insuline |
| US7002006B2 (en) * | 2003-02-12 | 2006-02-21 | Isis Pharmaceuticals, Inc. | Protection of nucleosides |
| US7803781B2 (en) | 2003-02-28 | 2010-09-28 | Isis Pharmaceuticals, Inc. | Modulation of growth hormone receptor expression and insulin-like growth factor expression |
| US20070141570A1 (en) * | 2003-03-07 | 2007-06-21 | Sequenom, Inc. | Association of polymorphic kinase anchor proteins with cardiac phenotypes and related methods |
| US20040185559A1 (en) | 2003-03-21 | 2004-09-23 | Isis Pharmaceuticals Inc. | Modulation of diacylglycerol acyltransferase 1 expression |
| US8043834B2 (en) | 2003-03-31 | 2011-10-25 | Qiagen Gmbh | Universal reagents for rolling circle amplification and methods of use |
| US7598227B2 (en) | 2003-04-16 | 2009-10-06 | Isis Pharmaceuticals Inc. | Modulation of apolipoprotein C-III expression |
| US7399853B2 (en) | 2003-04-28 | 2008-07-15 | Isis Pharmaceuticals | Modulation of glucagon receptor expression |
| EP1635693A2 (fr) * | 2003-05-23 | 2006-03-22 | Board Of Regents, The University Of Texas System | Recherche systematique a haut debit, dans des echantillotheques d'aptameres, de liaisons specifiques avec des proteines sur des virus et d'autres pathogenes |
| US7910523B2 (en) * | 2003-05-23 | 2011-03-22 | Board Of Regents, The University Of Texas System | Structure based and combinatorially selected oligonucleoside phosphorothioate and phosphorodithioate aptamer targeting AP-1 transcription factors |
| WO2004108081A2 (fr) * | 2003-06-02 | 2004-12-16 | Isis Pharmaceuticals, Inc. | Synthese d'oligonucleotides au moyen de solvants alternatifs |
| WO2005002507A2 (fr) | 2003-06-03 | 2005-01-13 | Isis Pharmaceuticals, Inc. | Modulation de l'expression de survivine |
| DK3604537T3 (da) | 2003-06-13 | 2022-02-28 | Alnylam Europe Ag | Dobbeltstrenget ribonukleinsyre med forøget effektivitet i en organisme |
| WO2004113496A2 (fr) * | 2003-06-20 | 2004-12-29 | Isis Pharmaceuticals, Inc. | Compositions bicatenaires comprenant une chaine 3'-endo modifiee destinees a etre utilisees en modulation genique |
| US20050118611A1 (en) * | 2003-07-24 | 2005-06-02 | Board Of Regents, The University Of Texas System | Thioaptamers enable discovery of physiological pathways and new therapeutic strategies |
| CA2533701A1 (fr) | 2003-07-31 | 2005-02-17 | Isis Pharmaceuticals, Inc. | Composes oligomeres et compositions utilisables pour moduler des petits arn non-codants |
| US7825235B2 (en) | 2003-08-18 | 2010-11-02 | Isis Pharmaceuticals, Inc. | Modulation of diacylglycerol acyltransferase 2 expression |
| US20050053981A1 (en) * | 2003-09-09 | 2005-03-10 | Swayze Eric E. | Gapped oligomeric compounds having linked bicyclic sugar moieties at the termini |
| US20070123480A1 (en) * | 2003-09-11 | 2007-05-31 | Replicor Inc. | Oligonucleotides targeting prion diseases |
| EP2182063A3 (fr) | 2003-09-18 | 2012-07-18 | Isis Pharmaceuticals, Inc. | Modulation de l'expression EIF4E |
| AU2004274021B2 (en) * | 2003-09-18 | 2009-08-13 | Isis Pharmaceuticals, Inc. | 4'-thionucleosides and oligomeric compounds |
| US20050191653A1 (en) | 2003-11-03 | 2005-09-01 | Freier Susan M. | Modulation of SGLT2 expression |
| JP4901478B2 (ja) | 2003-11-17 | 2012-03-21 | ジェネンテック， インコーポレイテッド | 造血系起源の腫瘍の治療のための組成物と方法 |
| EP1711606A2 (fr) | 2004-01-20 | 2006-10-18 | Isis Pharmaceuticals, Inc. | Modulation de l'expression du r cepteur glucocortico de |
| US7468431B2 (en) * | 2004-01-22 | 2008-12-23 | Isis Pharmaceuticals, Inc. | Modulation of eIF4E-BP2 expression |
| US8778900B2 (en) * | 2004-01-22 | 2014-07-15 | Isis Pharmaceuticals, Inc. | Modulation of eIF4E-BP1 expression |
| US8569474B2 (en) | 2004-03-09 | 2013-10-29 | Isis Pharmaceuticals, Inc. | Double stranded constructs comprising one or more short strands hybridized to a longer strand |
| EP2700720A3 (fr) | 2004-03-15 | 2015-01-28 | Isis Pharmaceuticals, Inc. | Compositions et procédés pour optimiser le clivage d'ARN par RNASE H |
| US20050244869A1 (en) | 2004-04-05 | 2005-11-03 | Brown-Driver Vickie L | Modulation of transthyretin expression |
| WO2005097817A2 (fr) | 2004-04-05 | 2005-10-20 | Alnylam Pharmaceuticals, Inc. | Procedes et reactifs pour la synthese et la purification d'oligonucleotides |
| US20050260755A1 (en) * | 2004-04-06 | 2005-11-24 | Isis Pharmaceuticals, Inc. | Sequential delivery of oligomeric compounds |
| US20050239134A1 (en) * | 2004-04-21 | 2005-10-27 | Board Of Regents, The University Of Texas System | Combinatorial selection of phosphorothioate single-stranded DNA aptamers for TGF-beta-1 protein |
| US7674778B2 (en) | 2004-04-30 | 2010-03-09 | Alnylam Pharmaceuticals | Oligonucleotides comprising a conjugate group linked through a C5-modified pyrimidine |
| DK1773872T3 (en) | 2004-05-21 | 2017-05-08 | Uab Res Found | VARIABLE Lymphocyte Receptors, Associated Polypeptides and Nucleic Acids, and Uses thereof |
| US8394947B2 (en) | 2004-06-03 | 2013-03-12 | Isis Pharmaceuticals, Inc. | Positionally modified siRNA constructs |
| AU2005252662B2 (en) * | 2004-06-03 | 2011-08-18 | Isis Pharmaceuticals, Inc. | Double strand compositions comprising differentially modified strands for use in gene modulation |
| WO2006023880A2 (fr) * | 2004-08-23 | 2006-03-02 | Isis Pharmaceuticals, Inc. | Composes et procedes permettant de caracteriser les oligonucleotides |
| US7884086B2 (en) | 2004-09-08 | 2011-02-08 | Isis Pharmaceuticals, Inc. | Conjugates for use in hepatocyte free uptake assays |
| ES2729826T3 (es) | 2004-09-23 | 2019-11-06 | Arc Medical Devices Inc | Composiciones farmacéuticas y métodos relacionados para inhibir adherencias fibrosas o enfermedad inflamatoria usando fucanos con bajo contenido de sulfato |
| CA2584614A1 (fr) | 2004-10-20 | 2006-08-24 | Antisense Therapeutics Ltd | Modulation antisens de l'expression de l'integrine .alpha.4 |
| US20100256062A1 (en) | 2004-12-06 | 2010-10-07 | Howard Tommy E | Allelic Variants of Human Factor VIII |
| CN101175769A (zh) | 2005-03-10 | 2008-05-07 | 健泰科生物技术公司 | 用于调控血管完整性的方法和组合物 |
| US8309303B2 (en) | 2005-04-01 | 2012-11-13 | Qiagen Gmbh | Reverse transcription and amplification of RNA with simultaneous degradation of DNA |
| WO2006125094A2 (fr) * | 2005-05-18 | 2006-11-23 | Board Of Regents, The University Of Texas System | Selection combinatoire d'aptameres de phosphorothioate ciblant les rnases |
| WO2007008300A2 (fr) | 2005-05-31 | 2007-01-18 | ECOLE POLYTECHNIQUE FéDéRALE DE LAUSANNE | Copolymeres triblocs pour l'administration cytoplasmique de medicaments a base de genes |
| US20090209621A1 (en) | 2005-06-03 | 2009-08-20 | The Johns Hopkins University | Compositions and methods for decreasing microrna expression for the treatment of neoplasia |
| WO2006138145A1 (fr) | 2005-06-14 | 2006-12-28 | Northwestern University | Nanoparticules fonctionnalisees d'acide nucleique pour applications therapeutiques |
| ATE483802T1 (de) | 2005-08-11 | 2010-10-15 | Synthetic Genomics Inc | Verfahren zur in vitro-rekombination |
| EP1915461B1 (fr) | 2005-08-17 | 2018-08-01 | Dx4U GmbH | Composition et methode pour la determination de l'expression de ck-19 |
| US20090203893A1 (en) | 2005-08-29 | 2009-08-13 | Regulus Therapeutics, Llc | Antisense compounds having enhanced anti-microrna activity |
| AU2006284855B2 (en) | 2005-08-29 | 2011-10-13 | Regulus Therapeutics Inc. | Methods for use in modulating miR-122a |
| EP1762627A1 (fr) | 2005-09-09 | 2007-03-14 | Qiagen GmbH | Procédé pour l'activation d'acides nucléiques pour effectuer une réaction d'une polymérase |
| EP1934331A4 (fr) | 2005-10-14 | 2009-01-21 | Musc Found For Res Dev | Ciblage de pax2 en vue d'induire le traitement du cancer et l'immunite tumorale induite par defb1 |
| US8080534B2 (en) | 2005-10-14 | 2011-12-20 | Phigenix, Inc | Targeting PAX2 for the treatment of breast cancer |
| AU2006305886C1 (en) * | 2005-10-28 | 2011-03-17 | Alnylam Pharmaceuticals, Inc. | Compositions and methods for inhibiting expression of huntingtin gene |
| EP1942948A4 (fr) * | 2005-11-04 | 2010-03-03 | Alnylam Pharmaceuticals Inc | Compositions et methodes pour inhiber l'expression du gene nav1.8 |
| US20100069461A1 (en) | 2005-11-09 | 2010-03-18 | Alnylam Pharmaceuticals, Inc. | Compositions and methods for inhibiting expression of factor v leiden mutant gene |
| JP2009516710A (ja) | 2005-11-21 | 2009-04-23 | アイシス ファーマシューティカルズ， インコーポレーテッド | ｅＩＦ４Ｅ−ＢＰ２の発現のモジュレート |
| US20090069263A1 (en) * | 2005-12-16 | 2009-03-12 | Damha Masad J | 4'-thioarabinonucleotide-containing oligonucleotides, compounds and methods for their preparation and uses thereof |
| WO2007100412A2 (fr) * | 2005-12-21 | 2007-09-07 | Yale University | Méthodes et compositions associées à la modulation de ribocommutateurs |
| CN101437933B (zh) | 2005-12-28 | 2013-11-06 | 斯克里普斯研究所 | 作为药物靶标的天然反义和非编码的rna转录物 |
| PT2161038E (pt) | 2006-01-26 | 2014-03-10 | Isis Pharmaceuticals Inc | Composições e suas utilizações dirigidas à huntingtina |
| EP2314594B1 (fr) * | 2006-01-27 | 2014-07-23 | Isis Pharmaceuticals, Inc. | Analogues d'acide nucléique bicyclique modifiés en position 6 |
| US7569686B1 (en) | 2006-01-27 | 2009-08-04 | Isis Pharmaceuticals, Inc. | Compounds and methods for synthesis of bicyclic nucleic acid analogs |
| US8129515B2 (en) | 2006-01-27 | 2012-03-06 | Isis Pharmaceuticals, Inc. | Oligomeric compounds and compositions for the use in modulation of microRNAs |
| KR101547579B1 (ko) | 2006-03-31 | 2015-08-27 | 알닐람 파마슈티칼스 인코포레이티드 | Ｅｇ5 유전자의 발현을 억제하는 이본쇄 리보핵산 |
| CA2651031A1 (fr) * | 2006-05-03 | 2007-11-08 | Baltic Technology Development, Ltd. | Agents antisens combinant un oligonucleotide modifie par une base fortement liee et une nuclease artificielle |
| US20090326041A1 (en) | 2006-05-05 | 2009-12-31 | Isis Pharmaceuticals, Inc. | Compounds and methods for modulating expression of sglt2 |
| EP2527442A3 (fr) | 2006-05-05 | 2013-03-06 | Isis Pharmaceuticals, Inc. | Composés et procédés pour moduler l'expression génique |
| US7666854B2 (en) * | 2006-05-11 | 2010-02-23 | Isis Pharmaceuticals, Inc. | Bis-modified bicyclic nucleic acid analogs |
| DK2066684T3 (da) | 2006-05-11 | 2012-10-22 | Isis Pharmaceuticals Inc | 5´-Modificerede bicycliske nukleinsyreanaloge |
| CN101489566B (zh) | 2006-05-19 | 2012-04-18 | 阿尔尼拉姆医药品有限公司 | Aha基因的RNAi调控及其治疗性应用 |
| CA2653451C (fr) | 2006-05-22 | 2015-12-29 | Alnylam Pharmaceuticals, Inc. | Compositions et methodes inhibant l'expression du gene ikk-b |
| WO2007137301A2 (fr) * | 2006-05-23 | 2007-11-29 | Isis Pharmaceuticals, Inc. | MODULATION DE L'EXPRESSION DE ChREBP |
| US9506056B2 (en) | 2006-06-08 | 2016-11-29 | Northwestern University | Nucleic acid functionalized nanoparticles for therapeutic applications |
| US8198253B2 (en) | 2006-07-19 | 2012-06-12 | Isis Pharmaceuticals, Inc. | Compositions and their uses directed to HBXIP |
| EP2057284A4 (fr) * | 2006-08-04 | 2011-06-29 | Isis Pharmaceuticals Inc | Compositions et procédés de modulation de protéines jnk |
| EP2061799A4 (fr) * | 2006-09-11 | 2010-12-22 | Univ Yale | Riborégulateurs lysine, mise au point d'un composé structural présentant des riborégulateurs lysine, et méthodes d'utilisation et compositions utilisables avec des riborégulateurs lysine |
| JP5560039B2 (ja) | 2006-10-05 | 2014-07-23 | マサチューセッツ インスティテュート オブ テクノロジー | ハイスループット分析のための多機能のコード化された粒子 |
| AU2007310989B2 (en) | 2006-10-18 | 2014-05-29 | Isis Pharmaceuticals, Inc. | Antisense compounds |
| WO2008136852A2 (fr) | 2006-11-01 | 2008-11-13 | University Of Rochester | Méthodes et compositions se rapportant à la structure et à la fonction de apobec3g |
