CA2074135C - Procede d'immobilisation d'un fragment d'acide nucleique par fixation passive sur un support solide, support solide ainsi obtenu et son utilisation - Google Patents
Procede d'immobilisation d'un fragment d'acide nucleique par fixation passive sur un support solide, support solide ainsi obtenu et son utilisation Download PDFInfo
- Publication number
- CA2074135C CA2074135C CA002074135A CA2074135A CA2074135C CA 2074135 C CA2074135 C CA 2074135C CA 002074135 A CA002074135 A CA 002074135A CA 2074135 A CA2074135 A CA 2074135A CA 2074135 C CA2074135 C CA 2074135C
- Authority
- CA
- Canada
- Prior art keywords
- ligand
- group
- fact
- groups
- substituted
- Prior art date
- Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
- Expired - Fee Related
Links
Classifications
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07H—SUGARS; DERIVATIVES THEREOF; NUCLEOSIDES; NUCLEOTIDES; NUCLEIC ACIDS
- C07H21/00—Compounds containing two or more mononucleotide units having separate phosphate or polyphosphate groups linked by saccharide radicals of nucleoside groups, e.g. nucleic acids
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
- C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
- C12Q1/68—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving nucleic acids
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
- C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
- C12Q1/68—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving nucleic acids
- C12Q1/6813—Hybridisation assays
- C12Q1/6834—Enzymatic or biochemical coupling of nucleic acids to a solid phase
-
- Y—GENERAL TAGGING OF NEW TECHNOLOGICAL DEVELOPMENTS; GENERAL TAGGING OF CROSS-SECTIONAL TECHNOLOGIES SPANNING OVER SEVERAL SECTIONS OF THE IPC; TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC CROSS-REFERENCE ART COLLECTIONS [XRACs] AND DIGESTS
- Y10—TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC
- Y10T—TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER US CLASSIFICATION
- Y10T436/00—Chemistry: analytical and immunological testing
- Y10T436/14—Heterocyclic carbon compound [i.e., O, S, N, Se, Te, as only ring hetero atom]
- Y10T436/142222—Hetero-O [e.g., ascorbic acid, etc.]
- Y10T436/143333—Saccharide [e.g., DNA, etc.]
Abstract
Procédé d'immobilisation par fixation passive, sur un support solide, d'un fragment d'acide nucléique comportant moins de 100 nucléotides, dans lequel on dépose sur ledit support ledit fragment sous la forme d'un dérivé résultant du couplage covalent dudit fragment avec un ligand ayant une masse moléculaire inférieure à 5000 et comprenant au moins un groupement fonctionnel polaire, ledit dérivé n'étant pas susceptible de réagir sur ledit support avec formation d'une liaison covalente dans les conditions dudit dépôt, étant entendu que lorsque ledit ligand est un nucléotide ou oligonucléotide, il comprend au moins un nucléotide modifié de façon à introduire ledit groupement fonctionnel polaire, et support solide ainsi obtenu. Ce support peut être utilisé notamment comme sonde de capture pour la détection d'une cible nucléotidique.
Description
_ -1-La présente invention a pour objet un procédé
d'immobilisation d'un fragment d'acide nucléique sur un support solide, le support solide ainsi obtenu et son utilisation notamment dans les méthodes de détection de séquences cibles comportant une séquence complémentaire de la séquence immobilisée.
On sait que l'une des propriétés des acides nucléiques est la possibilité d'interagir.avec une séquence complémentaire par l'intermédiaire de liaisons hydrogènes et de former un hybride selon les lois d'appariement connues, c'est-à-dire A-T, G-C pour l'ADN et A-U, G-C pour l'ARN.
Sur la base des propriétés des acides nucléiques, des techniques ont été développées permettant de mettre en évidence et de quantifier, dans un échantillon à analyser, un acide nucléique appelé cible. Ces techniques peuvent être divisées en deux grands groupes . les techniques dites de détection directe telles que celles développées par SOUTHERN. E. M. (J. Mol. Biol., 98, 503, (1975)) et la technique dite "Dot-blot" (MANIATIS et al., Molecular Cloning, Cold Spring Harbor, (1982)) pour la détection d'ADN, selon lesquelles l'ADN cible est déposé sur un film de nitrocellulose, de nylon ou un mélange de nitrocellulose et de nylon et on utilise pour la détection une séquence nucléique déterminée, appelée sonde de détection, marquée par tout marqueur connu tel que marqueur enzymatique, chimique ou radioactif. Ainsi, lorsqu'il y a complémentarité entre la séquence nucléique de la cible et la séquence nucléique de la sonde de détection, il se forme un hybride stable et après une étape de lavage pour éliminez la sonde de détection non appariée, on peut quantifier la cible dans l'échantillon. Une autre technique de détection directe est la technique dite "NORTHERN" identique dans la pratique à la technique dite "SOUTHERN" mais utilisée pour mettre en évidence et quantifier l'acide ribonucléique. Une modification à ces techniques sont les techniques dites indirectes telles que la technique sandwich ou "Reverse Dot". Selon cette technique, on utilise une première sonde nucléotidique, appelée sonde de capture, fixée sur un support solide qui sert à capter le gène ou .fragment de gène à détecter dans l'échantillon. La cible peut avoir été marquée au préalable (le plus souvent par un haptène ou par une modification chimique). Dans ce cas on effectuera une détection appropriée. Si la cible n'est pas marquée, on peut alors ajouter une deuxième sonde dite sonde de
d'immobilisation d'un fragment d'acide nucléique sur un support solide, le support solide ainsi obtenu et son utilisation notamment dans les méthodes de détection de séquences cibles comportant une séquence complémentaire de la séquence immobilisée.
On sait que l'une des propriétés des acides nucléiques est la possibilité d'interagir.avec une séquence complémentaire par l'intermédiaire de liaisons hydrogènes et de former un hybride selon les lois d'appariement connues, c'est-à-dire A-T, G-C pour l'ADN et A-U, G-C pour l'ARN.
Sur la base des propriétés des acides nucléiques, des techniques ont été développées permettant de mettre en évidence et de quantifier, dans un échantillon à analyser, un acide nucléique appelé cible. Ces techniques peuvent être divisées en deux grands groupes . les techniques dites de détection directe telles que celles développées par SOUTHERN. E. M. (J. Mol. Biol., 98, 503, (1975)) et la technique dite "Dot-blot" (MANIATIS et al., Molecular Cloning, Cold Spring Harbor, (1982)) pour la détection d'ADN, selon lesquelles l'ADN cible est déposé sur un film de nitrocellulose, de nylon ou un mélange de nitrocellulose et de nylon et on utilise pour la détection une séquence nucléique déterminée, appelée sonde de détection, marquée par tout marqueur connu tel que marqueur enzymatique, chimique ou radioactif. Ainsi, lorsqu'il y a complémentarité entre la séquence nucléique de la cible et la séquence nucléique de la sonde de détection, il se forme un hybride stable et après une étape de lavage pour éliminez la sonde de détection non appariée, on peut quantifier la cible dans l'échantillon. Une autre technique de détection directe est la technique dite "NORTHERN" identique dans la pratique à la technique dite "SOUTHERN" mais utilisée pour mettre en évidence et quantifier l'acide ribonucléique. Une modification à ces techniques sont les techniques dites indirectes telles que la technique sandwich ou "Reverse Dot". Selon cette technique, on utilise une première sonde nucléotidique, appelée sonde de capture, fixée sur un support solide qui sert à capter le gène ou .fragment de gène à détecter dans l'échantillon. La cible peut avoir été marquée au préalable (le plus souvent par un haptène ou par une modification chimique). Dans ce cas on effectuera une détection appropriée. Si la cible n'est pas marquée, on peut alors ajouter une deuxième sonde dite sonde de
-2-.,.,.
détection, complémentaire d'une autre région de la cible, qui permet la détection par l'intermédiaire d'un marqueur tel qu'un marqueur radioactif, enzymatique ou chimique (voir par exemple DUNN A.R. et HASSEL J.A, Cell, 12,23 (1977): RANKI M. et al., Gene, 21,77 (1983) ; PALVA A. et al., FEMS Microbiol. Lett. 23,83 (1984) : POLSKY-CYNKI
R. et al., Clin. Chem., 31,1438 (1985)).
Toutes ces techniques nécessitent l'immobilisation d'un fragment d'acide nucléique sur un support solide. La méthode la plus communément utilisée pour lier un fragment d'acide nucléique à un support est de l'attacher par diverses interactions non covalentes.
Les désavantages de cette méthode résident dans le fait qu'une partie de l'acide nucléique est immobilisée directement sur le support et que seule une petite partie du fragment d'acide nucléique reste disponible pour l'hybridation. Ces désavantages sont amplifiés lorsqu'on utilise des fragments d'acide nucléique relativement courts, par exemple inférieurs à 100 nucléotides. Ce problème se pose notamment lorsque l' on veut détecter des mutations génétiques et des polymorphismes. Pour cela, on utilise des sondes nucléiques de synthèse comprenant environ 15 à 20 nucléotides qui s'hybrideront aux cibles à détecter seulement s'il y a une complémentarité
parfaite. Dans la plupart des cas, le mésappariement d'une simple paire de base est suffisant pour empécher la formation d'un complexe sonde-cible stable, dans des conditions préalablement choisies.
Des solutions ont été proposées pour pallier ces inconvénients, parmi lesquelles celles notamment préconisées par SAIKI R.K. et al., Proc.Natl.Acad.Sci.USA, vol. 86, pp. 6230-6234, aoflt 1989, qui consiste à coupler â l'extrémité 3' d'un oligonucléotide ou sonde une queue poly(dT) de 400 bases et à
immobiliser l'oligonucléotide par l'intermédiaire de cette queue poly(dT) sur un filtre de nylon par exposition à des rayons ultraviolets, de façon à coupler par covalence les bases thymines aux amines primaires présentes dans le nylon.
Cependant, cette solution n'est pas entièrement satisfaisante parce qu'elle présente des problèmes de spécificité. En effet, les bases thymines de l'oligonucléotide peuvent également réagir, sous rayonnement U.V., avec le support, ce qui implique une diminution de l'efficacité d'hybridation. Ce problème est partiellement résolu, comme décrit dans la publication, par l'utilisation d'une queue très longue (400 bases) mais alors, la sonde, en masse , devient très
détection, complémentaire d'une autre région de la cible, qui permet la détection par l'intermédiaire d'un marqueur tel qu'un marqueur radioactif, enzymatique ou chimique (voir par exemple DUNN A.R. et HASSEL J.A, Cell, 12,23 (1977): RANKI M. et al., Gene, 21,77 (1983) ; PALVA A. et al., FEMS Microbiol. Lett. 23,83 (1984) : POLSKY-CYNKI
R. et al., Clin. Chem., 31,1438 (1985)).
Toutes ces techniques nécessitent l'immobilisation d'un fragment d'acide nucléique sur un support solide. La méthode la plus communément utilisée pour lier un fragment d'acide nucléique à un support est de l'attacher par diverses interactions non covalentes.
Les désavantages de cette méthode résident dans le fait qu'une partie de l'acide nucléique est immobilisée directement sur le support et que seule une petite partie du fragment d'acide nucléique reste disponible pour l'hybridation. Ces désavantages sont amplifiés lorsqu'on utilise des fragments d'acide nucléique relativement courts, par exemple inférieurs à 100 nucléotides. Ce problème se pose notamment lorsque l' on veut détecter des mutations génétiques et des polymorphismes. Pour cela, on utilise des sondes nucléiques de synthèse comprenant environ 15 à 20 nucléotides qui s'hybrideront aux cibles à détecter seulement s'il y a une complémentarité
parfaite. Dans la plupart des cas, le mésappariement d'une simple paire de base est suffisant pour empécher la formation d'un complexe sonde-cible stable, dans des conditions préalablement choisies.
Des solutions ont été proposées pour pallier ces inconvénients, parmi lesquelles celles notamment préconisées par SAIKI R.K. et al., Proc.Natl.Acad.Sci.USA, vol. 86, pp. 6230-6234, aoflt 1989, qui consiste à coupler â l'extrémité 3' d'un oligonucléotide ou sonde une queue poly(dT) de 400 bases et à
immobiliser l'oligonucléotide par l'intermédiaire de cette queue poly(dT) sur un filtre de nylon par exposition à des rayons ultraviolets, de façon à coupler par covalence les bases thymines aux amines primaires présentes dans le nylon.
Cependant, cette solution n'est pas entièrement satisfaisante parce qu'elle présente des problèmes de spécificité. En effet, les bases thymines de l'oligonucléotide peuvent également réagir, sous rayonnement U.V., avec le support, ce qui implique une diminution de l'efficacité d'hybridation. Ce problème est partiellement résolu, comme décrit dans la publication, par l'utilisation d'une queue très longue (400 bases) mais alors, la sonde, en masse , devient très
- 3-inférieure à la queue, ce qui diminue d'autant le taux de greffage en moles/g de papier. De plus, la fabrication d'une sonde avec une queue d'aussi grande taille pose des problèmes d'industrialisation.
Une autre solution préconisée est celle décrite dans la demande de brevet WO 88/01302 qui consiste à coupler à l'extrémité
terminale d'un oligonucléotide un ligand, tel qu'un aminoalkyle, et à attacher l'extrémité libre de ce ligand sur un support solide, tel que polystyrène ou analogues, par formation d'une liaison covalente.
Bien que cette méthode permette d'assurer une fixation stable de l'oligonucléotide, elle n'en demeure pas moins difficile à mettre en oeuvre techniquement car elle nécessite une étape d'activation du support pour créer à la surface de celui-ci une fonction réactive déterminée capable de former une liaison covalente avec la fonction réactive portée à l'extrémité du ligand.
On a maintenant trouvé un nouveau procédé qui pallie les inconvénients ci-dessus mentionnés, de mise en oeuvre simple et qui assure une excellente reproductibilité.
La présente invention a pour objet un procédé
d'it~anobilisation par fixation passive, sur un support solide, d'un fragment d'acide nucléique comportant moins de 100 nucléotides (notamment moins de 50 nucléotides et en particulier moins de 30 nucléotides), dans lequel on dépose sur ledit support ledit fragment sous la forme d'un dérivé résultant du couplage covalent dudit fragment avec un ligand ayant une masse moléculaire inférieure à
5000 et comprenant au moins un groupement fonctionnel polaire, ledit dérivé n'étant pas susceptible de réagir sur ledit support avec formation d'une liaison covalente dans les conditions dudit dépôt, étant entendu que lorsque ledit ligand est un nucléotide ou oligo-nucléotide, il comprend au moins un nucléotide modifié de façon à
introduire ledit groupement fonctionnel polaire.
On entend par "fixation de façon passive" une fixation due à
des forces autres que des forces de liaison covalence.
Dans des modes de réalisation particuliers, le procédé de l'invention peut encore présenter les caractéristiques suivantes, prises isolément ou, le cas échéant, en combinaison - ledit groupement fonctionnel est choisi parmi les groupements amine, hydrazino, hydrazono, imino, azido, triazeno, triazano, amide éventuellement substitué, semicarbazono, carbamoyle, cyano, carboxy,.';.hydroxy, alkylthio , arylthio , sulfamoyle, thiophosphate ._ 2074135
Une autre solution préconisée est celle décrite dans la demande de brevet WO 88/01302 qui consiste à coupler à l'extrémité
terminale d'un oligonucléotide un ligand, tel qu'un aminoalkyle, et à attacher l'extrémité libre de ce ligand sur un support solide, tel que polystyrène ou analogues, par formation d'une liaison covalente.
Bien que cette méthode permette d'assurer une fixation stable de l'oligonucléotide, elle n'en demeure pas moins difficile à mettre en oeuvre techniquement car elle nécessite une étape d'activation du support pour créer à la surface de celui-ci une fonction réactive déterminée capable de former une liaison covalente avec la fonction réactive portée à l'extrémité du ligand.
On a maintenant trouvé un nouveau procédé qui pallie les inconvénients ci-dessus mentionnés, de mise en oeuvre simple et qui assure une excellente reproductibilité.
La présente invention a pour objet un procédé
d'it~anobilisation par fixation passive, sur un support solide, d'un fragment d'acide nucléique comportant moins de 100 nucléotides (notamment moins de 50 nucléotides et en particulier moins de 30 nucléotides), dans lequel on dépose sur ledit support ledit fragment sous la forme d'un dérivé résultant du couplage covalent dudit fragment avec un ligand ayant une masse moléculaire inférieure à
5000 et comprenant au moins un groupement fonctionnel polaire, ledit dérivé n'étant pas susceptible de réagir sur ledit support avec formation d'une liaison covalente dans les conditions dudit dépôt, étant entendu que lorsque ledit ligand est un nucléotide ou oligo-nucléotide, il comprend au moins un nucléotide modifié de façon à
introduire ledit groupement fonctionnel polaire.
On entend par "fixation de façon passive" une fixation due à
des forces autres que des forces de liaison covalence.