| US8093222B2 (en) | 2006-11-27 | 2012-01-10 | Isis Pharmaceuticals, Inc. | Methods for treating hypercholesterolemia |
| CA2670563A1 (fr) * | 2006-11-27 | 2008-06-05 | Isis Pharmaceuticals, Inc. | Procedes pour traiter l'hypercholesterolemie |
| CA2672297A1 (fr) | 2006-12-11 | 2008-06-19 | University Of Utah Research Foundation | Compositions et methodes de traitement de l'angiogenese pathologique et de la permeabilite vasculaire |
| US20100129358A1 (en) | 2006-12-22 | 2010-05-27 | University Of Utah Research Foundation | Method of detecting ocular diseases and pathologic conditions and treatment of same |
| US20080293053A1 (en) * | 2006-12-28 | 2008-11-27 | The Regents Of The University Of Michigan | shRNA Materials and Methods of Using Same for Inhibition of DKK-1 |
| EP2121987B1 (fr) | 2007-02-09 | 2012-06-13 | Northwestern University | Particules utilisées dans la détection de cibles intracellulaires |
| CA2679586A1 (fr) * | 2007-02-27 | 2008-10-23 | Northwestern University | Fixation de molecules a des nanoparticules |
| KR20100015757A (ko) | 2007-03-22 | 2010-02-12 | 예일 유니버시티 | 택일적 스플라이싱을 조절하는 리보스위치와 관련된 방법 및 조성물 |
| JP5350360B2 (ja) | 2007-03-29 | 2013-11-27 | アルナイラム ファーマシューティカルズ， インコーポレイテッド | エボラ由来の遺伝子の発現を阻害するための組成物および方法 |
| WO2008141275A1 (fr) | 2007-05-11 | 2008-11-20 | The Johns Hopkins University | Biomarqueurs pour mélanomes |
| MX2009012773A (es) * | 2007-05-29 | 2009-12-16 | Univ Yale | Ribointerruptores y metodos y composiciones para usarse de y con ribointerruptores. |
| CA2687684A1 (fr) * | 2007-05-29 | 2008-12-11 | Yale University | Procedes et compositions lies a des ribointerrupteurs qui regulent l'epissage alternatif et le traitement d'arn |
| AU2008260277C1 (en) | 2007-05-30 | 2014-04-17 | Isis Pharmaceuticals, Inc. | N-substituted-aminomethylene bridged bicyclic nucleic acid analogs |
| US7807372B2 (en) * | 2007-06-04 | 2010-10-05 | Northwestern University | Screening sequence selectivity of oligonucleotide-binding molecules using nanoparticle based colorimetric assay |
| DK2173760T4 (en) | 2007-06-08 | 2016-02-08 | Isis Pharmaceuticals Inc | Carbocyclic bicyclic nukleinsyreanaloge |
| ES2376507T5 (es) * | 2007-07-05 | 2015-08-31 | Isis Pharmaceuticals, Inc. | Análogos de ácidos nucleicos bicíclicos 6-disustituidos |
| EP2188298B1 (fr) | 2007-08-15 | 2013-09-18 | Isis Pharmaceuticals, Inc. | Analogues d'acide nucléique de tétrahydropyrane |
| JP2010537638A (ja) | 2007-08-28 | 2010-12-09 | ユーエービー リサーチ ファウンデーション | 合成アポリポ蛋白質ｅ模倣ポリペプチドおよび使用方法 |
| DK2682400T5 (da) | 2007-08-28 | 2017-11-27 | Uab Research Foundation | Syntetiske apolipoprotein E-efterlignende polypeptider og fremgangsmåder til anvendelse |
| WO2009039466A1 (fr) | 2007-09-20 | 2009-03-26 | Vanderbilt University | Mesure de solution libre d'interactions moléculaires par interférométrie rétrodiffusée |
| WO2009039442A1 (fr) * | 2007-09-21 | 2009-03-26 | California Institute Of Technology | Nfia dans la détermination de la destinée gliale, thérapie du gliome et traitement de l'astrocytome |
| BRPI0819193A2 (pt) * | 2007-11-05 | 2017-05-23 | Baltic Tech Dev Ltd | uso de oligonucleotídeos com bases modificadas na hibridização de ácidos nucleicos. |
| EP2222851B1 (fr) | 2007-11-20 | 2017-06-28 | Ionis Pharmaceuticals, Inc. | Modulation de l'expression de cd40 |
| JP5530933B2 (ja) | 2007-12-10 | 2014-06-25 | アルナイラム ファーマシューティカルズ， インコーポレイテッド | 第ｖｉｉ因子遺伝子発現阻害のための組成物及び方法 |
| EP2224912B1 (fr) | 2008-01-02 | 2016-05-11 | TEKMIRA Pharmaceuticals Corporation | Compositions et procédés améliorés pour la délivrance d'acides nucléiques |
| WO2009100320A2 (fr) * | 2008-02-07 | 2009-08-13 | Isis Pharmaceuticals, Inc. | Analogues d’acides nucléiques de cyclohexitol bicycliques |
| JP2011518117A (ja) | 2008-03-05 | 2011-06-23 | アルナイラム ファーマシューティカルズ， インコーポレイテッド | Ｅｇ５およびＶＥＧＦ遺伝子の発現を阻害するための組成物および方法 |
| US8426378B2 (en) * | 2008-03-21 | 2013-04-23 | Isis Pharmaceuticals, Inc. | Oligomeric compounds comprising tricyclic nucelosides and methods for their use |
| DK2285819T3 (da) * | 2008-04-04 | 2013-12-02 | Isis Pharmaceuticals Inc | Oligomere forbindelser omfattende neutralt bundne, terminale bicykliske nukleosider |
| EP2274423A2 (fr) * | 2008-04-04 | 2011-01-19 | Isis Pharmaceuticals, Inc. | Composés oligomères comprenant des nucléosides bicycliques et ayant une toxicité réduite |
| EP2982753B1 (fr) | 2008-04-18 | 2018-06-06 | Baxter International Inc. | Composition à base de microsphères destinée à la prévention et/ou inversion de nouveaux cas de diabète auto-immun |
| EP2280995A2 (fr) * | 2008-04-29 | 2011-02-09 | Wyeth LLC | Méthodes de traitement d une inflammation |
| WO2009149182A1 (fr) | 2008-06-04 | 2009-12-10 | The Board Of Regents Of The University Of Texas System | Modulation de l'expression génique par ciblage d'un petit arn endogène de promoteurs de gènes |
| EP2317847B1 (fr) | 2008-07-29 | 2019-04-17 | The Board of Regents of The University of Texas System | Inhibition sélective d'expression de protéine de polyglutamine |
| EP3081648A1 (fr) | 2008-08-25 | 2016-10-19 | Excaliard Pharmaceuticals, Inc. | Oligonucléotides antisens dirigés contre le facteur de croissance du tissu conjonctif et leurs utilisations |
| EP3375451A1 (fr) | 2008-08-25 | 2018-09-19 | Excaliard Pharmaceuticals, Inc. | Procédé pour réduire une cicatrice pendant la cicatrisation d'une plaie au moyen de composés antisens dirigés contre ctgf |
| WO2010028054A1 (fr) | 2008-09-02 | 2010-03-11 | Alnylam Europe Ag. | Compositions et procédés d'inhibition de l'expression d'un gène egfr mutant |
| US8501805B2 (en) * | 2008-09-24 | 2013-08-06 | Isis Pharmaceuticals, Inc. | Substituted alpha-L-bicyclic nucleosides |
| EP2361256B1 (fr) * | 2008-09-24 | 2013-04-10 | Isis Pharmaceuticals, Inc. | Analogues d'acide nucléique cyclohexényle |
| EP2334793B1 (fr) | 2008-09-25 | 2016-04-06 | Alnylam Pharmaceuticals, Inc. | Compositions et methodes destinees a inhiber l'expression d'un gene de serum amyloïde a |
| WO2010042877A1 (fr) | 2008-10-09 | 2010-04-15 | Tekmira Pharmaceuticals Corporation | Lipides aminés améliorés et procédés d'administration d'acides nucléiques |
| AU2009305636A1 (en) | 2008-10-15 | 2010-04-22 | Ionis Pharmaceuticals, Inc. | Modulation of Factor 11 expression |
| EA029762B1 (ru) | 2008-10-20 | 2018-05-31 | Элнилэм Фармасьютикалз, Инк. | Композиции и способы для ингибирования экспрессии транстиретина |
| AU2009308217B2 (en) | 2008-10-24 | 2016-01-21 | Ionis Pharmaceuticals, Inc. | 5' and 2' bis-substituted nucleosides and oligomeric compounds prepared therefrom |
| EP2447274B1 (fr) | 2008-10-24 | 2017-10-04 | Ionis Pharmaceuticals, Inc. | Composants oligomères et procédés |
| DK2365803T3 (en) | 2008-11-24 | 2018-01-22 | Univ Northwestern | POLYVALENT RNA NANOPARTICLE COMPOSITIONS |
| ES2637063T3 (es) | 2008-12-04 | 2017-10-10 | Curna, Inc. | Tratamiento de enfermedades relacionadas con genes supresores de tumor mediante inhibición del transcrito antisentido natural al gen |
| MX366774B (es) | 2008-12-04 | 2019-07-24 | Curna Inc | Uso de oligonucleótidos antisentido en la inhibición de transcrito antisentido natural para sirtuina 1. |
| WO2010065792A2 (fr) | 2008-12-04 | 2010-06-10 | Curna, Inc. | Traitement de maladies liées à l'érythropoïétine (epo) par inhibition d'un transcrit antisens naturel de l'epo |
| WO2010068816A1 (fr) | 2008-12-10 | 2010-06-17 | Alnylam Pharmaceuticals, Inc. | Compositions d'arndb ciblé sur gnaq et procédés pour inhiber l'expression |
| US20100184844A1 (en) * | 2009-01-08 | 2010-07-22 | Northwestern University | Inhibition of Bacterial Protein Production by Polyvalent Oligonucleotide Modified Nanoparticle Conjugates |
| US20100233270A1 (en) | 2009-01-08 | 2010-09-16 | Northwestern University | Delivery of Oligonucleotide-Functionalized Nanoparticles |
| KR101546673B1 (ko) * | 2009-01-15 | 2015-08-25 | 삼성전자주식회사 | 전자 사진용 토너 및 그의 제조방법 |
| CA2751342C (fr) | 2009-01-29 | 2019-05-07 | Alnylam Pharmaceuticals, Inc. | Formules lipides renfermant un lipide cationique et un lipide cible renfermant de la galactosamine n-acetyle pour la livraison d'acide nucleique |
| WO2010090969A1 (fr) | 2009-02-06 | 2010-08-12 | Isis Pharmaceuticals, Inc. | Analogues d'acide nucléique de tétrahydropyrane |
| EP2393825A2 (fr) | 2009-02-06 | 2011-12-14 | Isis Pharmaceuticals, Inc. | Composés oligomères et procédés connexes |
| US20110319476A1 (en) | 2009-02-12 | 2011-12-29 | Opko Curna, Llc | Treatment of glial cell derived neurotrophic factor (gdnf) related diseases by inhibition of natural antisense transcript to gdnf |
| PL2396038T3 (pl) | 2009-02-12 | 2016-05-31 | Curna Inc | Leczenie chorób związanych z neurotropowym czynnikiem pochodzenia mózgowego (bdnf) poprzez zahamowanie naturalnego antysensownego transkryptu bdnf |
| WO2010099341A1 (fr) | 2009-02-26 | 2010-09-02 | Alnylam Pharmaceuticals, Inc. | Composition et procédés d'inhibition de l'expression du gène mig-12 |
| EP2403946A4 (fr) | 2009-03-04 | 2012-11-14 | Traitement de maladies liées à sirtuine 1 (sirt1) par inhibition d'un produit de transcription antisens naturel de sirt 1 | |
| JP6032724B2 (ja) | 2009-03-12 | 2016-11-30 | アルナイラム ファーマシューティカルズ， インコーポレイテッドＡｌｎｙｌａｍ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌｓ， Ｉｎｃ． | 脂質製剤組成物およびＥｇ５遺伝子とＶＥＧＦ遺伝子の発現を阻害する方法 |
| US9464287B2 (en) | 2009-03-16 | 2016-10-11 | Curna, Inc. | Treatment of nuclear factor (erythroid-derived 2)-like 2 (NRF2) related diseases by inhibition of natural antisense transcript to NRF2 |
| CA2755404C (fr) | 2009-03-17 | 2020-03-24 | Joseph Collard | Traitement des maladies associees a l'homologue du delta-like 1 (dlk1) par inhibition du transcrit antisens naturel de dlk1 |
| JP6145270B2 (ja) | 2009-04-15 | 2017-06-07 | ノースウェスタン ユニバーシティ | オリゴヌクレオチド機能化ナノ粒子の送達 |
| EP3248618A1 (fr) | 2009-04-22 | 2017-11-29 | Massachusetts Institute Of Technology | Suppression de l'immunité innée permettant l'administration répétée de longues molécules d'arn |
| EP2421972A2 (fr) | 2009-04-24 | 2012-02-29 | The Board of Regents of The University of Texas System | Modulation de l'expression d'un gène au moyen d'oligomères ciblant les séquences géniques situées en aval des séquences 3' non traduites |
| US8318690B2 (en) | 2009-05-01 | 2012-11-27 | Curna, Inc. | Treatment of hemoglobin (HBF/HBG) related diseases by inhibition of natural antisense transcript to HBF/HBG |
| SG10201402054UA (en) | 2009-05-05 | 2014-09-26 | Muthiah Manoharan | Lipid compositions |
| AU2010245933B2 (en) | 2009-05-05 | 2016-06-16 | Arbutus Biopharma Corporation | Methods of delivering oligonucleotides to immune cells |
| ES2609655T3 (es) | 2009-05-06 | 2017-04-21 | Curna, Inc. | Tratamiento de enfermedades relacionadas con tristetraprolina (TTP) mediante inhibición de transcrito antisentido natural para TTP |
| CN106237345A (zh) | 2009-05-06 | 2016-12-21 | 库尔纳公司 | 通过针对脂质转运和代谢基因的天然反义转录物的抑制治疗脂质转运和代谢基因相关疾病 |
| US20120107331A1 (en) | 2009-05-15 | 2012-05-03 | Yale University | Gemm riboswitches, structure-based compound design with gemm riboswitches, and methods and compositions for use of and with gemm riboswitches |
| JP5922017B2 (ja) | 2009-05-18 | 2016-05-24 | クルナ・インコーポレーテッド | リプログラミング因子に対する天然アンチセンス転写物の抑制によるリプログラミング因子関連疾患の治療 |
| WO2010135695A2 (fr) | 2009-05-22 | 2010-11-25 | Curna, Inc. | Traitement des maladies liées au facteur de transcription e3 (tfe3) et au substrat récepteur d'insuline 2 (irs2) par inhibition du transcript antisens naturel du tfe3 |
| EP2435571B1 (fr) | 2009-05-28 | 2016-12-14 | CuRNA, Inc. | Traitement de maladies associées à un gène antiviral grâce à l'inhibition d'un produit de transcription antisens naturel d'un gène antiviral |
| CN104873464B (zh) | 2009-06-10 | 2018-06-22 | 阿布特斯生物制药公司 | 改进的脂质制剂 |
| KR101801404B1 (ko) | 2009-06-16 | 2017-12-20 | 큐알엔에이, 인크. | 콜라겐 유전자에 대한 천연 안티센스 전사체의 억제에 의한 콜라겐 유전자 관련된 질환의 치료 |
| ES2629339T3 (es) | 2009-06-16 | 2017-08-08 | Curna, Inc. | Tratamiento de enfermedades relacionadas con la paraoxonasa 1 (pon1) por inhibición de transcrito antisentido natural a pon1 |
| NZ624712A (en) | 2009-06-17 | 2015-10-30 | Isis Pharmaceuticals Inc | Compositions and methods for modulation of smn2 splicing in a subject |
| CA2765889A1 (fr) | 2009-06-24 | 2010-12-29 | Opko Curna, Llc | Traitement de maladies associees au recepteur de facteur necrosant des tumeurs 2 (tnfr2) par inhibition de la transcription antisens naturelle de tnfr2 |
| KR101807324B1 (ko) | 2009-06-26 | 2017-12-08 | 큐알엔에이, 인크. | 다운 증후군 유전자에 대한 천연 안티센스 전사체의 억제에 의한 다운 증후군 유전자 관련된 질환의 치료 |
| CA2769665A1 (fr) | 2009-08-05 | 2011-02-10 | Opko Curna, Llc | Traitement de maladies liees a un gene de l'insuline (ins) par inhibition du transcrit antisens naturel d'un gene de l'insuline (ins) |
| EP2462153B1 (fr) | 2009-08-06 | 2015-07-29 | Isis Pharmaceuticals, Inc. | Analogues d'acides nucléiques cyclohexoses bicycliques |
| AP2015008874A0 (en) | 2009-08-14 | 2015-11-30 | Alnylam Pharmaceuticals Inc | Lipid formulated compositions and methods for inhibiting expression of a gene from the ebola virus |
| WO2011022420A1 (fr) | 2009-08-17 | 2011-02-24 | Yale University | Biomarqueurs de méthylation et méthodes dutilisation |
| KR101892760B1 (ko) | 2009-08-25 | 2018-08-28 | 큐알엔에이, 인크. | ＩＱＧＡＰ에 대한 천연 안티센스 전사체의 억제에 의한 ＧＴＰａｓｅ 활성화 단백질을 함유하는 ＩＱ 모티프(ＩＱＧＡＰ)와 관련된 질환의 치료 |
| DK2473522T3 (en) | 2009-09-02 | 2016-11-28 | Genentech Inc | Smoothened MUTANT AND METHODS OF USING THE SAME |
| RU2539772C2 (ru) | 2009-10-22 | 2015-01-27 | Дженентек, Инк. | Способы и композиции для модуляции гепсином стимулирующего макрофаги белка |
| EP2494066B1 (fr) | 2009-10-27 | 2017-04-05 | Swift Biosciences, Inc. | Amorces bimoléculaires |
| AU2010313154B2 (en) | 2009-10-30 | 2016-05-12 | Northwestern University | Templated nanoconjugates |
| US20110110860A1 (en) | 2009-11-02 | 2011-05-12 | The Board Of Regents Of The University Of Texas System | Modulation of ldl receptor gene expression with double-stranded rnas targeting the ldl receptor gene promoter |
| KR20120102674A (ko) | 2009-11-03 | 2012-09-18 | 유니버시티 오브 버지니아 페이턴트 파운데이션 | 중합체 분석물을 검출하는 다용도의 가시적인 방법 |
| EP2504450B1 (fr) | 2009-11-23 | 2016-07-06 | Swift Biosciences, Inc. | Dispositifs permettant l'extension de molécules monocaténaires cibles |
| PE20121584A1 (es) | 2009-11-30 | 2012-11-29 | Genentech Inc | Composiciones y metodos para el diagnostico y el tratamiento de tumores |
| ES2661813T3 (es) | 2009-12-16 | 2018-04-04 | Curna, Inc. | Tratamiento de enfermedades relacionadas con la peptidasa del factor de transcripción de membrana, sitio 1 (mbtps1) mediante inhibición del transcrito antisentido natural al gen mbtps1 |
| EP2515947B1 (fr) | 2009-12-23 | 2021-10-06 | CuRNA, Inc. | Traitement de maladies associées à la protéine ucp2 (uncoupling protein) par inhibition du produit de transcription antisens naturel en ucp2 |
| WO2011079261A2 (fr) | 2009-12-23 | 2011-06-30 | Curna, Inc. | Traitement de maladies associées au facteur de croissance des hépatocytes (hgf) par inhibition de la transcription antisens naturelle en hgf |
| JP5982288B2 (ja) | 2009-12-29 | 2016-08-31 | カッパーアールエヌエー，インコーポレイテッド | 腫瘍タンパク質６３（ｐ６３）に対する天然アンチセンス転写物の阻害による腫瘍タンパク質６３関連疾患の治療 |
| RU2615450C2 (ru) | 2009-12-29 | 2017-04-04 | Курна, Инк. | Лечение заболеваний, связанных с ядерным респираторным фактором 1(nrf1), путем ингибирования природного антисмыслового транскрипта к nrf1 |
| DK2521784T3 (en) | 2010-01-04 | 2018-03-12 | Curna Inc | TREATMENT OF INTERFERON REGULATORY FACTOR 8- (IRF8) RELATED DISEASES BY INHIBITION OF NATURAL ANTISENCE TRANSCRIPT TO IRF8 |
| JP5963680B2 (ja) | 2010-01-06 | 2016-08-03 | カッパーアールエヌエー，インコーポレイテッド | 膵臓発生遺伝子に対する天然アンチセンス転写物の阻害による膵臓発生遺伝子疾患の治療 |
| WO2011085347A2 (fr) | 2010-01-11 | 2011-07-14 | Opko Curna, Llc | Traitement des maladies associées à la globuline se liant aux hormones sexuelles (shbg) par inhibition du produit de transcription anti-sens naturel en shbg |
| US8779118B2 (en) | 2010-01-11 | 2014-07-15 | Isis Pharmaceuticals, Inc. | Base modified bicyclic nucleosides and oligomeric compounds prepared therefrom |
| EP2524042A2 (fr) | 2010-01-12 | 2012-11-21 | Yale University | Motifs et composés arn structurés et leurs procédés d'utilisation |
| WO2011088391A2 (fr) * | 2010-01-14 | 2011-07-21 | Haplomics, Inc. | Prédiction et réduction de l'allo-immunogénicité des agents thérapeutiques protéiques |
| ES2671877T3 (es) | 2010-01-25 | 2018-06-11 | Curna, Inc. | Tratamiento de enfermedades relacionadas con la RNASA (H1) mediante inhibición del transcrito antisentido natural a RNASA H1 |
| WO2011097388A1 (fr) | 2010-02-03 | 2011-08-11 | Alnylam Pharmaceuticals, Inc. | Inhibition sélective de l'expression de la protéine de polyglutamine |
| CA2824843A1 (fr) | 2010-02-04 | 2011-08-11 | Ico Therapeutics Inc. | Schemas posologiques permettant de traiter et de prevenir des affections oculaires au moyen d'oligonucleotides c-raf antisens |
| CN102844435B (zh) | 2010-02-22 | 2017-05-10 | 库尔纳公司 | 通过抑制吡咯啉‑5‑羧酸还原酶1(pycr1)的天然反义转录物而治疗pycr1相关疾病 |
| WO2011105900A2 (fr) | 2010-02-23 | 2011-09-01 | Academisch Ziekenhuis Bij De Universiteit Van Amsterdam | Antagonistes de composant du complément 8-alpha (c8-alpha) et utilisations associées |
| WO2011105902A2 (fr) | 2010-02-23 | 2011-09-01 | Academisch Ziekenhuis Bij De Universiteit Van Amsterdam | Antagonistes de composant du complément 8-bêta (c8-bêta) et utilisations associées |
| KR20130004579A (ko) | 2010-02-23 | 2013-01-11 | 제넨테크, 인크. | 종양의 진단 및 치료를 위한 조성물 및 방법 |
| WO2011105901A2 (fr) | 2010-02-23 | 2011-09-01 | Academisch Ziekenhuis Bij De Universiteit Van Amsterdam | Antagonistes de composant du complément 9 (c9) et utilisations associées |
| WO2011112516A1 (fr) | 2010-03-08 | 2011-09-15 | Ico Therapeutics Inc. | Traitement et prévention de l'infection par le virus de l'hépatite c en utilisant des oligonucléotides antisens de la kinase c-raf |
| US20130101512A1 (en) | 2010-03-12 | 2013-04-25 | Chad A. Mirkin | Crosslinked polynucleotide structure |
| US9193752B2 (en) | 2010-03-17 | 2015-11-24 | Isis Pharmaceuticals, Inc. | 5′-substituted bicyclic nucleosides and oligomeric compounds prepared therefrom |
| AU2011235276B2 (en) | 2010-03-29 | 2015-09-03 | Alnylam Pharmaceuticals, Inc. | SiRNA therapy for transthyretin (TTR) related ocular amyloidosis |
| EP2556160A4 (fr) | 2010-04-09 | 2013-08-21 | Curna Inc | Traitement des maladies associées au facteur de croissance du fibroblaste 21 (fgf21) par l'inhibition d'un produit de la transcription antisens naturel de fgf21 |
| WO2011133695A2 (fr) | 2010-04-20 | 2011-10-27 | Swift Biosciences, Inc. | Matériaux et procédés de fractionnement de l'acide nucléique par piégeage en phase solide et détachement enzymatique |
| EP2625186B1 (fr) | 2010-04-28 | 2016-07-27 | Ionis Pharmaceuticals, Inc. | Nucléosides modifiés en 5' et composés oligomères préparés à partir de ceux-ci |
| CN103154014B (zh) | 2010-04-28 | 2015-03-25 | Isis制药公司 | 修饰核苷、其类似物以及由它们制备的寡聚化合物 |
| ES2625689T3 (es) | 2010-04-29 | 2017-07-20 | Ionis Pharmaceuticals, Inc. | Modulación de la expresión de transtiretina |
| WO2011139387A1 (fr) | 2010-05-03 | 2011-11-10 | Opko Curna, Llc | Traitement de maladies liées à une sirtuine (sirt) par inhibition de la transcription antisens naturelle pour donner une sirtuine (sirt) |
| CN107090045A (zh) | 2010-05-03 | 2017-08-25 | 霍夫曼-拉罗奇有限公司 | 用于肿瘤诊断和治疗的组合物和方法 |
| TWI586356B (zh) | 2010-05-14 | 2017-06-11 | 可娜公司 | 藉由抑制ｐａｒ４天然反股轉錄本治療ｐａｒ４相關疾病 |
| KR20180053419A (ko) | 2010-05-26 | 2018-05-21 | 큐알엔에이, 인크. | 무조(無調)의 동소체 1 (atoh1)에 대한 자연 안티센스 전사체의 저해에 의한 atoh1 관련된 질환의 치료 |
| WO2011150226A1 (fr) | 2010-05-26 | 2011-12-01 | Landers James P | Procédé de détection d'acides nucléiques en fonction de formation d'agrégats |
| EP2576579B1 (fr) | 2010-06-02 | 2018-08-08 | Alnylam Pharmaceuticals, Inc. | Compositions et méthodes pour traiter une fibrose hépatique |
| US8957200B2 (en) | 2010-06-07 | 2015-02-17 | Isis Pharmaceuticals, Inc. | Bicyclic nucleosides and oligomeric compounds prepared therefrom |
| US9476101B2 (en) | 2010-06-07 | 2016-10-25 | Firefly Bioworks, Inc. | Scanning multifunctional particles |
| US8846637B2 (en) | 2010-06-08 | 2014-09-30 | Isis Pharmaceuticals, Inc. | Substituted 2′-amino and 2′-thio-bicyclic nucleosides and oligomeric compounds prepared therefrom |
| US9638632B2 (en) | 2010-06-11 | 2017-05-02 | Vanderbilt University | Multiplexed interferometric detection system and method |
| US9168297B2 (en) | 2010-06-23 | 2015-10-27 | The United States Of America, As Represented By The Secretary, Department Of Health And Human Services | Regulation of skin pigmentation by neuregulin-1 (NRG-1) |
| WO2012009402A2 (fr) | 2010-07-14 | 2012-01-19 | Opko Curna Llc | Traitement de maladies liées à « discs large homolog » (dlg) par inhibition de transcrit antisens naturel de dlg |
| DK3031920T3 (da) | 2010-07-19 | 2019-10-14 | Ionis Pharmaceuticals Inc | Modulation af dystrofi myotonica-protein kinase (dmpk) ekspression |
| AU2011312205B2 (en) | 2010-10-05 | 2015-08-13 | Curis, Inc. | Mutant smoothened and methods of using the same |
| CA2813901C (fr) | 2010-10-06 | 2019-11-12 | Curna, Inc. | Traitement de maladies liees a la sialidase 4 (neu4) par inhibition du transcrit anti-sens endogene de neu4 |
| EP2630241B1 (fr) | 2010-10-22 | 2018-10-17 | CuRNA, Inc. | Traitement de maladies associées à l'alpha-l-iduronidase (idua) par inhibition du transcrit antisens endogène de idua |
| ES2677070T3 (es) | 2010-10-27 | 2018-07-27 | Curna, Inc. | Tratamiento de enfermedades relacionadas con el regulador del desarrollo 1 asociado a interferón (ifrd1) mediante inhibición del transcrito antisentido natural al gen ifrd1 |
| CN110123830A (zh) | 2010-11-09 | 2019-08-16 | 阿尔尼拉姆医药品有限公司 | 用于抑制Eg5和VEGF基因的表达的脂质配制的组合物和方法 |
| EP2640853B1 (fr) | 2010-11-17 | 2018-12-26 | Ionis Pharmaceuticals, Inc. | Modulation de l'expression de l'alpha synucléine |
| ES2657590T3 (es) | 2010-11-23 | 2018-03-06 | Curna, Inc. | Tratamiento de enfermedades relacionadas con nanog mediante inhibición del transcrito antisentido natural a nanog |
| US9150926B2 (en) | 2010-12-06 | 2015-10-06 | The United States Of America, As Represented By The Secretary, Department Of Health And Human Services | Diagnosis and treatment of adrenocortical tumors using human microRNA-483 |
| WO2012078967A2 (fr) | 2010-12-10 | 2012-06-14 | Alnylam Pharmaceuticals, Inc. | Compositions et procédés pour l'augmentation de la production d'érythropoïétine (epo) |
| EP2648763A4 (fr) | 2010-12-10 | 2014-05-14 | Alnylam Pharmaceuticals Inc | Compositions et procédés d'inhibition de l'expression des gènes klf-1 et bcl11a |
| US20130338178A1 (en) | 2011-02-02 | 2013-12-19 | The Trustees Of Princeton University | Sirtuin modulators as inhibitors of cytomegalovirus |
| TWI593416B (zh) | 2011-02-02 | 2017-08-01 | 艾克厘德製藥公司 | 利用針對結締組織生長因子（ｃｔｇｆ）目標之反義化合物治療瘢痕或肥厚性疤痕之方法 |
| MY165507A (en) | 2011-02-03 | 2018-03-28 | Mirna Therapeutics Inc | Synthetic mimics of mir-34 |
| AU2012212105A1 (en) | 2011-02-03 | 2013-09-12 | Mirna Therapeutics, Inc. | Synthetic mimics of miR-124 |