Dans des modes de réalisation particuliers, le procédé de l'invention peut encore présenter les caractéristiques suivantes, prises isolément ou, le cas échéant, en combinaison - ledit groupement fonctionnel est choisi parmi les groupements amine, hydrazino, hydrazono, imino, azido, triazeno, triazano, amide éventuellement substitué, semicarbazono, carbamoyle, cyano, carboxy,.';.hydroxy, alkylthio , arylthio , sulfamoyle, thiophosphate ._ 2074135
4 - ledit groupement fonctionnel polaire est choisi parmi les groupements amine (primaire, secondaire ou tertiaire), hydroxy, alkylthio et arylthio - ledit groupement amine est choisi parmi les groupements amino,amino mono ou disubstitué(lé ou les substituants étant choisis parmi les groupements alkyle ou aryle éventuellement substitués), amidino, guanidino, triazinyle, indolyle et imidazolyle - ledit ligand comprend au moins un groupement hydrophobe ;
ledit groupement hydrophobe est choisi notamment parmi les groupements hydrocarbonés éventuellement insaturés ayant de 2 à 30 atomes de carbone : le ou les groupements hydrocarbonés peuvent être choisis notamment parmi les groupements alkyle, alkylène, alcényle et alcénylène, les groupements aryle et arylène et les groupements alkyle, alkylène, alcényle ou alcénylène éventuellement interrompus ou substitués par au moins un groupement arylène ou aryle ; le ou les groupements hydrophobes peuvent être substitués par ledit ou lesdits groupements fonctionnels polaires - le ligand est de préférence lié à un nucléotide terminal de la séquence immobilisée, en particulier à l'extrémité 3' et 5' de ladite séquence, ou encore lié à la base (thymine, cytosine, etc.") dudit nucléotide terminal ; le ligand peut également être lié à une base d'un nucléotide non terminal , ou au phosphore d'une liaison intranucléotidique - ledit ligand comprend un groupement choisi parmi - les groupements de formule (1) .
II II
3a n X X
dans laquelle n est zéro ou un nçmbre entier de 1 à 30, les groupements Z sont choisis parmi les groupements alkylène ou alcénylène ayant 2 à 30 atomes de carbone, Z' est un groupement alkyle ou alcényle ayant 2 à 30 atomes de carbone, X et X' représentent indépendamment -O M+, -S M+ ou un groupement alkyle, alcoxy, aryloxy, aminoalkyle ou aminoalcoxy, .,
ledit groupement hydrophobe est choisi notamment parmi les groupements hydrocarbonés éventuellement insaturés ayant de 2 à 30 atomes de carbone : le ou les groupements hydrocarbonés peuvent être choisis notamment parmi les groupements alkyle, alkylène, alcényle et alcénylène, les groupements aryle et arylène et les groupements alkyle, alkylène, alcényle ou alcénylène éventuellement interrompus ou substitués par au moins un groupement arylène ou aryle ; le ou les groupements hydrophobes peuvent être substitués par ledit ou lesdits groupements fonctionnels polaires - le ligand est de préférence lié à un nucléotide terminal de la séquence immobilisée, en particulier à l'extrémité 3' et 5' de ladite séquence, ou encore lié à la base (thymine, cytosine, etc.") dudit nucléotide terminal ; le ligand peut également être lié à une base d'un nucléotide non terminal , ou au phosphore d'une liaison intranucléotidique - ledit ligand comprend un groupement choisi parmi - les groupements de formule (1) .
II II
3a n X X
dans laquelle n est zéro ou un nçmbre entier de 1 à 30, les groupements Z sont choisis parmi les groupements alkylène ou alcénylène ayant 2 à 30 atomes de carbone, Z' est un groupement alkyle ou alcényle ayant 2 à 30 atomes de carbone, X et X' représentent indépendamment -O M+, -S M+ ou un groupement alkyle, alcoxy, aryloxy, aminoalkyle ou aminoalcoxy, .,
-5-M+ étant un Cation d1Cd11I1 ou NH4+, étant entendu que l'un au moins des groupements Z et/ou Z' est substitué par un groupement fonctionnel polaire ou par un groupement portant un groupement fonctionnel polaire.
- les groupements de formule (II) .
II
-NHC Z
lo ( II ) dans laquelle n, Z et Z' sont définis comme précédemment, - et les groupements de formule (III) .
-L ( III ) 15 dans laquelle L, est un reste peptidyle (dont la valence libre est liée par exemple â l' extrémité N-terminale ou C-terminale) , ledit reste peptidyle comprenant au moins un motif dérivé d'un acide aminé
comportant une chaine latérale substituée par un groupement fonctionnel polaire.
20 - ledit ligand répond à la formule (I) , n étant zéro ou un nombre entier de 1 à 10, Z est un alkylène ayant de 2 à 12 atomes de carbone, et Z' est un alkyle ayant de 2 à 12 atomes de carbone, l'un au moins des groupements Z et Z' étant substitué par au moins un groupement amine hydroxy ou hydrazino ; en particulier, n = O et X
représente O- M+' - ledit ligand répond à la formule (II) avec n = O, et z' représente un groupement alkyle ayant 3 à 12 atomes de carbone, substitué par au moins un groupement amine ; ledit groupement alkyle est en outre substitué par au moins un groupement hydroxy ;
- ledit ligand répond à la formule (II) avec n = 1, Z
représente un alkylène ayant au moins 2 atomes de carbone et Z' représente un groupement alkyle substitué par au moins un groupement amine - ledit ligand répond à la formule (III), et ledit acide aminé comportant une chaine latérale substituée est choisi parmi la lysine, l'arginine, l'ornithine, la glutamine, l'asparagine, la sérine, la thréonine, la tyrosine, l'histidine et le tryptophane.
Le composé de formule générale (III) est par exemple un
- les groupements de formule (II) .
II
-NHC Z
lo ( II ) dans laquelle n, Z et Z' sont définis comme précédemment, - et les groupements de formule (III) .
-L ( III ) 15 dans laquelle L, est un reste peptidyle (dont la valence libre est liée par exemple â l' extrémité N-terminale ou C-terminale) , ledit reste peptidyle comprenant au moins un motif dérivé d'un acide aminé
comportant une chaine latérale substituée par un groupement fonctionnel polaire.
20 - ledit ligand répond à la formule (I) , n étant zéro ou un nombre entier de 1 à 10, Z est un alkylène ayant de 2 à 12 atomes de carbone, et Z' est un alkyle ayant de 2 à 12 atomes de carbone, l'un au moins des groupements Z et Z' étant substitué par au moins un groupement amine hydroxy ou hydrazino ; en particulier, n = O et X
représente O- M+' - ledit ligand répond à la formule (II) avec n = O, et z' représente un groupement alkyle ayant 3 à 12 atomes de carbone, substitué par au moins un groupement amine ; ledit groupement alkyle est en outre substitué par au moins un groupement hydroxy ;
- ledit ligand répond à la formule (II) avec n = 1, Z
représente un alkylène ayant au moins 2 atomes de carbone et Z' représente un groupement alkyle substitué par au moins un groupement amine - ledit ligand répond à la formule (III), et ledit acide aminé comportant une chaine latérale substituée est choisi parmi la lysine, l'arginine, l'ornithine, la glutamine, l'asparagine, la sérine, la thréonine, la tyrosine, l'histidine et le tryptophane.
Le composé de formule générale (III) est par exemple un
- 6-peptide tel que représenté respectivement par les séquences - (KGS)m KGG,m étant un nombre entier pouvant varier de 1 à 15 - KIEPLGVAPTKAKRRWQREKR
Le terme "fragment d'acide nucléique~ tel qu'utilisé dans la présente invention, signifie un fragment d'ADN ou d'ARN naturel ou un oligonucléotide naturel ou de synthëse ou un fragment d'ADN ou d'ARN de synthèse non modifié ou comprenant une ou plusieurs bases modifiées telles que l'inosine, la méthyl-5-désoxycytidine, la diméthylamino-5-désoxyuridine, la désoxyuridine, la diamino-2,6 purine, la bromo-5-désoxyuridine ou toute autre base modifiée permettant l'hybridation, le fragment d'acide nucléique pouvant être simple brin ou double brin.
Le terme "support solide~ tel qu'utilisé ici inclut tous les matériaux sur lesquels peut étre immobilisé un fragment d'acide nucléique pour une utilisation dans des tests diagnostiques, en chromatographie d'affinité et dans des processus de séparation. Des matériaux naturels, de synthèse, modifiés ou non chimiquement peuvent être utilisés comme support solide , notamment les polysaccharides tels que les matériaux de cellulose, par exemple du papier, des dérivés de cellulose tels que l'acétate de cellulose et la nitrocellulose ; des polymères tels que polyChlorure de vinyle, polyéthylène, polystyrènes, polyacrylate ou copolymères tel que polymère de chlorure de vinyle et de propylène, polymère de chlorure de vinyle et acétate de vinyle : copolymères à base de styrènes des fibres naturelles telles que le coton et des fibres synthétiques telles que le nylon.
De préférence, le support solide utilisé dans la présente invention est un polymère de polystyrène, un copolymère butadiène-styrène ou un copolymère butadiène-styrène en mélange avec un ou plusieurs polymères ou copolymères choisis parmi le polystyrène, les copolymères styrène-acrylonitrile ou styrène-méthaCrylate de méthyle, les polypropylènes, les polycarbonate ou analogues.
Avantageusement, le support de la présente invention est un polystyrène ou un copolymère à base de styrène comprenant entre environ 10 et 90 % en poids de motifs de styrène.
Le support solide selon l'invention peut étre, sans limitation, sous la forme d'une plaque de microtitration, d'une feuille, d'un c8ne, d'un tube, d'un puits, de billes ou analogue.
Le terme ~agent de couplage~, tel qu'utilisé ici désigne une molécule contenant au moins deux ~extrémités~ ou groupements réactifs. L'agent de couplage peut être homobifonctionnel ou hétérobifonctionnel.
Les ligands utilisés dans la présente invention, et donnés ici à titre d'exemple, peuvent étre des composés disponibles dans le commerce ou des composés synthétisés selon des méthodes connues en soi.
L'invention a également pour objet un support sur lequel est immobilisé par fixation passive un fragment d'acide nucléique (tel que défini précédemmentj, ce support étant caractérisé par le fait qu'il peut être obtenu selon le procédé décrit ci-dessus. ün tel support peut être utilisé notamment dans diverses techniques telles que celles des tests de diagnostic et celles de la chromatographie d'affinité. L'invention concerne également l'utilisation d'un tel support dans un procédé de détection ou de purification, selon les techniques connues, d'une cible nucléotidique contenant une séquence complémentaire de celle du fragment d'acide nucléique immobilisé .
en particulier, ce fragment i~nobilisé peut être employé comme sonde de capture.
Les exemples suivants illustrent l'invention sans toutefois la limiter.
~~ple 1 : ligands phosphoramidites Les composés disponibles dans le commerce utilisés dans la présente invention sont listés dans le tableau 1 ci-après N° Formule Fournisseur ref /~
CF,-C-NH-{CH~j,~OP
\ N(isoPr)z pppli~ Biosystems 400808 ~(CH~2~CN
MMTr-NH-{CH~,Z-O-P ~ ' 6 N (isoPr)p _ Clontech Lab Inc 5206-1 _g_ O~(CHz)2-CN
MMTr-NH-(CHZ)a'O-W\
N (isoPr)~ GlenResearch 10-1903 _______________________________________________________________________________ _______________________ O-(CH2)2 CN
(Ph); C-S-(CHz); O-P /
N(isoPr)z Clontech Lab Inc 5211-1 ~ (CHz)Z CN
DMTr~O-(CH2)2 SO-(CHz)z'O-P \
9a N(isoPr)2 Clontech Lab Inc. 5210-1 Fmoc-NH-CHz-CH-CHyO-DMTr O-(CHZ)2-CN
OP /
10 N(isoPr)2 Clontech Lab Inc. 5203-3 _______________________________________________________________________________ _____________________ O
O
~NH-C-CF, DMT
N(isoPr)p GlenResearch 101039 .-, _g_ NH-(CH$)z NH-I I-(CHz)5 NH II-CF, DMT
O~(CH2)s CN
O-P /
N(isoPr)2 12 Cytolab 2599-Ol 1 5 ____ _________________________ CHi NH-Fmoc ________________________________________________________ 13 CPG-LCAAO-CHi CH-CHI-ODMTr Clontech Lab Inc 5221-1 DMTr - dimethoxytrityle MMTr ~ monomethoxytrityle Fmoc = fluorenyl-9-methoxycarbonyle CPG ~ billes de verre à porosité contr8lée LCAA g longue chaine alkyle amine (bras espaceur) D'autres ligands phosphoramidites préparés par la demanderesse sont respectivement synthétisés selon les protocoles décrits ci-dessous a) - Dans un ballon de 100 ml purgé à l'argon sont mélangés 2 g d'octanediol-1,8 (commercialisé par la société ALDRICH 0-330-3), 0,084 g de diméthyl-4 aminopyridine, 1,9 ml de triethylamine dans 20 ml de pyridine anhydre. Puis 3 g de chlorure de diméthoxy-4,4' triphenylméthyle dans 15 ml de pyridine sont additionnés en 30 min.
Après 1 heure de réaction sous agitation, la réaction est bloquée par 10 ml de méthanol. Après extraction par un mélange acétate d'éthyle, tampon phosphate de sodium 0,1 M à pH 7, la phase organique est séchée sur sulfate de sodium, puis purifiée sur colonne de silice par un mélange de CH2C12/méthanol/triethylamine selon les proportions suivantes : 98/1/1.
Les fractions contenant un produit dont le facteur de rétention (Rf) est égal à 0,47 sont mélangées et concentrées sous vide. 0,7 g de ce produit séché sont mis en solution dans 4 ml de CH3CN anhydre avec 4,7 ml de tétrazole à 0,5 M dans CH3CN. La solution est ajoutée goutte à goutte dans 0,5 g de cyanoethyl-2 N,N,N',N'-tétraisopropylphosphoro-diamidite (commercialisé par la société
ALDRICH sous la référence 30-599-5) dans 6 ml de CH3CN.
Après 30 minutes de réaction, la phase organique est centrifugée. Le surnageant est purifié par chromatographie sur couche mince sur colonne de silice en utilisant un mélange A composé
d'hexane/acétate d'éthyle/triéthylamine respectivement selon les proportions 60/35/5. Les solutions contenant le produit souhaité
sont regroupées et concentrées.
Le composé obtenu est le composé référencé 1 représenté par la formule générale IV ci-dessous dans laquelle DMTr représente le diméthoxytrityle.
O(CH~2CN
DMTr O (CHp), - O - P
\N(isoPr)z ( Iv ) Le déplacement chimique en RMN (résonance magnétique nucléaire) du 31P du composé 1 est de 148,40 ppm et son facteur de rétention (Rf) dans le mélange A est de 0,77. Les déplacements chimiques en RMN sont donnés par rapport à H3Pp4 à 85 %.
b) - 210 mg de benzyloxy-2-éthanol (commercialisé par la société ALDRICH sous la référence 25286-7) anhydre dans 10 ml de tétrazole à 0,25 M dans CH3CN sont additionnés goutte à goutte dans 3 ml de CH3CN contenant 600 mg de cyano-2 N,N,N',N'-tétraisopropyl phosphorodiamidite.
Après 1 heure de réaction sous agitation, centrifugation pour éliminer le précipité, la phase organique est concentrée et purifiée par chromatographie sur couche mince sur colonne de silice par un mélange B hexane/acétate d'éthyle/triethylamine respectivement selon les proportions 50/45/5.
Le composé obtenu est le composé référencé 2 représenté par la formule générale V ci-dessous.
2~74135 ~ o(~~z~
CHe-O(CH2)p0-P
N(isoPr)$
(v) Les caractéristiques du composé 2 sont les suivantes 31P (ppm) ~ 148,57, Rf = 0,85 dans le mélange B.Les déplacements chimiques en RMN sont donnés par rapport à H3P04 à 85%.
c) - On utilise un protocole identique à celui décrit pour la synthèse du composé 2 en utilisant comme produit de départ du phényl-6-hexanol-1 (commercialisé par la société ALDRICH sous la référence 33361-1).
Après 1 heure de réaction sous agitation, centrifugation pour éliminer le précipité, la phase organique est concentrée et purifiée par chromatographie sur couche mince sur colonne de silice en utilisant un mélange C composé d'hexane/acétate d'éthyle/triéthyl amine respectivement selon les proportions 70/25/5. .
Le composé obtenu est le composé référencé 3 représenté par la formule générale VI ci-dessous «C~x~
(CHxIe . O . P
N(isoPr)=
( VI ) Les caractéristiques du composé 3 sont les suivantes 31P (ppm) = 148,40, Rf ~ 0,70 dans le mélange C.
d) - On utilise un protocole de synthèse identique ~ celui décrit our le co p mposé 2 en utilisant comme produit de départ l'hexanol-1 (commercialisé par la société ALDRICH sous la référence H 1330-3). La réaction n'est pas suivie par chromatographie sur couche mince, mais par RMN du 31P . La réaction est stoppée après disparition du bisphosphoramidite de départ (S31P s 128,18 ppm). Le composé obtenu est le composé référencé 4 représenté par la formule générale VII ci-dessous et est utilisé brut après filtration sur Miliex (désignation commerciale) 0,45 Elm.
O(CH2)2CN
(CH3)-(CH2)3-O-P (VII) N (isoPr) 2 Le déplacement chimique en RMN du 31p est égal à 148,37 ppm.
a) On utilise un protocole de synthêse identique â celui décrit pour le composé 2 en utilisant comme produit de départ le diméthylamino-3 propanol-1 (commercialisé par la société ALDRICH sous la référence D14440.1). La réaction n'est pas suivie par chromatographie sur couche mince, mais par RMN du 31p. La réaction est stoppée après disparition du bisphosphoramidite de départ (831p - 128,18 ppm). Le composé obtenu peut être utilisé brut après filtration sur Millex (désignation commerciale) 0,45 ~.m.
f) On utilise un protocole de synthèse identique à celui décrit pour le composé 2 mais en utilisant comme produit de départ un N-méthyl aminoalcool tel que le (méthylamino)-2 éthanol (commercialisé par la société ALDRICH sous la référence 23966-6).