| US10017764B2 (en) | 2011-02-08 | 2018-07-10 | Ionis Pharmaceuticals, Inc. | Oligomeric compounds comprising bicyclic nucleotides and uses thereof |
| US9562853B2 (en) | 2011-02-22 | 2017-02-07 | Vanderbilt University | Nonaqueous backscattering interferometric methods |
| JP6108628B2 (ja) | 2011-03-29 | 2017-04-05 | アルナイラム ファーマシューティカルズ， インコーポレイテッドＡｌｎｙｌａｍ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌｓ， Ｉｎｃ． | Ｔｍｐｒｓｓ６遺伝子の発現を阻害する組成物および方法 |
| AU2012236099A1 (en) | 2011-03-31 | 2013-10-03 | Moderna Therapeutics, Inc. | Delivery and formulation of engineered nucleic acids |
| EP2694660B1 (fr) | 2011-04-03 | 2018-08-08 | The General Hospital Corporation | Expression protéique efficace in vivo à l'aide d'arn modifié (mod-arn) |
| US20140186844A1 (en) | 2011-04-26 | 2014-07-03 | Swift Biosciences, Inc. | Polynucleotide primers and probes |
| WO2012151289A2 (fr) | 2011-05-02 | 2012-11-08 | University Of Virginia Patent Foundation | Procédé et système pour détecter la formation d'agrégats sur un substrat |
| WO2012151268A1 (fr) | 2011-05-02 | 2012-11-08 | University Of Virginia Patent Foundation | Procédé et système de détection optique, sans marqueur et à haut rendement, d'analytes |
| WO2012170347A1 (fr) | 2011-06-09 | 2012-12-13 | Isis Pharmaceuticals, Inc. | Nucléosides bicycliques et composés oligomères préparés à partir de ceux-ci |
| RU2620980C2 (ru) | 2011-06-09 | 2017-05-30 | Курна, Инк. | Лечение заболеваний, связанных с фратаксином (fxn), путем ингибирования природного антисмыслового транскрипта fxn |
| AU2012267546B2 (en) | 2011-06-10 | 2015-12-24 | Ionis Pharmaceuticals, Inc. | Methods for modulating kallikrein (KLKB1) expression |
| RU2631805C2 (ru) | 2011-06-21 | 2017-09-26 | Элнилэм Фармасьютикалз, Инк. | Композиции и способы ингибирования экспрессии генов аполипопротеина с-iii (арос3) |
| CN103890000B (zh) | 2011-06-21 | 2017-09-01 | 阿尔尼拉姆医药品有限公司 | 血管生成素样3(ANGPTL3)iRNA组合物及其使用方法 |
| EP3388068A1 (fr) | 2011-06-21 | 2018-10-17 | Alnylam Pharmaceuticals, Inc. | Composition et procédés d'inhibition de l'expression des gènes de la protéine c (proc) |
| EP3366312A1 (fr) | 2011-06-23 | 2018-08-29 | Alnylam Pharmaceuticals, Inc. | Arnsi de serpina 1 : compositions de matière et procédés de traitement |
| US9322021B2 (en) | 2011-06-29 | 2016-04-26 | Ionis Pharmaceuticals, Inc. | Methods for modulating kallikrein (KLKB1) expression |
| US20140328811A1 (en) | 2011-08-01 | 2014-11-06 | Alnylam Pharmaceuticals, Inc. | Method for improving the success rate of hematopoietic stem cell transplants |
| US10202599B2 (en) | 2011-08-11 | 2019-02-12 | Ionis Pharmaceuticals, Inc. | Selective antisense compounds and uses thereof |
| CA2847698C (fr) | 2011-09-14 | 2020-09-01 | Northwestern University | Nanoconjugues capables de traverser la barriere hemato-encephalique |
| WO2013040548A2 (fr) | 2011-09-17 | 2013-03-21 | Yale University | Riborégulateurs répondant aux fluorures, transporteurs de fluorure et procédés d'utilisation |
| US9738727B2 (en) | 2011-10-14 | 2017-08-22 | Genentech, Inc. | Anti-HtrA1 antibodies and methods of use |
| RS63244B1 (sr) | 2011-12-16 | 2022-06-30 | Modernatx Inc | Kompozicije modifikovane mrna |
| WO2013096837A1 (fr) | 2011-12-22 | 2013-06-27 | Isis Pharmaceuticals, Inc. | Procédés pour la modulation d'une expression d'un transcrit 1 d'adénocarcinome associé à la métastase (malat-1) |
| WO2013106358A1 (fr) | 2012-01-10 | 2013-07-18 | Hussain M Mahmood | Procédé destiné au traitement de l'hyperlipidémie et de l'athérosclérose par le biais du mir-30c |
| EP3330278A1 (fr) | 2012-02-08 | 2018-06-06 | Ionis Pharmaceuticals, Inc. | Modulation de l'arn par ciblage de repetitions |
| SG11201405669XA (en) | 2012-03-13 | 2014-10-30 | Swift Biosciences Inc | Methods and compositions for size-controlled homopolymer tailing of substrate polynucleotides by a nucleic acid polymerase |
| US20150031750A1 (en) | 2012-03-15 | 2015-01-29 | The Scripps Research Institute | Treatment of brain derived neurotrophic factor (bdnf) related diseases by inhibition of natural antisense transcript to bdnf |
| US9610362B2 (en) | 2012-03-16 | 2017-04-04 | Valerion Therapeutics, Llc | Antisense conjugates for decreasing expression of DMPK |
| US9340784B2 (en) | 2012-03-19 | 2016-05-17 | Ionis Pharmaceuticals, Inc. | Methods and compositions for modulating alpha-1-antitrypsin expression |
| CN108949772A (zh) | 2012-04-02 | 2018-12-07 | 现代泰克斯公司 | 用于产生与人类疾病相关的生物制剂和蛋白质的修饰多核苷酸 |
| US9283287B2 (en) | 2012-04-02 | 2016-03-15 | Moderna Therapeutics, Inc. | Modified polynucleotides for the production of nuclear proteins |
| EP2833892A4 (fr) | 2012-04-02 | 2016-07-20 | Moderna Therapeutics Inc | Polynucléotides modifiés destinés à la production de protéines et de peptides associés à l'oncologie |
| WO2013154799A1 (fr) | 2012-04-09 | 2013-10-17 | Isis Pharmaceuticals, Inc. | Nucléosides tricycliques et composés oligomères préparés à partir de ceux-ci |
| EP2850092B1 (fr) | 2012-04-09 | 2017-03-01 | Ionis Pharmaceuticals, Inc. | Analogues tricycliques d'acide nucléique |
| US9133461B2 (en) | 2012-04-10 | 2015-09-15 | Alnylam Pharmaceuticals, Inc. | Compositions and methods for inhibiting expression of the ALAS1 gene |
| WO2013159108A2 (fr) | 2012-04-20 | 2013-10-24 | Isis Pharmaceuticals, Inc. | Composés oligomères comprenant des nucléotides bicycliques et utilisations de ceux-ci |
| US9127274B2 (en) | 2012-04-26 | 2015-09-08 | Alnylam Pharmaceuticals, Inc. | Serpinc1 iRNA compositions and methods of use thereof |
| US9273949B2 (en) | 2012-05-11 | 2016-03-01 | Vanderbilt University | Backscattering interferometric methods |
| WO2013177248A2 (fr) | 2012-05-22 | 2013-11-28 | Isis Pharmaceuticals, Inc. | Modulation de l'expression génique à médiation par un activateur arn |
| PT3461895T (pt) | 2012-06-25 | 2020-09-08 | Baylor College Medicine | Modulação da expressão de ube3a-ats |
| US20140038182A1 (en) | 2012-07-17 | 2014-02-06 | Dna Logix, Inc. | Cooperative primers, probes, and applications thereof |
| WO2014018930A1 (fr) | 2012-07-27 | 2014-01-30 | Isis Pharmaceuticals. Inc. | Modulation de maladies associées au système rénine—angiotensine (ras) par l'angiotensinogène |
| EP2885312A4 (fr) | 2012-08-15 | 2016-01-20 | Isis Pharmaceuticals Inc | Procédé de préparation de composés oligomères utilisant des protocoles de coiffage modifiés |
| WO2014045126A2 (fr) | 2012-09-18 | 2014-03-27 | Uti Limited Partnership | Traitement de la douleur par inhibition de la déubiquitinase usp5 |
| EP2906699A4 (fr) | 2012-10-11 | 2016-06-08 | Ionis Pharmaceuticals Inc | Composés oligomères comportant des nucléosides bicycliques et leurs utilisations |
| EP4052709A1 (fr) | 2012-10-11 | 2022-09-07 | Ionis Pharmaceuticals, Inc. | Procédés de traitement de la maladie de kennedy |
| US9175291B2 (en) | 2012-10-11 | 2015-11-03 | Isis Pharmaceuticals Inc. | Modulation of androgen receptor expression |
| US9029335B2 (en) | 2012-10-16 | 2015-05-12 | Isis Pharmaceuticals, Inc. | Substituted 2′-thio-bicyclic nucleosides and oligomeric compounds prepared therefrom |
| EP2912179A4 (fr) | 2012-10-26 | 2016-10-12 | Geron Corp | Oligonucléotides antisens c-myc et ses procédés d'utilisation pour le traitement de troubles de la prolifération cellulaire |
| EP2914621B1 (fr) | 2012-11-05 | 2023-06-07 | Foundation Medicine, Inc. | Nouvelles molécules de fusion de ntrk1 et leurs utilisations |
| ES2921623T3 (es) | 2012-11-26 | 2022-08-30 | Modernatx Inc | ARN modificado terminalmente |
| BR112015013311A2 (pt) | 2012-12-07 | 2017-11-14 | Haplomics Inc | indução de tolerancia e reparação de mutação do fator 8 |
| WO2014113089A2 (fr) | 2013-01-17 | 2014-07-24 | Moderna Therapeutics, Inc. | Polynucléotides capteurs de signal servant à modifier les phénotypes cellulaires |
| CA2898326C (fr) | 2013-01-18 | 2022-05-17 | Foundation Medicine, Inc. | Methodes de traitement du cholangiocarcinome |
| DK2951191T3 (en) | 2013-01-31 | 2019-01-14 | Ionis Pharmaceuticals Inc | PROCEDURE FOR MANUFACTURING OLIGOMERIC COMPOUNDS USING MODIFIED CLUTCH PROTOCOLS |
| US9593333B2 (en) | 2013-02-14 | 2017-03-14 | Ionis Pharmaceuticals, Inc. | Modulation of apolipoprotein C-III (ApoCIII) expression in lipoprotein lipase deficient (LPLD) populations |
| US20150366890A1 (en) | 2013-02-25 | 2015-12-24 | Trustees Of Boston University | Compositions and methods for treating fungal infections |
| US10398661B2 (en) | 2013-02-28 | 2019-09-03 | The Board Of Regents Of The University Of Texas System | Methods for classifying a cancer as susceptible to TMEPAI-directed therapies and treating such cancers |
| WO2014159813A1 (fr) | 2013-03-13 | 2014-10-02 | Moderna Therapeutics, Inc. | Molécules polynucléotidiques à longue durée de vie |
| WO2014152513A1 (fr) | 2013-03-14 | 2014-09-25 | Shire Human Genetic Therapies, Inc. | Acides ribonucléiques ayant des nucléotides 4'-thio-modifiés et procédés associés |
| US10258698B2 (en) | 2013-03-14 | 2019-04-16 | Modernatx, Inc. | Formulation and delivery of modified nucleoside, nucleotide, and nucleic acid compositions |
| HUE034987T2 (en) | 2013-03-14 | 2018-05-02 | Alnylam Pharmaceuticals Inc | C5 complementary component IRNS preparations and methods for their use |
| EP3578663A1 (fr) | 2013-03-15 | 2019-12-11 | ModernaTX, Inc. | Procédés de production de transcription d'arn |
| WO2014152030A1 (fr) | 2013-03-15 | 2014-09-25 | Moderna Therapeutics, Inc. | Elimination de fragments d'adn dans des procédés de production d'arnm |
| WO2014144767A1 (fr) | 2013-03-15 | 2014-09-18 | Moderna Therapeutics, Inc. | Purification d'arnm par échange d'ions |
| US11377470B2 (en) | 2013-03-15 | 2022-07-05 | Modernatx, Inc. | Ribonucleic acid purification |
| US8980864B2 (en) | 2013-03-15 | 2015-03-17 | Moderna Therapeutics, Inc. | Compositions and methods of altering cholesterol levels |
| EP2981617B1 (fr) | 2013-04-04 | 2023-07-05 | President and Fellows of Harvard College | Utilisations thérapeutiques de l'édition de génome au moyen de systèmes crispr/cas |
| WO2014172698A1 (fr) | 2013-04-19 | 2014-10-23 | Isis Pharmaceuticals, Inc. | Compositions et procédés de modulation d'acides nucléiques par une dégradation médiée des éléments non-sens |
| EA031393B1 (ru) | 2013-05-01 | 2018-12-28 | Ионис Фармасьютикалз, Инк. | Композиции и способы модулирования экспрессии hbv и ttr |
| BR112015029276B1 (pt) | 2013-05-22 | 2022-07-12 | Alnylam Pharmaceuticals, Inc | Agente de irna fita dupla capaz de inibir a expressão de tmprss6, composição farmacêutica e uso dos mesmos |
| PT2999785T (pt) | 2013-05-22 | 2018-07-09 | Alnylam Pharmaceuticals Inc | Composições de irna de serpina1 e métodos de uso das mesmas |
| EP3004396B1 (fr) | 2013-06-06 | 2019-10-16 | The General Hospital Corporation | Compositions pour le traitement du cancer |
| US20160129089A1 (en) | 2013-06-13 | 2016-05-12 | Antisense Therapeutics Ltd | Combination therapy |
| EP3656386A1 (fr) | 2013-06-21 | 2020-05-27 | Ionis Pharmaceuticals, Inc. | Composés et méthodes de modulation de l'expression de l'alipoprotéine c-iii pour améliorer le profil diabétique |
| WO2015002971A2 (fr) | 2013-07-02 | 2015-01-08 | Isis Pharmaceuticals, Inc. | Modulateurs du récepteur de l'hormone de croissance |
| HRP20211563T1 (hr) | 2013-07-11 | 2022-01-07 | Modernatx, Inc. | Pripravci koji sadrže sintetske polinukleotide koji kodiraju proteine srodne crispr-u i sintetske sgrna, te postupci njihove uporabe |
| JP6697384B2 (ja) | 2013-07-25 | 2020-05-20 | イグジキュア, インコーポレーテッドExicure, Inc. | 予防的および治療的使用のための免疫刺激剤としての球状の核酸ベース構築物 |
| AU2014306271A1 (en) | 2013-08-08 | 2016-03-24 | The Scripps Research Institute | A method for the site-specific enzymatic labelling of nucleic acids in vitro by incorporation of unnatural nucleotides |
| TW201536329A (zh) | 2013-08-09 | 2015-10-01 | Isis Pharmaceuticals Inc | 用於調節失養性肌強直蛋白質激酶(dmpk)表現之化合物及方法 |
| NZ716816A (en) | 2013-08-28 | 2022-05-27 | Ionis Pharmaceuticals Inc | Modulation of prekallikrein (pkk) expression |
| EP3041938A1 (fr) | 2013-09-03 | 2016-07-13 | Moderna Therapeutics, Inc. | Polynucléotides circulaires |
| CA2923029A1 (fr) | 2013-09-03 | 2015-03-12 | Moderna Therapeutics, Inc. | Polynucleotides chimeriques |
| EP3043827B1 (fr) | 2013-09-13 | 2019-07-03 | Ionis Pharmaceuticals, Inc. | Modulateurs du facteur b du complément |
| EP3052626A1 (fr) | 2013-10-02 | 2016-08-10 | Alnylam Pharmaceuticals, Inc. | Compositions et méthodes d'inhibition de l'expression du gène lect2 |
| WO2015051169A2 (fr) * | 2013-10-02 | 2015-04-09 | Moderna Therapeutics, Inc. | Molécules de polynucléotides et leurs utilisations |
| AU2014329452B2 (en) | 2013-10-03 | 2019-06-20 | Moderna Therapeutics, Inc. | Polynucleotides encoding low density lipoprotein receptor |
| UA124961C2 (uk) | 2013-10-04 | 2021-12-22 | Елнілем Фармасьютикалз, Інк. | ДВОНИТКОВА РИБОНУКЛЕЇНОВА КИСЛОТА (dsRNA) ДЛЯ ІНГІБУВАННЯ ЕКСПРЕСІЇ ALAS1 |
| WO2015054451A1 (fr) | 2013-10-09 | 2015-04-16 | The United States Of America As Represented By The Secretary Department Of Health And Human Services | Détection du virus de l'hépatite delta (vhd) pour le diagnostic et le traitement du syndrome de sjögren et du lymphome |
| US11162096B2 (en) | 2013-10-14 | 2021-11-02 | Ionis Pharmaceuticals, Inc | Methods for modulating expression of C9ORF72 antisense transcript |
| WO2015061091A1 (fr) | 2013-10-21 | 2015-04-30 | The General Hospital Corporation | Méthodes se rapportant aux amas de cellules tumorales circulantes et au traitement du cancer |
| WO2015061246A1 (fr) | 2013-10-21 | 2015-04-30 | Isis Pharmaceuticals, Inc. | Procédé pour la détritylation en phase solution de composés oligomères |
| US10301622B2 (en) | 2013-11-04 | 2019-05-28 | Northwestern University | Quantification and spatio-temporal tracking of a target using a spherical nucleic acid (SNA) |
| CA2932122C (fr) | 2013-12-03 | 2022-04-19 | Northwestern University | Particules liposomales, leurs procedes de fabrication et leurs utilisations |
| WO2015085183A2 (fr) | 2013-12-06 | 2015-06-11 | Swift Biosciences, Inc. | Polynucléotides concurrents clivables |
| CA2844640A1 (fr) | 2013-12-06 | 2015-06-06 | The University Of British Columbia | Procede de traitement du cancer de la prostate resistant a la castration |
| IL282401B (en) | 2013-12-12 | 2022-08-01 | Alnylam Pharmaceuticals Inc | Complementary component irna compositions and methods for using them |
| US10900083B2 (en) | 2013-12-20 | 2021-01-26 | The General Hospital Corporation | Methods and assays relating to circulating tumor cells |
| KR102198082B1 (ko) | 2013-12-24 | 2021-01-05 | 아이오니스 파마수티컬즈, 인코포레이티드 | 안지오포이에틴-유사 3 발현의 조절 |
| CA2937539A1 (fr) | 2014-02-04 | 2015-08-13 | Genentech, Inc. | Mutant smoothened et methodes d'utilisation de celui-ci |
| EP3960860A3 (fr) | 2014-02-11 | 2022-06-08 | Alnylam Pharmaceuticals, Inc. | Compositions d'arni de cétohexokinase (khk) et leurs procédés d'utilisation |
| WO2015142910A1 (fr) | 2014-03-17 | 2015-09-24 | Isis Pharmaceuticals, Inc. | Nucléosides carbocycliques bicycliques et composés oligomères préparés à partir de ceux-ci |
| US10006027B2 (en) | 2014-03-19 | 2018-06-26 | Ionis Pharmaceuticals, Inc. | Methods for modulating Ataxin 2 expression |
| AU2015231130C1 (en) | 2014-03-19 | 2021-12-23 | Ionis Pharmaceuticals, Inc. | Compositions for modulating Ataxin 2 expression |
| AU2015240761B2 (en) | 2014-04-01 | 2019-09-12 | Biogen Ma Inc. | Compositions for modulating SOD-1 expression |
| TWI638047B (zh) | 2014-04-09 | 2018-10-11 | 史基普研究協會 | 藉由核酸三磷酸酯轉運子將非天然或經修飾的核苷三磷酸酯輸入至細胞中 |
| EP4162940A1 (fr) | 2014-04-17 | 2023-04-12 | Biogen MA Inc. | Compositions et procédés de modulation de l'épissage du smn2 chez un sujet |
| US10221416B2 (en) | 2014-04-24 | 2019-03-05 | Ionis Pharmaceuticals, Inc. | Oligomeric compounds comprising alpha-beta-constrained nucleic acid |
| CA2946003A1 (fr) | 2014-05-01 | 2015-11-05 | Ionis Pharmaceuticals, Inc. | Compositions et methodes de modulation de l'expression de l'angiopoietine de type 3 |
| ES2812099T3 (es) | 2014-05-01 | 2021-03-16 | Ionis Pharmaceuticals Inc | Composiciones y métodos para modular la expresión del receptor de la hormona del crecimiento |
| EP3811977A1 (fr) | 2014-05-01 | 2021-04-28 | Ionis Pharmaceuticals, Inc. | Procédé de synthèse de grappes de conjugués réactifs |
| BR112016022593B1 (pt) | 2014-05-01 | 2022-04-26 | Ionis Pharmaceuticals, Inc | Compostos oligoméricos, composições que os compreendem, e usos dos mesmos |
| RU2703411C2 (ru) | 2014-05-01 | 2019-10-16 | Ионис Фармасьютикалз, Инк. | Композиции и способы модулирования экспрессии пкп |
| TW201607559A (zh) | 2014-05-12 | 2016-03-01 | 阿尼拉製藥公司 | 治療ｓｅｒｐｉｎｃ１相關疾患之方法和組成物 |
| AU2015264038B2 (en) | 2014-05-22 | 2021-02-11 | Alnylam Pharmaceuticals, Inc. | Angiotensinogen (AGT) iRNA compositions and methods of use thereof |
| WO2015187541A1 (fr) | 2014-06-02 | 2015-12-10 | Children's Medical Center Corporation | Procédés et compositions pour une immunomodulation |
| AU2015269412B2 (en) | 2014-06-04 | 2020-03-12 | Exicure Operating Company | Multivalent delivery of immune modulators by liposomal spherical nucleic acids for prophylactic or therapeutic applications |
| HRP20220379T1 (hr) | 2014-06-10 | 2022-05-27 | Erasmus University Medical Center Rotterdam | Antisense oligonukleotidi korisni u liječenju pompeove bolesti |
| WO2015196128A2 (fr) | 2014-06-19 | 2015-12-23 | Moderna Therapeutics, Inc. | Molécules d'acide nucléique alternatives et leurs utilisations |
| EP3169335B8 (fr) | 2014-07-16 | 2019-10-09 | ModernaTX, Inc. | Polynucléotides circulaires |
| CA2955250A1 (fr) | 2014-07-16 | 2016-01-21 | Moderna Therapeutics, Inc. | Polynucleotides chimeriques |
| US9951327B1 (en) | 2014-07-17 | 2018-04-24 | Integrated Dna Technologies, Inc. | Efficient and rapid method for assembling and cloning double-stranded DNA fragments |
| WO2016014846A1 (fr) | 2014-07-23 | 2016-01-28 | Moderna Therapeutics, Inc. | Polynucléotides modifiés destinés à la production d'anticorps intracellulaires |
| BR112017001860A2 (pt) | 2014-07-31 | 2018-02-27 | Uab Research Foundation | peptídeo sintético, composição farmacêutica, métodos, regime de dosagem, e, anticorpo monoclonal |
| CN106794256B (zh) | 2014-08-19 | 2021-04-30 | 西北大学 | 蛋白质/寡核苷酸核-壳纳米颗粒治疗剂 |
| WO2016033424A1 (fr) | 2014-08-29 | 2016-03-03 | Genzyme Corporation | Méthodes de prévention et de traitement d'évènements indésirables cardiovasculaires majeurs à l'aide de composés modulant l'apolipoprotéine b |
| US10385343B2 (en) | 2014-08-29 | 2019-08-20 | Children's Medical Center Corporation | Methods and compositions for the treatment of cancer |
| CN113599539A (zh) | 2014-08-29 | 2021-11-05 | 阿尔尼拉姆医药品有限公司 | 治疗甲状腺素运载蛋白（ttr）介导的淀粉样变性的方法 |
| WO2016040589A1 (fr) | 2014-09-12 | 2016-03-17 | Alnylam Pharmaceuticals, Inc. | Agents polynucléotidiques ciblant le composant du complément c5 et leurs méthodes d'utilisation |
| AU2015318782A1 (en) | 2014-09-18 | 2017-04-06 | The University Of British Columbia | Allele-specific therapy for Huntington Disease haplotypes |
| JOP20200115A1 (ar) | 2014-10-10 | 2017-06-16 | Alnylam Pharmaceuticals Inc | تركيبات وطرق لتثبيط التعبير الجيني عن hao1 (حمض أوكسيداز هيدروكسيلي 1 (أوكسيداز جليكولات)) |
| WO2016061487A1 (fr) | 2014-10-17 | 2016-04-21 | Alnylam Pharmaceuticals, Inc. | Agents polynucléotidiques de ciblage d'acide aminolévulinique synthase-1 (alas1) et utilisations de ceux-ci |
| EP3904519A1 (fr) | 2014-10-30 | 2021-11-03 | Genzyme Corporation | Agents polynucléotidiques ciblant serpinc 1 (at3) et leurs méthodes d'utilisation |
| EP3218486A1 (fr) | 2014-11-10 | 2017-09-20 | Glaxosmithkline Intellectual Property (No. 2) Limited | Compositions combinées à action prolongée et méthodes pour lutter contre l'hépatite c |
| JOP20200092A1 (ar) | 2014-11-10 | 2017-06-16 | Alnylam Pharmaceuticals Inc | تركيبات iRNA لفيروس الكبد B (HBV) وطرق لاستخدامها |
| PE20170921A1 (es) | 2014-11-10 | 2017-07-12 | Glaxosmithkline Intellectual Property (No 2) Ltd | Composiciones farmaceuticas de accion prolongada para la hepatitis c |
| AU2015350120B2 (en) | 2014-11-17 | 2021-05-27 | Alnylam Pharmaceuticals, Inc. | Apolipoprotein C3 (APOC3) iRNA compositions and methods of use thereof |
| WO2016081911A2 (fr) | 2014-11-21 | 2016-05-26 | Northwestern University | Absorption cellulaire spécifique à une séquence de conjugués nanoparticulaires d'acides nucléiques sphériques |
| US10400243B2 (en) | 2014-11-25 | 2019-09-03 | Ionis Pharmaceuticals, Inc. | Modulation of UBE3A-ATS expression |
| WO2016100716A1 (fr) | 2014-12-18 | 2016-06-23 | Vasant Jadhav | Composés reversirtm |
| US9688707B2 (en) | 2014-12-30 | 2017-06-27 | Ionis Pharmaceuticals, Inc. | Bicyclic morpholino compounds and oligomeric compounds prepared therefrom |
| US10793855B2 (en) | 2015-01-06 | 2020-10-06 | Ionis Pharmaceuticals, Inc. | Compositions for modulating expression of C9ORF72 antisense transcript |
| US10538763B2 (en) | 2015-01-16 | 2020-01-21 | Ionis Pharmaceuticals, Inc. | Compounds and methods for modulation of DUX4 |
| EP3247988A4 (fr) | 2015-01-23 | 2018-12-19 | Vanderbilt University | Interféromètre robuste et procédés de son utilisation |
| CA2976445A1 (fr) | 2015-02-13 | 2016-08-18 | Alnylam Pharmaceuticals, Inc. | Compositions d'arni du gene codant pour la proteine 3 contenant un domaine phospholipase de type patatine (pnpla3) et leurs procedes d'utilisation |
| US10450342B2 (en) | 2015-02-23 | 2019-10-22 | Ionis Pharmaceuticals, Inc. | Method for solution phase detritylation of oligomeric compounds |
| MX2017011010A (es) | 2015-02-26 | 2017-10-20 | Ionis Pharmaceuticals Inc | Moduladores de rodopsina p23h con especificidad de alelo. |
| US11129844B2 (en) | 2015-03-03 | 2021-09-28 | Ionis Pharmaceuticals, Inc. | Compositions and methods for modulating MECP2 expression |
| US20160348073A1 (en) | 2015-03-27 | 2016-12-01 | President And Fellows Of Harvard College | Modified t cells and methods of making and using the same |
| WO2016164746A1 (fr) | 2015-04-08 | 2016-10-13 | Alnylam Pharmaceuticals, Inc. | Compositions et méthodes d'inhibition de l'expression du gène lect2 |
| PL3283080T3 (pl) | 2015-04-16 | 2020-07-27 | Ionis Pharmaceuticals, Inc. | Kompozycja do modulowania ekspresji c9orf72 |
| WO2016167780A1 (fr) | 2015-04-16 | 2016-10-20 | Ionis Pharmaceuticals, Inc. | Compositions destinées à moduler l'expression du transcrit antisens c9orf72 |
| WO2016201301A1 (fr) | 2015-06-12 | 2016-12-15 | Alnylam Pharmaceuticals, Inc. | Compositions d'arni de composant du complément c5 et leurs procédés d'utilisation |
| WO2016205323A1 (fr) | 2015-06-18 | 2016-12-22 | Alnylam Pharmaceuticals, Inc. | Agents polynucléotidiques ciblant l'hydroxyacide oxydase (glycolate oxydase, hao1) et procédés d'utilisation de ceux-ci |
| WO2016209862A1 (fr) | 2015-06-23 | 2016-12-29 | Alnylam Pharmaceuticals, Inc. | Compositions d'arndb contre un gène de glucokinase (gck) et leurs procédés d'utilisation |
| US10494632B2 (en) | 2015-07-10 | 2019-12-03 | Alnylam Pharmaceuticals, Inc. | Insulin-like growth factor binding protein, acid labile subunit (IGFALS) compositions and methods of use thereof |