EXEMPLE 2: Synthêse d'un bras thiophosphate à l'extrémité
5' de l'oligonucléotide Une solution de 15,02 g d'hydroxy-3 proprionitrile (10 992-4 Aldrich) dans 40 ml de THF anhydre et 26 ml de N,N'-diisopropyl-éthylamine (Aldrich D 12580-6) est refroidie à -10°C, 10,10 g de dichloro(diisopropyl-amine)phosphine sont additionnés sous agitation en 30 min.
Après 20 min supplémentaires de réaction, le chlorhydrate 12a est filtré sous atmosphère inerte. Le filtrat dilué dans 1 litre d' acétate d' éthyle est extrait 3 fois avec 150 ml de Tampon phosphate pH 7,00 puis séché sur Na2S04. Après concentration sous vide, le produit est purifié sur silice en présence de triéthylamine.
Le composé obtenu est le composé référencé 9b représenté par la formule VIII ci-dessous:
O-(CH2)2-CN
(IsoPr) 2-N-P ~ (VIII) O (CH2)2-CN
r~.
..~
Exemple 3 . Ligands peptidiques Les peptides sont synthétisés sur une résine phényl-acétamidomethyl (PAM) polystyrène/divinylbenzène (Applied Biosystems, Inc. Foster City, CA) par la méthode en phase solide de Merrifield en utilisant un synthétiseur automatique Applied Biosysteme 430A. Les acides aminés sont couplés sous forme d'anhydride symétrique à l'exception de la glutamine et de l'asparagine qui réagissent sous forme d'esters d'hydroxybenzotriazole (HOBT). Les acides aminés utilisés proviennent de chez Novabiochem (Laüflerlfingen, Suisse) ou de chez BACHEM (Bubendorf Suisse).
La synthèse chimique des peptides a été réalisée en utilisant un protocole de double couplage avec la N-methyl-pyrrolidone (NMP) comme solvant. Les peptides ont été coupés de leurs résine ainsi que les protections latérales de manière simultanée à l'aide d'acide fluorhydrique (HF) dans un appareillage approprié (HF appareil de coupure de Type I, Peptide Institute, Osaka, Japon).
Pour 1 g de peptidylrésine, 10 ml de HF, 1 ml d'anisole et 1 ml de dimethylsulfure (DMS) sont utilisés et le mélange est agité durant 45 minutes à - 2°C. Le HF est alors évaporé
sous vide. Après des lavages intensifs à l'éther, le peptide est élué de la résine par l'acide acétique l0ô puis de l'acide acétique concentré. Après dilution par de l'eau le peptide est lyophilisé.
Les peptides sont purifiés par chromatographie liquide haute performance préparative sur une colonne VYDAC* de type i C18 (250 x 21 mm). (The Separation Group, Hesperia, CA, U.S.A). L'élution est réalisée par un gradient d'acétonitrile à un débit de 22 ml/min. Les fractions collectées sont * marques de commerce ., P
contrôlées par une élution en condition isocratique sur une colonne VYDAC* C18 analytique (250 x 4, 6 mm) à un débit de 1 ml/min. Les fractions qui présentent le même temps de rétention sont réunies et lyophilisées. La fraction majoritaire est ensuite analysée par CLHP analytique avec le système décrit précédemment. Le peptide qui est considéré
comme de pureté acceptable se traduit par un pic unique représentant 95$ minimum du chromatogramme. Les peptides purifiés sont alors analysés dans le but de contrôler leur composition en acides aminés. I1 sont tout d'abord hydrolysés dans de l'HCl 6N (Pierre) additionné de phénol (1°s final) à
110°C durand 24 h sous vide dans une station d'hydrolyse Picotag* (WATERS, Millipore Corporation, Milford USA).
L'analyse des acides aminés est ensuite effectuée à l'aide d'un analyseur d'acides amines BECHIKAN 6300*. La mesure de la masse moléculaire chimique (moyenne) des peptides est obtenue en utilisant la spectrométrie de masse L.S.I.M.S. en mode d'ion positif sur un instrument à double focalisation VG.ZAB.ZSEQ relié à un système d'acquisition DEC-VAX 2000*
(VG analytical Ltd, Manchester, Angleterre).
PeptideSquence Masse Masse Temps Thorique relle de rtention(*) G28K KGSKGSKGSKGSKGSKGSKGSKGSKGSKGG 2712,04 2712,27,68 mn K20A KIEPLGVAPTKAKRRVVOREKR 2561,3 2560,717,98 mn (*) conditions de CLHP (chromatographie liquide haute pression) sur une colonne VYDAC 218* TP 52 (25 cm x 2, 1 mm) selon les conditions suivantes:
* marques de commerce débit - 0,25 ml/min gradient de 0 -~ â 100 ~ B' en 30 min avec - Tampon A' - eau + 0,1~ TFA (acide trifluoroacétique) - Tampon B' - 80~ CH3CN, 0,1% TFA
Exemple 4: couplage d'un ligand phosphoramidite.
Le couplage d'un ligand phosphoramidite à un oligonucléotide est effectué selon le protocole général 10 suivant:
Un oligonucléotide est synthétisé sur un appareil automatique APPLIED* 381 A de la société APPLIED BIOSYSTEMS
en utilisant la chimie des phosphoramidites selon le protocole du constructeur. Le ligand phosphoramidite dissout dans de l'acétonitrile anhydre à une concentration de 0,2 M, est placé en position X du synthétiseur et l'addition du ligand se fait à l'extrémité 5' de l'oligonucléotide selon le protocole standard de la synthèse automatique lorsque la synthèse de l'oligonucléotide est achevée. Dans le cas où le ligand est porteur d'un groupement protecteur dimethoxytrityle, tel que pour les composés 1 et 9 à 12 décrits précédemment, il est nécessaire d'effectuer une étape supplémentaire de déprotection du groupement trityle par l'acide trichloroacétique en fin de synthèse. Après déprotection une nuit à 55°C dans NH40H 33$, précipitation dans de l'éthanol à -20°C, l'oligonucléotide est séché sous vide et repris dans 1 ml d'eau.
Pour les composés référencés 6 et 7, une étape supplémentaire de clivage du groupement monomethoxytrityle est effectuée selon le protocole du fabricant (CLONTECH) après déprotection.
* marque de commerce A
,_ 2074135 15a Pour les composés 11 et 12, le couplage est effectué
selon le protocole général décrit ci-dessus jusqu'à la déprotection, mais le ligand est greffé sur la base terminale de l'extrémité 5' de l'oligonucléotide. I1 faut noter par ailleurs que les ligands 1, 10, 11 et 12 peuvent s'additionner sur eux-mêmes par l'intermédiaire du groupement hydroxyle libéré par detritylation.
Dans le cas du composé portant la référence 13, la synthèse automatique démarre par la silice greffée par le ligand sur le protocole standard. Le couplage ligand et oligonucléotide s'effectue par l'extrémité 3' de ce dernier.
Il est dans les connaissances de l'homme de l'art de fabriquer le support silice avec les ligands convenablement protégés pour la synthèse automatique ou pouvant être déprotégés comme expliqué précédemment.
Dans tous les cas, les oligonucléotides modifiés à leurs extrémités 5' ou 3' sont purifiés par chromatographie liquide haute pression en phase inverse sur une colonne Brownlee RP18* (10 mm - 25 cm), effectuant un gradient de 10 à 35% de Tampon B" en 30 minutes puis de 35 à 100 ô de Tampon B" en 3 minutes: Les caractéristiques des tampons A" et B" sont les suivantes:
- Tampon A" = 0,1 M TEAA (triethylammoniunacétate), pH = 7,0 - Tampon B" = 50~ A + 50 ô CH3CN.
Exemple 5: Couplage d'un ligand thiophosphate à un oligonucléotide Une solution 0,2 M du composé 9b dans CH3CN est additionnée, tel que précédemment décrit dans l' exemple 4, à
l'extrémité 5' d'un oligonucléotide en supprimant l'étape * marque de commerce 15b d'oxydation par le mélange I2, H20, THF, pyridine. La cassette comportant la silice greffée par l'oligonucléotide est mise en contact 1 heure avec une solution de soufre â 5~
dans un mélange CSZ/Pyridine respectivement selon les proportion 50/50. Après rinçage soigneux par le mélange CSZ/Pyridine, une déprotection est effectué comme décrit précédemment .
Le tableau 3 ci-dessous illustre les produits obtenus après couplage des composés 1 à 13 précédemment décrits sur ur r.. ~) r oligonucléotide quelconque et déprotection, et donne également à
titre de référence un oligonucléotide nu.
par couplage avec X ligand X
oligonucléotide s ~ OH
O
oligonucléotide d - O- ~~ -(CH,),-OH
o- 1 j oiigonucléotide s ~ OPI -(CH,)z0-CHp O
~ oligonucléotide s - O-P-O~(CHz);
o- 3 ~ oügonucléotide e ~ O- ~~ -(CH,)~ CH, O
oligonucléotide ; - O~P~-(CH,); NH, o- 5 ~ oügonucléotide s - O-P-O-(CHp),i NH2 o- 6 - ~ 207 4 1 35 I) oügonucléotide ' - O-P~O-(CHz); NH=
o- 7 O
,' oligonucléotide ; - O-p~p-(CHz); S-CPh, o-I I
oligonucléotide ; - O-P-O-9a o II
oligonucléotide ; - O-P- S _ 9b II j "~-N"
; - oligonucléotide ; - O-P-O-CH;CH
o- 'Cf'~zq'I
1~
O O
\v \ NH-(CH~; NHz f.p U
,=oligonucléotide s- p . 11 NH-(CH2yNH-C~(CH~s NH2 ~ =oligonucléot a 12 HUCHz-CH-CHZ-~ â oiigonucléotide s - CH
CHz-NHz 13 F,xemR_e 6 : couplage d'un ligand peptidique à un oligonucléotide Le couplage d'un peptide à un oligonucléotide peut être effectué selon les méthodes dites directes ou indirectes connues.
Par méthode directe, on entend le couplage par synthèse automatique telle que décrite dans la publication de C. D. Juby, Tetrahedron Lett., 879 (1991) et la méthode selon laquelle on synthétise un oligonucléotide ayant une fonction réactive à son extrémité 5' ou 3' ou sur une base. On fait subir à l'oligonucléotide une étape de déprotection et on le couple à un peptide, préparé au préalable, par formation d'une liaison covalente entre deux fonctions réactives complémentaires, l'une portée par l'oligonucléotide et l'autre par le peptide. Par exemple, on peut coupler des amines primaires avec un acide carboxylique activé ou un aldéhyde ou bien une fonction thiol avec un halogénoalkyle. Méthode de couplage indirecte signifie que l'oligonucléotide et le peptide sont chacun porteurs d'une fonction réactive identique ou différente l'une de l'autre, ces 2 fonctions n'étant pas complémentaires. En conséquence, il est nécessaire d'utiliser un agent intermédiaire de couplage qui peut être homobifonctionnel si les deux fonctions sont identiques ou hétérobifonctionnel si les deux fonctions sont différentes. Parmi les agents de couplage homobifonctionnels, on peut citer le DITC
(phénylène-1,4-diisothiocyanate) lorsque les deux fonctions réactives sont des fonctions amines primaires, le DSS
(disuccinimidylsubérate) ou analogues. Parmi les agents de couplage hétérobifonctionnels, on peut citer le SMCC (succinimidyl-4-(N-maléimidométhyl)cyclohexane-1-carboxylate) lorsque les deux fonctions réactives présentent chacune indépendamment de l'autre une fonction amine primaire et une fonction thiol, le SMPB
(succinimidyl-4-(p-maléimido phényl) butyrate ) ou analogues.
Selon l'invention, on a réalisé le couplage d'un oligonucléotide et d'un peptide par technique indirecte telle que décrite en détail ci-après. Mais bien entendu, ceci n'est qu'une illustration non limitative d'un mode de réalisation particulier de l'invention.
Aussi, selon l'invention, on arrive à synthétiser un oligonucléotide avec un ligand représenté par le composé 5, puis on procéde à une étape de purification comme décrit dans l'exemple 4.
Après séchage sous vide, l'oligonucléotide (3.10-8 moles) a été
repris dans 25 )11 de Tampon borate de sodium 0, 1 M pH 9, 3. On a additionné 500 X11 à 30 mg/ml de DITC (Fluka 78 480) dans le DMF. Le mélange a été agité 1 heure 30 min environ à 37°C avant addition de 3 ml d'H20.
Après extraction de la solution par le butanol (3 x 3 ml) , la phase aqueuse restante (600 ~,1) est séchée sous vide, puis reprise par 1,5 10-7 moles de peptides dans 300 ~.1 de tampon borate O.1M pH 9,3. Après une nuit de réaction à 37°C sous agitation, le conjugué oligopeptide obtenu a été purifié sur colonne Brownlee RP
30Ö (4,6 x 100 mm) dans les conditions suivantes On a utilisé deux tampons respectivement C = 0.1 M TEAA, pH
8,0 et D = 50 % C + 50 % CH3CN. On a réalisé un gradient de 0 à 30 %
de C en 30 min, puis de 30 à 100 % de C en 3 min.
En utilisant les protocoles décrit précédemment, on a respectivement synthétisé 3 olig6nucléotides a, b et c et couplés ou non à divers ligands phosphoramidites, thiophosphates ou peptidiques.
La séquence nucléotidique de l'oligonucléotide a est la suivante : 5'-GCATTTAGAGCC-3'.
* marque de commerce -' A
-2 0- ~ 2 0 7 4 1 3 5 L'oligonucléotide b est représenté par la séquence 5'-TGCATTTAGAGCC-3'.
L'oligonucléotide c est caractérisé par la séquence 5'-TCTACGCATTTCACCGCTACAC-3'.
Les résultats sont présentés dans le tableau 4 ci-après 5'- oligonuclotide - X LI T EMP DE RETENTI
N (#
(ligand) CLHP (minutes) 0~~~ - a 17 , 8 X--0CATrI~GAOCC 5 a - 16 , 0 X-0GATl'IAGAC~CC 6 a - 2 8 , 9 X-i~C',ATl'T~GA~C 8 a - 3 5 , 0 ~TI~GAGCC - b 27,8 X-WCAZ'I'TP~AC~C 1 b -1 2 4 , 3 XX-fiAGAOCC 1 b-1'2 32.1 ~ ~~G~ 1 b-1'3 34 5 -X-ZGCAZ'ITI~GAC~OC 2 b - 2 3 , 3 X-'ICCPr~'I'I~GAOOC 3 b - 3 5 , 0 X-~CATrI~GAC~OC 4 b - 2 6 , 2 X~IG~AC~ 5 b - 17 , 0 X ~~~ 6 b-6 32,3 X~CAZ'I~L'ACzAC~OC 7 b - 16 , 5
Le terme "fragment d'acide nucléique~ tel qu'utilisé dans la présente invention, signifie un fragment d'ADN ou d'ARN naturel ou un oligonucléotide naturel ou de synthëse ou un fragment d'ADN ou d'ARN de synthèse non modifié ou comprenant une ou plusieurs bases modifiées telles que l'inosine, la méthyl-5-désoxycytidine, la diméthylamino-5-désoxyuridine, la désoxyuridine, la diamino-2,6 purine, la bromo-5-désoxyuridine ou toute autre base modifiée permettant l'hybridation, le fragment d'acide nucléique pouvant être simple brin ou double brin.
Le terme "support solide~ tel qu'utilisé ici inclut tous les matériaux sur lesquels peut étre immobilisé un fragment d'acide nucléique pour une utilisation dans des tests diagnostiques, en chromatographie d'affinité et dans des processus de séparation. Des matériaux naturels, de synthèse, modifiés ou non chimiquement peuvent être utilisés comme support solide , notamment les polysaccharides tels que les matériaux de cellulose, par exemple du papier, des dérivés de cellulose tels que l'acétate de cellulose et la nitrocellulose ; des polymères tels que polyChlorure de vinyle, polyéthylène, polystyrènes, polyacrylate ou copolymères tel que polymère de chlorure de vinyle et de propylène, polymère de chlorure de vinyle et acétate de vinyle : copolymères à base de styrènes des fibres naturelles telles que le coton et des fibres synthétiques telles que le nylon.
De préférence, le support solide utilisé dans la présente invention est un polymère de polystyrène, un copolymère butadiène-styrène ou un copolymère butadiène-styrène en mélange avec un ou plusieurs polymères ou copolymères choisis parmi le polystyrène, les copolymères styrène-acrylonitrile ou styrène-méthaCrylate de méthyle, les polypropylènes, les polycarbonate ou analogues.
Avantageusement, le support de la présente invention est un polystyrène ou un copolymère à base de styrène comprenant entre environ 10 et 90 % en poids de motifs de styrène.
Le support solide selon l'invention peut étre, sans limitation, sous la forme d'une plaque de microtitration, d'une feuille, d'un c8ne, d'un tube, d'un puits, de billes ou analogue.
Le terme ~agent de couplage~, tel qu'utilisé ici désigne une molécule contenant au moins deux ~extrémités~ ou groupements réactifs. L'agent de couplage peut être homobifonctionnel ou hétérobifonctionnel.
Les ligands utilisés dans la présente invention, et donnés ici à titre d'exemple, peuvent étre des composés disponibles dans le commerce ou des composés synthétisés selon des méthodes connues en soi.
L'invention a également pour objet un support sur lequel est immobilisé par fixation passive un fragment d'acide nucléique (tel que défini précédemmentj, ce support étant caractérisé par le fait qu'il peut être obtenu selon le procédé décrit ci-dessus. ün tel support peut être utilisé notamment dans diverses techniques telles que celles des tests de diagnostic et celles de la chromatographie d'affinité. L'invention concerne également l'utilisation d'un tel support dans un procédé de détection ou de purification, selon les techniques connues, d'une cible nucléotidique contenant une séquence complémentaire de celle du fragment d'acide nucléique immobilisé .
en particulier, ce fragment i~nobilisé peut être employé comme sonde de capture.