| AU2016295168B2 (en) | 2015-07-17 | 2021-08-19 | Alnylam Pharmaceuticals, Inc. | Multi-targeted single entity conjugates |
| EP3332009A1 (fr) | 2015-08-04 | 2018-06-13 | Yeda Research and Development Co., Ltd. | Procédés de criblage pour riborégulateurs et atténuateurs |
| CN114525280A (zh) | 2015-09-02 | 2022-05-24 | 阿尔尼拉姆医药品有限公司 | 程序性细胞死亡1配体1（PD-L1）的iRNA组合物及其使用方法 |
| WO2017049286A1 (fr) | 2015-09-17 | 2017-03-23 | Moderna Therapeutics, Inc. | Polynucléotides contenant un lieur morpholino |
| US10533175B2 (en) | 2015-09-25 | 2020-01-14 | Ionis Pharmaceuticals, Inc. | Compositions and methods for modulating Ataxin 3 expression |
| KR20240033305A (ko) | 2015-10-08 | 2024-03-12 | 아이오니스 파마수티컬즈, 인코포레이티드 | 앤지오텐시노겐 발현 조정을 위한 화합물 및 방법 |
| KR102440160B1 (ko) | 2015-10-30 | 2022-09-02 | 제넨테크, 인크. | 항-HtrA1 항체 및 이의 사용 방법 |
| ES2938883T3 (es) | 2015-11-05 | 2023-04-17 | Los Angeles Childrens Hospital | Oligo antisentido para su uso en el tratamiento de la leucemia mieloide aguda |
| WO2017079739A1 (fr) | 2015-11-06 | 2017-05-11 | Ionis Pharmaceuticals, Inc. | Modulation de l'expression de l'apolipoprotéine (a) |
| US11058709B1 (en) | 2015-12-04 | 2021-07-13 | Ionis Pharmaceuticals, Inc. | Methods of treating breast cancer |
| AU2015416656B2 (en) | 2015-12-07 | 2023-02-23 | Erasmus University Medical Center Rotterdam | Enzymatic replacement therapy and antisense therapy for Pompe disease |
| US11761007B2 (en) | 2015-12-18 | 2023-09-19 | The Scripps Research Institute | Production of unnatural nucleotides using a CRISPR/Cas9 system |
| AU2017205462A1 (en) | 2016-01-05 | 2018-06-07 | Ionis Pharmaceuticals, Inc. | Methods for reducing LRRK2 expression |
| US10627396B2 (en) | 2016-01-29 | 2020-04-21 | Vanderbilt University | Free-solution response function interferometry |
| CN109071625A (zh) | 2016-02-04 | 2018-12-21 | 柯瑞斯公司 | 平滑化突变体和其使用方法 |
| CA3013799A1 (fr) | 2016-03-16 | 2017-09-21 | Ionis Pharmaceuticals, Inc. | Procedes pour moduler keap1 |
| US10577607B2 (en) | 2016-03-16 | 2020-03-03 | Ionis Pharmaceuticals, Inc. | Modulation of DYRK1B expression |
| MA45295A (fr) | 2016-04-19 | 2019-02-27 | Alnylam Pharmaceuticals Inc | Composition d'arni de protéine de liaison de lipoprotéines haute densité (hdlbp/vigiline) et procédés pour les utiliser |
| JP2019518028A (ja) | 2016-06-10 | 2019-06-27 | アルナイラム ファーマシューティカルズ， インコーポレイテッドＡｌｎｙｌａｍ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌｓ， Ｉｎｃ． | 補体成分Ｃ５ｉＲＮＡ組成物及び発作性夜間血色素尿症（ＰＮＨ）を処置するためのその使用方法 |
| US11236339B2 (en) | 2016-06-17 | 2022-02-01 | Ionis Pharmaceuticals, Inc. | Modulation of GYS1 expression |
| EP3475295B1 (fr) | 2016-06-24 | 2022-08-10 | The Scripps Research Institute | Nouveau transporteur de nucléoside triphosphate et ses utilisations |
| KR20230088522A (ko) | 2016-07-21 | 2023-06-19 | 맥스시티 인코포레이티드 | 게놈 dna를 변경하기 위한 방법 및 조성물 |
| NL2017294B1 (en) | 2016-08-05 | 2018-02-14 | Univ Erasmus Med Ct Rotterdam | Natural cryptic exon removal by pairs of antisense oligonucleotides. |
| NL2017295B1 (en) | 2016-08-05 | 2018-02-14 | Univ Erasmus Med Ct Rotterdam | Antisense oligomeric compound for Pompe disease |
| WO2018039629A2 (fr) | 2016-08-25 | 2018-03-01 | Northwestern University | Acides nucléiques sphériques micellaires obtenus à partir de matrices thermosensibles sans trace |
| WO2018055577A1 (fr) | 2016-09-23 | 2018-03-29 | Synthena Ag | Compositions d'oligonucléotides d'arn modifiés en 2', de tricyclo-adn mélangé et leurs utilisations |
| KR20190065341A (ko) | 2016-10-06 | 2019-06-11 | 아이오니스 파마수티컬즈, 인코포레이티드 | 올리고머 화합물들의 접합 방법 |
| JOP20190104A1 (ar) | 2016-11-10 | 2019-05-07 | Ionis Pharmaceuticals Inc | مركبات وطرق لتقليل التعبير عن atxn3 |
| TW202313978A (zh) | 2016-11-23 | 2023-04-01 | 美商阿尼拉製藥公司 | 絲胺酸蛋白酶抑制因子Ａ１ ｉＲＮＡ組成物及其使用方法 |
| EP3548620A4 (fr) | 2016-12-02 | 2020-07-22 | Cold Spring Harbor Laboratory | Modulation de l'expression de lnc05 |
| KR20230166146A (ko) | 2016-12-16 | 2023-12-06 | 알닐람 파마슈티칼스 인코포레이티드 | 트랜스티레틴(TTR) iRNA 조성물을 사용하여 TTR-관련 질병을 치료하거나 예방하는 방법 |
| BR112019014841A2 (pt) | 2017-01-23 | 2020-04-28 | Regeneron Pharma | rna guia, uso do rna guia, rna antissentido, sirna ou shrna, uso do rna antissentido, do sirna ou do shrna, ácido nucleico isolado, vetor, composição, célula, e, métodos para modificar um gene hsd17b13 em uma célula, para diminuir a expressão de um gene hsd17b13 em uma célula, para modificar uma célula e para tratar um indivíduo que não é portador da variante de hsd17b13 |
| WO2018165564A1 (fr) | 2017-03-09 | 2018-09-13 | Ionis Pharmaceuticals, Inc. | Composés oligomères modifiés par morpholino |
| WO2018183969A1 (fr) | 2017-03-30 | 2018-10-04 | California Institute Of Technology | Plate-forme de dosage rapide à code-barres pour l'analyse efficace de molécules candidates et procédés de préparation et d'utilisation de la plate-forme |
| KR20200015895A (ko) | 2017-04-18 | 2020-02-13 | 알닐람 파마슈티칼스 인코포레이티드 | B형 간염 바이러스 (hbv)에 감염된 대상체의 치료 방법 |
| WO2018193428A1 (fr) | 2017-04-20 | 2018-10-25 | Synthena Ag | Composés oligomères modifiés comprenant des nucléosides tricyclo-adn et utilisations correspondantes |
| JP2020517613A (ja) | 2017-04-20 | 2020-06-18 | シンセナ アーゲー | トリシクロｄｎａヌクレオシドを含む改変オリゴマー化合物およびその使用 |
| AU2018300069A1 (en) | 2017-07-11 | 2020-02-27 | Synthorx, Inc. | Incorporation of unnatural nucleotides and methods thereof |
| EP3652186A4 (fr) | 2017-07-13 | 2021-03-31 | Northwestern University | Procédé général et direct pour préparer des nanoparticules à structure organométallique fonctionnalisées par des oligonucléotides |
| WO2019014530A1 (fr) | 2017-07-13 | 2019-01-17 | Alnylam Pharmaceuticals Inc. | Compositions d'arni de lactate déshydrogénase a (ldha) et leurs procédés d'utilisation |
| TWI757528B (zh) | 2017-08-03 | 2022-03-11 | 美商欣爍克斯公司 | 用於增生及感染性疾病治療之細胞激素結合物 |
| US11197884B2 (en) | 2017-08-18 | 2021-12-14 | Ionis Pharmaceuticals, Inc. | Modulation of the notch signaling pathway for treatment of respiratory disorders |
| WO2019051173A1 (fr) | 2017-09-08 | 2019-03-14 | Ionis Pharmaceuticals, Inc. | Modulateurs de l'expression de smad7 |
| US11806360B2 (en) | 2017-09-19 | 2023-11-07 | Alnylam Pharmaceuticals, Inc. | Compositions and methods for treating transthyretin (TTR) mediated amyloidosis |
| WO2019089922A1 (fr) | 2017-11-01 | 2019-05-09 | Alnylam Pharmaceuticals, Inc. | Compositions d'arni de composant du complément c3 et leurs procédés d'utilisation |
| TWI809004B (zh) | 2017-11-09 | 2023-07-21 | 美商Ionis製藥公司 | 用於降低snca表現之化合物及方法 |
| US20200385719A1 (en) | 2017-11-16 | 2020-12-10 | Alnylam Pharmaceuticals, Inc. | Kisspeptin 1 (kiss1) irna compositions and methods of use thereof |
| WO2019100039A1 (fr) | 2017-11-20 | 2019-05-23 | Alnylam Pharmaceuticals, Inc. | Compositions d'arni de composant p amyloïde serique et leurs procédés d'utilisation |
| JP2021508491A (ja) | 2017-12-18 | 2021-03-11 | アルナイラム ファーマシューティカルズ， インコーポレイテッドＡｌｎｙｌａｍ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌｓ， Ｉｎｃ． | 高移動度グループボックス−１（ＨＭＧＢ１）ｉＲＮＡ組成物及びその使用方法 |
| WO2019126641A2 (fr) | 2017-12-21 | 2019-06-27 | Ionis Pharmaceuticals, Inc. | Modulation de l'expression de la frataxine |
| CN111902537A (zh) | 2018-01-15 | 2020-11-06 | Ionis制药公司 | Dnm2表达的调节剂 |
| US20190233816A1 (en) | 2018-01-26 | 2019-08-01 | Massachusetts Institute Of Technology | Structure-guided chemical modification of guide rna and its applications |
| KR20200127207A (ko) | 2018-02-26 | 2020-11-10 | 신톡스, 인크. | Il-15 접합체 및 이의 용도 |
| BR112020016001A2 (pt) | 2018-03-02 | 2020-12-15 | Ionis Pharmaceuticals, Inc. | Moduladores de expressão irf4 |
| WO2019169243A1 (fr) | 2018-03-02 | 2019-09-06 | Ionis Pharmaceuticals, Inc. | Composés et procédés pour la modulation de la protéine précurseur de l'amyloïde bêta |
| WO2019183440A1 (fr) | 2018-03-22 | 2019-09-26 | Ionis Pharmaceuticals, Inc. | Méthodes de modulation de l'expression de fmr1 |
| CA3096274A1 (fr) | 2018-04-06 | 2019-10-10 | Children's Medical Center Corporation | Compositions et procedes de reprogrammation de cellules somatiques et de modulation d'impression |
| CN112041440A (zh) | 2018-04-11 | 2020-12-04 | Ionis制药公司 | Ezh2表达的调节剂 |
| BR112020022546A8 (pt) | 2018-05-07 | 2022-05-17 | Alnylam Pharmaceuticals Inc | Entrega extra-hepática |
| SG11202010215TA (en) | 2018-05-09 | 2020-11-27 | Ionis Pharmaceuticals Inc | Compounds and methods for reducing atxn3 expression |
| CU20200082A7 (es) | 2018-05-09 | 2021-06-08 | Ionis Pharmaceuticals Inc | Compuestos y métodos para la reducción de la expresión de fxi |
| TW202016304A (zh) | 2018-05-14 | 2020-05-01 | 美商阿尼拉製藥公司 | 血管收縮素原（ＡＧＴ）ｉＲＮＡ組成物及其使用方法 |
| CA3103429A1 (fr) | 2018-06-14 | 2019-12-19 | Don W. Cleveland | Composes et procedes permettant d'augmenter l'expression de stmn2 |
| WO2020006267A1 (fr) | 2018-06-27 | 2020-01-02 | Ionis Pharmaceuticals, Inc. | Composés et procédés permettant de réduire l'expression de lrrk2 |
| AR115847A1 (es) | 2018-07-25 | 2021-03-03 | Ionis Pharmaceuticals Inc | Compuestos y métodos para reducir la expresión de la atxn2 |
| SG11202100715WA (en) | 2018-08-13 | 2021-02-25 | Alnylam Pharmaceuticals Inc | HEPATITIS B VIRUS (HBV) dsRNA AGENT COMPOSITIONS AND METHODS OF USE THEREOF |
| TW202020157A (zh) | 2018-08-16 | 2020-06-01 | 美商艾爾妮蘭製藥公司 | 用於抑制lect2基因表現之組合物及方法 |
| CA3112793A1 (fr) | 2018-09-14 | 2020-03-19 | Northwestern University | Programmation de la polymerisation de proteines avec de l'adn |
| JP2022500003A (ja) | 2018-09-18 | 2022-01-04 | アルナイラム ファーマシューティカルズ, インコーポレイテッドAlnylam Pharmaceuticals, Inc. | ケトヘキソキナーゼ（ＫＨＫ）ｉＲＮＡ組成物およびその使用方法 |
| WO2020069055A1 (fr) | 2018-09-28 | 2020-04-02 | Alnylam Pharmaceuticals, Inc. | Compositions d'arni de la transthyrétine (ttr) et leurs procédés d'utilisation pour traiter ou prévenir des maladies oculaires associées à la ttr |
| US10913951B2 (en) | 2018-10-31 | 2021-02-09 | University of Pittsburgh—of the Commonwealth System of Higher Education | Silencing of HNF4A-P2 isoforms with siRNA to improve hepatocyte function in liver failure |
| TW202028222A (zh) | 2018-11-14 | 2020-08-01 | 美商Ionis製藥公司 | Foxp3表現之調節劑 |
| AU2019380940A1 (en) | 2018-11-15 | 2021-06-03 | Ionis Pharmaceuticals, Inc. | Modulators of IRF5 expression |
| WO2020118259A1 (fr) | 2018-12-06 | 2020-06-11 | Northwestern University | Ingénierie de cristaux de protéines par l'intermédiaire d'interactions d'hybridation de l'adn |
| AU2019406186A1 (en) | 2018-12-20 | 2021-07-15 | Praxis Precision Medicines, Inc. | Compositions and methods for the treatment of KCNT1 related disorders |
| TW202039000A (zh) | 2018-12-20 | 2020-11-01 | 瑞士商休曼斯生物醫藥公司 | 組合ｈｂｖ療法 |
| CN113557023A (zh) | 2019-01-16 | 2021-10-26 | 建新公司 | Serpinc1 iRNA组合物及其使用方法 |
| KR20210122809A (ko) | 2019-01-31 | 2021-10-12 | 아이오니스 파마수티컬즈, 인코포레이티드 | Yap1 발현의 조절인자 |
| AU2020218203A1 (en) | 2019-02-06 | 2021-08-26 | Synthorx, Inc. | IL-2 conjugates and methods of use thereof |
| BR112021015323A2 (pt) | 2019-02-27 | 2021-10-05 | Ionis Pharmaceuticals, Inc. | Moduladores de expressão de malat1 |
| CA3135579A1 (fr) | 2019-03-29 | 2020-10-08 | Mitsubishi Tanabe Pharma Corporation | Compose, methode et composition pharmaceutique pour normalisation de l'expression du dux4 |
| WO2020205463A1 (fr) | 2019-03-29 | 2020-10-08 | Ionis Pharmaceuticals, Inc. | Composés et méthodes de modulation de ube3a-ats |
| CN114126628A (zh) | 2019-05-13 | 2022-03-01 | 维尔生物科技有限公司 | 用于治疗乙型肝炎病毒(hbv)感染的组合物及方法 |
| JP2022532652A (ja) | 2019-05-17 | 2022-07-15 | アルニラム ファーマスーティカルズ インコーポレイテッド | オリゴヌクレオチドの経口送達 |