Les exemples suivants illustrent l'invention sans toutefois la limiter.
~~ple 1 : ligands phosphoramidites Les composés disponibles dans le commerce utilisés dans la présente invention sont listés dans le tableau 1 ci-après N° Formule Fournisseur ref /~
CF,-C-NH-{CH~j,~OP
\ N(isoPr)z pppli~ Biosystems 400808 ~(CH~2~CN
MMTr-NH-{CH~,Z-O-P ~ ' 6 N (isoPr)p _ Clontech Lab Inc 5206-1 _g_ O~(CHz)2-CN
MMTr-NH-(CHZ)a'O-W\
N (isoPr)~ GlenResearch 10-1903 _______________________________________________________________________________ _______________________ O-(CH2)2 CN
(Ph); C-S-(CHz); O-P /
N(isoPr)z Clontech Lab Inc 5211-1 ~ (CHz)Z CN
DMTr~O-(CH2)2 SO-(CHz)z'O-P \
9a N(isoPr)2 Clontech Lab Inc. 5210-1 Fmoc-NH-CHz-CH-CHyO-DMTr O-(CHZ)2-CN
OP /
10 N(isoPr)2 Clontech Lab Inc. 5203-3 _______________________________________________________________________________ _____________________ O
O
~NH-C-CF, DMT
N(isoPr)p GlenResearch 101039 .-, _g_ NH-(CH$)z NH-I I-(CHz)5 NH II-CF, DMT
O~(CH2)s CN
O-P /
N(isoPr)2 12 Cytolab 2599-Ol 1 5 ____ _________________________ CHi NH-Fmoc ________________________________________________________ 13 CPG-LCAAO-CHi CH-CHI-ODMTr Clontech Lab Inc 5221-1 DMTr - dimethoxytrityle MMTr ~ monomethoxytrityle Fmoc = fluorenyl-9-methoxycarbonyle CPG ~ billes de verre à porosité contr8lée LCAA g longue chaine alkyle amine (bras espaceur) D'autres ligands phosphoramidites préparés par la demanderesse sont respectivement synthétisés selon les protocoles décrits ci-dessous a) - Dans un ballon de 100 ml purgé à l'argon sont mélangés 2 g d'octanediol-1,8 (commercialisé par la société ALDRICH 0-330-3), 0,084 g de diméthyl-4 aminopyridine, 1,9 ml de triethylamine dans 20 ml de pyridine anhydre. Puis 3 g de chlorure de diméthoxy-4,4' triphenylméthyle dans 15 ml de pyridine sont additionnés en 30 min.
Après 1 heure de réaction sous agitation, la réaction est bloquée par 10 ml de méthanol. Après extraction par un mélange acétate d'éthyle, tampon phosphate de sodium 0,1 M à pH 7, la phase organique est séchée sur sulfate de sodium, puis purifiée sur colonne de silice par un mélange de CH2C12/méthanol/triethylamine selon les proportions suivantes : 98/1/1.
Les fractions contenant un produit dont le facteur de rétention (Rf) est égal à 0,47 sont mélangées et concentrées sous vide. 0,7 g de ce produit séché sont mis en solution dans 4 ml de CH3CN anhydre avec 4,7 ml de tétrazole à 0,5 M dans CH3CN. La solution est ajoutée goutte à goutte dans 0,5 g de cyanoethyl-2 N,N,N',N'-tétraisopropylphosphoro-diamidite (commercialisé par la société
ALDRICH sous la référence 30-599-5) dans 6 ml de CH3CN.
Après 30 minutes de réaction, la phase organique est centrifugée. Le surnageant est purifié par chromatographie sur couche mince sur colonne de silice en utilisant un mélange A composé
d'hexane/acétate d'éthyle/triéthylamine respectivement selon les proportions 60/35/5. Les solutions contenant le produit souhaité
sont regroupées et concentrées.
Le composé obtenu est le composé référencé 1 représenté par la formule générale IV ci-dessous dans laquelle DMTr représente le diméthoxytrityle.
O(CH~2CN
DMTr O (CHp), - O - P
\N(isoPr)z ( Iv ) Le déplacement chimique en RMN (résonance magnétique nucléaire) du 31P du composé 1 est de 148,40 ppm et son facteur de rétention (Rf) dans le mélange A est de 0,77. Les déplacements chimiques en RMN sont donnés par rapport à H3Pp4 à 85 %.
b) - 210 mg de benzyloxy-2-éthanol (commercialisé par la société ALDRICH sous la référence 25286-7) anhydre dans 10 ml de tétrazole à 0,25 M dans CH3CN sont additionnés goutte à goutte dans 3 ml de CH3CN contenant 600 mg de cyano-2 N,N,N',N'-tétraisopropyl phosphorodiamidite.
Après 1 heure de réaction sous agitation, centrifugation pour éliminer le précipité, la phase organique est concentrée et purifiée par chromatographie sur couche mince sur colonne de silice par un mélange B hexane/acétate d'éthyle/triethylamine respectivement selon les proportions 50/45/5.
Le composé obtenu est le composé référencé 2 représenté par la formule générale V ci-dessous.
2~74135 ~ o(~~z~
CHe-O(CH2)p0-P
N(isoPr)$
(v) Les caractéristiques du composé 2 sont les suivantes 31P (ppm) ~ 148,57, Rf = 0,85 dans le mélange B.Les déplacements chimiques en RMN sont donnés par rapport à H3P04 à 85%.
c) - On utilise un protocole identique à celui décrit pour la synthèse du composé 2 en utilisant comme produit de départ du phényl-6-hexanol-1 (commercialisé par la société ALDRICH sous la référence 33361-1).
Après 1 heure de réaction sous agitation, centrifugation pour éliminer le précipité, la phase organique est concentrée et purifiée par chromatographie sur couche mince sur colonne de silice en utilisant un mélange C composé d'hexane/acétate d'éthyle/triéthyl amine respectivement selon les proportions 70/25/5. .
Le composé obtenu est le composé référencé 3 représenté par la formule générale VI ci-dessous «C~x~
(CHxIe . O . P
N(isoPr)=
( VI ) Les caractéristiques du composé 3 sont les suivantes 31P (ppm) = 148,40, Rf ~ 0,70 dans le mélange C.
d) - On utilise un protocole de synthèse identique ~ celui décrit our le co p mposé 2 en utilisant comme produit de départ l'hexanol-1 (commercialisé par la société ALDRICH sous la référence H 1330-3). La réaction n'est pas suivie par chromatographie sur couche mince, mais par RMN du 31P . La réaction est stoppée après disparition du bisphosphoramidite de départ (S31P s 128,18 ppm). Le composé obtenu est le composé référencé 4 représenté par la formule générale VII ci-dessous et est utilisé brut après filtration sur Miliex (désignation commerciale) 0,45 Elm.
O(CH2)2CN
(CH3)-(CH2)3-O-P (VII) N (isoPr) 2 Le déplacement chimique en RMN du 31p est égal à 148,37 ppm.
a) On utilise un protocole de synthêse identique â celui décrit pour le composé 2 en utilisant comme produit de départ le diméthylamino-3 propanol-1 (commercialisé par la société ALDRICH sous la référence D14440.1). La réaction n'est pas suivie par chromatographie sur couche mince, mais par RMN du 31p. La réaction est stoppée après disparition du bisphosphoramidite de départ (831p - 128,18 ppm). Le composé obtenu peut être utilisé brut après filtration sur Millex (désignation commerciale) 0,45 ~.m.
f) On utilise un protocole de synthèse identique à celui décrit pour le composé 2 mais en utilisant comme produit de départ un N-méthyl aminoalcool tel que le (méthylamino)-2 éthanol (commercialisé par la société ALDRICH sous la référence 23966-6).
EXEMPLE 2: Synthêse d'un bras thiophosphate à l'extrémité
5' de l'oligonucléotide Une solution de 15,02 g d'hydroxy-3 proprionitrile (10 992-4 Aldrich) dans 40 ml de THF anhydre et 26 ml de N,N'-diisopropyl-éthylamine (Aldrich D 12580-6) est refroidie à -10°C, 10,10 g de dichloro(diisopropyl-amine)phosphine sont additionnés sous agitation en 30 min.
Après 20 min supplémentaires de réaction, le chlorhydrate 12a est filtré sous atmosphère inerte. Le filtrat dilué dans 1 litre d' acétate d' éthyle est extrait 3 fois avec 150 ml de Tampon phosphate pH 7,00 puis séché sur Na2S04. Après concentration sous vide, le produit est purifié sur silice en présence de triéthylamine.
Le composé obtenu est le composé référencé 9b représenté par la formule VIII ci-dessous:
O-(CH2)2-CN
(IsoPr) 2-N-P ~ (VIII) O (CH2)2-CN
r~.
..~
Exemple 3 . Ligands peptidiques Les peptides sont synthétisés sur une résine phényl-acétamidomethyl (PAM) polystyrène/divinylbenzène (Applied Biosystems, Inc. Foster City, CA) par la méthode en phase solide de Merrifield en utilisant un synthétiseur automatique Applied Biosysteme 430A. Les acides aminés sont couplés sous forme d'anhydride symétrique à l'exception de la glutamine et de l'asparagine qui réagissent sous forme d'esters d'hydroxybenzotriazole (HOBT). Les acides aminés utilisés proviennent de chez Novabiochem (Laüflerlfingen, Suisse) ou de chez BACHEM (Bubendorf Suisse).
La synthèse chimique des peptides a été réalisée en utilisant un protocole de double couplage avec la N-methyl-pyrrolidone (NMP) comme solvant. Les peptides ont été coupés de leurs résine ainsi que les protections latérales de manière simultanée à l'aide d'acide fluorhydrique (HF) dans un appareillage approprié (HF appareil de coupure de Type I, Peptide Institute, Osaka, Japon).
Pour 1 g de peptidylrésine, 10 ml de HF, 1 ml d'anisole et 1 ml de dimethylsulfure (DMS) sont utilisés et le mélange est agité durant 45 minutes à - 2°C. Le HF est alors évaporé
sous vide. Après des lavages intensifs à l'éther, le peptide est élué de la résine par l'acide acétique l0ô puis de l'acide acétique concentré. Après dilution par de l'eau le peptide est lyophilisé.
Les peptides sont purifiés par chromatographie liquide haute performance préparative sur une colonne VYDAC* de type i C18 (250 x 21 mm). (The Separation Group, Hesperia, CA, U.S.A). L'élution est réalisée par un gradient d'acétonitrile à un débit de 22 ml/min. Les fractions collectées sont * marques de commerce ., P
contrôlées par une élution en condition isocratique sur une colonne VYDAC* C18 analytique (250 x 4, 6 mm) à un débit de 1 ml/min. Les fractions qui présentent le même temps de rétention sont réunies et lyophilisées. La fraction majoritaire est ensuite analysée par CLHP analytique avec le système décrit précédemment. Le peptide qui est considéré
comme de pureté acceptable se traduit par un pic unique représentant 95$ minimum du chromatogramme. Les peptides purifiés sont alors analysés dans le but de contrôler leur composition en acides aminés. I1 sont tout d'abord hydrolysés dans de l'HCl 6N (Pierre) additionné de phénol (1°s final) à
110°C durand 24 h sous vide dans une station d'hydrolyse Picotag* (WATERS, Millipore Corporation, Milford USA).
L'analyse des acides aminés est ensuite effectuée à l'aide d'un analyseur d'acides amines BECHIKAN 6300*. La mesure de la masse moléculaire chimique (moyenne) des peptides est obtenue en utilisant la spectrométrie de masse L.S.I.M.S. en mode d'ion positif sur un instrument à double focalisation VG.ZAB.ZSEQ relié à un système d'acquisition DEC-VAX 2000*
(VG analytical Ltd, Manchester, Angleterre).
PeptideSquence Masse Masse Temps Thorique relle de rtention(*) G28K KGSKGSKGSKGSKGSKGSKGSKGSKGSKGG 2712,04 2712,27,68 mn K20A KIEPLGVAPTKAKRRVVOREKR 2561,3 2560,717,98 mn (*) conditions de CLHP (chromatographie liquide haute pression) sur une colonne VYDAC 218* TP 52 (25 cm x 2, 1 mm) selon les conditions suivantes:
* marques de commerce débit - 0,25 ml/min gradient de 0 -~ â 100 ~ B' en 30 min avec - Tampon A' - eau + 0,1~ TFA (acide trifluoroacétique) - Tampon B' - 80~ CH3CN, 0,1% TFA
Exemple 4: couplage d'un ligand phosphoramidite.
Le couplage d'un ligand phosphoramidite à un oligonucléotide est effectué selon le protocole général 10 suivant:
Un oligonucléotide est synthétisé sur un appareil automatique APPLIED* 381 A de la société APPLIED BIOSYSTEMS
en utilisant la chimie des phosphoramidites selon le protocole du constructeur. Le ligand phosphoramidite dissout dans de l'acétonitrile anhydre à une concentration de 0,2 M, est placé en position X du synthétiseur et l'addition du ligand se fait à l'extrémité 5' de l'oligonucléotide selon le protocole standard de la synthèse automatique lorsque la synthèse de l'oligonucléotide est achevée. Dans le cas où le ligand est porteur d'un groupement protecteur dimethoxytrityle, tel que pour les composés 1 et 9 à 12 décrits précédemment, il est nécessaire d'effectuer une étape supplémentaire de déprotection du groupement trityle par l'acide trichloroacétique en fin de synthèse. Après déprotection une nuit à 55°C dans NH40H 33$, précipitation dans de l'éthanol à -20°C, l'oligonucléotide est séché sous vide et repris dans 1 ml d'eau.
Pour les composés référencés 6 et 7, une étape supplémentaire de clivage du groupement monomethoxytrityle est effectuée selon le protocole du fabricant (CLONTECH) après déprotection.
* marque de commerce A
,_ 2074135 15a Pour les composés 11 et 12, le couplage est effectué
selon le protocole général décrit ci-dessus jusqu'à la déprotection, mais le ligand est greffé sur la base terminale de l'extrémité 5' de l'oligonucléotide. I1 faut noter par ailleurs que les ligands 1, 10, 11 et 12 peuvent s'additionner sur eux-mêmes par l'intermédiaire du groupement hydroxyle libéré par detritylation.
Dans le cas du composé portant la référence 13, la synthèse automatique démarre par la silice greffée par le ligand sur le protocole standard. Le couplage ligand et oligonucléotide s'effectue par l'extrémité 3' de ce dernier.
Il est dans les connaissances de l'homme de l'art de fabriquer le support silice avec les ligands convenablement protégés pour la synthèse automatique ou pouvant être déprotégés comme expliqué précédemment.
Dans tous les cas, les oligonucléotides modifiés à leurs extrémités 5' ou 3' sont purifiés par chromatographie liquide haute pression en phase inverse sur une colonne Brownlee RP18* (10 mm - 25 cm), effectuant un gradient de 10 à 35% de Tampon B" en 30 minutes puis de 35 à 100 ô de Tampon B" en 3 minutes: Les caractéristiques des tampons A" et B" sont les suivantes:
- Tampon A" = 0,1 M TEAA (triethylammoniunacétate), pH = 7,0 - Tampon B" = 50~ A + 50 ô CH3CN.
Exemple 5: Couplage d'un ligand thiophosphate à un oligonucléotide Une solution 0,2 M du composé 9b dans CH3CN est additionnée, tel que précédemment décrit dans l' exemple 4, à
l'extrémité 5' d'un oligonucléotide en supprimant l'étape * marque de commerce 15b d'oxydation par le mélange I2, H20, THF, pyridine. La cassette comportant la silice greffée par l'oligonucléotide est mise en contact 1 heure avec une solution de soufre â 5~
dans un mélange CSZ/Pyridine respectivement selon les proportion 50/50. Après rinçage soigneux par le mélange CSZ/Pyridine, une déprotection est effectué comme décrit précédemment .
Le tableau 3 ci-dessous illustre les produits obtenus après couplage des composés 1 à 13 précédemment décrits sur ur r.. ~) r oligonucléotide quelconque et déprotection, et donne également à
titre de référence un oligonucléotide nu.
par couplage avec X ligand X
oligonucléotide s ~ OH
O
oligonucléotide d - O- ~~ -(CH,),-OH
o- 1 j oiigonucléotide s ~ OPI -(CH,)z0-CHp O
~ oligonucléotide s - O-P-O~(CHz);
o- 3 ~ oügonucléotide e ~ O- ~~ -(CH,)~ CH, O
oligonucléotide ; - O~P~-(CH,); NH, o- 5 ~ oügonucléotide s - O-P-O-(CHp),i NH2 o- 6 - ~ 207 4 1 35 I) oügonucléotide ' - O-P~O-(CHz); NH=
o- 7 O
,' oligonucléotide ; - O-p~p-(CHz); S-CPh, o-I I
oligonucléotide ; - O-P-O-9a o II
oligonucléotide ; - O-P- S _ 9b II j "~-N"
; - oligonucléotide ; - O-P-O-CH;CH
o- 'Cf'~zq'I
1~
O O
\v \ NH-(CH~; NHz f.p U
,=oligonucléotide s- p . 11 NH-(CH2yNH-C~(CH~s NH2 ~ =oligonucléot a 12 HUCHz-CH-CHZ-~ â oiigonucléotide s - CH
CHz-NHz 13 F,xemR_e 6 : couplage d'un ligand peptidique à un oligonucléotide Le couplage d'un peptide à un oligonucléotide peut être effectué selon les méthodes dites directes ou indirectes connues.
Par méthode directe, on entend le couplage par synthèse automatique telle que décrite dans la publication de C. D. Juby, Tetrahedron Lett., 879 (1991) et la méthode selon laquelle on synthétise un oligonucléotide ayant une fonction réactive à son extrémité 5' ou 3' ou sur une base. On fait subir à l'oligonucléotide une étape de déprotection et on le couple à un peptide, préparé au préalable, par formation d'une liaison covalente entre deux fonctions réactives complémentaires, l'une portée par l'oligonucléotide et l'autre par le peptide. Par exemple, on peut coupler des amines primaires avec un acide carboxylique activé ou un aldéhyde ou bien une fonction thiol avec un halogénoalkyle. Méthode de couplage indirecte signifie que l'oligonucléotide et le peptide sont chacun porteurs d'une fonction réactive identique ou différente l'une de l'autre, ces 2 fonctions n'étant pas complémentaires. En conséquence, il est nécessaire d'utiliser un agent intermédiaire de couplage qui peut être homobifonctionnel si les deux fonctions sont identiques ou hétérobifonctionnel si les deux fonctions sont différentes. Parmi les agents de couplage homobifonctionnels, on peut citer le DITC
(phénylène-1,4-diisothiocyanate) lorsque les deux fonctions réactives sont des fonctions amines primaires, le DSS
(disuccinimidylsubérate) ou analogues. Parmi les agents de couplage hétérobifonctionnels, on peut citer le SMCC (succinimidyl-4-(N-maléimidométhyl)cyclohexane-1-carboxylate) lorsque les deux fonctions réactives présentent chacune indépendamment de l'autre une fonction amine primaire et une fonction thiol, le SMPB
(succinimidyl-4-(p-maléimido phényl) butyrate ) ou analogues.
Selon l'invention, on a réalisé le couplage d'un oligonucléotide et d'un peptide par technique indirecte telle que décrite en détail ci-après. Mais bien entendu, ceci n'est qu'une illustration non limitative d'un mode de réalisation particulier de l'invention.
Aussi, selon l'invention, on arrive à synthétiser un oligonucléotide avec un ligand représenté par le composé 5, puis on procéde à une étape de purification comme décrit dans l'exemple 4.
Après séchage sous vide, l'oligonucléotide (3.10-8 moles) a été
repris dans 25 )11 de Tampon borate de sodium 0, 1 M pH 9, 3. On a additionné 500 X11 à 30 mg/ml de DITC (Fluka 78 480) dans le DMF. Le mélange a été agité 1 heure 30 min environ à 37°C avant addition de 3 ml d'H20.
Après extraction de la solution par le butanol (3 x 3 ml) , la phase aqueuse restante (600 ~,1) est séchée sous vide, puis reprise par 1,5 10-7 moles de peptides dans 300 ~.1 de tampon borate O.1M pH 9,3. Après une nuit de réaction à 37°C sous agitation, le conjugué oligopeptide obtenu a été purifié sur colonne Brownlee RP
30Ö (4,6 x 100 mm) dans les conditions suivantes On a utilisé deux tampons respectivement C = 0.1 M TEAA, pH
8,0 et D = 50 % C + 50 % CH3CN. On a réalisé un gradient de 0 à 30 %
de C en 30 min, puis de 30 à 100 % de C en 3 min.
En utilisant les protocoles décrit précédemment, on a respectivement synthétisé 3 olig6nucléotides a, b et c et couplés ou non à divers ligands phosphoramidites, thiophosphates ou peptidiques.
La séquence nucléotidique de l'oligonucléotide a est la suivante : 5'-GCATTTAGAGCC-3'.
* marque de commerce -' A
-2 0- ~ 2 0 7 4 1 3 5 L'oligonucléotide b est représenté par la séquence 5'-TGCATTTAGAGCC-3'.
L'oligonucléotide c est caractérisé par la séquence 5'-TCTACGCATTTCACCGCTACAC-3'.
Les résultats sont présentés dans le tableau 4 ci-après 5'- oligonuclotide - X LI T EMP DE RETENTI
N (#
(ligand) CLHP (minutes) 0~~~ - a 17 , 8 X--0CATrI~GAOCC 5 a - 16 , 0 X-0GATl'IAGAC~CC 6 a - 2 8 , 9 X-i~C',ATl'T~GA~C 8 a - 3 5 , 0 ~TI~GAGCC - b 27,8 X-WCAZ'I'TP~AC~C 1 b -1 2 4 , 3 XX-fiAGAOCC 1 b-1'2 32.1 ~ ~~G~ 1 b-1'3 34 5 -X-ZGCAZ'ITI~GAC~OC 2 b - 2 3 , 3 X-'ICCPr~'I'I~GAOOC 3 b - 3 5 , 0 X-~CATrI~GAC~OC 4 b - 2 6 , 2 X~IG~AC~ 5 b - 17 , 0 X ~~~ 6 b-6 32,3 X~CAZ'I~L'ACzAC~OC 7 b - 16 , 5
7 X-WCA~'I'l'AGA~ 8 b - 3 3 , 8
8 X~iGCA2~.'l'AGACCC 9a b-9a 17,3 X-mOCAT7LTAGP~OC 9 b b - 16 , 4
9 b X~CATI'.I'AG~C 1 0 b -1 17 , 2 X-'I~CCAZ'I'IP~GAOCC 1 1 b -1 17 , 3 2 X~~G~ 1 2 b -1 18 , 2 ZGC~1TI~C~1C,OC X 1 3 b -1 17 , 0 - c 17,5 X- 1 c-1 24,3 XXX 1 c-1'3 33,5 X 5 c-5 17,1
10 c-10'9 19,5 -.
X 1 1 c-11'9 19,2 5'- oligonuclotide PEPTlI7ENOM TEMPS DE ltATtO
- 3' ABREGE RTENTION
CLHP minutes TL~CP~7.'ITAGAOCC G28K b-G28 2 5 , 7 1 , 0 K
OCAI'ITAGADOC G28K a-G28K 24, 8 i , 0 'IbCA~T~GA00C K20R b-K20R 36,1 1 ,1 K20R C-K20R 39,3 0,9 dans lequel X caractérise le ligand selon la nomenclature utilisée précédemment, le symbole *n, n représentant le nombre 2, 3 ou 9, signifie que le ligand peut s'additionner n fois sur lui-même.
S Le symbole - dans la colonne X du tableau 4 signifie que l'oligonucléotide est synthétisé sans ligand.
Le symbole # signifie que les conditions chromatographiques sont celles décrites pour l'exemple 4.
Dans le tableau 5, l'oligonucléotide est quantifié en picomoles par U.V. en mesurant l'absorbance à 260 nm, selon le protocole Applied Biosystems. Le peptide est quantifié en picomoles par analyse d'acides aminés selon la méthode décrite dans l'exemple 3. Le ratio oligo/peptide est le rapport de ces deux valeurs.
F-xemple 7: détection d'un fragment d'acide nucléique par la technique dite "sandwich".
Dans une plaque de microtitration en polystyrène (Nunc 439454), sont déposés 100 )11 d'une solution d'un oligonucléotide de capture modifié ou non par un ligand à une concentration de 0,15 )1M
dans du PBS 3X (0,45 M NaCl; 0,15 M phosphate de sodium,; pH 7,0).
La plaque est incubée deux heures à environ 37°C puis lavée 3 fois par 300 ~I,l de PBS Tween (0,15 M NaCl; 0,05 M phosphate de sodium; pH
7,0: 0,5% Tween*20 (MERCK 822184)).
50 )11 d'une séquence cible à différentes concentrations dans du tampon PBS saumon (PBS 3X + ADN de sperme de saumon 10 mg/ml (Sigma D9156) ) sont ajoutés dans les puits, suivis de 50 )11 d'une solution d'un conjugué oligonucléotide-peroxydase à une concentration de 0,1 ng/~L1 (15 nM) en oligonucléotides dans un tampon PBS - cheval (PBS 3X + 10 % de sérum de cheval (BIOMERIEUX
55842) ) .
La plaque est incubée 1 heure à 37°C et lavée par 3 fois 300 ~,1 de PBS Tween*
100 )11 de substrat OPD (ortho-phénylène diamine, Cambridge Medical Biotechnology ref. 456), dans un tampon OPD (0,05 M acide citrique: 0,1 M NaH2P04; pH 4,93) de la concentration de 4 mg/ml, auxquels on ajoute..extemporanément H202 à 30 volumes au 1/1000, sont * marques de car~r~erce ajoutés par puits. Après 20 minutes de réaction, l'activité
enzymatique est bloquée par 100 )1.1 d'H2S04 1N. La lecture est effectuée sur un lecteur AXIA Micro Reader (BIOMERIEUX) à 492 nm.
Conformément au protocole général décrit dans l'exemple 7, on a effectué la détection d'un fragment d'acide nucléique cible déterminé par la séquence 5'-AAGGTCAACCGGAATTTCATTTTGGGGCTCTAAATGCAATACAATGTCTTG
CAATGTTGCCTTA-3', respectivement à une concentration de 10 9 M et de 10-10 M en utilisant un oligonucléotide de capture de séquence 5' TGCATTTAGAGCC-3' modifié ou non par un ligand et un oligonucléotide de détection conjugué à la peroxydase de séquence 5'-TAAGGCAACATTGCAAGATA-3'.
Les résultats sont présentés aux figures 1 et 2 dans lesquelles les oligonucléotides de capture sont notés selon les règles définies précédemment dans les tableaux 4 et 5.
L'effet de l'addition d'un ligand à l'extrémité d'un oligonucléotide sur l'efficacité de la détection peut se quantifier par le ratio signal oligonucléotide-ligand/signal oligonucléotide nu. On entend par oligonucléotide nu, un oligonucléotide de synthèse standard, c'est-à-dire 3' OH, 5' OH et ne possédant pas de ligand sur les bases.
On a représenté dans le tableau ci-dessous le ratio signal oligonucléotide-ligand/signal oligonucléotide nu, dans lequel X
représente un ligand selon la terminologie utilisée précédemment et b représente un oligonucléotide tel que déterminé précédemment.
X ' ~1~~ 2 3 4 5 6 7 Ratio b-X/b2,6 1,3 1,5 1,2 8,2 7,8 6,3 3,8 .
K
X 9a 9b 10 11 12 13 G28K 20R
Ratio b-X/b0,5 6,7 7,1 9,7 1 1,1 6,8 > 12,6 >
12,6 Ce tableau montre que l'addition d'un ligand sur un oligonucléotide pérmet d'augmenter de manière importante le signal, * marque de canrierce jusqu'à plus de 10 fois dans certains cas. Tous les ligands n'ont pas le mème effet et la présence d'une amine primaire est un facteur déterminant. Ceci est d'ailleurs confirmé par les figures 1 et 2 (donnant les résultats obtenus (donnés en D.O. (densité optique)) avec diverses sondes de capture).
Comme cela ressort des figures 1 et 2, il n'y a pas d'effet de la concentration en cible.
Avec les ligands 5, 6, 7, 10 et 13 qui comportent une amine primaire sur une chaS.ne alkyle ramifiée ou non, le ratio b-X/b est compris entre 6, 3 et 8, 2, alors que pour les ligands 1, 2, 3, 4, 9 qui ne comportent pas d'amines primaires, ce ratio est compris entre 1,2 et 3,7.
Dans le cas du ligand 9a, qui amène un groupement phosphate, l'effet est négatif avec un ratio de 0,5.
Si le ligand aminé est porté par une chaine aliphatique greffée sur la base d'un nucléotide non complémentaire de la cible, le même effet d'augmentation du signal est visible, ce qui est le cas avec les ligands 11 et 12.
On répète le protocole général décrit dans l'exemple 7 utilisant des ligands simples, des ligands pouvant s'additionner sur eux-mémes, des ligands peptidiques et un nucléotide thymine (T).
L'oligonucléotide de capture b est caractérisé par la séquence 5'-TGCATTTAGAGCC-3'.
Les résultats sont présentés à la figure 3 et dans le tableau 7.
TART.RAL~ 7 ~X 1 1*2 1*3 11 11*9 T*9 10 10*9 G28K K20R
lt~r,~/h 76 3_4 4_9.7 >12.6 4,4 7,1 >12,6 >12 6 >12,6 Comme cela ressort de cette figure et du tableau 7, dans lequel X représente le ligand, le symbole *n signifie le ligand pouvant d'additionner n fois sur lui-méme, b représente l'oligonucléotide de capture.
La sensibilité de détection est augmentée par l'addition multiple du ligand, quel que soit le type de ligand, mais avec un -24- ~ 2 0 7 4 1 3 5 effet très marqué lorsque le ligand est porteur d'une fonction amine. Cet effet de la fonction amine est confirmé par la comparaison entre ligand 1 ((CH2)8-OH) et le ligand S ((CH2)6-NH2) de l'exemple précédent. En effet, le ligand 1 porteur d'un S groupement hydroxyle, méme additionné 3 fois sur lui-même, ne donne un gain que de 4,56, alors que le ligand S portant un groupement amine primaire produit un gain de 8,20. De même pour le ligand thymine (T) additionné 9 fois sur lui-même, le gain de sensibilité
n'est que de 4,4 en comparaison avec le ligand 11 additionné 9 fois sur lui-méme, qui donne un gain de sensibilité de 12,6. Le ligand 11 diffère du ligand thymine par la présence d'un bras aliphatique comportant une amine primaire sur la base T en position 5.
1S F,x~m,~l,Q l0 On utilise le méme protocole général que celui décrit dans l'exemple 7. On utilise une sonde de capture courte, référencée a, de séquence 5'-GCATTTAGAGCC-3' et qui est raccourcie d'une base par rapport à la sonde b précédemment testée. Les ligands couplés à la sonde de capture sont respectivement les ligands phosphoramidite 5 et 6 et le ligand peptidique G28K.
La cible est déposée à une concentration égale à 10-10 M.
Comme cela ressort à la figure 4, la sensibilité de détection est augmentée en présence d'un ligand porteur d'une fonction amine primaire, par rapport à un oligonucléotide nu. Par ailleurs, on constate que la sensibilité de détection est fortement augmentée en présence d'un ligand peptidique en comparaison avec un ligand phosphoramidite S et 6. Les résultats sont confirmés dans le tableau '8 ci-dessous, dans lequel x représente le ligand, a l'oligonucléotide.
3S X I I ~ 5 .II 6 G28K
Ratio a-X/a 3,2 3,7 8,9 r.
-2 5- ~ 2 0 7 4 1 3 5 On utilise un protocole de détection identique à celui décrit dans l'exemple 7. L'oligonucléotide de capture est l'oligonucléotide c de séquence 5'-TCTACGCATTTCACCGCTACAC-3' modifié
à l'extrémité 5' par un ligand et qui est déposé à une concentration de 0,30 ~.M. La cible est composée de 5.109 Moles d'un mélange d'ARN
16S et 23S E. Coli commercialisé par la société BOEHRINGER sous la référence 206938) dans 50 X11 d'un tampon PBS saumon. La sonde de détection couplée à la peroxydase a pour séquence 5'-TCTAATCCTGTTTGCTCCC-3'.
Comme montré à la figure 5, la sensibilité de détection est augmentée par la présence d'un ligand et ceci d'autant plus qu'on utilise un ligand couplé plusieurs fois sur lui même.
Les résultats sont confirmés dans le tableau 9 ci-dessous, dans lequel X représente le ligand et c l'oligonucléotide de capture.
-X 1 1*3 5 10'9 11'9 K20R
Ratio c-X/c1,5 1,8 5,7 8 9 ,1 9 , , 6 On constate par ailleurs qu'avec une sonde de capture de 22 bases, les ligands 10 et 11 additionnés 9 fois sur eux-mémes et le ligand peptidique K20R ont sensiblement le méme effet.
On utilise le mégi protocole que celui décrit dans l'exemple 7. On fait varier la nature du tampon de dilution de l'oligonucléotide de capture modifié par des ligands chimiques.
L'oligonucléotide de capture, est l'oligo b tel que décrit précédemment, mis en solution à 0,15 NM respectivement dans des tampons A*, B*, C*, D*. La cible S décrite dans l'exemple S est déposée à une concentration de 10-10 M.
A* ~ 150 mM phosphate de sodium pH 7,0 : 450 mM NaCl B* = 150 mM phosphâte de sodium pH 4,2 : 450 mM NaCl C* g 150 mM phosphate de sodium pH 8,5 ; 450 mM NaCl D* ~ 150 mM Tris pH 7,0 ; 450 mM NaCl.
Comme cela ressort de la figure 6, quel que soit le tampon, l'effet du ligand sur la sensibilité de détection est conservé. Cet effet diminue à pH acide avec le tampon B*.
On va montrer maintenant l'effet du ligand sur la spécificité. On utilise un protocole sandwich identique à celui décrit dans l'exemple 7 et 2 fragments d'ADN à une concentration de 10 10 M comme cible. La séquence S ci-dessous est parfaitement homologue de l'oligonucléotide de capture b modifié ou non par des ligands .
La séquence SGT décrite ci-dessous contient un mésappariement de type GT au milieu de la région complémentaire de la sonde de capture.
S y,Pnce 3'-ATTCCGTTGTAACGTTCTGTAAGATAACGTAAATCTCGGGGTTTTACTTTAAGGCCA
ACTGGAA-5' ~r~,,~aPnce cCT s 3'-ATTCCGTTGTAACGTTCTGTAACATAACGTA~TCTCGGGGTTTTACTTTAAGGCCA
ACTGAA-5' Le gain en signal amené par la présence d'un ligand ne doit pas diminuer la spécificité de la détection. Le ratio signal S/signal SGT peut donc servir de référence pour mesurer les performances du système.