| TW202113078A (zh) | 2019-06-14 | 2021-04-01 | 美商史基普研究協會 | 於半合成生物體中複製、轉錄及轉譯之試劑及方法 |
| EP3956450A4 (fr) | 2019-07-26 | 2022-11-16 | Ionis Pharmaceuticals, Inc. | Composés et procédés pour la modulation de gfap |
| EP4007812A1 (fr) | 2019-08-01 | 2022-06-08 | Alnylam Pharmaceuticals, Inc. | Compositions d'arni de la famille des serpines 2 (serpinf2) et leurs procedes d'utilisation |
| WO2021022108A2 (fr) | 2019-08-01 | 2021-02-04 | Alnylam Pharmaceuticals, Inc. | Compositions d'arni de carboxypeptidase b2 (cpb2) et leurs procédés d'utilisation |
| WO2021030522A1 (fr) | 2019-08-13 | 2021-02-18 | Alnylam Pharmaceuticals, Inc. | Compositions d'agent d'arni à sous-unité de protéine ribosomale 25 (rps25) et leurs procédés d'utilisation |
| CN114555128A (zh) | 2019-08-15 | 2022-05-27 | 新索思股份有限公司 | 采用il-2缀合物的免疫肿瘤学组合疗法 |
| EP4013767A4 (fr) | 2019-08-15 | 2023-10-25 | Ionis Pharmaceuticals, Inc. | Composés oligomères modifiés par liaison et leurs utilisations |
| MX2022002053A (es) | 2019-08-23 | 2022-03-17 | Synthorx Inc | Conjugados de il-15 y sus usos. |
| US20220290152A1 (en) | 2019-09-03 | 2022-09-15 | Alnylam Pharmaceuticals, Inc. | Compositions and methods for inhibiting expression of the lect2 gene |
| KR20220061158A (ko) | 2019-09-10 | 2022-05-12 | 신톡스, 인크. | 자가면역질환을 치료하기 위한 il-2 접합체 및 사용 방법 |
| US20220389429A1 (en) | 2019-10-04 | 2022-12-08 | Alnylam Pharmaceuticals, Inc. | Compositions and methods for silencing ugt1a1 gene expression |
| EP4045652A1 (fr) | 2019-10-18 | 2022-08-24 | Alnylam Pharmaceuticals, Inc. | Compositions d'arni de membre de la famille des transporteurs de solutés et leurs procédés d'utilisation |
| TW202134435A (zh) | 2019-10-22 | 2021-09-16 | 美商阿尼拉製藥公司 | 補體成分ｃ３ ｉｒｎａ組成物及其使用方法 |
| TW202132567A (zh) | 2019-11-01 | 2021-09-01 | 美商阿尼拉製藥公司 | 亨汀頓蛋白（ＨＴＴ）ｉＲＮＡ劑組成物及其使用方法 |
| EP4051796A1 (fr) | 2019-11-01 | 2022-09-07 | Alnylam Pharmaceuticals, Inc. | Compositions et méthodes pour rendre silencieuse l'expression du gène de fusion dnajb1-prkaca |
| TW202131952A (zh) | 2019-11-04 | 2021-09-01 | 美商欣爍克斯公司 | 介白素10接合物及其用途 |
| WO2021092145A1 (fr) | 2019-11-06 | 2021-05-14 | Alnylam Pharmaceuticals, Inc. | Composition d'arni de la transthyrétine (ttr) et ses procédés d'utilisation pour le traitement ou la prévention de maladies oculaires associées à ttr |
| JP2023500681A (ja) | 2019-11-06 | 2023-01-10 | アルニラム ファーマスーティカルズ インコーポレイテッド | 肝臓外送達 |
| EP4061945A1 (fr) | 2019-11-22 | 2022-09-28 | Alnylam Pharmaceuticals, Inc. | Compositions d'agent arni d'ataxine 3 (atxn3) et leurs procédés d'utilisation |
| KR20220115995A (ko) | 2019-12-13 | 2022-08-19 | 알닐람 파마슈티칼스 인코포레이티드 | 인간 염색체 ９ 개방 판독 프레임 72 (C9orf72) iRNA 제제 조성물 및 이의 사용 방법 |
| WO2021126734A1 (fr) | 2019-12-16 | 2021-06-24 | Alnylam Pharmaceuticals, Inc. | Compositions d'arni du gène codant pour la protéine 3 contenant un domaine phospholipase de type patatine (pnpla3) et leurs méthodes d'utilisation |
| US20230057461A1 (en) | 2020-01-27 | 2023-02-23 | The U.S.A., As Represented By The Secretary, Department Of Health And Human Services | Rab13 and net1 antisense oligonucleotides to treat metastatic cancer |
| WO2021154941A1 (fr) | 2020-01-31 | 2021-08-05 | Alnylam Pharmaceuticals, Inc. | Compositions d'arni du composant c5 du complément destinées à être utilisées dans le traitement de la sclérose latérale amyotrophique (sla) |
| IL295445A (en) | 2020-02-10 | 2022-10-01 | Alnylam Pharmaceuticals Inc | Preparations and methods for silencing vegf-a expression |
| MX2022010052A (es) | 2020-02-18 | 2022-09-05 | Alnylam Pharmaceuticals Inc | Composiciones de acido ribonucleico de interferencia (arni) contra la apolipoproteina c3 (apoc3) y metodos para su uso. |
| CR20220485A (es) | 2020-02-28 | 2022-11-10 | Ionis Pharmaceuticals Inc | Compuestos y métodos para modular smn2 |
| EP4114947A1 (fr) | 2020-03-05 | 2023-01-11 | Alnylam Pharmaceuticals, Inc. | Compositions d'arni de composant c3 du complément et leurs procédés d'utilisation pour le traitement ou la prévention de maladies associées au composant c3 du complément |
| WO2021178736A1 (fr) | 2020-03-06 | 2021-09-10 | Alnylam Pharmaceuticals, Inc. | Compositions d'arni de cétohexokinase (khk) et leurs procédés d'utilisation |
| EP4121534A1 (fr) | 2020-03-18 | 2023-01-25 | Alnylam Pharmaceuticals, Inc. | Compositions et méthodes pour traiter des sujets ayant un variant de gène d'alanine-glyoxylate aminotransférase hétérozygote (agxt) |
| WO2021195307A1 (fr) | 2020-03-26 | 2021-09-30 | Alnylam Pharmaceuticals, Inc. | Compositions d'arni de coronavirus et leurs procédés d'utilisation |
| EP4127171A2 (fr) | 2020-03-30 | 2023-02-08 | Alnylam Pharmaceuticals, Inc. | Compositions et procédés de silençage de l'expression du gène dnajc15 |
| CA3179411A1 (fr) | 2020-04-06 | 2021-10-14 | Alnylam Pharmaceuticals, Inc. | Compositions et methodes pour le silencage de l'expression de myoc |
| WO2021206922A1 (fr) | 2020-04-07 | 2021-10-14 | Alnylam Pharmaceuticals, Inc. | Compositions d'arni de la serine protease 2 transmembranaire (tmprss2) et leurs procédés d'utilisation |
| WO2021206917A1 (fr) | 2020-04-07 | 2021-10-14 | Alnylam Pharmaceuticals, Inc. | Compositions arni d'enzyme de conversion de l'angiotensine 2 (eca2) et procédés d'utilisation associés |
| CN116134135A (zh) | 2020-04-07 | 2023-05-16 | 阿尔尼拉姆医药品有限公司 | 用于沉默scn9a表达的组合物和方法 |
| CA3181400A1 (fr) | 2020-04-27 | 2021-11-04 | Alnylam Pharmaceuticals, Inc. | Compositions d'agent d'arni de l'apolipoproteine e (apoe) et leurs procedes d'utilisation |
| WO2021222549A1 (fr) | 2020-04-30 | 2021-11-04 | Alnylam Pharmaceuticals, Inc. | Compositions d'arni du facteur b du complément (cfb) et leurs procédés d'utilisation |
| TW202206596A (zh) | 2020-05-01 | 2022-02-16 | 美商Ionis製藥公司 | 調節ａｔｘｎ１之化合物及方法 |
| CN115667513A (zh) | 2020-05-12 | 2023-01-31 | 田边三菱制药株式会社 | 用于调节Ataxin 3表达的化合物、方法和药物组合物 |
| WO2021231692A1 (fr) | 2020-05-15 | 2021-11-18 | Korro Bio, Inc. | Procédés et compositions pour l'édition médiée par adar d'otoferline (otof) |
| EP4150078A1 (fr) | 2020-05-15 | 2023-03-22 | Korro Bio, Inc. | Procédés et compositions pour l'édition médiée par adar d'argininosuccinate lyase (asl) |
| WO2021231680A1 (fr) | 2020-05-15 | 2021-11-18 | Korro Bio, Inc. | Procédés et compositions pour l'édition médiée par adar de la protéine 2 de liaison méthyl-cpg (mecp2) |
| EP4150089A1 (fr) | 2020-05-15 | 2023-03-22 | Korro Bio, Inc. | Procédés et compositions pour l'édition médiée par adar de rétinoschisine 1 (rs1) |
| EP4150077A1 (fr) | 2020-05-15 | 2023-03-22 | Korro Bio, Inc. | Procédés et compositions pour l'édition médiée par adar de la protéine 1 de type canal transmembranaire (tmc1) |
| EP4150087A1 (fr) | 2020-05-15 | 2023-03-22 | Korro Bio, Inc. | Procédés et compositions pour l'édition médiée par adar de la protéine bêta 2 de jonction lacunaire (gjb2) |
| WO2021231673A1 (fr) | 2020-05-15 | 2021-11-18 | Korro Bio, Inc. | Procédés et compositions pour l'édition médiée par adar de la kinase 2 à répétition riche en leucine (lrrk2) |
| WO2021231675A1 (fr) | 2020-05-15 | 2021-11-18 | Korro Bio, Inc. | Procédés et compositions pour l'édition médiée par adar d'argininosuccinate synthétase (ass1) |
| EP4153746A1 (fr) | 2020-05-21 | 2023-03-29 | Alnylam Pharmaceuticals, Inc. | Compositions et procédés d'inhibition de l'expression du gène marc1 |
| AR122534A1 (es) | 2020-06-03 | 2022-09-21 | Triplet Therapeutics Inc | Métodos para el tratamiento de los trastornos de expansión por repetición de nucleótidos asociados con la actividad de msh3 |
| EP4161552A1 (fr) | 2020-06-05 | 2023-04-12 | The Broad Institute, Inc. | Compositions et méthodes de traitement de la néoplasie |
| WO2021252557A1 (fr) | 2020-06-09 | 2021-12-16 | Alnylam Pharmaceuticals, Inc. | Compositions d'arni et leurs procédés d'utilisation pour une administration par inhalation |
| BR112022024420A2 (pt) | 2020-06-18 | 2023-01-17 | Alnylam Pharmaceuticals Inc | Composições de irna de xantina desidrogenase (xdh) e métodos de uso das mesmas |
| AU2021296848A1 (en) | 2020-06-24 | 2023-02-09 | Humabs Biomed Sa | Engineered hepatitis B virus neutralizing antibodies and uses thereof |
| IL299074A (en) | 2020-06-25 | 2023-02-01 | Synthorx Inc | Immuno-oncology therapeutic combination with IL-2 and anti-AGFR antibody conjugates |
| BR112022024206A2 (pt) | 2020-06-29 | 2023-01-03 | Ionis Pharmaceuticals Inc | Compostos e métodos para modular plp1 |
| WO2022011214A1 (fr) | 2020-07-10 | 2022-01-13 | Alnylam Pharmaceuticals, Inc. | Parni circulaires |
| WO2022066847A1 (fr) | 2020-09-24 | 2022-03-31 | Alnylam Pharmaceuticals, Inc. | Compositions d'arni de dipeptidyle peptidase 4 (dpp4) et leurs procédés d'utilisation |
| EP3978608A1 (fr) | 2020-10-05 | 2022-04-06 | SQY Therapeutics | Composé oligomère de sauvetage de dystrophine chez des patients atteints de dmd durant des sauts d'exon-51 |
| EP4225917A1 (fr) | 2020-10-05 | 2023-08-16 | Alnylam Pharmaceuticals, Inc. | Compositions d'arni de récepteur 75 couplé à une protéine g (gpr75) et leurs procédés d'utilisation |
| KR20230084204A (ko) | 2020-10-09 | 2023-06-12 | 신톡스, 인크. | Il-2 콘쥬게이트를 사용한 면역 종양학 치료법 |
| CA3194859A1 (fr) | 2020-10-09 | 2022-04-14 | Carolina E. CAFFARO | Polytherapie immuno-oncologique avec des conjugues d'il-2 et du pembrolizumab |
| AU2021365822A1 (en) | 2020-10-21 | 2023-06-08 | Alnylam Pharmaceuticals, Inc. | Methods and compositions for treating primary hyperoxaluria |
| WO2022087329A1 (fr) | 2020-10-23 | 2022-04-28 | Alnylam Pharmaceuticals, Inc. | Compositions d'arni de la mucine 5b (muc5b) et leurs méthodes d'utilisation |
| IL302709A (en) | 2020-11-13 | 2023-07-01 | Alnylam Pharmaceuticals Inc | Coagulation factor iRNA compositions (F5) and methods of using them |
| US11447521B2 (en) | 2020-11-18 | 2022-09-20 | Ionis Pharmaceuticals, Inc. | Compounds and methods for modulating angiotensinogen expression |
| EP4256053A1 (fr) | 2020-12-01 | 2023-10-11 | Alnylam Pharmaceuticals, Inc. | Méthodes et compositions pour l'inhibition de l'expression du gène de l'hao1 (hydroxyacide oxydase 1 (glycolate oxydase)) |
| WO2022125490A1 (fr) | 2020-12-08 | 2022-06-16 | Alnylam Pharmaceuticals, Inc. | Compositions d'arni du facteur de coagulation x (f10) et leurs méthodes d'utilisation |
| WO2022140702A1 (fr) | 2020-12-23 | 2022-06-30 | Flagship Pioneering, Inc. | Compositions de molécules effectrices à base d'arnt (trem) modifiées et leurs utilisations |
| WO2022147223A2 (fr) | 2020-12-31 | 2022-07-07 | Alnylam Pharmaceuticals, Inc. | Promédicaments oligonucléotidiques à base de nucléosides modifiés en 2' |
| EP4271696A2 (fr) | 2020-12-31 | 2023-11-08 | Alnylam Pharmaceuticals, Inc. | Promédicaments oligonucléotidiques à base de phosphate modifiés par un disulfure cyclique |
| EP4274896A1 (fr) | 2021-01-05 | 2023-11-15 | Alnylam Pharmaceuticals, Inc. | Compositions d'arni du composant du complément 9 (c9) et leurs méthodes d'utilisation |
| JP2024508714A (ja) | 2021-02-12 | 2024-02-28 | アルナイラム ファーマシューティカルズ， インコーポレイテッド | スーパーオキシドジスムターゼ１－（ＳＯＤ１－）関連神経変性疾患を治療または予防するためのスーパーオキシドジスムターゼ１（ＳＯＤ１）ｉＲＮＡ組成物およびその使用方法 |
| WO2022174101A1 (fr) | 2021-02-12 | 2022-08-18 | Synthorx, Inc. | Polythérapie contre le cancer de la peau à l'aide de conjugués il-2 et de cemiplimab |
| TW202302148A (zh) | 2021-02-12 | 2023-01-16 | 美商欣爍克斯公司 | 使用ｉｌ－２接合物和抗ｐｄ－１抗體或其抗原結合片段的肺癌組合療法 |
| JP2024509783A (ja) | 2021-02-25 | 2024-03-05 | アルナイラム ファーマシューティカルズ， インコーポレイテッド | プリオンタンパク質（ｐｒｎｐ）ｉｒｎａ組成物およびその使用方法 |
| KR20230150844A (ko) | 2021-02-26 | 2023-10-31 | 알닐람 파마슈티칼스 인코포레이티드 | 케토헥소키나아제(KHK) iRNA 조성물 및 이의 사용 방법 |