Les résultats sont présentés à la figure 7 et dans le tableau 10 ci-dessous, dans lequel b représente l'oligonucléotide de capture et X le ligand. , b-X b b-1 b-2 b-3 b-4 Ib-5 b-6 b-7 CIBLF.JCIBLE 7,1 7,$ 9,1 8 8 9 9 15 MITT'F.E , , , , , b-X b-8 b-9b 10 11 12 13 G28K K2oR
7.9 7.9 8.6 >4,7 >3,2 On constate que le gain en signal amené par le ligand ne diminue en rien la spécificité de la détection. Dans le cas de l'utilisation des ligands peptidiques, on note une diminution de gain en signal, en comparaison de celui obtenu avec des ligands phosphoramidites et ceci est dt1 à une saturation du détecteur. En réalité, la spécificité de la détection n'est pas altérée par l'utilisation du ligand peptidique.
Exemple 14 On réalise la détection d'un fragment d'acide nucléique sur un automate VIDAS (marque enregistrée - commercialisé par la société
BIOMERIEUX SA - VITEK). La détection est effectuée à l'aide d'un support conique SPR (commercialisé par la société VITEK (USA), marque de commerce) réalisé à partir d'un matériau vendu sous la dénomination K résine qui est un copolymère butadiène-styrène) et d'une barrette. La réaction d'hybridation sandwich décrite dans le protocole ci-dessous se produit sur la paroi interne du cône.
Sur la surface interne du c8ne SPR, sont fixés passivement des oligonucléotides modifiés ou non par un ligand à une concentration de 0,15 jlM dans un volume de 315 ),l.l d'une solution de PBS 4X (phosphate de sodium 200 mM pH 7,0, NaCl 600 mM). Après une nuit à température ambiante ou deux heures à 37°C, les c8nes sont lavés 2 fois par une solution de PBS Tween, puis séchés sous vide.
La barrette contient l'ensemble des réactifs nécessaires à la détection, c'est-à-dire 200 )11 d'une solution à 15 nM d'un oligonucléotide de séquence 5'-TAAGGCAACATTGCAAGATA-3' couplé à l'extrémité 5' à la phosphatase alcaline, 3 fois 600 fil de solution de lavage PBS Tween et une cuvette de substrat.
Dans le premier puits de la barrette, est déposé 200 ).~.1 de la cible à une concentration de 10-9 M dans le même tampon que pour l'exemple 7 Après incubation 30 minutes du c8ne par le mélange cible plus sonde de détection, le c8ne est lavé 3 fois par une solution de PBS Tween* 250 )ll de substrat MUP (méthyl-4 umbelliféryl phosphate) en solution dans un tampon diéthanolamine sont aspirés dans le c8ne, puis~~relâchés dans une cuvette de lecture. L'appareil * marques de conrnerce ~A
- ~ 2474135 mesure le signal fluorescent exprimé en RFU (unités relatives de fluorescence) de la cuvette.
Les résultats sont représentés à la figure 8 et dans le tableau 11 ci-dessous dans lequel X représente le ligand, *n signifie addition n fois du ligand sur lui-même, b représente l'oligonucléotide de capture tel que représenté précédemment.
X 1 1*2 1*3 3 5 6 8 G28K K20R
Ratiob-X/b 2,3 2,8 4,8 2,7 20,4 26,9 21,6 >43 >43 Les résultats confirment l'effet du ligand dans l'amélioration de la sensibilité de détection et le r8le prépondérant des ligands portant au moins un groupement fonctionnel amine primaire.
On effectue la détection d'une séquence d'acide nucléique selon le protocole sandwich tel que décrit dans l'exemple 7 en utilisant des plaques de polystyrène irradiées ou non irradiées commercialisées par la société NUNC respectivement sous les références 439454 et 269620.
Le fragment d'acide cible est un fragment d'ADN du papillomavirus de type 16 (région E7) utilisé à une concentration de 10-10 M.
La séquence de l'oligonucléotide de capture utilisé, référencé
d~ est : 5'-GACAACTGATCTCTAC-3' .
La séquence de l'oligonucléotide de détection, couplé à
l'extrémité 5' à la phosphatase alcaline, est 5'-CCGGACAGAGCCCATTAC-3' Les résultats sont présentés dans les tableaux ci dessous 12 et 13.
OLIGO -LIGAND PLAQUE NON IRRADIEE PLAQUE IRRADIEE
d 0,100 D.O. 0,230 D.O.
d-5 0,180 D.O. 0,490 D.O.
-__________________________________________-________________________ OLIGO-LIGAND RAPPORT SIGNAL IRRADIEE/NON IRRADIEE
d 2, 3 d-5 2,7 Les résultats ci-dessus confirment le r8le prépondérant du ligand dans la sensibilité de détection. Par ailleurs, on constate une amélioration de la sensibilité de détection lorsqu'on utilise des plaques de microtitration irradiées.
On effectue la détection d'une séquence d'acide nucléique selon le protocole sandwich sur l'automate VIDAS selon le protocole décrit dans l'exemple 14 en utilisant des c8nes de K résine respectivement irradiés ou non irradiés. Ces c8nes sont commercialisées par la société VITEK SYSTEM.
L'ADN, les oligonucléotides de capture et de détection utilisés sont identiques à ceux décrits dans l'exemple 15. Le ligand utilisé est celui référencé précédemment dans l'exemple 5.
Les résultats sont présentés dans le tableau 14 ci-dessous TABLEAU 14, OLIGO -LIGAND SPR NON IRRADIE SPR IRRADIE
d 84 RFU 540 RFU
d-5 1302 RFU 3917 RFU
Les rapports de détection SPR activé/SPR non activé sont de OLIGO-LIGAND RAPPORT activé/non activé
______~ ___________________________643 ____________________________ d-5 » 3,00 Les résultats ci-dessus confirment encore l'effet du ligand sur la sensibilité de détection. Par ailleurs, on constate une diminution du gain du signal lorsqu'on utilise des c$nes irradiés, mais ceci est dQ à une saturation du détecteur. Le rapport est donc nettement supérieur à 3, 00 (»3, 00) .
On met ci-après en évidence la stabilité des cônes utilisés à
différentes températures.
En effet, dans le cas d'utilisation de c8nes pour l'automate VIDAS, comme composants de la trousse de détection de fragments d'acides nucléiques, ceux ci doivent être vendus prêts à l'emploi, c'est à dire avec l'oligonucléotide de capture immobilisé. Un facteur déterminant de leur utilisation est leur stabilité dans le temps. Des expériences de stabilité ont été effectuées à trois températures différentes, respectivement 4°, 20°C et 37°C. Les résultats obtenus sont résumés dans le tableau 15 ci-dessous après 42 jours pour chaque température TEMPERATURE . RAPPORT SIGNAL jour 42/jour 1 4° 100 $ -_______________ 20° . 98 %
37° 86 %
Les résultats ci-dessus montrent l'excellente stabilité des c8nes utilisés après 42 jours de conservation dans un réfrigérateur à une température' de 4°C. Par ailleurs, une augmentation de la -31- ~ 2 0 7 4 1 3 5 température n'affecte que très peu la stabilité des produits.
Comme cela ressort de tous les exemples précédemment décrits, l'addition d'un ligand à un fragment d'acide nucléique augmente dans tous les cas la sensibilité de détection. Cet effet est encore accru lorsqu'on utilise un ligand portant au moins un groupement fonctionnel polaire tel qu'un groupement aminé. Par ailleurs, la fixation du ligand sur le support solide est très facile puisqu'elle se fait directement par adsorption passive. L'hypothèse émise pour expliquer l'adsorption passive directe du ligand sur le support est la combinaison d'interactions hydrophobes entre la partie hydrophobe du ligand et le support et d'interactions polaires entre les groupements polaires du ligand et des groupements polaires du support, ces derniers pouvant être apportés lors du processus de polymérisation du support ou par une irradiation du support après polymérisation.
X 1 1 c-11'9 19,2 5'- oligonuclotide PEPTlI7ENOM TEMPS DE ltATtO
- 3' ABREGE RTENTION
CLHP minutes TL~CP~7.'ITAGAOCC G28K b-G28 2 5 , 7 1 , 0 K
OCAI'ITAGADOC G28K a-G28K 24, 8 i , 0 'IbCA~T~GA00C K20R b-K20R 36,1 1 ,1 K20R C-K20R 39,3 0,9 dans lequel X caractérise le ligand selon la nomenclature utilisée précédemment, le symbole *n, n représentant le nombre 2, 3 ou 9, signifie que le ligand peut s'additionner n fois sur lui-même.
S Le symbole - dans la colonne X du tableau 4 signifie que l'oligonucléotide est synthétisé sans ligand.
Le symbole # signifie que les conditions chromatographiques sont celles décrites pour l'exemple 4.
Dans le tableau 5, l'oligonucléotide est quantifié en picomoles par U.V. en mesurant l'absorbance à 260 nm, selon le protocole Applied Biosystems. Le peptide est quantifié en picomoles par analyse d'acides aminés selon la méthode décrite dans l'exemple 3. Le ratio oligo/peptide est le rapport de ces deux valeurs.
F-xemple 7: détection d'un fragment d'acide nucléique par la technique dite "sandwich".
Dans une plaque de microtitration en polystyrène (Nunc 439454), sont déposés 100 )11 d'une solution d'un oligonucléotide de capture modifié ou non par un ligand à une concentration de 0,15 )1M
dans du PBS 3X (0,45 M NaCl; 0,15 M phosphate de sodium,; pH 7,0).
La plaque est incubée deux heures à environ 37°C puis lavée 3 fois par 300 ~I,l de PBS Tween (0,15 M NaCl; 0,05 M phosphate de sodium; pH
7,0: 0,5% Tween*20 (MERCK 822184)).
50 )11 d'une séquence cible à différentes concentrations dans du tampon PBS saumon (PBS 3X + ADN de sperme de saumon 10 mg/ml (Sigma D9156) ) sont ajoutés dans les puits, suivis de 50 )11 d'une solution d'un conjugué oligonucléotide-peroxydase à une concentration de 0,1 ng/~L1 (15 nM) en oligonucléotides dans un tampon PBS - cheval (PBS 3X + 10 % de sérum de cheval (BIOMERIEUX
55842) ) .
La plaque est incubée 1 heure à 37°C et lavée par 3 fois 300 ~,1 de PBS Tween*
100 )11 de substrat OPD (ortho-phénylène diamine, Cambridge Medical Biotechnology ref. 456), dans un tampon OPD (0,05 M acide citrique: 0,1 M NaH2P04; pH 4,93) de la concentration de 4 mg/ml, auxquels on ajoute..extemporanément H202 à 30 volumes au 1/1000, sont * marques de car~r~erce ajoutés par puits. Après 20 minutes de réaction, l'activité
enzymatique est bloquée par 100 )1.1 d'H2S04 1N. La lecture est effectuée sur un lecteur AXIA Micro Reader (BIOMERIEUX) à 492 nm.
Conformément au protocole général décrit dans l'exemple 7, on a effectué la détection d'un fragment d'acide nucléique cible déterminé par la séquence 5'-AAGGTCAACCGGAATTTCATTTTGGGGCTCTAAATGCAATACAATGTCTTG
CAATGTTGCCTTA-3', respectivement à une concentration de 10 9 M et de 10-10 M en utilisant un oligonucléotide de capture de séquence 5' TGCATTTAGAGCC-3' modifié ou non par un ligand et un oligonucléotide de détection conjugué à la peroxydase de séquence 5'-TAAGGCAACATTGCAAGATA-3'.
Les résultats sont présentés aux figures 1 et 2 dans lesquelles les oligonucléotides de capture sont notés selon les règles définies précédemment dans les tableaux 4 et 5.
L'effet de l'addition d'un ligand à l'extrémité d'un oligonucléotide sur l'efficacité de la détection peut se quantifier par le ratio signal oligonucléotide-ligand/signal oligonucléotide nu. On entend par oligonucléotide nu, un oligonucléotide de synthèse standard, c'est-à-dire 3' OH, 5' OH et ne possédant pas de ligand sur les bases.
On a représenté dans le tableau ci-dessous le ratio signal oligonucléotide-ligand/signal oligonucléotide nu, dans lequel X
représente un ligand selon la terminologie utilisée précédemment et b représente un oligonucléotide tel que déterminé précédemment.
X ' ~1~~ 2 3 4 5 6 7 Ratio b-X/b2,6 1,3 1,5 1,2 8,2 7,8 6,3 3,8 .
K
X 9a 9b 10 11 12 13 G28K 20R
Ratio b-X/b0,5 6,7 7,1 9,7 1 1,1 6,8 > 12,6 >
12,6 Ce tableau montre que l'addition d'un ligand sur un oligonucléotide pérmet d'augmenter de manière importante le signal, * marque de canrierce jusqu'à plus de 10 fois dans certains cas. Tous les ligands n'ont pas le mème effet et la présence d'une amine primaire est un facteur déterminant. Ceci est d'ailleurs confirmé par les figures 1 et 2 (donnant les résultats obtenus (donnés en D.O. (densité optique)) avec diverses sondes de capture).
Comme cela ressort des figures 1 et 2, il n'y a pas d'effet de la concentration en cible.
Avec les ligands 5, 6, 7, 10 et 13 qui comportent une amine primaire sur une chaS.ne alkyle ramifiée ou non, le ratio b-X/b est compris entre 6, 3 et 8, 2, alors que pour les ligands 1, 2, 3, 4, 9 qui ne comportent pas d'amines primaires, ce ratio est compris entre 1,2 et 3,7.
Dans le cas du ligand 9a, qui amène un groupement phosphate, l'effet est négatif avec un ratio de 0,5.
Si le ligand aminé est porté par une chaine aliphatique greffée sur la base d'un nucléotide non complémentaire de la cible, le même effet d'augmentation du signal est visible, ce qui est le cas avec les ligands 11 et 12.
On répète le protocole général décrit dans l'exemple 7 utilisant des ligands simples, des ligands pouvant s'additionner sur eux-mémes, des ligands peptidiques et un nucléotide thymine (T).
L'oligonucléotide de capture b est caractérisé par la séquence 5'-TGCATTTAGAGCC-3'.
Les résultats sont présentés à la figure 3 et dans le tableau 7.
TART.RAL~ 7 ~X 1 1*2 1*3 11 11*9 T*9 10 10*9 G28K K20R
lt~r,~/h 76 3_4 4_9.7 >12.6 4,4 7,1 >12,6 >12 6 >12,6 Comme cela ressort de cette figure et du tableau 7, dans lequel X représente le ligand, le symbole *n signifie le ligand pouvant d'additionner n fois sur lui-méme, b représente l'oligonucléotide de capture.
La sensibilité de détection est augmentée par l'addition multiple du ligand, quel que soit le type de ligand, mais avec un -24- ~ 2 0 7 4 1 3 5 effet très marqué lorsque le ligand est porteur d'une fonction amine. Cet effet de la fonction amine est confirmé par la comparaison entre ligand 1 ((CH2)8-OH) et le ligand S ((CH2)6-NH2) de l'exemple précédent. En effet, le ligand 1 porteur d'un S groupement hydroxyle, méme additionné 3 fois sur lui-même, ne donne un gain que de 4,56, alors que le ligand S portant un groupement amine primaire produit un gain de 8,20. De même pour le ligand thymine (T) additionné 9 fois sur lui-même, le gain de sensibilité
n'est que de 4,4 en comparaison avec le ligand 11 additionné 9 fois sur lui-méme, qui donne un gain de sensibilité de 12,6. Le ligand 11 diffère du ligand thymine par la présence d'un bras aliphatique comportant une amine primaire sur la base T en position 5.
1S F,x~m,~l,Q l0 On utilise le méme protocole général que celui décrit dans l'exemple 7. On utilise une sonde de capture courte, référencée a, de séquence 5'-GCATTTAGAGCC-3' et qui est raccourcie d'une base par rapport à la sonde b précédemment testée. Les ligands couplés à la sonde de capture sont respectivement les ligands phosphoramidite 5 et 6 et le ligand peptidique G28K.
La cible est déposée à une concentration égale à 10-10 M.
Comme cela ressort à la figure 4, la sensibilité de détection est augmentée en présence d'un ligand porteur d'une fonction amine primaire, par rapport à un oligonucléotide nu. Par ailleurs, on constate que la sensibilité de détection est fortement augmentée en présence d'un ligand peptidique en comparaison avec un ligand phosphoramidite S et 6. Les résultats sont confirmés dans le tableau '8 ci-dessous, dans lequel x représente le ligand, a l'oligonucléotide.
3S X I I ~ 5 .II 6 G28K
Ratio a-X/a 3,2 3,7 8,9 r.
-2 5- ~ 2 0 7 4 1 3 5 On utilise un protocole de détection identique à celui décrit dans l'exemple 7. L'oligonucléotide de capture est l'oligonucléotide c de séquence 5'-TCTACGCATTTCACCGCTACAC-3' modifié
à l'extrémité 5' par un ligand et qui est déposé à une concentration de 0,30 ~.M. La cible est composée de 5.109 Moles d'un mélange d'ARN
16S et 23S E. Coli commercialisé par la société BOEHRINGER sous la référence 206938) dans 50 X11 d'un tampon PBS saumon. La sonde de détection couplée à la peroxydase a pour séquence 5'-TCTAATCCTGTTTGCTCCC-3'.
Comme montré à la figure 5, la sensibilité de détection est augmentée par la présence d'un ligand et ceci d'autant plus qu'on utilise un ligand couplé plusieurs fois sur lui même.
Les résultats sont confirmés dans le tableau 9 ci-dessous, dans lequel X représente le ligand et c l'oligonucléotide de capture.
-X 1 1*3 5 10'9 11'9 K20R
Ratio c-X/c1,5 1,8 5,7 8 9 ,1 9 , , 6 On constate par ailleurs qu'avec une sonde de capture de 22 bases, les ligands 10 et 11 additionnés 9 fois sur eux-mémes et le ligand peptidique K20R ont sensiblement le méme effet.