| CA3212128A1 (fr) | 2021-03-04 | 2022-09-09 | Alnylam Pharmaceuticals, Inc. | Compositions a base d'arni de type angiopoietine 3 (angptl3) et leurs procedes d'utilisation |
| EP4304640A1 (fr) | 2021-03-12 | 2024-01-17 | Northwestern University | Vaccins antiviraux utilisant des acides nucléiques sphériques |
| WO2022192519A1 (fr) | 2021-03-12 | 2022-09-15 | Alnylam Pharmaceuticals, Inc. | Compositions d'arni de la glycogène synthase kinase 3 alpha (gsk3a) et leurs procédés d'utilisation |
| WO2022212231A2 (fr) | 2021-03-29 | 2022-10-06 | Alnylam Pharmaceuticals, Inc. | Compositions d'agents d'arni de la huntingtine (htt) et leurs procédés d'utilisation |
| IL307298A (en) | 2021-03-31 | 2023-11-01 | Entrada Therapeutics Inc | Cell-penetrating circular peptides |
| WO2022212153A1 (fr) | 2021-04-01 | 2022-10-06 | Alnylam Pharmaceuticals, Inc. | Compositions d'arni de proline déshydrogénase 2 (prodh2) et procédés d'utilisation associés |
| IL307926A (en) | 2021-04-26 | 2023-12-01 | Alnylam Pharmaceuticals Inc | Transmembrane assemblies, serine 6 ((TMPRSS6 IRNA) and methods of using them |
| EP4330396A1 (fr) | 2021-04-29 | 2024-03-06 | Alnylam Pharmaceuticals, Inc. | Transducteur de signal et activateur de compositions d'arni du facteur de transcription 6 (stat6) et procédés d'utilisation correspondants |
| WO2022235537A1 (fr) | 2021-05-03 | 2022-11-10 | Alnylam Pharmaceuticals, Inc. | Compositions et méthodes de traitement de l'amylose à transthyrétine (ttr) |
| CA3217463A1 (fr) | 2021-05-10 | 2022-11-17 | Ziqing QIAN | Compositions et procedes de modulation de l'epissage d'arnm |
| WO2022240721A1 (fr) | 2021-05-10 | 2022-11-17 | Entrada Therapeutics, Inc. | Compositions et méthodes de modulation de l'activité du facteur 5 de régulation de l'interféron (irf-5) |
| IL308353A (en) | 2021-05-10 | 2024-01-01 | Entrada Therapeutics Inc | Compositions and methods for modulating tissue distribution of intracellular therapies |
| WO2022245583A1 (fr) | 2021-05-18 | 2022-11-24 | Alnylam Pharmaceuticals, Inc. | Compositions d'arni de cotransporteur-2 de sodium-glucose (sglt2) et leurs procédés d'utilisation |
| EP4341405A1 (fr) | 2021-05-20 | 2024-03-27 | Korro Bio, Inc. | Procédés et compositions pour l'édition médiée par adar |
| WO2022256283A2 (fr) | 2021-06-01 | 2022-12-08 | Korro Bio, Inc. | Méthodes de restauration de la fonction protéique par adar |
| EP4347823A1 (fr) | 2021-06-02 | 2024-04-10 | Alnylam Pharmaceuticals, Inc. | Compositions d'arni du gène codant pour la protéine 3 contenant un domaine phospholipase de type patatine (pnpla3) et procédés d'utilisation associés |
| TW202313679A (zh) | 2021-06-03 | 2023-04-01 | 美商欣爍克斯公司 | 包含il-2接合物及pd-1拮抗劑之頭頸癌組合療法 |
| CN117561334A (zh) | 2021-06-04 | 2024-02-13 | 阿尔尼拉姆医药品有限公司 | 人染色体9开放阅读框72（C9ORF72）iRNA药剂组合物和其使用方法 |
| WO2022260939A2 (fr) | 2021-06-08 | 2022-12-15 | Alnylam Pharmaceuticals, Inc. | Compositions et méthodes de traitement ou de prévention de la maladie de stargardt et/ou de troubles associés à la protéine 4 de liaison du rétinol (rbp4) |
| CN117500815A (zh) | 2021-06-18 | 2024-02-02 | Ionis制药公司 | 用于降低ifnar1表达的化合物和方法 |
| AU2022298774A1 (en) | 2021-06-23 | 2023-12-14 | Entrada Therapeutics, Inc. | Antisense compounds and methods for targeting cug repeats |
| US20230194709A9 (en) | 2021-06-29 | 2023-06-22 | Seagate Technology Llc | Range information detection using coherent pulse sets with selected waveform characteristics |
| WO2023278410A1 (fr) | 2021-06-29 | 2023-01-05 | Korro Bio, Inc. | Procédés et compositions pour édition médiée par adar |
| WO2023283403A2 (fr) | 2021-07-09 | 2023-01-12 | Alnylam Pharmaceuticals, Inc. | Composés bis-arni pour administration au snc |
| WO2023003805A1 (fr) | 2021-07-19 | 2023-01-26 | Alnylam Pharmaceuticals, Inc. | Méthodes et compositions pour traiter des sujets ayant ou ayant un risque de développer une maladie ou un trouble d'hyperoxalurie non primaire |
| AU2022314619A1 (en) | 2021-07-21 | 2024-01-04 | Alnylam Pharmaceuticals, Inc. | Metabolic disorder-associated target gene irna compositions and methods of use thereof |
| WO2023003995A1 (fr) | 2021-07-23 | 2023-01-26 | Alnylam Pharmaceuticals, Inc. | Compositions d'arni de bêta-caténine (ctnnb1) et leurs méthodes d'utilisation |
| WO2023009687A1 (fr) | 2021-07-29 | 2023-02-02 | Alnylam Pharmaceuticals, Inc. | Compositions d'arni de 3-hydroxy-3-méthylglutaryle-coa réductase (hmgcr) et leurs procédés d'utilisation |
| WO2023014677A1 (fr) | 2021-08-03 | 2023-02-09 | Alnylam Pharmaceuticals, Inc. | Compositions d'arni de la transthyrétine (ttr) et leurs procédés d'utilisation |
| KR20240042016A (ko) | 2021-08-04 | 2024-04-01 | 알닐람 파마슈티칼스 인코포레이티드 | 안지오텐시노겐(AGT)을 침묵화하기 위한 iRNA 조성물 및 방법 |
| IL310407A (en) | 2021-08-13 | 2024-03-01 | Alnylam Pharmaceuticals Inc | Factor XII (F12) IRNA compositions and methods of using them |
| CA3229661A1 (fr) | 2021-09-01 | 2023-03-09 | Xiang Li | Composes et procedes pour sauter l'exon 44 dans la dystrophie musculaire de duchenne |
| WO2023044370A2 (fr) | 2021-09-17 | 2023-03-23 | Alnylam Pharmaceuticals, Inc. | Compositions d'arni et procédés de silençage de composant du complément 3 (c3) |
| CA3232420A1 (fr) | 2021-09-20 | 2023-03-23 | Alnylam Pharmaceuticals, Inc. | Compositions modulatrices de la sous-unite beta e de l'inhibine (inhbe) et leurs procedes d'utilisation |
| WO2023064530A1 (fr) | 2021-10-15 | 2023-04-20 | Alnylam Pharmaceuticals, Inc. | Compositions d'arni à administration extra-hépatique et leurs procédés d'utilisation |
| CA3234835A1 (fr) | 2021-10-22 | 2023-04-27 | Korro Bio, Inc. | Procedes et compositions pour perturber l'interaction de la proteine nrf2-keap1 par l'edition d'arn a mediation adar |
| TW202334418A (zh) | 2021-10-29 | 2023-09-01 | 美商艾拉倫製藥股份有限公司 | 杭丁頓（ＨＴＴ）ｉＲＮＡ劑組成物及其使用方法 |
| CA3234636A1 (fr) | 2021-10-29 | 2023-05-04 | Alnylam Pharmaceuticals, Inc. | Compositions d'arni du facteur b du complement (cfb) et leurs procedes d'utilisation |
| WO2023092060A1 (fr) | 2021-11-18 | 2023-05-25 | Cornell University | Commutateurs d'arnm dépendant de microarn pour des thérapies à base d'arnm spécifiques de tissu |
| WO2023122573A1 (fr) | 2021-12-20 | 2023-06-29 | Synthorx, Inc. | Polythérapie contre le cancer de la tête et du cou comprenant un conjugué d'il-2 et du pembrolizumab |
| WO2023122750A1 (fr) | 2021-12-23 | 2023-06-29 | Synthorx, Inc. | Polythérapie contre le cancer avec des conjugués d'il-2 et du cétuximab |
| WO2023141314A2 (fr) | 2022-01-24 | 2023-07-27 | Alnylam Pharmaceuticals, Inc. | Compositions d'agent d'arni d'enzyme de voie de biosynthèse de sulfate d'héparine et leurs méthodes d'utilisation |
| WO2023220744A2 (fr) | 2022-05-13 | 2023-11-16 | Alnylam Pharmaceuticals, Inc. | Oligonucléotides à boucle simple brin |
| WO2024006999A2 (fr) | 2022-06-30 | 2024-01-04 | Alnylam Pharmaceuticals, Inc. | Promédicaments oligonucléotidiques à base de phosphate modifié au disulfure cyclique |
| WO2024039776A2 (fr) | 2022-08-18 | 2024-02-22 | Alnylam Pharmaceuticals, Inc. | Compositions d'arnsi universelles ne ciblant pas et procédés d'utilisation associés |
| WO2024059165A1 (fr) | 2022-09-15 | 2024-03-21 | Alnylam Pharmaceuticals, Inc. | Compositions d'arni de 17b-hydroxystéroïde déshydrogénase de type 13 (hsd17b13) et leurs procédés d'utilisation |
| WO2024073732A1 (fr) | 2022-09-30 | 2024-04-04 | Alnylam Pharmaceuticals, Inc. | Agents arn double brin modifiés |
Family Cites Families (6)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| JP2547714B2 (ja) * | 1981-10-23 | 1996-10-23 | モルキユラ− バイオシステムズ インコ−ポレテツド | オリゴヌクレオチド治療剤及びその製法 |
| FR2540122B1 (fr) * | 1983-01-27 | 1985-11-29 | Centre Nat Rech Scient | Nouveaux composes comportant une sequence d'oligonucleotide liee a un agent d'intercalation, leur procede de synthese et leur application |
| FR2568254B1 (fr) * | 1984-07-25 | 1988-04-29 | Centre Nat Rech Scient | Application d'oligonucleotides lies a un agent intercalant, notamment a titre de medicament |
| US4968602A (en) * | 1986-03-05 | 1990-11-06 | Molecular Diagnostics, Inc. | Solution-phase single hybridization assay for detecting polynucleotide sequences |
| ATE87932T1 (de) * | 1986-12-02 | 1993-04-15 | Centre Nat Rech Scient | Alpha-oligonukleotide. |
| FR2636633A1 (fr) * | 1988-09-20 | 1990-03-23 | Centre Nat Rech Scient | Procede de synthese d'oligoribonucleotides alpha et composes utiles dans le procede |
-
1992
- 1992-09-17 FR FR9211103A patent/FR2687679B1/fr not_active Expired - Fee Related
-
1993
- 1993-02-04 WO PCT/FR1993/000115 patent/WO1993016095A1/fr active IP Right Grant
- 1993-02-04 EP EP93904155A patent/EP0625986B1/fr not_active Expired - Lifetime
- 1993-02-04 US US08/284,484 patent/US5639873A/en not_active Expired - Lifetime
- 1993-02-04 CA CA002129364A patent/CA2129364A1/fr not_active Abandoned
- 1993-02-04 JP JP5513826A patent/JPH07506345A/ja active Pending
- 1993-02-04 DE DE69307495T patent/DE69307495T2/de not_active Expired - Fee Related
- 1993-02-04 AT AT93904155T patent/ATE147752T1/de not_active IP Right Cessation
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| WO1993016095A1 (fr) | 1993-08-19 |
| FR2687679A1 (fr) | 1993-08-27 |
| FR2687679B1 (fr) | 1994-10-28 |
| JPH07506345A (ja) | 1995-07-13 |
| EP0625986B1 (fr) | 1997-01-15 |
| US5639873A (en) | 1997-06-17 |
| ATE147752T1 (de) | 1997-02-15 |
| DE69307495T2 (de) | 1997-07-24 |
| EP0625986A1 (fr) | 1994-11-30 |
| DE69307495D1 (en) | 1997-02-27 |
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| CA2129364A1 (fr) | Oligothionucleotides | |
| US8063198B2 (en) | Processes and reagents for desilylation of oligonucleotides | |
| JP3256236B2 (ja) | チオール誘導化ヌクレオシドおよびオリゴヌクレオシド | |
| US6995259B1 (en) | Method for the chemical synthesis of oligonucleotides | |
| EP0698034B1 (fr) | Oligonucleotides phosphorothioates triesters et procede de preparation | |
| CA2131311C (fr) | Oligonucleotides unis par des liens covalents | |
| KR20180028516A (ko) | 올리고뉴클레오티드 조성물 및 이의 방법 | |
| JPH08508490A (ja) | 新規５’−置換ヌクレオシド及びそれから得られるオリゴマー | |
| JPH10279592A (ja) | ヌクレオチド試薬 | |
| WO2001002423A9 (fr) | Oligomeres fonctionnalises et a base de guanidine | |
| JP2002536453A (ja) | 混合主鎖オリゴマー化合物の合成のための化合物、方法及び中間体 | |
| JPH05504563A (ja) | リン含有キラルインターサブユニットリンケージを有する非電荷モルホリノ―基体ポリマー | |
| AU5333900A (en) | Ligand-conjugated oligomeric compounds | |
| EP0290583B1 (fr) | OLIGONUCLEOTIDES $g(a) | |
| FR2607507A1 (fr) | Nouveaux derives a-d-oligonucleotides, leur preparation et leur emploi | |
| Gao et al. | Stabilization of double-stranded oligonucleotides using backbone-linked disulfide bridges | |
| Almer et al. | Solid support synthesis of all-Rp-oligo (ribonucleoside phosphorothioate) s | |
| Adinolfi et al. | Solid phase synthesis of oligonucleotides tethered to oligo-glucose phosphate tails | |
| US5746997A (en) | Radiohalogenation of oligonucleotides via trialkylstannylaryl conjugates | |
| WO1990003381A1 (fr) | Procede de synthese d'oligoribonucleotides alpha et composes utiles dans le procede | |
| CA2119927A1 (fr) | Conjugues de polynucleotides formant duplex | |
| WO1996039414A1 (fr) | Groupes nouveaux de protection des bases pendant la synthese d'oligonucleotides | |
| Ferrer et al. | Synthesis of oligodeoxynucleotides containing 5-aminouracil and itsN-acetyl derivative | |
| Noe et al. | Chemistry of antisense oligonucleotides | |
| FR2663636A1 (fr) | Procede de fonctionnalisation d'un oligonucleotide. |
Legal Events
| Date | Code | Title | Description |
|---|---|---|---|
| FZDE | Discontinued |