On utilise le mégi protocole que celui décrit dans l'exemple 7. On fait varier la nature du tampon de dilution de l'oligonucléotide de capture modifié par des ligands chimiques.
L'oligonucléotide de capture, est l'oligo b tel que décrit précédemment, mis en solution à 0,15 NM respectivement dans des tampons A*, B*, C*, D*. La cible S décrite dans l'exemple S est déposée à une concentration de 10-10 M.
A* ~ 150 mM phosphate de sodium pH 7,0 : 450 mM NaCl B* = 150 mM phosphâte de sodium pH 4,2 : 450 mM NaCl C* g 150 mM phosphate de sodium pH 8,5 ; 450 mM NaCl D* ~ 150 mM Tris pH 7,0 ; 450 mM NaCl.
Comme cela ressort de la figure 6, quel que soit le tampon, l'effet du ligand sur la sensibilité de détection est conservé. Cet effet diminue à pH acide avec le tampon B*.
On va montrer maintenant l'effet du ligand sur la spécificité. On utilise un protocole sandwich identique à celui décrit dans l'exemple 7 et 2 fragments d'ADN à une concentration de 10 10 M comme cible. La séquence S ci-dessous est parfaitement homologue de l'oligonucléotide de capture b modifié ou non par des ligands .
La séquence SGT décrite ci-dessous contient un mésappariement de type GT au milieu de la région complémentaire de la sonde de capture.
S y,Pnce 3'-ATTCCGTTGTAACGTTCTGTAAGATAACGTAAATCTCGGGGTTTTACTTTAAGGCCA
ACTGGAA-5' ~r~,,~aPnce cCT s 3'-ATTCCGTTGTAACGTTCTGTAACATAACGTA~TCTCGGGGTTTTACTTTAAGGCCA
ACTGAA-5' Le gain en signal amené par la présence d'un ligand ne doit pas diminuer la spécificité de la détection. Le ratio signal S/signal SGT peut donc servir de référence pour mesurer les performances du système.
Les résultats sont présentés à la figure 7 et dans le tableau 10 ci-dessous, dans lequel b représente l'oligonucléotide de capture et X le ligand. , b-X b b-1 b-2 b-3 b-4 Ib-5 b-6 b-7 CIBLF.JCIBLE 7,1 7,$ 9,1 8 8 9 9 15 MITT'F.E , , , , , b-X b-8 b-9b 10 11 12 13 G28K K2oR
7.9 7.9 8.6 >4,7 >3,2 On constate que le gain en signal amené par le ligand ne diminue en rien la spécificité de la détection. Dans le cas de l'utilisation des ligands peptidiques, on note une diminution de gain en signal, en comparaison de celui obtenu avec des ligands phosphoramidites et ceci est dt1 à une saturation du détecteur. En réalité, la spécificité de la détection n'est pas altérée par l'utilisation du ligand peptidique.
Exemple 14 On réalise la détection d'un fragment d'acide nucléique sur un automate VIDAS (marque enregistrée - commercialisé par la société
BIOMERIEUX SA - VITEK). La détection est effectuée à l'aide d'un support conique SPR (commercialisé par la société VITEK (USA), marque de commerce) réalisé à partir d'un matériau vendu sous la dénomination K résine qui est un copolymère butadiène-styrène) et d'une barrette. La réaction d'hybridation sandwich décrite dans le protocole ci-dessous se produit sur la paroi interne du cône.
Sur la surface interne du c8ne SPR, sont fixés passivement des oligonucléotides modifiés ou non par un ligand à une concentration de 0,15 jlM dans un volume de 315 ),l.l d'une solution de PBS 4X (phosphate de sodium 200 mM pH 7,0, NaCl 600 mM). Après une nuit à température ambiante ou deux heures à 37°C, les c8nes sont lavés 2 fois par une solution de PBS Tween, puis séchés sous vide.
La barrette contient l'ensemble des réactifs nécessaires à la détection, c'est-à-dire 200 )11 d'une solution à 15 nM d'un oligonucléotide de séquence 5'-TAAGGCAACATTGCAAGATA-3' couplé à l'extrémité 5' à la phosphatase alcaline, 3 fois 600 fil de solution de lavage PBS Tween et une cuvette de substrat.
Dans le premier puits de la barrette, est déposé 200 ).~.1 de la cible à une concentration de 10-9 M dans le même tampon que pour l'exemple 7 Après incubation 30 minutes du c8ne par le mélange cible plus sonde de détection, le c8ne est lavé 3 fois par une solution de PBS Tween* 250 )ll de substrat MUP (méthyl-4 umbelliféryl phosphate) en solution dans un tampon diéthanolamine sont aspirés dans le c8ne, puis~~relâchés dans une cuvette de lecture. L'appareil * marques de conrnerce ~A
- ~ 2474135 mesure le signal fluorescent exprimé en RFU (unités relatives de fluorescence) de la cuvette.
Les résultats sont représentés à la figure 8 et dans le tableau 11 ci-dessous dans lequel X représente le ligand, *n signifie addition n fois du ligand sur lui-même, b représente l'oligonucléotide de capture tel que représenté précédemment.
X 1 1*2 1*3 3 5 6 8 G28K K20R
Ratiob-X/b 2,3 2,8 4,8 2,7 20,4 26,9 21,6 >43 >43 Les résultats confirment l'effet du ligand dans l'amélioration de la sensibilité de détection et le r8le prépondérant des ligands portant au moins un groupement fonctionnel amine primaire.
On effectue la détection d'une séquence d'acide nucléique selon le protocole sandwich tel que décrit dans l'exemple 7 en utilisant des plaques de polystyrène irradiées ou non irradiées commercialisées par la société NUNC respectivement sous les références 439454 et 269620.
Le fragment d'acide cible est un fragment d'ADN du papillomavirus de type 16 (région E7) utilisé à une concentration de 10-10 M.
La séquence de l'oligonucléotide de capture utilisé, référencé
d~ est : 5'-GACAACTGATCTCTAC-3' .
La séquence de l'oligonucléotide de détection, couplé à
l'extrémité 5' à la phosphatase alcaline, est 5'-CCGGACAGAGCCCATTAC-3' Les résultats sont présentés dans les tableaux ci dessous 12 et 13.
OLIGO -LIGAND PLAQUE NON IRRADIEE PLAQUE IRRADIEE
d 0,100 D.O. 0,230 D.O.
d-5 0,180 D.O. 0,490 D.O.
-__________________________________________-________________________ OLIGO-LIGAND RAPPORT SIGNAL IRRADIEE/NON IRRADIEE
d 2, 3 d-5 2,7 Les résultats ci-dessus confirment le r8le prépondérant du ligand dans la sensibilité de détection. Par ailleurs, on constate une amélioration de la sensibilité de détection lorsqu'on utilise des plaques de microtitration irradiées.
On effectue la détection d'une séquence d'acide nucléique selon le protocole sandwich sur l'automate VIDAS selon le protocole décrit dans l'exemple 14 en utilisant des c8nes de K résine respectivement irradiés ou non irradiés. Ces c8nes sont commercialisées par la société VITEK SYSTEM.
L'ADN, les oligonucléotides de capture et de détection utilisés sont identiques à ceux décrits dans l'exemple 15. Le ligand utilisé est celui référencé précédemment dans l'exemple 5.
Les résultats sont présentés dans le tableau 14 ci-dessous TABLEAU 14, OLIGO -LIGAND SPR NON IRRADIE SPR IRRADIE
d 84 RFU 540 RFU
d-5 1302 RFU 3917 RFU
Les rapports de détection SPR activé/SPR non activé sont de OLIGO-LIGAND RAPPORT activé/non activé
______~ ___________________________643 ____________________________ d-5 » 3,00 Les résultats ci-dessus confirment encore l'effet du ligand sur la sensibilité de détection. Par ailleurs, on constate une diminution du gain du signal lorsqu'on utilise des c$nes irradiés, mais ceci est dQ à une saturation du détecteur. Le rapport est donc nettement supérieur à 3, 00 (»3, 00) .
On met ci-après en évidence la stabilité des cônes utilisés à
différentes températures.
En effet, dans le cas d'utilisation de c8nes pour l'automate VIDAS, comme composants de la trousse de détection de fragments d'acides nucléiques, ceux ci doivent être vendus prêts à l'emploi, c'est à dire avec l'oligonucléotide de capture immobilisé. Un facteur déterminant de leur utilisation est leur stabilité dans le temps. Des expériences de stabilité ont été effectuées à trois températures différentes, respectivement 4°, 20°C et 37°C. Les résultats obtenus sont résumés dans le tableau 15 ci-dessous après 42 jours pour chaque température TEMPERATURE . RAPPORT SIGNAL jour 42/jour 1 4° 100 $ -_______________ 20° . 98 %
37° 86 %
Les résultats ci-dessus montrent l'excellente stabilité des c8nes utilisés après 42 jours de conservation dans un réfrigérateur à une température' de 4°C. Par ailleurs, une augmentation de la -31- ~ 2 0 7 4 1 3 5 température n'affecte que très peu la stabilité des produits.
Comme cela ressort de tous les exemples précédemment décrits, l'addition d'un ligand à un fragment d'acide nucléique augmente dans tous les cas la sensibilité de détection. Cet effet est encore accru lorsqu'on utilise un ligand portant au moins un groupement fonctionnel polaire tel qu'un groupement aminé. Par ailleurs, la fixation du ligand sur le support solide est très facile puisqu'elle se fait directement par adsorption passive. L'hypothèse émise pour expliquer l'adsorption passive directe du ligand sur le support est la combinaison d'interactions hydrophobes entre la partie hydrophobe du ligand et le support et d'interactions polaires entre les groupements polaires du ligand et des groupements polaires du support, ces derniers pouvant être apportés lors du processus de polymérisation du support ou par une irradiation du support après polymérisation.
Claims (32)
1. Procédé d'immobilisation par fixation passive, sur un support solide, d'un fragment d'acide nucléique comportant moins de 100 nucléotides, dans lequel on dépose sur ledit support ledit fragment sous la forme d'un dérivé résultant du couplage covalent dudit fragment avec un ligand ayant une masse moléculaire inférieure à 5 000 et comprenant au moins un groupement fonctionnel polaire, ledit dérivé n'étant pas susceptible de réagir sur ledit support avec formation d'une liaison covalente dans les conditions dudit dépôt, étant entendu que lorsque ledit ligand est un nucléotide ou oligonucléotide, il comprend au moins un nucléotide modifié
de façon à introduire ledit groupement fonctionnel polaire.
de façon à introduire ledit groupement fonctionnel polaire.
2. Procédé selon la revendication 1, caractérisé par le fait que ledit groupement fonctionnel est choisi parmi les groupements amine, hydrazino, imino, azido, thiophosphate, hydrazono, sulfamoyle, thiocarboxy, amide, amide substitué, triazano, triazéno, amido, semicarbazono, carbamoyle, cyano, carboxyle, hydroxy, alkylthio et arylthio.
3. Procédé selon la revendication 2, caractérisé par le fait que ledit groupement fonctionnel polaire est choisi parmi les groupements amine, hydroxy, amido, carbamoyl, alkylthio, arylthio et thiophosphate.
4. Procédé selon la revendication 3, caractérisé par le fait que ledit groupement amine est choisi parmi les groupements amino, amidino, guanidino, triazinyle, indolyle et imidazolyle.
5. Procédé selon l'une quelconque des revendications 1 à 4, caractérisé par le fait que ledit ligand comprend au moins un groupement hydrophobe.
6. Procédé selon la revendication 5, caractérisé par le fait que ledit groupement hydrophobe est choisi parmi les groupements hydrocarbonés, les groupements hydrocarbonés insaturés ayant 2 à 30 atomes de carbone.
7. Procédé selon la revendication 6, caractérisé par le fait que ledit groupement hydrocarboné est choisi parmi les groupements alkyle, alkylène, alcényle, alcénylène, les groupements aryles et arylènes, les groupements alkyle, alkylène, alcényle, alcénylène, alcénylène interrompus par au moins un groupement arylène ou aryle, les groupements alkyle, alkylène, alcényle, alcénylène substitués par au moins un groupement arylène ou aryle et les groupements alkyle, alkylène, alcényle ou alcénylène interrompus et substitués par au moins un groupement arylène ou aryle.
8. Procédé selon l'une quelconque des revendications 5 à 7, caractérisé par le fait que ledit ou lesdits groupement(s) hydrophobe(s) est ou sont substitué(s) par ledit ou lesdits groupement(s) fonctionnel(s) polaire(s).
9. Procédé selon l'une quelconque des revendications 1 à 8, caractérisé par le fait que ledit ligand est lié à un nucléotide terminal dudit fragment.
10. Procédé selon la revendication 9,caractérisé par le fait que ledit ligand est lié à l'extrémité 3' ou 5' dudit fragment.
11. Procédé selon la revendication 9, caractérisé par le fait que ledit ligand est lié à la base dudit nucléotide terminal.
12. Procédé selon l'une quelconque des revendications 1 à 11, caractérisé par le fait que ledit ligand comprend un groupement choisi parmi:
- les groupements de formule (I):
dans laquelle n est zéro ou un nombre entier de 1 à 30, les groupements z sont choisis parmi les groupements alkylène et alcénylène ayant 2 à 30 atomes de carbone, Z' est un groupement alkyle ou alcényle ayant 2 à 30 atomes de carbone, X et X' représente indépendamment -OM+, -S-Ni+ ou un groupement alkyle, alcoxy, aryloxy, aminoalkyle ou aminoalcoxy, M+ étant un cation alcalin ou NH4+, étant entendu que l' un au moins des groupements Z et Z' est substitué par un groupement fonctionnel polaire ou par un groupement portant un groupement fonctionnel polaire, les groupements de formule (II):
dans laquelle n, Z et Z' sont définis comme précédemment, - et les groupements de formule (III):
-L ~~(III) dans laquelle L est un reste peptidyle comprenant au moins un motif dérivé d'un acide aminé comportant une chaîne latérale substituée par un groupement fonctionnel polaire.
- les groupements de formule (I):
dans laquelle n est zéro ou un nombre entier de 1 à 30, les groupements z sont choisis parmi les groupements alkylène et alcénylène ayant 2 à 30 atomes de carbone, Z' est un groupement alkyle ou alcényle ayant 2 à 30 atomes de carbone, X et X' représente indépendamment -OM+, -S-Ni+ ou un groupement alkyle, alcoxy, aryloxy, aminoalkyle ou aminoalcoxy, M+ étant un cation alcalin ou NH4+, étant entendu que l' un au moins des groupements Z et Z' est substitué par un groupement fonctionnel polaire ou par un groupement portant un groupement fonctionnel polaire, les groupements de formule (II):
dans laquelle n, Z et Z' sont définis comme précédemment, - et les groupements de formule (III):
-L ~~(III) dans laquelle L est un reste peptidyle comprenant au moins un motif dérivé d'un acide aminé comportant une chaîne latérale substituée par un groupement fonctionnel polaire.
13. Procédé selon la revendication 12, caractérisé par le fait que ledit ligand répond à la formule (I), n étant zéro ou un nombre entier de 1 à 10, Z est un alkylène ayant de 2 à 12 atomes de carbone, et Z' est un alkyle ayant de 2 à
12 atomes de carbone, l'un au moins des groupements Z et Z' étant substitué par au moins un groupement amine, hydroxy ou hydrazino.
12 atomes de carbone, l'un au moins des groupements Z et Z' étant substitué par au moins un groupement amine, hydroxy ou hydrazino.
14. Procédé selon la revendication 13, caractérisé par le fait que n = O et X représente O-M+.
15. Procédé selon la revendication 12, caractérisé par le fait que ledit ligand répond à la formule (II), avec n - O, et Z' représente un groupement alkyle ayant 3 à 12 atomes de carbone, substitué par au moins un groupement amine.
16. Procédé selon la revendication 15, caractérisé par le fait que ledit groupement alkyle est en outre substitué
par au moins un groupement hydroxy.
par au moins un groupement hydroxy.
17. Procédé selon la revendication 12, caractérisé par le fait que ledit ligand répond à la formule (II), avec n - 1, et Z représente un alkylène ou alcénylène ayant au moins 2 atomes de carbone et Z' représente un groupement alkyle substitué par au moins un groupement amine.
18. Procédé selon la revendication 12, caractérisé par le fait que ledit ligand répond à la formule (II), avec n = 0.
19. Procédé selon la revendication 12, caractérisé par le fait que ledit ligand répond à la formule (III), et que ledit acide aminé comportant une chaîne latérale substituée est choisi parmi la lysine, l'arginine, l'ornithine, la glutamine, l'aspargine, la sérine, la thréonine, la tyrosine, l'histidine et le tryptophane.
20. Procédé selon la revendication 12, caractérisé par le fait que -L est choisi parmi:
- (KGS)m-KGG m étant un nombre entier pouvant varier de 1 à 15, et - KIEPLGVAPTKAKRRWQREKR.
- (KGS)m-KGG m étant un nombre entier pouvant varier de 1 à 15, et - KIEPLGVAPTKAKRRWQREKR.
21. Procédé selon l'une quelconque des revendications 1 â 20, caractérisé par le fait que ledit support solide est réalisé en un matériau choisi parmi les polysaccharides, les polymères vinyliques et les copolymères correspondants.
22. Procédé selon la revendication 21, caractérisé en ce que ledit support solide est réalisé en acétate de cellulose ou en nitrocellulose.
23. Procédé selon l'une quelconque des revendications 21 et 22, caractérisé en ce que ledit support solide est réalisé dans un matériau choisi dans le groupe constitué par le polychlorure de vinyle, le polyéthylène, le polystyrène, les dérivés polyacryliques, les polypropylènes et les polycarbonates.
24. Procédé selon l'une quelconque des revendications 21, 22 et 23, caractérisé par le fait que ledit copolymère est un copolymère chlorure de vinyle/acétate de vinyle, chlorure de vinyle/propylène, ou un copolymère de styrène, ou un copolymère styrène-acrylonitrile, ou un copolymère styrène méthacrylate de méthyle.
25. Procédé selon la revendication 24, caractérisé par le fait que le copolymère de styrène est choisi dans le groupe constitué par les copolymères butadiène-styrène, les copolymères styrène-acrylonitrile et les copolymères styrène-méthacrylate de méthyle.
26. Procédé selon l'une quelconque des revendications 24 et 25, caractérisé par le fait que ledit copolymère styrène contient de 10 à 90% de poids en motifs styrène.
27. Procédé selon l'une quelconque des revendications 21 à 26, caractérisé par le fait que ledit support est un support modifié par irradiation.
28. Procédé selon l'une quelconque des revendications 1 à 27, caractérisé par le fait que ledit fragment immobilisé
contient moins de 50 nucléotides.
contient moins de 50 nucléotides.
29. Procédé selon la revendication 28, caractérisé par le fait que ledit fragment immobilisé contient moins de 30 nucléotides.
30. Support sur lequel est immobilisée par fixation passive une séquence nucléotidique, caractérisé par le fait que ledit support est obtenu selon le procédé de l'une quelconque des revendications 1 à 29.
31. Utilisation d'un support selon l'une quelconque des revendications 1 à 30, dans un procédé de détection ou de purification, d'une cible nucléotidique contenant une séquence complémentaire de celle dudit fragment immobilisé.
32. Utilisation selon la revendication 31, caractérisé
par le fait que ledit fragment immobilisé est employé comme sonde de capture.
par le fait que ledit fragment immobilisé est employé comme sonde de capture.
Applications Claiming Priority (2)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| FR9109057 | 1991-07-17 | ||
| FR9109057A FR2679255B1 (fr) | 1991-07-17 | 1991-07-17 | Procede d'immobilisation d'un fragment nucleique par fixation passive sur un support solide, support solide ainsi obtenu et son utilisation. |
Publications (2)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| CA2074135A1 CA2074135A1 (fr) | 1993-01-18 |
| CA2074135C true CA2074135C (fr) | 2001-04-17 |
Family
ID=9415243
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| CA002074135A Expired - Fee Related CA2074135C (fr) | 1991-07-17 | 1992-07-17 | Procede d'immobilisation d'un fragment d'acide nucleique par fixation passive sur un support solide, support solide ainsi obtenu et son utilisation |
Country Status (9)
| Country | Link |
|---|---|
| US (1) | US5510084A (fr) |
| EP (1) | EP0524864B1 (fr) |
| JP (1) | JP2797047B2 (fr) |
| AU (1) | AU659176B2 (fr) |
| CA (1) | CA2074135C (fr) |
| DE (1) | DE69225646T2 (fr) |
| ES (1) | ES2118120T3 (fr) |
| FI (1) | FI102619B (fr) |
| FR (1) | FR2679255B1 (fr) |
Families Citing this family (37)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| FR2706618B1 (fr) * | 1993-06-11 | 1995-09-01 | Bio Merieux | Dispositif pour le dosage d'haptènes et son utilisation. |
| FR2707010B1 (fr) * | 1993-06-25 | 1995-09-29 | Bio Merieux | |
| US5656427A (en) * | 1994-08-29 | 1997-08-12 | Gen-Probe Incorporated | Nucleic acid hybridization assay probes, helper probes and amplification oligonucleotides targeted to Mycoplasma pneumoniae nucleic acid |
| FR2726277B1 (fr) | 1994-10-28 | 1996-12-27 | Bio Merieux | Oligonucleotide utilisable comme amorce dans une methode d'amplification basee sur une replication avec deplacement de brin |
| GB9425138D0 (en) * | 1994-12-12 | 1995-02-08 | Dynal As | Isolation of nucleic acid |
| CA2207629A1 (fr) * | 1994-12-22 | 1996-06-27 | Abbott Laboratories | Procedes d'immobilisation d'oligonucleotides sur des materiaux de support et procedes d'utilisation des oligonucleotides fixes auxdits supports |
| FR2733755B1 (fr) * | 1995-05-03 | 1997-07-11 | Bio Merieux | Fragment nucleotidique de l'arn ribosomique 16s de corynebacteries, sondes et amorces derivees, reactif et procede de detection |
| FR2758884B1 (fr) * | 1997-01-30 | 1999-04-02 | Bio Merieux | Procede pour isoler, notamment detecter ou quantifier un analyte dans un milieu |
| US6692912B1 (en) | 1997-03-05 | 2004-02-17 | Matrix Technologies Corporation | Nucleic acid-containing polymerizable complex |
| US5932711A (en) * | 1997-03-05 | 1999-08-03 | Mosaic Technologies, Inc. | Nucleic acid-containing polymerizable complex |
| US5786182A (en) * | 1997-05-02 | 1998-07-28 | Biomerieux Vitek, Inc. | Dual chamber disposable reaction vessel for amplification reactions, reaction processing station therefor, and methods of use |
| US6558901B1 (en) * | 1997-05-02 | 2003-05-06 | Biomerieux Vitek | Nucleic acid assays |
| US5989499A (en) * | 1997-05-02 | 1999-11-23 | Biomerieux, Inc. | Dual chamber disposable reaction vessel for amplification reactions |
| US6410275B1 (en) | 1997-05-02 | 2002-06-25 | Biomerieux, Inc. | Disposable test devices for performing nucleic acid amplification reactions |
| IL124275A (en) * | 1997-05-02 | 2002-03-10 | Bio Merieux Vitek Inc | A method to produce sequences of nucleic acids |
| US6429007B1 (en) | 1997-05-02 | 2002-08-06 | BIOMéRIEUX, INC. | Nucleic acid amplification reaction station for disposable test devices |
| US5858653A (en) * | 1997-09-30 | 1999-01-12 | Surmodics, Inc. | Reagent and method for attaching target molecules to a surface |
| US6762019B2 (en) | 1997-09-30 | 2004-07-13 | Surmodics, Inc. | Epoxide polymer surfaces |
| US6465178B2 (en) * | 1997-09-30 | 2002-10-15 | Surmodics, Inc. | Target molecule attachment to surfaces |
| US6703228B1 (en) | 1998-09-25 | 2004-03-09 | Massachusetts Institute Of Technology | Methods and products related to genotyping and DNA analysis |
| EP1001037A3 (fr) * | 1998-09-28 | 2003-10-01 | Whitehead Institute For Biomedical Research | Pre-selection et isolement d'un polymorphisme de mononucleotide |
| AU1750400A (en) * | 1998-12-04 | 2000-06-26 | Mosaic Technologies, Inc. | Method for the immobilization of oligonucleotides |
| US20050153926A1 (en) * | 1998-12-04 | 2005-07-14 | Adams Christopher P. | Method for the immobilization of oligonucleotides |
| US6383783B1 (en) | 1999-09-21 | 2002-05-07 | 3M Innovative Properties Company | Nucleic acid isolation by adhering to hydrophobic solid phase and removing with nonionic surfactant |
| GB0016836D0 (en) * | 2000-07-07 | 2000-08-30 | Lee Helen | Improved dipstick assays (1) |
| US6706479B2 (en) * | 2000-10-05 | 2004-03-16 | Virginia Tech Intellectual Properties, Inc. | Bio-chip, photoluminescent methods for identifying biological material, and apparatuses for use with such methods and bio-chips |
| WO2003062462A2 (fr) | 2002-01-16 | 2003-07-31 | Dynal Biotech Asa | Methode permettant d'isoler des acides nucleiques et des proteines contenus dans un echantillon unique |
| US20040067495A1 (en) * | 2002-10-08 | 2004-04-08 | Ray Gustav Allen | Polynucleic acid and polyamino acid binding substrate |
| US7309593B2 (en) * | 2003-10-01 | 2007-12-18 | Surmodics, Inc. | Attachment of molecules to surfaces |
| US20050130177A1 (en) * | 2003-12-12 | 2005-06-16 | 3M Innovative Properties Company | Variable valve apparatus and methods |
| US7727710B2 (en) | 2003-12-24 | 2010-06-01 | 3M Innovative Properties Company | Materials, methods, and kits for reducing nonspecific binding of molecules to a surface |
| US7939249B2 (en) | 2003-12-24 | 2011-05-10 | 3M Innovative Properties Company | Methods for nucleic acid isolation and kits using a microfluidic device and concentration step |
| EP1623996A1 (fr) * | 2004-08-06 | 2006-02-08 | Deutsches Krebsforschungszentrum Stiftung des öffentlichen Rechts | Procédé amélioré de selection d'une protéine desirée d'une bibliothéque. |
| JP4899067B2 (ja) * | 2006-02-23 | 2012-03-21 | 国立大学法人北海道大学 | 質量分析用生体関連分子のエステル化法及び得られたエステル化誘導体の質量分析方法 |
| EP2140001A2 (fr) * | 2007-04-25 | 2010-01-06 | 3M Innovative Properties Company | Procédés d'amplification d'acides nucléiques |
| US20120172336A2 (en) * | 2009-03-19 | 2012-07-05 | Seps Pharma N.V. | Fosfluconazole Derivatives, Synthesis, and Use in Long Acting Formulations |
| WO2022246196A1 (fr) * | 2021-05-21 | 2022-11-24 | Olix Us, Inc. | Réactifs de phosphorylation chimique, préparation et leurs utilisations |
Family Cites Families (17)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| US4379843A (en) * | 1981-01-26 | 1983-04-12 | Peter Cashion | Immobilization of polynucleotides and polypeptides with tritylated polysaccharides |
| US4994373A (en) * | 1983-01-27 | 1991-02-19 | Enzo Biochem, Inc. | Method and structures employing chemically-labelled polynucleotide probes |
| US4948882A (en) * | 1983-02-22 | 1990-08-14 | Syngene, Inc. | Single-stranded labelled oligonucleotides, reactive monomers and methods of synthesis |
| US4828979A (en) * | 1984-11-08 | 1989-05-09 | Life Technologies, Inc. | Nucleotide analogs for nucleic acid labeling and detection |
| US4739044A (en) * | 1985-06-13 | 1988-04-19 | Amgen | Method for derivitization of polynucleotides |
| US4806546A (en) * | 1985-09-30 | 1989-02-21 | Miles Inc. | Immobilization of nucleic acids on derivatized nylon supports |
| DE3785658T2 (de) * | 1986-08-11 | 1993-08-12 | Siska Diagnostics Inc | Methoden und zusammensetzungen fuer tests mit nukleinsaeuresonden. |
| US5185439A (en) * | 1987-10-05 | 1993-02-09 | Gen-Probe Incorporated | Acridinium ester labelling and purification of nucleotide probes |
| EP0972779A3 (fr) * | 1987-10-28 | 2004-10-20 | Howard Florey Institute Of Experimental Physiology And Medicine | Conjugués d'oligonucléotide-polyamide |
| US5112734A (en) * | 1989-05-26 | 1992-05-12 | Gene-Trak Systems | Target-dependent synthesis of an artificial gene for the synthesis of a replicatable rna |
| EP0405913B1 (fr) * | 1989-06-30 | 1998-12-23 | Chiron Corporation | Sonde d'acide nucléique hydrophobe |
| US5232829A (en) * | 1989-09-29 | 1993-08-03 | Hoffmann-La Roche Inc. | Detection of chlamydia trachomatis by polymerase chain reaction using biotin labelled lina primers and capture probes |
| WO1991008307A1 (fr) * | 1989-12-04 | 1991-06-13 | Microprobe Corporation | Capture amelioree d'acide nucleique cible faisant appel a des oligonucleotides attaches de façon covalente a des polymeres |
| CA2032203C (fr) * | 1989-12-29 | 2009-05-19 | Christine L. Brakel | Essai de capture par amplification |
| FR2663040B1 (fr) * | 1990-06-11 | 1995-09-15 | Bio Merieux | Procede de detection d'une sequence nucleotidique selon la technique d'hybridation sandwich. |
| US5552541A (en) * | 1990-06-20 | 1996-09-03 | Beckman Instruments, Inc. | Haptenic probes for detecting capture polynucleotides |
| US5138045A (en) * | 1990-07-27 | 1992-08-11 | Isis Pharmaceuticals | Polyamine conjugated oligonucleotides |
-
1991
- 1991-07-17 FR FR9109057A patent/FR2679255B1/fr not_active Expired - Fee Related
-
1992
- 1992-07-16 FI FI923260A patent/FI102619B/fi active IP Right Grant
- 1992-07-17 EP EP92402080A patent/EP0524864B1/fr not_active Expired - Lifetime
- 1992-07-17 DE DE69225646T patent/DE69225646T2/de not_active Expired - Lifetime
- 1992-07-17 JP JP4213504A patent/JP2797047B2/ja not_active Expired - Lifetime
- 1992-07-17 ES ES92402080T patent/ES2118120T3/es not_active Expired - Lifetime
- 1992-07-17 CA CA002074135A patent/CA2074135C/fr not_active Expired - Fee Related
- 1992-07-17 AU AU20379/92A patent/AU659176B2/en not_active Ceased
-
1994
- 1994-07-12 US US08/273,776 patent/US5510084A/en not_active Expired - Lifetime
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| ES2118120T3 (es) | 1998-09-16 |
| DE69225646D1 (de) | 1998-07-02 |
| EP0524864A1 (fr) | 1993-01-27 |
| FR2679255B1 (fr) | 1993-10-22 |
| FI102619B1 (fi) | 1999-01-15 |
| US5510084A (en) | 1996-04-23 |
| FI102619B (fi) | 1999-01-15 |
| FR2679255A1 (fr) | 1993-01-22 |
| FI923260A0 (fi) | 1992-07-16 |
| FI923260A (fi) | 1993-01-18 |
| DE69225646T2 (de) | 1998-12-24 |
| JPH05271272A (ja) | 1993-10-19 |
| CA2074135A1 (fr) | 1993-01-18 |
| JP2797047B2 (ja) | 1998-09-17 |
| AU2037992A (en) | 1993-01-21 |
| EP0524864B1 (fr) | 1998-05-27 |
| AU659176B2 (en) | 1995-05-11 |
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| CA2074135C (fr) | Procede d'immobilisation d'un fragment d'acide nucleique par fixation passive sur un support solide, support solide ainsi obtenu et son utilisation | |
| EP0691978B1 (fr) | Copolymere nucleotide(s)/polymere conducteur electronique, son procede de preparation et son utilisation | |
| EP3339314B1 (fr) | Nucleotides modifies pour la synthese d'acides nucleiques, un kit renfermant de tels nucleotides et leur utilisation pour la production de genes ou sequences d'acides nucleiques synthetiques | |
| CA2149315C (fr) | Reactif et procede pour la detection d'une sequence nucleotidique avec amplification de signal | |
| CA2444926C (fr) | Procede de marquage et de fragmentation d'adn | |
| EP0451213B1 (fr) | Derives de molecules polyhydroxylees permettant l'introduction d'au moins une ramification dans un oligonucleotide | |
| US20090155795A1 (en) | Baseless nucleotide analogues and uses thereof | |
| EP1100773A1 (fr) | Derives satures et insatures de l'abietane, conjugues derives et utilisations dans une composition diagnostique, un reactif et un dispositif | |
| CA2087961A1 (fr) | Gros polynucleotides ramifies du type peigne | |
| EP1383732A1 (fr) | Reactifs de marquage, procedes de synthese de tels reactifs et procedes de detection de molecules biologiques | |
| EP0195009B1 (fr) | Acides nucleiques marques chimiquement, leur utilisation et necessaire pour sa mise en oeuvre | |
| EP2859008A1 (fr) | Oligonucleotides modifies compenant des fonctions thiol et leur utilisation pour la detection d'acides nucleiques | |
| EP0772694A1 (fr) | Systeme de sondes permettant d'effectuer le typage hla dr, et procede de typage utilisant lesdites sondes | |
| EP0549776B1 (fr) | Systeme de sondes permettant d'effectuer le typage hla dr, et procede de typage utilisant lesdites sondes | |
| WO2013150106A1 (fr) | Composés thiol et leur utilisation pour la synthèse d'oligonucléotides modifiés | |
| EP0684954B1 (fr) | Sondes d'acides nucleiques chimiquement modifiees en 5'(oh) et/ou en 3'(oh) en vue de l'introduction en ces positions d'un ou plusieurs elements de marquage non radioactif et procede de preparation | |
| EP0334694A1 (fr) | Sonde d'acides nucléiques avec marquage non-radioactif et procédés de préparation | |
| EP1474430B1 (fr) | Metallocenes bifonctionnalises, utilisation pour le marquage de molecules biologiques | |
| WO1988000593A1 (fr) | Sondes de detection d'acides nucleiques renfermant des derives de desoxy-2' adenosine | |
| EP2185565B1 (fr) | Réactifs de marquage portant des fonctions diazo et nitro, procédés de synthèse de tels reactifs et procédés de détection de molécules biologiques | |
| JPH02109999A (ja) | 核酸マルチマーおよびそれを用いた増幅核酸ハイブリダイゼーション分析法 | |
| FR2644461A1 (fr) | Procede de stabilisation de l'hybridation de sequences polynucleotidiques complementaires, conjugues peptides-polynucleotides utiles pour la mise en oeuvre du procede | |
| TW200413286A (en) | Novel functional peptide nucleic acid and process for producing the same | |
| JPH07505907A (ja) | オリゴヌクレオチド−ポリアミドコンジュゲート |
Legal Events
| Date | Code | Title | Description |
|---|---|---|---|
| EEER | Examination request | ||
| MKLA | Lapsed |